Tehnica PCR

• Prin tehnica PCR (polymerase chain reaction, reacţia în lanţ a

polimerazei) se pot amplifica in vitro regiuni specifice dintr-o

secvenţă de ADN.

• Delimitarea secvenţelor amplificate se face cu ajutorul a două

secvenţe oligonucleotidice sintetice denumite primeri, care se vor

ataşa la secvenţele complementare din molecula de ADN template

• Amplificarea se face sub actiunea ADN polimerazei în prezenţa

celor patru deoxinucleotidtrifosfaţi (dNTP) : dATP–deoxiadenozin

trifosfat, dTTP–timidin trifsofat, dGTP–deoxiguanozin trifosfat,

dCTP– deoxicitozin trifosfat.

Teoretic, în fiecare ciclu de PCR are loc dublarea cantităţii de secvenţă ţintă (amplicon). Deoarece ambele catene de ADN sunt copiate, are loc o amplificare exponenţială a numărului de copii de ADN.

Etapele reacţiei PCR

A. Denaturarea ADN se face la 94°C timp de 15 secunde -

2 minute. În această etapă are loc separarea celor două catene de ADN.

B. Hibridizarea (annealing-ul) primerilor la secvenţele complementare de ADN

monocatenar are loc la temperaturi cuprinse între 40-60°C, timp de 15-60

secunde.

C. Sinteza ADN se face sub acţiunea ADN polimerazei la 72°C timp

de 1-2 minute, în funcţie de mărimea secvenţei care se va amplifica şi în funcţie

de viteza de polimerizare a enzimei utilizate.

Factorii care influenţează desfăşurarea reacţiei de PCR

1.Secvenţele primeri

trebuie să fie constituiţi, în general, din 18-25 nucleotide

să conţină un procent de 50-60% G şi C

între temperaturile de topire (melting) ale celor doi primeri nu

trebuie sa fie o diferenţă mai mare de 5ºC

Temperatura de topire (melting temperature) reprezintă temperatura la care

modificarea absorbanţei este 50% din cea totală, corespunzătoare unei

denaturări complete.

Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C

temperatura de annealing se calculează astfel încât să fie mai mică

cu 5ºC sub temperatura de melting a celor doi primeri

se evită complementaritatea primerilor care ar duce la formarea unor dimeri şi implicit la apariţia unor artefacte

eventualele structuri palindromice se vor plasa în interiorul primerilor şi în nici un caz la capete deoarece vor aparea structuri secundare - hairpin

la capete este bine ca primerii să conţină nucleotidele G şi C

2. ADN polimeraza şi concentraţia utilizată

a) polimeraze cu activitate autocorectoare (proofreading) 3'-5' (Pfu polimeraza).

Aceste polimeraze au activitate 3'-5' exonucleazică şi pot să elimine nucleotidele

greşit incorporate dintr-o catenă ADN în curs de sinteză. Produşii de PCR

rezultaţi în urma amplificării cu polimeraze cu proofreading au capete drepte.

b) polimeraze care nu au activitate de proofreading (Taq polimearaza)

3. Concentraţia ionilor Mg2+

Ionii de magneziu formează cu dNTP un complex, esenţial pentru polimerizarea

nucleotidelor, deoarece facilitează interacţia dintre primer şi secvenţa ţintă.

4. Cantitatea de ADN template utilizată în reacţia PCR

Dacă se utilizează o cantitate prea mică de ADN template atunci va avea loc o

amplificare scăzută a secvenţei de ADN. În cazul în care se utilizează

cantităţi prea mari de ADN template va avea loc amplificarea nespecifică a ADN.

5. Prezenţa unor inhibitori sau activatori ai reacţiei PCR

Activator Concentraţie

Formamida 5%

Dimetil sulfoxid (DMSO) <10%

Clorura de tetrametilamoniu (TMAC)

10 - 100µM

Polietilenglicol (PEG) 5 - 15%

Glicerol 10 - 15%

Tween 20 0,1 - 2,5%

Aplicaţiile tehnicii PCR

● clonarea ADN – tehnica PCR permite amplificarea secvenţelor de ADN de interes,

fie că aceste secvenţe sunt gene, secvenţe cu rol reglator, etc

● medicină - diagnosticul unor maladii, descoperirea unor noi medicamente etc.

Tehnica PCR este

utilizată pentru a studia

şi a identifica infecţiile virale (HIV, HBV, HCV, HPV etc.)

● arheologie moleculară - examinarea unor specii dispărute şi determinarea relaţiei acestora cu prezentul. ● criminalistică - pentru a identifica criminalii, investigatorii studiază secvenţe unice de ADN la fiecare individ. Aceste secvenţe se numesc Short Tandem Repeats (STR).

● ecologie - integrarea datelor genetice cu diverse date observate pe teren pentru diferite specii pentru a determina sexul animalelor şi al păsărilor, modul în care migrează etc

● identificarea organismelor modificate genetic - aceste organisme modificate genetic reprezintă organisme la care mesajul genetic a fost alterat într-un mod în care aceste modificări nu apar în mod natural.

Pentru a exemplifica practic reacţia de PCR se va amplifica un fragment de 450 pb din gena cyp2d6 utilizând ca template ADN genomic uman.

P1for : 5'-GGAGTGGGTGGTGGATGGTGG-3'P2rev : 5'-CCTCCTGAGCTAGGTCCAGCAGC-3'

GoTaq Flexi ADN polimeraza de la firma Promega. Kitul de amplificare conţine GoTaq polimerază, MgCl2 25 mM, tampon GoTaq Flexi incolor 5x şi tampon GoTaq Flexi colorat (verde). Tamponul colorat conţine doi coloranţi care vor indica poziţia frontului de migrare al probelor în gel de agaroză, un colorant albastru care migrează corespunzător unei benzi de ADN de 3-5 Kb şi un colorant galben care migrează la aproximativ 50 pb.

Mod de lucru1. În tubuşoare sterile de 0.2 mL se pipetează următorii

reactivi:

ReactivProbă

volum (μl)Control volum

(μl)

ADN template <0,5μg -

P1 0,2 μM 0,1–1,0μM

P2 0,2 μM 0,1–1,0μM

dNTP (10 mM fiecare ) 1μl 1μl

GoTaq Polimerază (5 u/μl)

0,25 0,25

Tampon GoTaq Flexi (5x)

10 10

Soluţie MgCl2 (25 mM) 2 2

Apă fără nucleaze z z

Volum final 50 50

2. Se pun probele în aparatul de PCR şi se setează parametrii de funcţionare.

Se utilizează următorul protocol standard de amplificare:

Etapă Temperatură Timp Nr. cicluri

Denaturare iniţială

95°C 2 min. 1

DenaturareAnnealingExtensie

95°C55°C72°C

0,5 min.0,5 min.0.5 min

25-35

Extensie finală 72°C 5 min. 1

Menţinere probe

4°C Nedefinit 1

P1 P2 P3 M