1. Experienţa 02. 1.Cunductivitatea apei distilate, filtrate şi de robinet.3. 2. Conductivitatea apei distilate şi de robinet la 25, 40, 50oC.

STUDIUL UREAZEI.

a. Extragerea ureazei din seminţele de soia. Determinarea activităţii ureazei prin reacţia de colorare. Determinarea cineticii activităţii ureazei prin metoda de conductivitate. Influenţa temperaturii. Determinarea inhibării activităţii enzimatice a ureazei cu ajutorul ionilor metalelor grele.

b. Influenţa concentraţiei substratului asupra activităţii ureasei. Determinarea inhibării activităţii enzimatice a ureazei cu ajutorul tioureei.

c. Determinarea (KM) și vitezei maximale (Vmax), constantei de specificitate şi de cataliză. d. Determinarea (KM) și vitezei maximale (Vmax) în prezența tioureei.

EXTRAGEREA UREAZEI

8g de făină de soia se adaugă 46 ml apă, 2 ml de 0,1N HCl. Amestecul se agită şi se adaugă câteva picături de toluol şi se lasă 15-20 ore. În această perioadă urează trece în soluţie. Suspensia se filtrează, iar precipitatul se spală cu apă slab acidificată (câteva 3 picături de HCl de 10% la 500 ml apă). Filtratul se aduce la 100 ml pentru determinarea activităţii enzimatice.

Prepararea soluțiilor:Urea (m=60,06g/mol)Tiourea (m=76,13g/mol)

Uree 12g/l Uree şi tiouree (12 g/l + 15g/l) Tiouree 15 g/l Suspensie urează:

Experienţa 11. Trei colbe cu 100 ml soluţii de:

Uree 12g/l 0,2 M (NH2) CO (CH4N2O) Uree şi tiouree (12 g/l + 15g/l) Tiouree 15 g/l CH4N2S

2. Se adaugă câte 5 ml urează 3. Se adaugă câte 1 ml phenolphtalină de 1

Fixam timpulRezultate: Soluția de uree în colba (eprubeta) A devine roșu. Culoarea se intensifică în câteva minute. După câteva minute mai târziu, amestecul de uree / tiouree în colba B începe să transforme un roșu deschis. Soluția apoasă de tiouree în colba (eprubeta) C rămâne incoloră.

Concluzie: În cât timp s-a colorat soluţia din cele trei colbe.

Experienţa №2 Determinarea inhibării activităţii enzimatice a ureazei cu ajutorul ionilor metalelor grele. REACTIVE: uree 12g/l, phenolphtalină de 1%, Pb(CH3COO)2de 0,1 M acetat de plumb, urează. 1.În 10 eprubete cu 2 ml uree 12g/l. Adăugăm 1 - Eprubeta - uree2 - 20 μl Pb(NO3)2de 0,1 M acetat de plumb3 - 50μl Pb(NO3) 2

4 -100μl Pb(NO3) 2

2.În toate eprubetele se adaugă urează 150 μl.3.şi 2 picături phenolphtalină de 1% Determinăm conductivitatea

Concluzii:

Experienţa №3 Determinarea cineticii activităţii ureazei prin metoda de conductivitate.

Influenţa temperaturii asupra activităţii ureazei. La 0 ˚C sau sub această temperatura

activitatea enzimelor este foarte mică. Este suficient însă să ridicăm temperatura peste 0 ˚C,

pentru a constata creşterii activităţii enzimatice. Din 10 în 10 ˚C – activitatea se dublează de

fiecare dată. Ea scade însă brusc odată cu depăşirea temperaturii 65 ˚C, anulându-se uneori cu

totul la 65-75 ˚C. Noi trebuie să determinăm temperatura optimă, la care activitatea este maximă.

Sensibilitatea activităţii enzimei în dependenţă de temperatură.1. 2 eprubete cu 2ml uree 12g/l şi 2 picături phenolphtalină de 1%2. 2 eprubete cu 150 μl urează.3. Se încălzeşte ultratermostatul până la 25ᵒC,45ᵒC, 55ᵒC, 65ᵒC,75ᵒC, 85ᵒC.4. Încălzim 1 eprubete cu uree + phenolphtalină de 1% şi 1 eprubetă cu urează.5. Amestecăm reactivele lăsate la t ˚C camerei.6. Amestecăm reactivele încălzite.

˚C sec

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Temp camerei

20

40

60

80

Concluzii:

Ureaza este enzima care descompune ureea în bioxid de carbon şi amoniac.

H2N NH2

O+ H2O H2N COO- + NH4

+ 2NH3 + CO2

(NH2)2 CO + H20→CO2+2NH3

Influenţa concentraţiei substratului.Schimbarea conductibilităţii reacţiei enzimatice dintre uree şi urează în dependenţă de concentraţia ureei la temperatura 50˚C.

Se pregătește soluție-stoc de uree 2 · 10 -2

M / L. Din ea se pregătesc soluții de 1.5 · 10 -2

, 10 -2

,

7 · 10 -3

 și  4 · 10 -3

M.

Uree 4*10-3 -2ml +150μl ureazăUree 7*10-3 -2ml +150μl urează Uree 10-2 -2ml +150μl urează

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

60

70f(x) = 0.25467032967033 x + 37.6813186813187R² = 0.980208285805539

f(x) = 0.109395604395604 x + 27.2593406593407R² = 0.957968423453991

Schimbarea conductivității reacției enzimatice dintre uree și urează la temperatura 50 C ⁰

4* 10-3

Linear (4* 10-3)

7* 10-3

10-2

Linear ( 10-2)

sec

mS

/m

Concluzii:

Inhib i ţia competitivă cu tioureea.

Influenţa tioureei asupra reacţiei enzimatice dintre uree şi urează.

Ca și în experimentul cu ureea se iau concentrațiile 1.5 · 10 -2, 10 -2,  7 · 10 -3  și  4 · 10 -3 M și se amestecă în concentrații echimolare cu tiourea. Se adaugă soluția de urează.

Uree 4*10-3 -2ml + tiouree-200μl + urează-150 μl

Uree 7*10-3 -2ml + tiouree-200μl + urează-150 μl

Uree 10-2 -2ml + tiouree-200μl + urează-150 μl

0 20 40 60 80 100 1200

10

20

30

40

50

60f(x) = 0.191758241758242 x + 36.3406593406593R² = 0.91464165565301

f(x) = 0.0713736263736264 x + 24.6175824175824R² = 0.924739084972478

Schimbarea conductivității reacției enzimatice dintre uree, tiouree și urează la temperatura 50 C ⁰

4 10-3

Linear ( 4 10-3)

7 10-3

10-2

Linear ( 10-2)

sec

mS

/m

-100.00 -50.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.000

2

4

6

8

10

12

14

f(x) = 0.0425419472924604 x + 1.56730756835918R² = 0.936829834676435

f(x) = 0.0272928598112734 x + 1.76685603151633R² = 0.940747525799767

Determinarea constanței Michaelis -Menten (Km) conform metodei Lineweaver-Burk

-1/Km

1/v

1/S mol/l

1/Vmax

Concluzii: