Universitatea de Medicina si Farmacie din Craiova

Facultatea de Medicina

TEZA DE DOCTORAT

Rezumat

Evaluarea inflamatiei tesutului adipos si hepatic la pacientii cu boala hepatica alcoolica: rolul patogenic al alcoolului

Conducator stiintific: Prof. Univ. Dr. Paulina Ciur ea

Doctorand: Cosmin Sebastian Voican

Anul 2011

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor

Umane 2007-2013

Axa Prioritar ă: 1. Educaţia şi formarea profesională în

sprijinul cre şterii economice şi dezvoltării societăţii

Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe doctorale

şi postdoctorale în sprijinul cercetării

Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu

frecvenţă prin acordarea de burse doctorale"

Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8

Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie

din Craiova

Cuprinsul rezumatului Introducere ............................................................................. 2

A. Partea Generala .................................................................. 4

B. Contributii proprii ............................................................... 5

I. Studiul genelor de normalizare in boala hepatica

alcoolica .............................................................................. 5

II. Evaluarea inflamatiei din tesutul adipos si hepatic la

pacientii cu boala hepatica alcoolica ................................ 10

III. Concluzii finale ............................................................. 23

IV. Perspective .................................................................. 24

Bibliografie ............................................................................ 25

Lucrari in tematica tezei de doctorat.................................... 27

2

Introducere Consumul excesiv de alcool este al treilea factor major de risc de boala si invaliditate la nivel global, fiind responsabil de aproximativ 2,5 milioane de decese anual (4% din totalul deceselor) (Raport al Organizatiei Mondiale a Sanatatii din 2011). Etilismul cronic este factor cauzal pentru o gama larga de afectiuni, cum ar fi boala hepatica alcoolica (BHA), boli cardiovasculare sau cancer. Ficatul, ca sediu principal de metabolizare a etanolului, poate fi grav afectat in caz de abuz, rezultând BHA (principala cauza de afectiune hepatica cronica in tarile industrializate). Caracteristicile histologice ale BHA includ un spectru larg de leziuni hepatice, mergand de la simpla steatoza (acumulare de lipide in hepatocite), la inflamatie (hepatita alcoolica), necroza hepatocitara si fibroza/ciroza. Din punct de vedere clinico-patologic, BHA poate fi impartita in 3 etape care insa in general se suprapun: ficatul gras alcoolic (steatoza), reversibil si benign in forma sa pura; hepatita alcoolica (infiltrat inflamator, predominant neutrofilic), ce poate duce la insuficienta hepatica acuta in forma sa severa; ciroza hepatica, stadiul final de evolutie. Intensitatea consumului de alcool este un factor determinant in patogeneza BHA, riscul crescand proportional cu aportul zilnic de etanol. Cu toate acestea, doar un procent relativ mic dintre marii consumatori de alcool vor dezvolta ciroza hepatica (Teli et al., 1995). Prin urmare, pe langa consumul zinic de etanol, si alti factori de risc par de asemenea sa joace un rol important in BHA. : excesul ponderal (Naveau et al., 1997), factori genetici, hepatitele virale, sexul.

3

Este binecunoscut ca obezitatea creste riscul de steatohepatita non-alcoolica, iar alterarea secretiei de citokine/adipokine la nivelul tesutului adipos pare sa joace un rol major in producerea leziunilor hepatice asociate cu excesul ponderal (Perlemuter et al., 2007). Similar, excesul ponderal timp de cel putin 10 ani este un factor de risc independent pentru steatoza, hepatita si ciroza la pacientii alcoolici (Naveau et al., 1997). Mai mult, indicele de masa ponderala este de asemenea un factor de risc independent pentru fibroza hepatica la alcoolicii non-obezi. Mecanismele care mediaza efectul nociv al tesutului adipos in BHA nu sunt bine intelese. In prezent este unanim acceptat ca tesutul adipos nu reprezinta doar un loc de depozitare a energiei, ci si un adevarat organ endocrin si imunitar capabil sa secrete o gama larga de citokine pro- si anti-inflamatorii, in general numite adipokine. Aparitia unui dezechilibru in secretia de adipokine poate avea efecte nocive asupra diferitelor organe, printre care si ficatul. S-a demonstrat anterior prezenta unei productii crescute de citokine pro-inflamatorii la nivelul tesutului adipos epididimar la sobolanii hraniti cu o dieta continand etanol (Lin et al., 1998). Un studiu recent publicat de echipa de cercetare care m-a indrumat demonstreaza prezenta unui proces inflamator nu numai la nivel hepatic, dar si la nivelul tesutului adipos subcutanat, la pacientii alcoolici non-obezi (Naveau et al., 2010). Aceste date sugereaza ca procesul inflamator din tesutul adipos poate fi implicat in patogeneza leziunilor hepatice induse de alcool la om. Cu toate acestea, rolul direct al alcoolului in aparitia inflamatiei in tesutul adipos nu a fost demonstrat pana acum la om. Mai mult, factorii care moduleaza acest

4

proces inflamator precum si semnificatia lui in contextul BHA nu sunt bine cunoscute. Cuvinte cheie: boala hepatica alcoolica, tesut adipos, citokine, adipokine, inflamatie

A. Partea Generala Primul capitol al partii generale intitulat „Mecanisme imunologice implicate in patogeneza leziunilor hepatice induse de alcool”, descrie modul in care alcoolul declanseaza procesul inflamator hepatic. Se considera ca celulele Kupffer detin rolul central in initierea procesului inflamator hepatic indus de consumul excesiv de etanol. Prin urmare, factorii de activare ai celulelor Kupffer sunt prezentati detaliat: endotoxemia, speciile reactive de oxigen, fierul, acetilarea histonelor (Voican et al., 2011). Celulele Kupffer activate vor elibera citokine si chemokine, atragand si activand neutrofilele si limfocitele circulante al caror rol in BHA este de asemenea discutat. Al doilea capitol al partii generale intitulat „Tesutul adipos si boala hepatica alcoolica”, descrie mecanismele implicate in generarea procesului inflamator de la nivelul tesutului adipos si posibila sa implicare in patogeneza leziunilor hepatice induse de alcool, facand o paralela cu obezitatea. Al treilea capitol al partii generale intitulat „Optiuni terapeutice specifice in boala hepatica

5

alcoolica”, prezinta principalele terapii disponibile in BHA, axandu-se in primul rand pe tratamentul hepatitei alcoolice acute.

B. Contributii proprii

I. Studiul genelor de normalizare in boala hepatica alcoolica

Tehnica de reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) este metoda cea mai frecvent utilizată pentru cuantificarea expresiei genice in diverse probe biologice. Semnalului PCR al unui ARN mesager (ARNm) necesita normalizarea pentru a obtine rezultate fiabile. Normalizarea utilizand o referinta endogena este esentiala pentru corectarea variatiilor de amplificare legate de cantitatea de ARNm si variatia conditiilor experimentale. In general, normalizarea implica cuantificarea exacta a ARNm total inainte de reactie sau folosirea unei gene de normalizare. O gena de normalizare ideala trebuie sa fie exprimata in toate celulele nucleate si sa aiba o expresie stabila indiferent de tipul de tesut, de afectiunea si de gravitatea afectiunii respective. Cu toate acestea, numeroase studii au aratat ca multe dintre genele de normalizare pot varia in functie de conditiile experimentale. Pana in prezent nu exista studii care sa examineze variabilitatea genelor de normalizare in BHA. Expresia genelor de normalizare poate varia in functie de

6

gravitatea leziunilor hepatice alcoolice: steatoza, inflamatie si fibroza. Din aceste motive mi-am propus sa studiez variabilitatea a 4 gene de normalizare curent utilizate (18S, β-actina, GAPDH si SFRS4) in functie de gradul leziunilor hepatice la un lot de pacienti alcoolici. Datele acestui prim studiu vor fi utile pentru o normalizare corecta a rezultatelor obtinute in cel de-al doilea lot de pacienti cu BHA. Pacienti si metode In acest prim studiu au fost inclusi 50 de pacienti internati pentru alcoolism si BHA in serviciul de Hepatogastroenterologie al Spitalului Universitar Antoine Béclère, Clamart, Franta. Pacientii au fost eligibili pentru a fi inclusi in studiu daca: au consumat cel putin 50 g alcool pur pe zi in ultimul an, nu au renuntat la alcool anterior internarii, nu au prezentat infectie cu virus B sau C, si-au dat consimtamantul si nu au prezentat contraindicatii pentru punctia biopsie hepatica. Criteriile de excludere au fost dupa cum urmeaza: sangerari gastro-intestinale, infectii bacteriene, carcinom hepatocelular sau alt neoplasm malign, pancreatita acuta, afectiuni severe asociate, infectie HIV, dislipidemie, diabet zaharat. Consumul de alcool a fost apreciat folosind un chestionar specific (Naveau et al., 2000). Pacientii au fost informati asupra studiului si a fost obtinut acordul lor pentru participarea in studiu. Punctia biopsie hepatica s-a efectuat in prima saptamana de la internare pentru intreg lotul de pacienti. Un fragment de tesut hepatic a fost utilizat pentru examenul anatomo-patologic, iar restul de tesut a fost

7

congelat la -80 °C pentru studiul expresiei genice. Examenul histologic a fost efectuat de un anatomo-patolog ce nu era informat asupra datelor clinice si paraclinice ale pacientilor. Leziunile hepatice (steatoza, inflamatia si fibroza) au fost evaluate semi-cantitativ. Izolarea ARN-ului total. ARN-ul total a fost extras din probele de tesut hepatic utilizand kitul de extractie RNeasy Lipid Tissue kits (Qiagen, Hilden, Germany), conform recomandarilor furnizorului. Concentratia si puritatea ARN-ului au fost determinate spectrofotometric (Eppendorf Biophotometer). Amplificarea ARN-ului total. Datorita dimensiunilor reduse ale fragmentului de biopsie hepatica, s-a izolat o cantitate mica de ARN total. Pentru a obtine o cantitate mai mare de ARN, am amplificat 1 µg de ARN total din fiecare proba utilizand kitul Message Amp II aRNA kit (Ambion, Austin, TX, USA). ARN-ul antisens rezultat a fost utilizat pentru studiul expresiei genice. RT-qPCR. In prima etapa s-a efectuat reverse transcriptia a 5 µg de ARN antisens in ADN complementar. In a doua etapa, s-a efectuat RT-qPCR utilizand LC FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) si primeri specifici pentru genele de interes: 18S, β-actina, GAPDH si SFRS4. Amplificarea genelor de interes s-a efectuat intr-un volum de reactie de 20 µl, in duplicat, folosind aparatul LightCycler 480 (Roche). Nivelul de expresie al genelor de interes este exprimat per microgram de ARN. Interpretare statistica. Pentru a compara dispersia valorilor obtinute pentru fiecare gena de normalizare studiata, am calculat valoarea absoluta a

8

deviatiei fata de medie pentru fiecare pacient in parte si mediile au fost comparate intre cele 4 gene de normalizare. Am utilizat testul Mann-Whitney pentru a analiza diferentele dintre doua grupuri si testul Kruskal-Wallis Z pentru a compara mai mult de doua grupuri. Valoarea p a fost ajustata folosind metoda Benjamini si Yekutieli pentru comparatii multiple. Analiza statistica s-a efectuat folosind Number Cruncher Statistical System 2007 software (NCSS, Kaysville UT) si R-2.12.1 software. Rezultate si discutii In acest studiu am inclus 41 de barbati si 9 femei. Durata medie de la internare pana la efectuarea biopsiei hepatice a fost de 5.6 ± 0.5 zile. Hepatita alcoolica a fost prezenta la 24 dintre pacienti, iar ciroza hepatica la 17 dintre pacienti, in timp ce 44 dintre pacienti au prezentat steatoza moderata (pana la 32% dintre hepatocite incarcate lipidic). Genele de normalizare cu expresia cea mai stabila in grupul nostru de pacienti cu BHA au fost 18S si SFRS4. Cel mai redus coeficient de dispresie a fost observat in cazul genei 18S (1,4), iar cel mai mare in cazul genei β-actina (23.9). Rezultatele au fost similare in cazul excluderii din analiza statistica a celor 9 femei. Mai intai am studiat variatia expresiei genelor de normalizare in functie de prezenta sau absenta steatozei hepatice. Am observat ca expresia genelor GAPDH si β-actina a fost semnificativ diferita in functie de steatoza hepatica. Expresia 18S si SFRS4 nu a variat semnificativ in functie de prezenta sau absenta steatozei hepatice. In

9

continuare am vrut sa studiez influenta hepatitei alcoolice asupra expresiei genelor de normalizare. Expresia genelor 18S si SFRS4 s-a dovedit in continuare stabila indiferent de prezenta sau absenta hepatitei alcoolice, in timp ce GAPDH si β-actina au variat semnificativ. Am studiat apoi stabilitatea genelor de normalizare in functie de gradul de steatoza. β-actina, 18S si SFRS4 nu au variat semnificativ in functie de scorul de fibroza hepatica. Intrucat aproape toti pacientii cu hepatita alcoolica prezinta un anumit grad de fibroza hepatica, am examinat variatia genelor de normalizare in functie de prezenta separata sau concomitenta a cirozei hepatice si hepatitei etanolice. 18S si SFRS4 s-au dovedit in continuare stabile. Am demonstrat aici ca expresia genelor de normalizare 18S si intr-o mai mica masura SFRS4 a fost stabila, indiferent de tipul si gravitatea leziunilor hepatice, la pacientii cu BHA. Cu toate acestea SFRS4 a prezentat o variatie mai mare decat 18S in probele noastre, sugerand ca este mai corect ca pentru normalizarea expresiei genice in BHA sa se foloseasca gena 18S. Din contra, GAPDH si β-actina au variat semnificativ in functie de leziunile hepatice, utilizarea lor ca gene de normalizare la pacientii cu BHA putand duce la valori eronate ale expresiei genice. Concluzii 1. Desi lotul meu este destul de mic, am demonstrat ca expresia hepatica a genelor 18S si SFRS4 la pacientii cu BHA nu este influentata de prezenta steatozei, hepatitei alcoolice, fibrozei semnificative si cirozei.

10

2. Atat 18S cat si SFRS4 ar putea fi utilizate ca gene de normalizare pentru rezultatele RT-qPCR in probele de punctie biopsie hepatica la pacientii alcoolici. Cu toate acestea gena 18S a fost cea care a prezentat cea mai redusa variabilitate. 3. Tinand cont de ansamblul rezultatelor mele recomand folosirea genei 18S pentru normalizare in studiile ce evalueaza expresia genica in tesutul hepatic al pacientilor cu BHA.

II. Evaluarea inflamatiei din tesutul adipos si hepatic la pacientii cu boala hepatica alcoolica

Severitatea leziunilor hepatice prezinta o variabilitate importanta in randul marilor consumatori de alcool si numai un procent destul de redus dintre acestia evolueaza catre afectare hepatica avansata (hepatita alcoolica, ciroza). Din aceste motive se considera ca o serie de alti factori, pe langa consumul zilnic de alcool, contribuie la patogeneza leziunilor hepatice. In acest context, cercetarile mele au fost centrate pe studiul tesutului adipos ca si factor de risc in BHA. Cu aproximativ 14 ani in urma, cercetatorii laboratorului in care mi-am efectuat experimentele au demonstrat ca excesul ponderal este un factor de risc independent pentru steatoza, hepatita alcoolica si fibroza hepatica la pacientii alcoolici (Naveau et al., 1997). Un alt studiu efectuat in cadrul aceluiasi laborator a aratat ca indicele de masa corporala este de asemenea un factor de risc independent pentru fibroza hepatica la alcoolici non-obezi (Raynard et al., 2002). Un studiu foarte recent

11

publicat de echipa demonstreaza ca tesutul adipos subcutanat prezinta un nivel ridicat al inflamatiei la pacientii cu BHA (Naveau et al., 2010). Acest proces inflamator de la nivelul tesutului adipos ar putea fi responsabil pentru asocierea patogenica dintre tesutul adipos si BHA. Totusi, acest aspect este departe de a fi elucidat. Ipoteze si obiective Am plecat de la ipoteza ca un consum cronic de etanol poate altera echilibrul dintre factorii pro- si anti-inflamatori la nivelul tesutului adipos. S-a demonstrat deja ca productia TNFα si leptinei este crescuta in tesutul adipos atat la pacientii alcoolici cat si in cazul modelelor animale de BHA, putand contribui la aparitia leziunilor hepatice induse de alcool. Ne putem imagina un model in care consumul excesiv de alcool activeaza expresia factorilor pro-inflamatori la nivelul celulelor adipoase si non-adipoase (cum ar fi macrofagele) din tesutul adipos, contribuind la patogeneza BHA. Cu toate acestea, rolul cauzal al alcoolului in declansarea procesului inflamator din tesutul adipos uman nu este inca demonstrat. Principalul obiectiv al studiului meu este de a demonstra implicarea alcoolului in patogeneza inflamatiei din tesutul adipos la pacientii cu diferite stadii de BHA. In acest sens am evaluat expresia adipokinelor si a receptorilor lor, a cytokinelor pro- si anti-inflamatorii, precum si a markerilor celulelor imune, in tesutul adipos subcutanat si in serul pacientilor cu diferite stadii de BHA, inainte si la 7 zile de la

12

intreruperea consumului de etanol. Astfel, fiecare pacient devine propriul sau control. In al doilea rand mi-am propus sa identific noi actori ai procesului inflamator din tesutul adipos si hepatic indus de consumul excesiv de alcool la om. In acest scop, am analizat expresia acelorasi citokine, adipokine si markeri celulari la nivel hepatic si adipos in functie de gravitatea leziunilor histologice hepatice. Aceasta abordare ar putea deschide noi perspective terapeutice in BHA. Pacienti si metode In acest studiu au fost inclusi 47 de pacienti cu diferite stadii de BHA internati in serviciul de Hepatogastroenterologie al Spitalului Universitar Antoine Béclère, Clamart, Franta. Pacientii au fost eligibili pentru a fi inclusi in studiu daca: au consumat cel putin 50 g alcool pur pe zi in ultimul an, nu au renuntat la alcool anterior internarii, nu au prezentat infectie cu virus B sau C, si-au dat consimtamantul si nu au prezentat contraindicatii pentru biopsie hepatica si biopsia de tesut adipos subcutanat. Criteriile de excludere au fost dupa cum urmeaza: sangerari gastro-intestinale, infectii bacteriene, carcinom hepatocelular sau alt neoplasm malign, pancreatita acuta, afectiuni severe asociate, infectie HIV, dislipidemie (cu exceptia hipertrigliceridemiei asociate consumului excesiv de alcool), diabet zaharat. Consumul de alcool a fost apreciat folosind un chestionar specific (Naveau et al., 2000). Pacientii au fost informati asupra studiului si si-au data acordul pentru participare.

13

La internarea in spital s-a efectuat o punctie biopsie hepatica si o biopsie de tesut adipos subcutanat abdominal. Pacientii au urmat protocolul obisnuit de preventie a sevrajului alcoolic. Ulterior, dupa 7 zile de la intreruperea consumului de etanol, s-a efectuat o a doua biopsie de tesut adipos subcutanat abdominal. Un fragment de tesut hepatic a fost utilizat pentru examenul anatomo-patologic, iar restul de tesut a fost congelat la -80 °C pentru studiul expresiei genice. Examenul histologic a fost efectuat de un anatomo-patolog ce nu era informat asupra datelor clinice si paraclinice ale pacientilor. Leziunile hepatice (steatoza, inflamatia si fibroza) au fost evaluate semi-cantitativ. Fragmentele de tesut adipos au fost congelate la -80 °C pentru studiul expresiei genice. Un volum de 10 ml de ser a fost de asemenea recoltat de la fiecare pacient la internare si dupa 7 zile de sevraj, si pastrat la -80 °C pentru determinarea nivelului seric al citokinelor. Analiza expresiei genice. ARN-ul total a fost izolat si purificat din probele de tesut utilizand kitul RNeasy Lipid Tissue kits (Qiagen, Hilden, Germany). Concentratia si puritatea ARN-ului au fost determinate spectrofotometric (Eppendorf Biophotometer). Calitatea ARN-ului a fost evaluata utilizand instrumentul Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) si kitul RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent Technologies). In continuare am obtinut ADN-ul complementar prin revers transcriptia a 0,35 µg de ARN total, utilizand kitul RT2 First Strand kit (SABiosciences). Expresia citokinelor, adipokinelor si markerilor celulari (tabel 1) a fost determinata simultan prin tehnica RT2 Profiler PCR arrays (CAPH09709, SABiosciences) utilizand primeri

14

specifici pentru fiecare gena in parte si gena 18S (control intern) pentru normalizarea rezultatelor. Nivelul relativ al expresiei genice (raportat la expresia genei 18S) a fost calculat pentru fiecare gena in parte. Tabel 1. Grupul de gene a caror expresie a fost determinata prin RT2 Profiler PCR arrays.

Citokinele pro-

inflamatorii (Th1/M1)

Citokinele anti-

inflamatorii (Th2/M2)

Adipokine/ receptori

Macrofagele totale

Macrofagele M2

IL18, IL8, CXCL12, SEMA7A,

CCL2, CCL5, OPN, IL1β, IFNγ, IL6,

TNFα

IL10, IL1RA, TGFβ1

Leptina, LepR,

Adiponectina, AdipoR1, AdipoR2, Apelina

CD68, CD14 CCL18, MRC1

Analiza nivelului seric al adipokinelor. Concentratia serica a adipokinelor a fost determinata inainte si dupa intreruperea consumului de etanol prin tehnica Luminex (Millipore). Interpretare statistica. Diferentele expresiei genice intre subgrupurile de pacienti au fost analizate utilizand testul non-parametric Mann-Whitney. Pentru analiza diferentei de expresie genica inainte si dupa 7 zile de sevraj a fost utilizat testul Wilcoxon pentru probe pereche. Corelatia dintre diferitii parametri a fost analizata utilizand testul Spearman. O valoare a p < 0,05 este considerata semnificativa statistic.

15

Rezultate si discutii Am inclus in studiu 38 de barbati si 9 femei cu diferite stadii de BHA. Nici un pacient nu a prezentat valori ridicate ale glicemiei sau hemoglobinei glicozilate (HbA1c), indicand absenta insulino-rezistentei. Majoritatea pacientilor nu au prezentat BHA avansata. Am analizat efectul intreruperii consumului de etanol asupra expresiei citokinelor pro- si anti-inflamatorii la nivelul tesutului adipos subcutanat. Am observat o reducere a nivelului expresiei citokinelor pro-inflamatorii IL-18, osteopontinei si semaforinei 7A la nivelul tesutului adipos dupa intreruperea consumului de etanol, dar fara semnificatie statistica. In continuare am analizat expresia markerilor macrofagici. Expresia markerilor macrofagelor totale, CD68 si CD14, nu a prezentat modificari semnificative, dar am observat o supraexpresie a CCL18 (marker al macrofagelor cu fenotip anti-inflamator (M2)) in tesutul adipos ca urmare a intreruperii consumului de alcool (Fig. 1). Aceste observatii sugereaza ca macrofagele de la nivelul tesutului adipos vireaza catre un fenotip anti-inflamator ca urmare a renuntarii la consumul de alcool, un prim pas catre rezolutia procesului inflamator de la acest nivel. Este posibil ca o saptamana de abstinenta la alcool sa nu fie suficienta pentru o reducere semnificativa a productiei de citokine pro-inflamatorii la nivelul tesutului adipos. Am analizat apoi evolutia genelor de interes in tesutul adipos in timpul abstinentei la alcool in doua subgrupuri de pacienti: pacienti fara BHA severa si pacienti cu BHA severa. Evolutia este semnificativ diferita intre cele doua subgrupuri de pacienti. Astfel, la

16

pacientii fara BHA severa am observat o reducere semnificativa a productiei de citokine pro-inflamatorii si un viraj al macrofagelor din tesutul adipos catre un fenotip M2 anti-inflamator dupa cele 7 zile de abstinenta la alcool (Fig. 2A). In subgrupul cu BHA severa am observat o supraexpresie a citokinelor pro-inflamatorii in tesutul adipos in ciuda virajului macrofagelor catre fenotipul anti-inflamator, sugerand probabil prezenta unui proces inflamator mai intens la acesti pacienti (Fig. 2B).

Figura 1. Evolutia markerilor macrofagici in tesutul adipos dupa intreruperea consumului de alcool.

17

Figura 2. Efectul abstinentei la alcool asupra inflamatiei din tesutul adipos in functie de prezenta sau absenta BHA severe. Coloane gri - pacientii fara BHA severa; Coloane negre- pacienti cu BHA Expresia genei leptinei, adiponectinei si receptorilor adiponectinei a scazut semnificativ dupa 7 zile de la intreruperea consumului de alcool (Fig. 3). Concentratia serica a adiponectinei si leptinei scade dupa abstinenta la alcool in concordanta cu nivelul expresiei in tesutul adipos, dar semnificatia statistica este atinsa doar in cazul adiponectinei (Fig. 4).

Figura 3. Efectul abstinentei la alcool asupra

expresiei adipokinelor in tesutul adipos.

18

Figura 4. Evolutia concentratiei serice a adiponectinei dupa renuntarea la consumul de alcool. Leptina este o adipokina cu proprietati pro-inflamatorii si pro-fibrozante hepatice. Rezultatele mele indica faptul ca aportul excesiv de alcool creste expresia leptinei la om. In consecinta nivelurile crescute de leptina pot contribui la intretinerea procesului inflamator de la nivelul tesutului adipos si hepatic. Leptina ar putea fi cel putin partial responsabila de asocierea patogenica dintre tesutul adipos si BHA la om. Adiponectina este o adipokina cu proprietati anti-inflamatorii si anti-fibrozante hepatice. Citokinele pro-inflamatorii inhiba productia de adiponectina. Existenta unei expresii crescute a adiponectinei in tesutul adipos la pacientul alcoolic in prezenta inflamatiei, sugereaza ca este vorba de un proces de contrareglare incercand sa limiteze procesul inflamator. Mi-am propus in continuare sa identific noi factori implicati in modularea inflamatiei din tesutul

19

hepatic si adipos la pacientii alcoolici. Am observat ca productia hepatica de osteopontina, citokina cu rol chemotactic si pro-inflamator, creste progresiv odata cu cresterea gradului de fibroza hepatica (Fig. 5).

Figura 5. Expresia osteopontinei in ficat in functie de gradul de fibroza. #, p=0.013, comparativ cu F0; $, p<0.01, comparativ cu F0; &, p<0.001, comparativ cu F0; §, p<0.001, comparativ cu F1; £, p<0.05, comparativ cu F2. O crestere progresiva a expresiei osteopontinei odata cu gradul fibrozei hepatice s-a observat si in cazul tesutului adipos subcutanat. Osteopontina serica si hepatica s-a corelat pozitiv cu scorul de fibroza si inflamatie hepatica, precum si cu expresia hepatica a markerilor de fibroza (TGFβ1, αSMA). Expresia osteopontinei la nivelul tesutului adipos s-a corelat de asemenea cu scorul fibrozei hepatice. Rezultatele mele sugereaza ca osteopontina poate fi un actor important in patogeneza fibrozei hepatice si a procesului inflamator hepatic in BHA. Mai mult, osteopontina pare sa detina un rol si in inflamatia

20

indusa de consumul cronic de alcool in tesutul adipos. Blocarea efectului osteopontinei ar putea fi o abordare terapeutica utila mai ales in hepatita alcoolica, dar care necesita studii suplimentare.

Figura 6. Expresia osteopontinei in tesutul adipos subcutanat in functie de gradul de fibroza. #, p<0.01, comparativ cu F0; $, p<0.05, comparativ cu F0. CXCL12 (CXC-motif chemokine ligand 12) este o citokina pro-inflamatorie cu rol major in homing-ul celulelor stem hematopoietice (Peled et al., 1999). CXCL12 are si un efect chemotactic pentru limfocite, neutrofile si macrofage (Balabanian et al., 2005). Ea pare sa aiba un efect activator pentru celulele stelate hepatice (Hong et al., 2009). Cu toate acestea, rolul CXCL12 in BHA nu este cunoscut. Din aceste motive mi-am propus sa analizez expresia CXCL12 in ficat si tesutul adipos la grupul nostru de pacienti alcoolici in functie de leziunile hepatice. Productia hepatica a CXCL12 este semnificativ mai mare la subgrupul de pacienti alcoolici cu hepatita

21

alcoolica, comparativ cu cei fara hepatita alcoolica (Fig. 7).

Figura 7. Expresia hepatica a CXCL12 in functie de prezenta sau absenta hepatitei alcoolice. Productia CXCL12 la nivel hepatic s-a corelat pozitiv cu inflamatia si fibroza hepatica, cat si cu markerii de fibroza. La nivelul tesutului adipos subcutanat, nivelul expresiei CXCL12 este semnificativ mai mare la subgrupul de pacienti alcoolici cu hepatita alcoolica, comparativ cu cei fara hepatita alcoolica (Fig. 8), fiind corelat pozitiv cu inflamatia hepatica. Rezultatele studiului meu indica faptul ca CXCL12 ar putea fi implicata in modularea procesului inflamator hepatic si de la nivelul tesutului adipos la pacientii cu BHA. Totusi, acestea sunt doar rezultate preliminare, fiind necesare studii suplimentare pentru confirmare si pentru evaluarea potentialului terapeutic al CXCL12 in BHA.

22

Figura 8. Expresia CXCL12 in tesutul adipos subcutanat in functie de prezenta sau absenta hepatitei alcoolice. Concluzii Alcoolul este direct implicat in declansarea procesului inflamator de la nivelul tesutului adipos la pacientii cu BHA. Din aceste motive, propun un model in care alcoolul orienteaza macrofagele din tesutul adipos catre un fenotip pro-inflamator M1 si o productie crescuta de cytokine pro- si anti-inflamatorii, iar intreruperea consumului de alcool vireaza macrofagele catre un fenotip anti-inflamator M2 si o productie scazuta de cytokine (Fig. 9). Aceste perturbari induse de consumul cronic de alcool pot explica cel putin partial efectul nefast al tesutului adipos in BHA. OPN si CXCL12 par sa joace un rol important in patogeneza leziunilor hepatice induse de alcool si reprezinta potentiale tinte terapeutice.

23

IL18

SEMA7A

OPNChemokines

Pro-inflammatory cyto(adipo)kines

Anti-inflammatory cyto(adipo)kines

↑ M1Macrophages

Alcohol Alcohol

Chemokines

Cytokines

Adipokines

↑ M2Macrophages

IL18

SEMA7A

OPN

X

↑ Adiponectin↑ IL10

↑ MCP1↑ OPN

↑ CXCL12

↑ TNFα↑ IL6↑ IL18

↑ SEMA7A↑ Leptin

Leptin

adiponectin

OPNOPN

IL18

SEMA7A

OPN

IL18

SEMA7A

OPNChemokines

Pro-inflammatory cyto(adipo)kines

Anti-inflammatory cyto(adipo)kines

↑ M1Macrophages

AlcoholAlcohol AlcoholAlcohol

Chemokines

Cytokines

Adipokines

↑ M2Macrophages

IL18

SEMA7A

OPN

X

↑ Adiponectin↑ IL10

↑ MCP1↑ OPN

↑ CXCL12

↑ TNFα↑ IL6↑ IL18

↑ SEMA7A↑ Leptin

Leptin

adiponectin

Leptin

adiponectin

OPNOPN

IL18

SEMA7A

OPN

Figura 9. Efectele alcoolului asupra tesutului adipos.

III. Concluzii finale

1. 18S si SFRS4 sunt gene adecvate pentru normalizarea rezultatelor RT-qPCR in probele de punctie biopsie hepatica la pacientii alcoolici. β actina si GAPDH nu trebuie folosite ca si control endogen al RT-qPCR la pacientii alcoolici, datorita variabilitatii expresiei in functie de leziunile hepatice. 2. Numai 7 zile de abstinenta la alcool amelioreaza inflamatia din tesutul adipos, inducand orientarea macrofagelor catre un fenotip anti-inflamator M2. Datele mele sustin rezultatele anterioare ale echipei conform carora alcoolul induce inflamatie nu numai in ficat, dar si in tesutul adipos. In plus, demonstreaza ca alcoolul este

24

cauza inflamatiei de la nivelul tesutului adipos in BHA. Modificarile induse de alcool la nivelul tesutului adipos pot fi cel putin partial responsabile de asocierea patogenica dintre excesul ponderal si steatoza, inflamatia si fibroza hepatica. 3. Inflamatia hepatica si adipoasa par sa aiba mecanisme patogenice comune, iar OPN si CXCL12 pot juca un rol major si reprezinta doua tinte terapeutice atractive.

IV. Perspective

1. Studiul mecanismelor prin care alcoolul induce inflamatia tesutului adipos.

2. Studiul infiltratului inflamator din tesutul adipos la pacientii cu BHA, prin tehnici de imunohistochimie, citometrie de flux si RT-qPCR.

3. Studiul expresiei citokinei CXCL12 pe model murin de boala hepatica alcoolica, pentru confirmarea rezultatelor obtinute la pacientii alcoolici. Daca rezultatele se confirma, o abordare interesanta ar fi evaluarea efectului blocarii specifice a CXCL12 asupra aparitiei leziunilor induse de alcool.

25

Bibliografie

Balabanian K, Lagane B, Infantino S, Chow KY, Harriague J, Moepps B, Arenzana-Seisdedos F, Thelen M, Bachelerie F (2005) The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem 280(42):35760-6.

Hong F, Tuyama A, Lee TF, Loke J, Agarwal R, Cheng X, Garg A, Fiel MI, Schwartz M, Walewski J, Branch A, Schecter AD, Bansal MB (2009) Hepatic stellate cells express functional CXCR4: role in stromal cell-derived factor-1alpha-mediated stellate cell activation. Hepatology 49(6):2055-67.

Lin HZ, Yang SQ, Zeldin G, Diehl AM (1998) Chronic ethanol consumption induces the production of tumor necrosis factor-alpha and related cytokines in liver and adipose tissue. Alcohol Clin Exp Res 22(5 Suppl):231S-237S.

Naveau S, Cassard-Doulcier AM, Njike-Nakseu M, Bouchet-Delbos L, Barri-Ova N, Boujedidi H, Dauvois B, Balian A, Maitre S, Prevot S, Dagher I, Agostini H, Grangeot-Keros L, Emilie D, Perlemuter G (2010) Harmful effect of adipose tissue on liver lesions in patients with alcoholic liver disease. J Hepatol 52(6):895-902.

Naveau S, Chemla P, Chaput J (2000) Validité relative d'un questionnaire évaluant la consommation d'alcool d'un groupe de buveurs hospitalisés. Cah Nutr Diet 35:121-125.

Naveau S, Giraud V, Borotto E, Aubert A, Capron F, Chaput JC (1997) Excess weight risk factor for alcoholic liver disease. Hepatology 25(1):108-11.

26

Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben-Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T (1999) Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science 283(5403):845-8.

Perlemuter G, Bigorgne A, Cassard-Doulcier AM, Naveau S (2007) Nonalcoholic fatty liver disease: from pathogenesis to patient care. Nat Clin Pract Endocrinol Metab 3(6):458-69.

Raynard B, Balian A, Fallik D, Capron F, Bedossa P, Chaput JC, Naveau S (2002) Risk factors of fibrosis in alcohol-induced liver disease. Hepatology 35(3):635-8.

Teli MR, Day CP, Burt AD, Bennett MK, James OF (1995) Determinants of progression to cirrhosis or fibrosis in pure alcoholic fatty liver. Lancet 346(8981):987-90.

Voican CS, Perlemuter G, Naveau S (2011) Mechanisms of the inflammatory reaction implicated in alcoholic hepatitis: 2011 update. Clin Res Hepatol Gastroenterol 35(6-7):465-74.

27

Lucrari in tematica tezei de doctorat

I. Articole in extenso publicate in reviste indexate ISI cu factor de impact

1. Patouraux S*, Bonnafous S*, Voican CS, Anty R, Saint-Paul MC, Rosenthal-Allieri MA, Agostini H, Njike M, Barrri-Ove N, Naveau S, Calès P, Le Marchand-Brustel Y, Perlemuter G, Tran A, Gual G. Elevated osteopontin expression in the liver, adipose tissue and serum correlated with fibrosis in patients with alcoholic liver disease. PloS One (in evaluare).

2. Boujedidi H, Bouchet-Delbos L, Cassard-Doulcier AM, Njike-Nakseu M, Maitre S, Prevot S, Dagher I, Agostini H, Voican CS, Emilie D, Perlemuter G, Naveau S Housekeeping Gene Variability in the Liver of Alcoholic Patients. Alcohol Clin Exp Res 2011; doi: 10.1111/j.1530-0277.2011.01627.x.

3. Voican CS, Perlemuter G, Naveau S. Mechanisms of the inflammatory reaction implicated in alcoholic hepatitis: 2011 update. Clin Res Hepatol Gastroenterol 2011;35(6-7):465-74

4. Voican CS, Perlemuter G. Insulin resistance and oxidative stress: Two therapeutic targets in non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol 2011;54(2):388-91.

28

II. Comunicari- manifestari stiintifice internation ale

Comunicari orale

1. Voican CS, Boujedidi H, Njiké-Nakseu M, Bouchet-Delbos L, Agostini H, Barri-Ova N, Maitre S; Prévot S, Cassard-Doulcier AM; Naveau S; Perlemuter G. Implication du tissu adipeux sous-cutané abdominal dans l’évolution des lésions hépatiques induites par l’alcool. Volum de rezumate. 69ème Journées Scientifiques de l’Association Française pour l'Etude du Foie, Paris-La Villette 2011.

Comunicari poster

1. Gual P; Patouraux S; Bonnafous S; Voican CS; Anty R; Saint-Paul MC; Rosenthal-Allieri MA; Agostini H; Njike M; Barri-Ova N; Naveau S; Calès P; le Marchand-Brustel Y; Perlemuter G; Tran A. L’augmentation de l’expression de l’ostéopontine dans le foie, le tissu adipeux et le sérum de patients alcooliques est corrélée à la fibrose hépatique. Volum de rezumate. 69ème Journées Scientifiques de l’Association Française pour l'Etude du Foie, Paris-La Villette 2011.

2. Boujedidi H, Bouchet-Delbos L, Cassard-Doulcier AM, Njike-Nakseu M, Maitre S, Prevot S, Dagher I, Agostini H, Voican CS, Emilie D, Perlemuter G, Naveau S. Housekeeping gene variability in the liver of alcoholic patients. Volum de rezumate. 69ème Journées Scientifiques de l’Association Française pour l'Etude du Foie, Paris-La Villette 2011.