TOIINFECŢII PRODUSE DE SALMONELLA SPP.

• Salmon şi Smith, în anul 1885 izolează o bacterie de la porcii bolnavi de pestă denumită Bacillus cholerae suis, ulterior, în 1888, Gärtner descrie o t.i.a. prin consum de carne de vită care a îmbolnăvit 58 de persoane, microorganismul implicat fiind denumit B. enteritidis.

• În România primul caz de t.i.a. cu salmonele a fost descris în anul 1905, de către Babeş, t.i.a. fiind produsă prin consum de carne de miel.

• Habitat - Salmonelele sunt bacterii ubicvitare aflându-se în mediul înconjurător, de unde ajung în intestinul omului şi animalelor.

• Factorul uman ca sursă primară joacă un rol mai puţin important, rolul decisiv este reprezentat de activităţi incorecte, mai ales când este purtător: manipulare, preparare, depozitare, comercializare, etc.;

• Animalele bolnave şi/sau purtătoare sunt adesea implicate în transmiterea salmonelelor, în contaminarea materiilor prime, a alimentelor destinate consumului.

• Salmonele fac parte din genul Enterobacteriaceae sunt bacterii nepatogene, slab patogene sau patogene care au ca biotop intestinul animalelor şi a omului.

• Acesta reprezintă un biotop complex, cu multiple variaţii în funcţie de substratul nutritiv oferit, ceea ce determină o variaţie şi o selecţie continuă a enterobacteriilor care-l populează.

• Rezervoare şi căi de infecţie• purtătorul uman reprezintă unica sursă de

infecţie pt. Salm. Paratyphi A, B, şi C;• furajele contaminate, în special făinurile

furajere utilizate în hrana porcilor şi păsărilor;• oul – cel mai frecvent aliment contaminat cu

Salm., în special servar. enteritidis, utilizat în prepararea fără prelucrare termică a unor: maioneze, creme, torturi, îngheţate, etc.;

• carnea de pasăre, în special carnea de raţă, dar şi găină, gâscă, etc.;

• laptele şi produsele lactate – se realizează prin utilizarea materiei prime contaminate sau contaminare la procesare, contaminare ulterioară;

• carnea animalelor de măcelărie este mai rar incriminată, mai ales când nu corespund condiţiile de abataj;

• peştele, produsele din peşte, crustacee, moluştele sunt tot mai frecvent contaminate datorită extinderii numărului de crescătorii;

• vegetatele se contaminează prin intermediul apei de irigare, spălare, utilizate în stare crudă, iar indirect prin mâinile personalului;

• tehnologia de preparare a ciocolatei favorizează dezvoltarea salmonelelor, în aceste produse supravieţuind în timp îndelungat;

• alte produse pe bază de cacao, condimentele, diferite adaosuri, etc., pot fi contaminate;

• Factorii de virulenţă• Capacitatea agresiva a salmonelelor este

datorată a două mecanisme de patogenitate: virulenţă şi toxicitate;

S. PARATYPHI AA

S.OTHNMARSCHENC— 1

S. BISPEBJERGB

S. HAELSINGBORGC - 1

S.PARATYPHI BB

S. ORANIENBURGC— 1

S. JAVAB

S. THOMPSONC — 1

S. ABONYB

S. SINGAPOREC —1

S. ABORTUS BOVIS

B

S. CONCORD

C — 1

S. WIEN

B

S. IRUMU

C — 1

S. SCHLEISSHEIMB

S.BONNC — 1

S. san-diegoB

S. agunaB

S. essenB

S. californiaB

S. kingstonB

S. typhmurium ...0.-/

S. agama

S. brendeneyB

• Speciile de Salmonella şi entitătţle determinate• GAZDA SEROTIPURI DE SALMONELLA• Om• S. typhi; S. paratyphi; S. schatmuelleri• S. enteritidis; S. typhimurium; Febra tifoida• febra paratifoida, toxiinfecţii alimentare• Bovine• S. dublin; S. typhimurium; S.bovimorbificans şi

altele - excretori subclinici, purtători, enterita, septicemie, meningita la viţel, avort, osteomielita, artrita, gangrena uscata a extremităţilor la viţel, enterita şi septicemie;

• Porcine• S. cholerae suis; S. cholerae suis biotip

Kunzendorf S. typphisuis;• S. thyphimurium şi altele;• izbucniri clinice severe, similare cu cele din

pesta porcina; complicaţii secundare în pesta porcină.

• enterita cronica la porcii tineri; mai puţin virulenta decât S. Cholerae suis;

• enterită sau septicemie;

• Cabaline• S. abortus equi; S. typhimurium şi altele• avort la iapa;• enterita sau septicemie mai ales la mânji şi

la adulţii supuşi stresului• Ovine• S. abortus ovis; S. montevideo; S. dublin;• S. typhimurium; S. anatum şi altele• avort la oaie;• enterita sau septicemii;

• puluroza - transmisie transovariană;• tifoza păsărilor la toate vârstele, mai ales

adulte, transmisa prin oua, infecţii severe (enterite şi septicemii) la puii de găină şi curcan;

• Transmiterea prin ou – se întâlneşte şi la reptile;

• infecţie inaparentă, enterite şi septicemii;• poate fi transmisă prin ouă;• S. typhimurium produce adesea moartea

(septicemie) la puii de porumbel şi artrite ale aripilor;

Mecanisme de acţiune

• ataşarea – este un mecanism complex, proces de adeziune la nivelul receptorilor glicoproteici localizaţi pe microvilii sau glicocalixul enterocitelor;

• supravieţuirea şi multiplicarea în celulele gazdă prin declanşarea unui proces inflamator cu eliberare de mediatori vasodilatatori; eliberarea de endotoxină;

• existenţa plasmidelor de virulenţă - care stimulează bacteria purtătoare la o multiplicare mai rapidă în celula gazdă depăşind capacitatea acesteia de a se apăra.

• Toxigenitatea – Salm. elaborează 2 tipuri de toxine bacteriene: exo şi endotoxine

• Exotoxinele – proteine termolabile, cu greutatea moleculară de 90 şi 110KDa;

• Citotoxina - proteină termolabilă citotoxică, cu greutatea moleculară de 56-78 Kda, localizată în membrana citoplasmei bacteriene.

• Citotoxina inhibă sinteza proteică pt. celula gazdă determinând liza acesteia;

• Endotoxinele – eliberate după fagocitoză, î-şi exercită rolul toxic pa mai multe căi:

• declanşarea mecanismului coagulării intravasculare cu eliberare de mediatori vaso-paralitici;

• efecte citolitice de tipul TNF – Tumor Necrosis Factor de către macrofage şi celuleepiteliale;

• Efect pirogen prin factori eliberaşi de polimorfonucleare, ş.a.

• Simptomatologie – cea mai mare parte a serotipurilor de Salm. sunt antropozoonotice

• indiferent de gazdă, unele serotipuri sunt patogene numai pentru o anumită specie: ex. ser. Typhisuis – porcine, Abortus ovis – ovine, ser. Gallinarum – pasări;

• febrele enterice la om sunt produse de ser. Typhi, ser. Paratyphi A, B şi C nu sunt considerate t.i.a., deşi transmiterea se face pe cale alimentară sau hidrică.

• Salmonelele enterice sunt cele mai răspândite şi sunt cea mai frecventă formă de îmbolnăvire

• simptomatologia salm. enterice, necomplicate sunt preponderent digestive, însoţite de cortegiul de simptome adiacente: diaree profuză, deshidratare, slăbiciune, etc. şi constant apare febra;

• debutul bolii apare după o incubaţie de 8-72ore, cu alterarea stării generale, cefalee, ameţeli, anxietate, transpiraţii reci, frisoane, etc.;

• fenomenle digestive: greţuri, vărsături, dureri epigastrice, crampe abdominale şi diaree.

•

• Tabloul digestiv poate avea intensităţi variabile, de la scaune moi însoţite sau nu de vomă, la forme severe de diaree – până la diaree holeiformă (20-40 scaune pe zi) , însoţită de febră mare. Concomitent apar stari clinice alarmante: adinamie, reacţii meningeale, stări de agitaţie, confuzie, delir. Tahicardie, însoţită de puls slab, neregulat, microhemoragii capilare.

• Recent se admite existenţa a două forme majore: enterice şi septicemice.

• Forma septicemică - apare la bătrâni, copii, diabet, infecţii cronice, bolnavii neoplazici, ş.a., cu evoluţie gravă, generalizată – tulburări cardiovasculare, chiar sindrom de coagulare intravasculară diseminată.

• Localizările secundare – pulmonului, meningelui, hepatice, splenice, articulare, însoţesc formele generalizate sau sunt urmare a acestora.

•

Izolarea Salmonella spp.

• Pe plan mondial, cel mai des incriminat agent etiologic al toxiinfecţiilor alimentare (TIA) sunt salmonelele.

• TIA sunt considerate cea mai frecventă zoonoză, morbiditatea în cazul salmonelozelor este mult mai ridicată în Europa decât în America, deşi în ultimii ani s-a constatat o escaladare a numărului de îmbolnăviri pe ambele continente.

• În România, numai în 1997, au fost confirmate şi tipizate de către Centrul Naţional de Referinţă pentru Salmonella de la Institutul Cantacuzino din Bucureşti un număr de 1 475 de tulpini de Salmonella spp.

Incidenţa tulpinilor izolate de Salmonella spp la om este în relativă scădere, comparativ cu cele izolate de la mamifere şi păsări.Raportarea privind preponderenţa diverselor serotipuri izolate din carnea de pasăre sunt relativ diferite în funcţie de autori, de zona geografică, de exemplu: Spania, Albania sau de produsele studiate, contaminarea cărnii de pasăre fiind cel mai frecvent citată în literatura de specialitate. În România, sunt citate izolări frecvente din carnea de pasăre dezosată mecanic, din organele de pasăre sau carnea de pasăre, de pe carcasele de pasăre şi din alte tipuri de alimente de origine animală.

• Metode de izolare şi confirmare Salmonella spp. utilizate în laboratoarele veterinare de diagnostic din România:

• SR EN ISO 6579/2003 actualizată în 2006 şi 2007 - Metodă orizontală pentru detectarea (izolarea şi confirmarea) bacteriilor din genul Salmonella.

completată cu SR EN ISO 6579/2009; • SR-EN 12 824/2004 şi alte normative şi prevederi

din literatura de specialitate.

• DEFINIŢIE – conform SR-EN -ISO 6579/2006-2007 Microorganismele care formează colonii tipice sau

mai puţin tipice pe medii selective solide XLD şi RVS cu soia, (respectiv alte medii HK, IM, ş.a.) şi care posedă caracteristici biochimice şi serologice descrise conform prezentului standard, sunt considerate Salmonella spp.

SCOP – conform SR-EN -ISO 6579/2006-2007 Detectarea prezenţei sau absenţei germenilor din

genul Salmonella într-o cantitate determinată de produs (25g), atunci când analiza este efectuată conform prezentului Standard Internaţional.

Ziva Etapa Descriere

Prima zi Preincalzirea APT Se vor pregati la sfarsitul zilei de lucru suficiente baloane , fiecare continand 225 ml APT si se vor incuba la 37 ° C ± 1 °C.

Ziua a II-a Preimbogatirea In pungile de stomacher cu probele de analizat (25g came) adaugati cate 225 ml APT. Omogenizati proba in punga stomacher pentru aproximativ 1 minut.- pentru detectia Salmonella spp.- se incubeaza cei 250 ml timp de 18 h ± 2 h la 37 °C ± 1 °C.

Ziua a III — a Imbogatirea selective Pentru detectia Salmonella se iau :- 0.1 ml din APT si se introduc intr-o eprubeta continand 10 ml RVS; se incubeaza la 41.5 ± 1°C pentru 24 ± 3 h;- 1 ml din APT Si se introduce intr-o eprubeta continand 10 ml MKTTn; se incubeaza la 37 ± 1°C pentru 24 ± 3 h.

Ziua a IV — a Izolarea - Pentru detectia Salmonella - din RVS si MKTTn seinoculeaza agar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Si se incubeaza la 37 ± 1°C pentru 24 ± 3 h. Al doilea mediu estelasat la discretia laboratorului, dartrebuie sa se respecte custrictete instructiunilefabricantului in

ceea ceprivestepregatirea lui pentru folosire.

Ziua a V-a Confirmare biochimica a Salmonella spp.

Confirmarea prin teste biochimice a coloniilor suspecte de Salmonella spp.

Ziua a VI-a Confirmarea serologica a Salmonella spp.

Confirmarea serologica ( grup 0) a coloniilor suspecte de Salmonella spp. prin metoda aglutinarii pe lama conform SR EN ISO 6579/2003 AC/2009.

• Etapele de lucruEtapele de lucruI- Preîmbogăţirea (îmbogăţire neselectivă). • Din proba de analizat se prelevează 25 de grame

(din profunzime) care se însămânţează în unul din mediile de preîmbogăţire: bulion lactozat sau apă peptonată tamponată.

• Mediul de preîmbogăţire - apă peptonată tamponată (APT), este utilizată şi pentru efectuarea diluţiilor.

• APT se foloseşte în cantitate de 225ml la care se adaugă 25 g probă, respectând raportul probă/mediu de 1/10. Incubaţia se efectuează la 350 C sau la 370C -/+ 10C, timp de 16-20 ore.

II - Îmbogăţirea selectivă. II - Îmbogăţirea selectivă. • din mediul de preîmbogăţire se prelevează din mediul de preîmbogăţire se prelevează

0,1 ml de cultură (din mediul de 0,1 ml de cultură (din mediul de preîmbogăţire) care se introduce în 10 ml preîmbogăţire) care se introduce în 10 ml de bulion cu verde malahit şi clorură de de bulion cu verde malahit şi clorură de magneziu, denumit şi mediul Rappaport–magneziu, denumit şi mediul Rappaport–Vassiliadis cu soia (R-VS), iarVassiliadis cu soia (R-VS), iar

• 1 ml din cultură se introduc în 10 ml de 1 ml din cultură se introduc în 10 ml de mediu Muller Kauffman tetrationat –mediu Muller Kauffman tetrationat –novobiocină (MKTTn).novobiocină (MKTTn).

Incubaţia se efectuează astfel: • eprubeta cu Rappaport–Vassiliadis cu soia

(RVS) se incubează timp de 24 ore +/-3 ore la 41,50C;

• eprubeta cu Muller Kauffman tetrationat – novobiocină (MKTTn) se incubează la 370C +/- 10C, timp de 24 ore

+/-3 ore .

III - Izolare şi identificareIII - Izolare şi identificare• cu ansa bacteriologică încărcată cu cultura obţinută cu ansa bacteriologică încărcată cu cultura obţinută

din MKTTn şi RVS (medii de îmbogăţire selectivă) se din MKTTn şi RVS (medii de îmbogăţire selectivă) se striază pe suprafaţa uscată a unei în plăci Petri de striază pe suprafaţa uscată a unei în plăci Petri de dimensiuni 10 cm diametru, în care s-a turnat mediul dimensiuni 10 cm diametru, în care s-a turnat mediul OBLIGATORIU - xiloză-lizină-deoxicolat (XLD) şi o OBLIGATORIU - xiloză-lizină-deoxicolat (XLD) şi o altă placă cu un alt mediu selectiv LA ALEGERE: altă placă cu un alt mediu selectiv LA ALEGERE: agar Hektoen (HK), agar Mac-Conkey (McK), agar Hektoen (HK), agar Mac-Conkey (McK), Istrati-Meitert (IM), agar-dezoxicolat-citrat-lactoză Istrati-Meitert (IM), agar-dezoxicolat-citrat-lactoză (ADCL), Drigalsky (Dky), etc.(ADCL), Drigalsky (Dky), etc.

• din cultura obţinută în mediile selective se testează din cultura obţinută în mediile selective se testează biochimic, după modalitatea pe care o vom descrie la biochimic, după modalitatea pe care o vom descrie la confirmarea tulpinilor care formează colonii confirmarea tulpinilor care formează colonii caracteristice sau mai puţin caracteristice dar caracteristice sau mai puţin caracteristice dar suspecte de a fi suspecte de a fi SalmonellaSalmonella;;

• Citirea caracteristicilor coloniilor de Citirea caracteristicilor coloniilor de SalmonellaSalmonella pe pe mediile menţionate prezintă următoarele aspecte:mediile menţionate prezintă următoarele aspecte:

Mediul obligatoriu este mediul XLD, conform acestui standard;

• Coloniile de Salmonella sunt pe mediul XLD (xiloză, lizină, lactoza, dezoxicolat) (bioMerieux), de culoare roşie, deoarece acestea nu utilizează lactoza.

• Tulpinile de E. coli, Citrobacter, Enterobacter, etc., care folosesc atât lactoza cât şi xiloza, determină apariţia coloniilor de culoare galbenă în prezenţa indicatorului roşu fenol, deoarece pH-ul devine acid.

• Acest mediu este recomandat în special pentru diferenţierea coloniilor de Salmonella de cele de Shigella, deoarece permite producerea de H2S, aceste colonii având centrul negru.

• Colonii transparente (roşii) de Salmonella spp. H2S pozitive, pe mediul XLD

• Mediul Hektoen (bioMerieux), este inhibitor al speciilor de E. coli,

• Citrbacter şi Proteus, însă nu inhibă dezvoltarea vibrionului choleric. Salmonella H2S (+) produce colonii de culoare verde cu centrul negru, iar Salm. H2S (-) prezintă colonii de culoare verde cu centrul albastru.

• Coloniile de culoare roz pot fi de Salm. Arizonae, dar se pot dezvolta slab şi colonii de E. coli, Enterbacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, chiar cu acelaşi aspect.

• Coloniile roz cu centru negru sunt produse de Proteus vulgaris.

• Acest tip de colonii este întâlnit şi în cazul dezvoltării speciilor de Shigella, M. morgani, P. rettgeri, Providencia, Pseudomonas, iar Vibrio cholerae produce colonii roz.

• Interpretare:• Pentru diferenţierea coloniilor de Salmonella de Shigella

urmărim:• colonii de culoare verde cu centrul negru sunt considerate

colonii suspecte, posibil de P. mirabilis sau de Salmonella,• colonii verzi sau albastre sunt considerate suspecte şi pot fi

de Shigella, tulpini H2S- de Salmonella, M. Morganii, Providencia rettgeri sau Pseudomonas,

• colonii roz, galbene, cu sau fără centru negru nu sunt suspecte şi pot fi colonii de: E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, P. vulgaris, etc.,

• Limitele mediului constau în faptul că speciile Salm. Arizonae şi Sh. Sonnei nu sunt suspecte în aparenţă.

Formerea coloniilor H2S-pozitive, pe mediul Hektoen, la 24 şi 48 ore (3x10)

Alte medii recomandate pt. Salmonella spp.;• Mediul cu roşu fenol şi verde briliant, BGA sau Edel şi

Kampelmacher (Oxoid); • Pe mediul Edel-Kampelmacher coloniile prezumtive de

salmonele sunt:• de dimensiuni mici, 1-2mm, roşii, rotunde, cu suprafaţa

bombată, umedă;• mediul din jurul coloniei prezintă coloraţie roşu-aprins sau

roz-roşu;• este un mediu utilizat pentru selectarea şi izolarea

Salmonella spp. din produse alimentare, în special bacteriile care se găsesc în număr mic.

• Principiu – • mediul cu roşu fenol şi verde briliant are următoarele

proprietăţi:• verdele briliant inhibă bacteriile Gram –pozitive şi

unele bacterii Gram-negative,• comparativ cu mediul Cristensen, acesta este îmbogăţit

cu factori nutritivi, inhibitori şi reducători,• mediul conţine carbohidraţi, sucroză şi lactoză, care

prin fermentare schimbă pH-ul mediului,• în prezenţa roşului fenol ca pH indicator vor apărea

colonii galbene în cazul bacteriilor care folosesc aceste zaharuri,

• Salmonella produce colonii de culoare roz.

• Interpretare• Mediul cu roşu fenol şi verde briliant prezintă următoarea

citire:• Colonii roz sau roşii, lactoză/sucroză negative, sunt colonii

suspecte de Salmonella,• colonii roz, proliferate, rugoase sunt tulpini de Proteus,• colonii mici roz, sunt reprezentate de Pseudomonas,• colonii galbene, galben-verzui, înconjurate de o zonă galbenă,

sunt colonii de Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter , deci tulpini lactoză şi sucroză pozitive,

• bacteriile Gram-pozitive sunt inhibate pe acest mediu.

•Mediul Istrati-Meitert – produce colonii de culoare verde-albastrăpentru Salmonella spp., cu centrul negru în cazul coloniilor H2S (+), cu diametrul de 2mm, semitransparente, lucioase, luminoase, uneori prezintă centrul mai întunecat sau chiar negru (in cazul salmonelelor care produc H2S), iar mediul din jurul coloniei virează în albastru.

Salmonella spp., pe mediul SS

Salmonlla spp. produce colonii negre pe mediul Wilson Blair

 

•Salmonella produce colonii roşii, iar bacteriile coliforme colonii albastre – pe mediul RAMBACH

• Salmonella spp., pe mediul Őnőz•  

IV - Confirmarea Salmonella spp.:IV - Confirmarea Salmonella spp.:• Efectuarea testelor biochimice;Efectuarea testelor biochimice;• Efectuarea reacţiilor serologice;• Testarea AND-ului prin testul PCR.Efectuarea testelor biochimice;Efectuarea testelor biochimice;•  Mediul TSI – glucoză, lactoză, zaharoză• Interpretarea reacţiilor biochimice se face prin

vizualizarea culorii pe coloana şi panta mediului TSI:• coloana galbenă a mediului denotă fermentarea glucozei

(reacţie pozitivă);• coloana roşie sau neschimbată indică neutilizarea

glucozei (reacţie negativă);• apariţia coloraţiei negre, denotă producerea de hidrogen

sulfurat;

• producerea de gaz din glucoză se vizualizează prin apariţia bulelor de gaz în mediu sau chiar prin ruperea mediului.

• panta mediului de culoare galbenă denotă fermentarea lactozei şi/sau zaharozei (lactoză şi/sau zaharoză pozitivă), iar

• culoarea roşie sau neschimbată indică neutilizarea lactozei şi/sau zaharozei (lactoză şi/sau zaharoză negativă);

Salmonella nu produce indol, reacţia este negativă pe banda de hârtie impregnată cu para-dimetilamino-benzaldehidă. Cu excepţia serotipurilor Gallinarum şi Pullorum toate clelelalte serotipuri sunt mobile.

• Mediul MILF – mobilitate, indol, lizină, fenilalanină• apariţia unei coloraţii violete după incubare indică o

reacţie pozitivă, deci producerea lizindecarboxilazei, salmonelele fiind de regulă lizindecarboxilază pozitive;

• verificarea producerii de feninalanindecarboxilază se verifică prin adăugarea clorurii ferice la suprafaţa mediului, salmonelele fiind feninalanindecarboxilază negative nu se produce virarea culorii în verde (reacţie negativă);

• mobilitatea tulpinilor însămânţate determină modificarea turbidităţii mediului, indiferent de modificările de culşoare care pot apărea;

Mediul citrat Simmons - bacteriile din genul Salmonella utilizeză citratul de sodiu - reacţie pozitivă, apariţia coloraţiei albastre a mediului, deci virarea din verde în albastru, după incubare;- reacţie negativă nu se modifică culoarea iniţială a mediului.

• Mediul MIU şi Christensen –• este utilizat pentru verificarea utilizării ureeii prin

hidroliză• germenii din grupul Salmonella nu folosesc urea-

reacţie negativă, • coloraţia mediului (maronie pentru MIU şi galben

deschis la mediul Cristensen) nu este modificată;• reacţia pozitivă – se produce o îngălbenire a mediului.

Utilizarea ureii de Salmonella spp. – pe mediul MIU

Utilizarea citratului de Salomnella spp.– pe mediul Citrat Simmons

DECARBOXILAREA ORNITINEI - pe mediul MIO

Teste biochimice pentru identificare şi confirmare