Tehnica RFLP. Tehnica RFLP. Descriere generală, Descriere generală,

aplicaţiiaplicaţii

Toma Rodica ElenaToma Rodica Elena

Bucureşti, 2013Bucureşti, 2013

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂUNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

Tehnica RFLP. Descriere generală, aplicaţii

Toma Rodica Elena

Bucureşti, 2013

Tehnica RFLPTehnica RFLP (Restriction Fragment Length (Restriction Fragment Length Polymorphism) se bazează pe Polymorphism) se bazează pe

proprietăţile de hibridareproprietăţile de hibridare care există care există între două fragmente de ADN, prezentând între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de omologie (RFLP- bazat pe un grad înalt de omologie (RFLP- bazat pe

hibridare) şi hibridare) şi tehnica PCRtehnica PCR – denumită – denumită PCR-RFLP, în care se evidenţiază PCR-RFLP, în care se evidenţiază

polimorfismele existente la nivelul polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricţie.situsurilor enzimelor de restricţie.

1.Tehnica RFLP bazată pe hibridare cu o sondă, implică parcurgerea următoarelor etape:

extracţia ADN din organismele ce urmează să fie analizate;

digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie;

separarea fragmentelor obţinute în urma separarea fragmentelor obţinute în urma digestiei, în funcţie de mărimea lor, prin digestiei, în funcţie de mărimea lor, prin electroforeză în gel de agaroză;electroforeză în gel de agaroză;

transferul ADN sub formă denaturată pe o transferul ADN sub formă denaturată pe o membrană de nylon (Southern blotting) în care membrană de nylon (Southern blotting) în care poziţia relativă a diferitelor fragmente de ADN poziţia relativă a diferitelor fragmente de ADN din gel se păstrează pe parcursul transferului;din gel se păstrează pe parcursul transferului;

hibridarea ADN cu sonda marcată prealabil, în regiunile în care prezintă omologie;

vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film sensibil la radiaţii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacţii enzimatice, care dă o coloraţie specifică.

În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit tipuri de sonde, care permit

evidenţierea unor tipuri diferite de evidenţierea unor tipuri diferite de polimorfism.polimorfism.

Sondele mono- sau oligogenice

Sondele poligenice sau multilocus

Sondele mono- sau oligogenice pun în evidenţă unul sau mai mulţi loci; ele dau un profil simplu care include câteva benzi.

Utilizarea acestui tip de sonde permite vizualizarea polimorfismelor de secvenţă, localizate la nivelul situsurilor de restricţie,precum şi a polimorfismelor de inserţie/deleţie, situate între situsurile de restricţie.

Acest tip de sondă a fost utilizat pentru a alcătui hărţi genetice la om, pentru a identifica unele varietăţi de măr şi pentru a pune la punct un test de depistare a anemiei falciforme.

Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezintă Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezintă variabilitate foarte mare, cum sunt secvenţele de tip micro şi minisatelit, variabilitate foarte mare, cum sunt secvenţele de tip micro şi minisatelit,

alcătuite de 2 până la 16 perechi de baze, repetate în tandem. alcătuite de 2 până la 16 perechi de baze, repetate în tandem.

Cu ajutorul sondelor multilocus, se observă, în general un grad ridicat de Cu ajutorul sondelor multilocus, se observă, în general un grad ridicat de polimorfism între genotipurile înrudite. Acest tip de sondă a fost utilizat polimorfism între genotipurile înrudite. Acest tip de sondă a fost utilizat

pentru prima dată de Jeffreys şi colab., (1985) la hibridarea cu ADN pentru prima dată de Jeffreys şi colab., (1985) la hibridarea cu ADN genomic uman digerat şi amprentizarea genetică a fiecărui individ.genomic uman digerat şi amprentizarea genetică a fiecărui individ.

Ulterior, au fost descoperite alte secvenţe satelit şi la alte mamifere, la insecte şi plante. Sondele multilocus permit evidenţierea polimorfismului de secvenţă la nivelul situsurilor de restricţie, polimorfismului de inserţie/deleţie precum şi polimorfismului determinat de numărul unităţilor repetitive, pentru fiecare individ în parte.

2. Tehnica RFLP, bazată pe PCR, utilizează o enzimă de restricţie pentru digerarea unui produs de amplificare, obţinut cu primeri specifici, iar în gelul de agaroză se vor obţine benzi de dimensiuni diferite, corespunzătoare celor trei genotipuri (homozigoţi pe una din cele două alele şi heterozigoţi).

Markerii RFLP sunt markeri cu Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce identifică polimorfism limitat ce identifică

variaţiile secvenţei de ADN la nivelul variaţiile secvenţei de ADN la nivelul unui situs de restricţie, prin analiza unui situs de restricţie, prin analiza

RFLP. RFLP.

O sursă abundentă de markeri genetici, O sursă abundentă de markeri genetici, utilizaţi în tehnicile de cartare a genomului utilizaţi în tehnicile de cartare a genomului animal au la bază modificările unor animal au la bază modificările unor secvenţe de ADN care se produc la nivelul secvenţe de ADN care se produc la nivelul situsurilor de restricţie. De regulă aceste situsurilor de restricţie. De regulă aceste variaţii sunt cauzate de mutaţii variaţii sunt cauzate de mutaţii punctiforme (substituţia unei nucleotide cu punctiforme (substituţia unei nucleotide cu o alta), inserţii sau deleţii, în interiorul o alta), inserţii sau deleţii, în interiorul situsului de restricţie şi astfel, enzima de situsului de restricţie şi astfel, enzima de restricţie, nu mai recunoaşte situsul restricţie, nu mai recunoaşte situsul respectiv şi nu mai taie. respectiv şi nu mai taie.

Aceasta va determina obţinerea unor fragmente de restricţie de lungimi diferite (polimorfice) care pot fi uşor vizualizate şi identificate în gelul de agaroză datorită lungimii lor diferite.

Din această cauză ele se vor separa în gelul de electroforeză sub forma unor benzi situate în diferite regiuni. Greutatea moleculară se apreciază cu ajutorul unui ADN standard de etalonare ”leadder”.

În practică, mărimea unui fragment ce se detectează prin În practică, mărimea unui fragment ce se detectează prin Southern blotting este de 300 pb – 15 kb cu diferenţe Southern blotting este de 300 pb – 15 kb cu diferenţe detectabile mai mici de 50 pb. detectabile mai mici de 50 pb.

Prin tehnica PCR se detectează produşi între 60 pb-2kb, cu Prin tehnica PCR se detectează produşi între 60 pb-2kb, cu diferenţe chiar de câteva baze. Indivizii diferiţi genetic diferenţe chiar de câteva baze. Indivizii diferiţi genetic pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de restricţie de lungimi diferite, într-un număr diferit pentru restricţie de lungimi diferite, într-un număr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda moleculară – enzimă un anumit cuplu format din sonda moleculară – enzimă de restricţie. În acest context, fiecare sistem format din de restricţie. În acest context, fiecare sistem format din ADN genomic – enzimă de restricţie, poate defini un ADN genomic – enzimă de restricţie, poate defini un locus polimorf care are cel mult două alele diferite.locus polimorf care are cel mult două alele diferite.

Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaţiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoaştere a enzimelor de restricţie, respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri existente în locusul de interes (AA, Aa, aa) şi nu se pot detecta variaţiile la nivelul întregului genom.

Vă mulţumesc