noi metode pcr
TRANSCRIPT
NOI METODE P. C. R.
Coordonator:
Profesor doctor Candidat:
................................ Pintilescu (Budală) Mirela
2015
Reacția de polimerizare în lanț , prescurtat( PCR ) a fost numită de Lederberg ,,
instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară “ . Reacția PCR ((Polymerase
Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ) dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN
1
să poată fi extrasă o singură moleculă de ADN, care apoi poate fi amplificată enzimatic, cu
mijloace tehnice aparent simple, are loc in vitro. În vederea aplicabilității pe diferite domenii
(criminalistică, studii ecologice ,arheologie, științe medicale , industria
alimentară ,epidemiologie , biologie moleculară ) a fost dezvoltată o adevărată tehnologie
PCR, care din punct de vedere chimic , este construită din cicluri succesive de replicare ADN
in vitro , Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene
ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).Replicarea ADN in vivo diferă de
replicarea ADN in vitro doar prin faptul că , în reacția PCR etapa de desfacere a dublului
helix mariță și respectiv, cea de atașare a primerilor , nu sunt realizate enzimatic , ea
parcurgând unele trepte de temperatură , iar singura enzimă folosită în reacție este o ADN
polimerază , ADN-dependentă ( cu funcție de replicază ) .
PCR este o metodă cu un spectru larg de aplicabilitate datorită avantajelor .
Pentru ceretare nu este nevoie de o cantitate mare de ADN . Prin ,, agățarea unei
molecule de ADN se pot diagnostifica boli genetice , identifica criminali și putem găsi
răspunsuri la întrbările care nu ne dau pace ,, Cine suntem noi , de unde venim noi ? .
Polimerase chain reaction ( PCR) este o reacție care are la bază o tehnologie in vivo care
imită capacitatea naturală de replicare a ADN și care constă în generarea rapidă a unor copii
multiple a unei secvențe nucleotidice țintă ( ADN sau ARN )dintr-o genă de interes sau un
patogen specifi.. Copia rezultată este numită amplicon .Amplificarea se realizează într-un
analizator special ( thermal cycler). Amperaza este enzima care promovează amplificarea
selectivă a țintei și distrugerea produșilor de contaminare din cursul reacțiilor de amplificare
anterioare. Reacția PCR are loc în trei etape :
1. Denaturarea : amestecul se încălzește la 94 grade iar ADN se desface în două
catene.
2. Hibridizarea primerilor: temperatura va fi scăzută la 55-70 grade Celsius ,
primerii se vor atașa complementar la capetele 3 ale celor două catene.
3. Elongația are loc la o temperatură de 72 de grade și va extinde primerii
atașați în lungul matriței țintă și va produce un amplicon ADN. Analizatorul va repeta
automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35).
I. Aplicabilitatea practică a PCR-ului.
În anii 1980 , se folosea ADN – polimeraza Klenow (fragment de ADN –polimeraza
termostabilă , izolată de la bacteria Termus acquaticus. Astăzi tehnologia PCR a fost
2
revoluționată prin dezvoltarea metodelor de detecție în faza exponențială numită detecție în
timp real ( real-time PCR). Această reacție are ca și avantaj acuratețea rezultatelor obținute.
Comparativ cu tehnica PCR convențional ,detecția are loc în faza de platou, după ce a
fost stopată iar produșii au început să se degradeze. Domeniul de linearitate este mult extins
folosind mai puține diluții ale probelor. Limita inferioară de detecție este mult îmbunătățită
(se pot detecta cantități mai mici de ADN-ului țintă).
Produsele ADN obținute prin PCR sunt separate electoforetic în funcție de dimensiuni,
sub formă de benzi, în gelul de electoforeză, iar apoi benzile sunt făcute vizibile în lumina UV
prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. Se realizează hibridizarea ADN-ului cu
sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. Reacția de polimerizare în lanț poate
fi aplicată în foarte multe domenii de interes cu ar fi: medicină, ecologie, arheologie. În
diagnosticul medical reacția PCR este utilizată în diagnostificarea bolilor ereditare(fibroza
chistică, anemia Cooley, distrofia musculară Duchenne, fenilcetonuria).
Aceste boli pot fi depistate prenatal, grație metodei PCR, prin determinarea ADN-ului din
celulele trofoblastice. Se mai poate determina sexul copilului, dar și o boală genetică
II. Variante tehnice ale reacției PCR
Multiplex PCR constă în introducerea PCR a mai multor seturi de primeri, specifici
pentru secvențe diferite de ADN, care vor produce ampliconi de dimensiuni diferite.
Metoda este foarte utilă datorită faptului că furnizează informații multiple, care prin
PCR clasic ar fi posibile doar prin amplificări, cu consum de tipi și reactivi. Problematica
ridicată de multiplex PCR constă în alegerea setului de primeri care trebuie să se hibridizeze
eficient la o singură temperatură. Acest inconvenient duce la limitarea numărului de secvențe
amplificate. A doua situație dificilă este sortarea pentru amplificat a unor secvențe de
dimensiuni diferite care prin migrare electroforetică să nu producă suprapunerea benzilor.
Metodele de laborator convenționale, bazate pe cultivarea și identificarea agentului
etiologic prezent în produsul patologic, poate necesita câteva zile pentru obținerea unui
rezultat cert. În plus introducerea precoce a tratamentului cu antibiotice, înaintea recoltării
probelor biologice, a diminuat numărul cazurilor de meningită confirmate prin metode de
laborator tradiționale. Acest impas poate fi depășit prin identificarea microorganismului direct
în produsul patologic, utilizând în principal tehnica PCR. Este folosită o reacție PCR
multiplex care permite detectarea simultană a celor trei microorganisme care cauzează
majoritatea meningitelor bacteriene : Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae și
Haemophilus influenzae.
3
Această metodă țintește trei gene specifice speciilor menționate: ctrA – codifică o proteină
de membrană implicată în transportul capsulei la N. Meningitidis; ply- codifică pneumolizina
la S. pneumoniae; bexA – codifică o proteină implicată în exportul capsulei polizaharidice la
H. Influenzae. Studiile efectuate pe probe biologice în diferite laboratoare, au evidențiat
sporirea numărului de rezultate pozitive înregistrate în diagnosticul etiologic al meningitelor
acute bacteriene obținute prin utilizarea unei reacții PCR multiplex și sunt unanim de acord
asupra utilității includerii unor reacții de acest tip de acest tip în diagnosticul molecular de
rutină.
Identificarea serogrupului / serotipului reprezintă primul pas în caracterizarea tulpinilor
de meningococ și cel mai important pentru managementul prompt al contracțiilor. Pentru
acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de amplificare a acizilor nucleici, pentru
identificarea serogrupului la nivel molecular ( genogrup), care sunt sau trebuie să devină o
parte importantă într-un laborator. Pentru determinarea sensibilității la agenți antimicrobieni
în absența unor culturi bacteriene, s-a experimentat detectarea mutațiilor în secvența genelor
implicate în rezistența principalilor agenți cauzali ai MBA la substanțe antimicrobiene prin
amplificarea PCR urmată de secvențiere.
https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetic%C4%83&biw
NESTED PCR este o variantă modificată a amplificării PCR folosită pentru a reduce
formarea de produși nespecifici sau pentru a amplifica un produs a cărui matriță este în
cantitate foarte redusă. Metoda constă în amplificarea în două etape (reacții PCR) a unui
fragment, utilizând două seturi de primeri (un set de primeri externi și un set de primeri
4
interni). În prima reacție PCR se amplifică un fragment de dimensiuni mai mari prin utilizarea
primerilor externi, iar în a doua reacție PCR se utilizează primerii interni, rezultând un
fragment de dimensiuni mai mici dar într-o cantitate mai mare.
https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetică&biw
Hot start PCR o reacție PCR proiectată pentru a evita apariția de produși nespecifici
determinați de activitatea defectuasă a polimerazei la temperaturi reduse (sub Tm a
primerilor) în timpul manipulării reactivilor și realizarea mixului PCR. Se folosește o
polimerază care necesită o etapă de activare la temperatură ridicată. Sunt descrise mai multe
metode de inactivare a polimerazei care includ: modificare chimică(anhidride sau
formaldehide), modificări fizice(includerea în bile de parafină), legare cu anticorpi.
5
https://www.google.ro/search?q=v&biw=1600&bih=799&source
Touchdown PCR(step-down PCR) reprezintă o variație a reacției PCR menite să
limiteze formarea de legături nespecifice ale primerilor la matrița ADN. Temperatura de
hibridizare este definitorie pentru ligarea specifică a primerilor. Metoda constă utilizarea în
primul ciclu de amplificare a unei temperaturi de hibridizare crescute, pentru ca în
următoarele cicluri, primerii se vor fixa foarte specific și vor aduce un avantaj(este amplificat
exponențial) pentru apliconul de interes.
https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetică&biw
Reverse transcrption polymerase chain reaction (RT-PCR) este o variantă a PCR-
ului utilizată pentru identificarea calitativă sau semicantitativă a expresiei genice (transcripția
în ARNm). ARNm este în prima etapă reverstranscris în ADN complementar (ADNc)
6
utilizându-se o polimerază inversă(reverstrancriptaza) de origine virală. ADNc rezultat este
ulterior amplificat folosind reacția PCR clasic.
Real time o variantă a tehnicii PCR în care se poate vizualiza în timp real producerea
de apliconi, cu ajutorul unor fluorocromi. Tehnica poate fi utilizată pornind de la două tipuri
de matrițe: ADNg, ADNc în cazul în care se utilizează ca matriță ADNg se urmărește
identificarea variațiilor numărului de copiii pentru o anumită genă sau se identifică încărcările
virale. Deci în prima situație(cea a variațiilor numărului de copiii) se utilizează ca referință o
genă (preferabil mai multe gene care nu prezintă deleții sau amplificării în patologia
respectivă. În situația viremiilor realizează de obicei doar o cuantificare absolută. Real time
RT-PCR este o variantă PCR în care amplificarea (creșterea umărului de apliconi) poate fi
vizualizată în timp real utilizându-se fluorescența.
Există două mari categorii de obținere a fluorescenței proporționale cu creșterea
numărului de apliconi din reacție: metodă specifică și metodă nespecifică.
Real time PCR a fost dezvoltat pentru a obține rezultate cât mai curate. Un avantaj
suplimentar al acestei metode este ușurința de a compara rezultatele obținute din experimente
diferite.
Metode de identificare a mutațiilor prin biologie moleculară.
1. High resolution melting = tehnică ce constă în analizarea post-amplificare PCR a
curbelor de topire a fragmentelor de interes(apliconi) este o metodă atractivă simplă (doar un
set de primeri) și rapidă de realizat. Impune realizarea unor etape consistente de optimizare,
utilizarea unor fluorocromi cu sensibilitate foarte mare și de asemenea utilizarea unei
aparaturi(real-time PCR) care să permită înregistrarea unui număr mare de date cu o variație
constantă uniformă și precisă a temperaturii. Metoda se bazează pe utilizarea curbelor de
disociere(melting sau topire) a produșilor de interes fiind disponibilă datorită îmbunătățirii
coloranților care emit fluorescență la legarea de ADN-ul dublu catenar, și evoluției aparaturii
de real-time PCR(cu rotor, care asigură o omogenitate a temperaturii de topire) și a
programelor de analiză asociată fiecărui aparat în parte. Permite detecția rapidă a mutațiilor
genice(SNP) permițând identificarea unor noi variante(fără posibilitatea de a le caracteriza).
HRM începe cu amplificare PCR a regiunii de interes, în prezența coloranților care se
leagă de dublu helix și emit fluorescența. Fluorescența este mai intensă când sunt legați de
ADN dublu catenar(dsADN) și o fluorescență foarte slabă când sunt legați de dsADN.
Amplificarea este urmată de o curbă de topire la o rezoluție foarte înaltă(HRM)
alcătuită din pași mici(0,10 Celsius) și cu o citire a unui număr foarte mare de evenimente
7
fluorescente pentru fiecare pas cu o precizie foarte mare. Când dsADN se denaturează în
catenele componente fluorocromul este eliberat ducând la o scădere a fluorescenței generale
din tub. Rezultatul constă în obținerea unei curbe de melting caracteristic fiecărui aplicon.
Reacția HRM poate avea loc într-o singură etapă (PCR+MELT) sau poate fi realizată
reacția PCR într-un termociclor standard, și doar HRM într-un Real – Time PCR. Produsul
PCR obținut prin realizarea curbei de melting nu este unul nou, el utilizându-se de rutină în
Real-Time PCR nespecific. Acest procedeu se numește astăzi Lou Resoltion Melting(LRM).
Curba de topire în LRM este realizată prin creșterea temperaturii cu un pas mai mare de
temperatură de 0,5o Celsius. Cea mai mare rată de scădere a fluorescenței în procesul de topire
este la temperatura caracteristică a ampliconului obținut.
1. Amplification Refractory Mutation System(ARMS) denumită și Alelele specific
PCR(ASP) este o metodă care se bazează pe amplificarea PCR-ului standard folosită în
detecția STR-urilor (Newton et. al., 1989). ARMS utilizată pentru analiza unei palete largi de
polimorfisme, mutații germinale și somatice. Tehnica poate identifica nivele scăzute ale alelei
mutante.(Billadeau et. al., 1991). Tehnica poate identifica probe corespunzătore WT, MT, HZ,
doar pentru mutația vizată. Mai poate identifica mutații punctiforme sau SNP germinale
(moștenite) la care raportul dintre cele două alele(în cazul unui heterozigot), cu excepția
indivizilor cu mozaic cromozomial, este unu.
Tehnica PCR poate fi adaptată în mai multe variante pentru a putea răspunde unor
întrebări foarte precise legate de matrița care trebuie amplificată putând fi realizate într-o
singură amplificare sau în amplificări separate, calitativ sau cantitativ.
2. Restriction fragment length polymorphism este o tehnică ce utilizează capacitatea
enzimelor de restricție de a tăia foarte specific anumite modele de secvențe de ADN. Tehnica
RFLP are la bază o amplificare PCR, în urma căreia se obține un amplicon care conține
polimorfismul sau mutația punctiformă vizată. Se cunosc două variante RFLP: când
polimorfismul studiat transformă secvența ampliconului într-un situs de recunoaștere și când
acesta anulează situsul de recunoaștere a enzimei. Cel mai important în această tehnică este
distincția dintre o reacție de digestie completă și una incompletă. Fragmentele rezultate în
urma digerării polimorfismului vizat să aibă dimensiuni diferite, pentru a putea fi diferențiate
în gelul de agaroză și să fie destul de lungi pentru a nu se suprapune peste eventualii dimeri
deprimeri formați în reacția PCR.
Etapele tehnicii RFLP: în prima etapă se realizează amplificarea PCR cu primeri
specifici care încadrează polimorfismul vizat. În cea de a doua etapă se realizează o migrare
electroforetică pentru verificarea amplificării. Se migrează o cantitate de aproximativ 4 µl, iar
8
restul se păstrează pentru digestie și controlul nedigerat. Cantitatea de produs de amplificare
se împarte în două secțiuni: controlul nedigerat și produsul care va fi supus digestiei cu
enzima de restricție.
În ultima etapă cele două secțiuni migrează în paralel pentru a se identifica diferențele
3. TaqMan SNP Genotyping
TaqManassays(Applied Byositem, Life Tehnologies, Pleasanton, CA, USA) se bazează
pe discriminarea alelică prin Real –Time PCR în sistem TaqMan tehnică asemănătoare cu
ARMS cu diferența că în loc de primeri sunt utilizate sonde de hidrolize.
Pentru genotiparea prin sistem TaqMan assay se realizează designul de primeri astfel
încât acestea încadrează polimorfismul, iar cele două sonde să fie situate pe zona de interes
(STR), una pe varianta sălbatică și una pe varianta polimorfică. Pentru cele două sonde se
folosesc ca reporter clorocromi a căror emisie să nu se suprapună și să poată fi captată corect
pe canale diferite.
Prin suprapunerea fluorescențelor sau Ct-urilor obținute pe cele două canale, într-un
grafic bidimensional se pot identifica ușor cele patru categorii: dublu negativ(NTC și tuburile
unde amplificarea a eșuat), simplu-pozitiv pe una sau cealaltă fluorescență(homozigot sălbatic
într-un cadran și homozigot mutant în alt cadran) și dublu pozitiv(heterozigot).
În urma utilizării unor controale cu diferite procentaje alela MT, poate da informații de
raportul dintre cele două alele.
Această tehnică este cea mai utilizată pentru identificarea SNP-urilor , deoarece are o
rezoluție foarte bună, de până la 0,01%. Se mai utilizează la identificarea majorității
polimorfismelor, și mutațiilor.
Tehnica poate fi utilizată pentru identificarea mai multor ținte în același timp folosind
sonde de hidroliză cu fluorescențe de referință diferite .
Odată cu introducerea sondelor de hidroliză cuplate cu MinorGoveBinder (MGB) s-a
reușit creșterea sensibilității și specificității metodei, deoarece nepotrivirile la nivelul
secvenței de hibridare a sondei se fac practic fac practic imposibila cuplare a acesteia și
implicit obținerea unui semnal fals de amplificare.
4. Secvențierea Sânger reprezintă tehnica prin care sunt identificate bazele azotate
în ordinea înlănțuirii lor într-o secvență oligonucleotidică de ADN.
De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai multe metode de identificare a secvenței
nucleotidice, metode care diferă atât prin chimia reacției, cât și prin modul de migrare a
produșilor obținuți .În prezent cele mai utilizate metode sunt secvențierea Sânger Dye
Terminator(Sânger et al. , 1975) și metoda pirosecvențierii.
9
Tehnica Sânger se bazează pe utilizarea unor nucleotide modificate, numite
ddNTP( dideoxinucleotide trifosfat ).Aceste nucleotide nu prezintă în poziția 3 'gruparea-OH,
necesar[ polimerazei pentru a face leg[tura diester cu nucleotidul următor . Acest fenomen
duce la întreruperea bruscă a amplificării. Utilizând ddNTP fluorescente, fiecare fragment
format se va termina cu o anumită fluorescență caracteristică.
Etape de lucru:
amplificarea fragmentului de interes cu primeri specifici prin reacția PCR;
vizualizarea produsului din gelul de agaroză ( folosit când în setul de primeri duce la
obținerea unui număr mare de ampliconi) sau din produsul PCRrămas. Această etapă
este strict necesară pentru a îndepărta primerii neutilizați în reacția PCR și a
celorlalți compuși ai mixului de reacție( dNTP, enzima, buffer , etc.) ;
migrarea electoforetică de siguranță , pentru a verifica prezența produsului purificat.
Se pot identifica probele corespunzătoare fiecărei categorii WT, MT, HZ , pentru toate
mutațiile existente în ampliconul secvențiat. Mai poate identifica deleții, adiții, duplicații,
inversii, etc. , existente în fragmentul amplificat.
MAAP techniques (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)
Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face
parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), alături de tehnicile DAF
(Amplification Fingerprinting ) şi AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).
DAF technique (DNA Amplification Fingerprint) - Caetano-Anolles şi colab. (1991), au
introdus o metodă numită DNA
Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scurţi, cel mai adesea de
lungime între 5 – 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiţi parametrii PCR,
folosind paşi atât de joasă cât şi de înaltă stringenţă, precum şi un program al ciclurilor cu
numai două temperaturi în loc de standardul cu trei. Produşii de amplificare au fost
separaţi prin electroforeză în gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin colorare cu argint.
Nivelul complexităţii profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea
condiţiilor de reacţie. Ca urmare a apariţiei mai multor variante de amprentare a
întregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles şi colab., au
propus în (1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de Multiple
Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP).
Totuşi, datorită simplităţii şi utilităţii, numele şi metoda originală RAPD, cunoaşte
10
cea mai largă răspândire. Această tehnică permite amplificarea unui număr mai mare de
fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de
poliacrilamidă.
7. Identificarea alterării numărului de copii genice- metoda MLPA( Multiplex
Ligation- dependent Probe Amplification) . Este o metodă de PCR multiplex ce detectează
existența unui număr anormal de copii, până la cincizeci de secvențe de doar un nucleotid.
( Schouten JP et al. 2002) Poate fi folosită în mai multe laboratoare deoarece , nu necesită
decât un termociclor și un echipament de electroforeză prin capilar. Prin această tehnică pot fi
procesate până la 96 de probe simultan. Când comparăm MLPA cu FISH, MLPA-ul nu are
numai avantajul multiplex , dar de asemenea este una în care secvențe foarte mici devin
ținta( 50-70 nt) ceea ce permite MLPA-ului identificarea aberațiilor frecvente ale unei gene ce
sunt prea mici pentru a fi detectate prin FISH . De asemenea , MLPA poate fi folosit pe ADN
purificat . Comparat cu array CGH, MLPA este o metodă ieftină și ușor de realizat. Tipic
pentru MLPA este faptul că ținta nu este reprezentată de secvențele ce sunt amplificate ci de
sondele MLPA care hibridizează cu secvențele țintă , în contrast cu un PCR standard de tip
multiplex .
Reacția MLPA poate fi împărțită în 4 pași principali:
denaturarea ADN- ului și hibridizarea sondelor MLPA;
reacția de ligare;
reacția PCR;
separarea produșilor de amplificare prin electoforeză și analiza datelor.
Tipuri de MLPA: RT- MLPA - Un tip special de MLPA creat pentru caracterizarea
expresiei genice și în consecință a ARNm.( Elding , e. , et al . 2003 ) . Schimbarea
expresiei genice joacă un rol important în dezvoltarea celulei și în procesele de
diferențiere și patologie . RT- MLPA este disponibil pentru detectarea ARNm a
numeroase gene implicate în inflamație și apoptoză. Oferă numeroase avantaje în
comparație cu alte tehnici de caracterizare a expresiei genice cum ar fi Northern
blotting , Real time PCR și microarray. Permite procesarea rapidă a numeroase probe
într-un format standard de PCR de 96 godeuri. Al doilea tip special de MLPA este
Metylation – Specific MLPA ( MS- MLPA) folosit pentru caracterizarea atât a
cuantificării cât și a metilării numărului de copii.( Nygren AO , et al.2005) . Metoda
MS-MLPA s-a dovedit a fi o mre genică ( Bittel , D.C . ,et al. 2007. Dikow , N. , et al.
2007. Procter , M , et al . 2006 ) și mai ales pentru analiza aberațiilor de metilare a
probelor de tumori ( Jeuken , J., et al.2006. Hess, C.J. , et al. 2008) .
11
ARMS –PCR technique (Amplification Refractory Mutation System –PCR)
O modificare a metodei PCR, care permite detecţia mutaţiilor punctiforme
cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR.
Aceasta este o metodă care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar
genotipizarea este posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin elecroforeză
în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea mutaţiilor prin amplificare refractară,
descrisă pentru prima dată de Newton C.R. şi colab., 1989.
Metoda constă în utilizarea a doi primeri care prezintă aceeaşi secvenţă de
nucleotide cu excepţia nucleotidei terminale 3’ – unul complementar cu alela normală, iar
celălat cu alela mutantă. Pentru amplificarea enzimatică se foloseşte Taq-polimeraza,
enzimă care nu are activitate exonucleazică 3’5’, ceea ce implică necesitatea unei
perfecte complementarităţi a primerului cu capatul 3’ al matriţei ADN. Rezultatul se
obţine în urma electroforezei în gel de agaroză prin prezenţa sau absenţa produsului de
amplificare respectiv.
Specificitatea este obţinută dacă primerul oligonucleotidic este complementar cu
secvenţa alelei dorite, dar nu este complementar cu cealaltă alelă la capătul 3’, sau în
imediata vecinătate a capătului 3' al primerului specific de alelă. Neamplificarea este
rezultatul nepotrivirii dintre ADN matriţă şi oligonucleotidul din primer. Pentru că
Taqpolimeraza nu are activitate exonucleoazică în direcţia 3'5', această nepotrivire
împiedică eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei. Metoda este
aplicabilă, în general, în detecţia mutaţiilor punctiforme cunoscute, mici deleţii şi inserţii,
polimorfisme şi alte variaţii în secvenţa ADN. De aceea, o mutaţie (sau un polimorfism) poate
fi detectată prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o elongare
eficientă, în cazul unui cromozom mutant şi o elongare ineficientă, în cazul unui cromozom
normal.
SSCP TECHNIQUE (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)
Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului determinat de cel puţin o
nucleotidă. Evidenţierea polimorfismului se face în timpul electroforezei în gel de
poliacrilamidă. Acest polimorfism se bazează pe diferenţele de conformaţie ale unei
singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct, datorită unei
substituţii, deleţii sau inserţii (Barroso , A. şi colab., 1998). În anumite condiţii, acizii
nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluţie o structură secundară. Structura
secundară depinde de compoziţia în baze, structură care poate fi alterată şi de substituţia
12
unei singure nucleotide. Această diferenţă va determina o mobilitate electroforetică
diferită în condiţiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamidă nedenaturat).
Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi detectate se face după o prealabilă colorare
cu argint sau după marcarea radioactivă.(Abba , M.C. şi colab.,2001).
STS technique (Sequence –Tagged Site)
Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvenţă unică într-un punct definit
din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiţi markerii genetici RAPD în markeri
STS, pentru acelaşi locus. Tehnica nu necesită clonare dacă există informaţii anterioare
despre secvenţă, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi
conceput după secvenţa fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior
fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvenţa unui produs PCR - RAPD sau a
sondelor RFLP).
Polimorfismul este în general detectat ca o diferenţă de mărime în produsul de
amplificare STS faţă de produsul RAPD, de la acelaşi locus. Dacă nu există nici o
diferenţă de mărime, se apelează la restricţia enzimatică pentru a tăia produşii de
amplificare şi pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi astfel detectat un
polimorfism de câteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi decât
primerii RAPD şi bazaţi pe o secvenţă specifică, această metodă detectează
polimorfismul de la acelaşi locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică.
Dezavantajul metodei este că proiectarea şi crearea primerilor poate implica o investiţie
importantă ( Roach J. C. şi colab., 2000).
Aplicabilitatea tehnicilor în laboratoarele din țara noastră
Tehnica real-time PCR mai este folosită în determinarea cantitativă a viremiei la
pacienții infectați cu virusurile hepatice B și C ; analiza mutației factorului V Leiden și a
mutației protrombinei. De curând s-a trecut de la tehnologia convențională PCRla tehnologia
real-time PCR Taqman cu prelucrare automată a probelor.Diferența constă în metoda de
detecție a produsului PCR, care este cuantificat în cursul desfășurării reacției prin
monitorizarea fluorescenței emise la fiecare ciclu de amplificare , spre deosebire de detecția
colorimetrică care avea loc la sfârșitul reacției .
Determinarea cantitativă a viremiei ( VHB) se bazează pe două procese majore:
- pregătirea probei pentru a izola ADN-VHB;
13
- amplificarea PCR a ADN-ului țintă cu detecția simultană a sondei oligonucleotidice dublu
marcate clivate specifice țintei.
Cuantificarea viremiei se realizează cu ajutorul unei secvențe ADN neinfecțioase
denumită Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un număr cunoscut de copii este adăugat
în fiecare probă și parcurge aceleași etape de preparare a probei, amplificarea PCR si detecție,
ca și secvența țintă. QS conține secvențe VHB cu zone identice de legare a primerilor ca și
ADN-ul țintă, dar cu o zonă unică de legare a sondei de detecție care permite diferențierea
ampliconului QS de ampliconul țintei. Analizorul calculează concentrația ADN-VHB prin
comparararea semnalului țintei cu semnalul QS din fiecare probă și controale.
Extracția acizilor nucleici se face automat printr-o tehnică de captură la suprafața unor
biluțe magnetice de sticlă. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatură ridicată
cu o protează și un tampon care eliberează acizii nucleici și îi protejează de acțiunea DNA-
zelor din plasmă. În fiecare probă este introdus ADN QS într-o concentrație cunoscută,
împreună cu proteaza, agentul lizant și biluțele de sticlă. După ce are loc incubarea
amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captați la suprafața biluțelor de sticlă, în
timp ce substanțele nelegate vor fi îndepărtate printr-un proces de spălare. După încheierea
etapei de spălare, acizii nucleici adsorbiți vor fi diluați cu o soluție apoasă la temperatură
înaltă. Proba procesată, ce include biluțele de sticlă împreună cu ADN VHB si ADN VHB
QS, va fi adăugată amestecului de amplificare si transferată în analizorul în care vor avea loc
amplificarea și detecția. În cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face în prezența
unui sistem raportor care emite fluorescență. Detecția se realizează cu ajutorul sondelor de tip
5’ nuclează-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capăt cu o substanță fluorofora (“reporter
dye” R) și la celălat capăt cu o moleculă blocantă (“quencher dye” Q). Cât timp sonda este
intactă, fluorescența sistemului R va fi inhibată de molecula Q. In cazul în care amplificarea
este eficientă, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; în
cursul etapei de elongație, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa
enzimatică de 5’ endonuclează și va elibera astfel fluoroforul.
Analiza mutatiei factorului V Leiden
Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutații punctiforme a genei umane care
codifică factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigură amplificarea unui
fragment ADN țintă din gena factorului V, izolat printr-o tehnică automată dintr-o probă de
sânge integral.
14
Pentru efectuarea testului se utilizează sistemul PCR LightCycler care folosește o
detecție în timp real prin fluorescența produsului amplificat diferită de cea obținută cu
ajutorul sondei TaqMan. Astfel, pentru detecția ampliconului se folosesc 2 sonde care
hibridizează la o secvență internă a fragmentului amplificat, în cursul fazei de hibridizare a
primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2 secvențe oligonucleotidice specifice, marcate cu
fluorofori diferiți:
- sonda 1, marcată la capătul 3’ cu fluoresceina (fluoroforul donator D);
- sonda 2, marcată la capătul 5’ cu substanța LightCycler Red 640 (fluoroforul
acceptor A). Secvențele celor 2 sonde sunt astfel selectate încât să hibridizeze la secvențele
țintei într-un aranjament de tip cap-coadă, facilitând apropierea celor 2 fluorofori.
Fluoresceina este excitată de lumina albastră emisă de o sursă a LightCycler-ului și emite o
lumină fluorescentă verde. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de
hibridizare, energia emisă excită la rândul său fluoroforul Red 640, printr-un transfer de
energie a rezonanței fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer); acesta va
emite o lumină fluorescentă roșie, a cărei intensitate va fi măsurată în unitatea optică a
LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescență emisă va fi proporțională cu nivelul țintei.
Metoda de detectie a fluorescentei light cycler
Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutației,
prin analiza curbei de topire efectuată după încheierea ciclurilor de amplificare, când
ampliconul este prezent în concentrații crescute.
Sonda marcată cu Red 640 hibridizează la o secvență a țintei care nu conține situsul
mutației (sonda ancora); sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include
situsul respectiv (sondă a mutației). În cursul analizei curbei de topire, creșterea
semnificativă a temperaturii induce scăderea fluorescenței emise, deoarece sonda cu o
secvență mai scurtă (sonda mutației) este prima care disociază și cei 2 fluorofori nu mai sunt
in apropiere. Dacă este prezentă mutația factorului V, nepotrivirea sondei mutației cu țintă va
destabiliza hibridul, astfel că scăderea fluorescenței se va înregistra la temperaturi mai joase.
În prezenta genotipului sălbatic (fără mutație), heteroduplexul ADN este stabil și va
avea o temperatură de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezintă o combinație distinctă
de proprietăți.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie să prezinte întotdeauna un profil al
curbei de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot sălbatic (mutație absentă),
15
mutant homozigot sau genotip heterozigot. Dacă nu se produce acest lucru, testul va fi
considerat invalid și vor trebui repetate toate etapele.
În plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ si pozitiv, cu
mențiunea că, pentru acesta din urmă trebuie să se obtină obligatoriu un profil de genotip
heterozigot.
Detecţia tipurilor oncogene HPV .
Testul include 4 procese majore:
- pregatirea probei;
- amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV;
- hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei;
- detecția acestora printr-o metoda colorimetrica.
Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale
recoltate in mediu lichid, printr-o tehnica manuala. Amplificarea se realizeaza intr-un
termocycler, iar detecția pe un analizor ELISA automat. Pentru monitorizarea acuratetii
acestor 4 procese, se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul β-globinei umane
care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Amestecul de reactie contine perechi de
primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt, cat si pentru
ADN-ul β-globinei. Detecția ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde
oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui
corespunzator β-globinei.
Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv
pentru ADN-ul β-globinei.mbinei se folosește o metodă similară.
Genotiparea HPV
In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37
genotipuri HPV precum si a genei β-globinei. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un
ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub
forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale.
Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA
Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27, marker pentru
spondilita ankilopoietica.
Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru
tipizarea HLA. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri, fiecare continand una
sau mai multe perechi de primeri specifici, precum si o pereche de primeri de control
16
(specifici pentru o secventa nonalelica din proba, care functioneaza ca un control intern al
PCR, verificand eficiența procesului). Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri
cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient
decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3’.
Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare, iar
procesarea post-amplificare este redusa la maximum. In cazul in care are loc amplificarea,
identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza.
Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de
interpretare - Dynal SSP Tool, care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala,
reducând astfel riscul unor erori umane.
Chlamydia pneumoniae PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detectarea Chlamydia pneumoniae prin Reactia Real
Time in lanț a polimerazei. Detectarea C. pneumoniae se bazeaza pe amplificarea unei
secvențe ADN specifice unei singure copii a genei ompA si pe masurarea concentratiei
produsului de amplificare in cursul procesului PCR, prin intermediul unei sonde marcate
fluorescent.
Prezenta C. pneumoniae este indicata de cresterea fluorescentei fluoroforului FAM.
Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland posibila inhibare a
reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului
este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE. Kit-ul de detectare prezinta
avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-specifice si asigurand o
sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG), eliminand posibila
contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare.
Kit de diagnostic de o foarte mare sensibilitate folosind o singura copie a genomului in
reactia PCR. Acest lucru asigura ridicata sensibilitate in detectarea C. pneumoniae in
laborator din material clinic. Kit-ul este conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea
calitativă.
Legionella pneumophila PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Legionella pneumophila
avand la baza amplificarea secvenței specifice L. pneumophila a genei care codifica
subunitatea 16S ARN ribozomal prin reactie de polimerizare in lanț (PCR) si prin masurarea
17
cresterii concentratiei produsului de amplificare in cursul PCR cu sonda marcata fluorescent
(Real time PCR).
Prezenta ADN-ului de Legionella in porba este indicata de cresterea fluorescentei
fluoroforului FAM. Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland
posibila inhibare a reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea
pozitiva a IS-ului este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.
Kit-ul de detectare prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-
specifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),
eliminand posibila contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare. Acest lucru asigura
ridicata sensibilitate in detectarea Legionella in laborator din material clinic. Kit-ul este
conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea calitativă.
Mycoplasma pneumoniae PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru detecția Mycoplasma pneumoniae prin metoda
PCR. Detecția se bazeaza pe principiul amplificarii secvenței ADN specifica pentru M.
Pneumoniae, a genei M181 care codeaza toxina CARDS si masurarea cersterii concentratiei
produsului amplificat pe durata reacției PCR cu ajutorul unei sonde marcate fluorescent (real-
time PCR).
Prezenta Mycoplasma este indicata de cresterea fluorescentei floroforului FAM. In
mixul de reactie este inclus un Standard Intern (IS) care controleaza posibila inhibare a
reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului
este detectata pe canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.
Kit-ul de detecţie prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-
specifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),
eliminand posibila contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare.
Acest kit de diagnostic asigura sensiblitatea foarte ridicata a a detectiei Mycoplasma in
laborator pornind de la materialul clinic. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si
asigura detecția calitativă.
Borrelia burgdoferi PCR Kit
Kit-ul este este conceput pentru detecția speciilor clinice importante din grupul
"Borrelia burgdoferi sensu lato" (B. burgdoferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B.
valasiana, B. lusitaniae, B. andersonii, B. bissettii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi, B. sinica).
18
Kitul se bazeaza pe principiul detectiei secvenței specifice a unei gene cromozomiale, care
codeaza proteina flagelata si a unei gene care codeaza 16S ARN bacterial, specific pentru
grupul B. Burgdoferi sensu lato grup.
Metoda a fost testata pe o gama larga de bacterii europene de tipul Borrelia si
Spirochete. Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la detectarea unei singure copii a
genomului borrelia intr-o reactie, asigurand sensibilitate maxima in detecția in laborator din
fluide organice (fluid sinovial, fluid cerebrospinal, urina) sau sânge. Kitul este destinat pentru
diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.
Neisseria gonorrhoeae PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin
reactia de polimerizare in lanț (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenței
multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.
Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la o singura copie a ADN-ului
genomic gonococcus intr-o reactie, asigurând sensibilitatea maxima a detecției in laborator
din tampoane uretale sau vaginale.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.
Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu
cytomegalovirus. Detecția este bazata pe amplificarea unei secvențe conservative ADN
specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.
Sensibilitatea detecţiei cu ajutorul acestui kit constă in identificarea unui singur genom
al virusului apărut într-o reacție. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea
de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice
(spalatură bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral
pentru 2 x 10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro și asigura detecția calitativă sau
cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente și pentru
monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluției unei boli.
Neisseria gonorrhoeae PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin
reactia de polimerizare in lanț (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenței
multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.
19
Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la o singura copie a ADN-ului genomic
gonococcus intr-o reacție, asigurând sensibilitatea maxima a detecției in laborator din
tampoane uretale sau vaginale.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.
Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit
Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu
cytomegalovirus. Detecția este bazata pe amplificarea unei secvențe conservative ADN
specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.
Sensibilitatea detecţiei cu ajutorul acestui kit consta in identificarea unui singur genom
al virusului aparut intr-o reacție. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea
de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice
(spălătura bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral
pentru 2 x 10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă sau
cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente si pentru
monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluției unei boli.
Epstein-Barr virus (EBV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu Epstein-
Barr virus. Detecția este bazata pe amplificarea unei singure copii a genei EBNA1 nuclear
prin metoda reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei (PCR).
Sensibilitatea de detecţie a kitului ajunge până la o singura copie a genomului viral
/reactie. Acest lucru asigură laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea de 1 la 10 in cazul
probelor de tesut (biopsii) și de sute per ml. in probele de fluide biologice (spălătura
bronhoalveolara, ser, salivă) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral pentru 2 x
10E5 leucocite).
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigură detecţia calitativă sau
cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente și pentru
monitorizarea eficienței terapiei sau a evoluției unei boli.
20
HSV/VZV PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecția simultana a virusului Herpes simplex (HSV) si
virusului Varicella-Zoster (VZV) prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea
polimerazei (PCR).
Detecția VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei
singure copii a genei pentru ORF62 (IE62 transactivator). Detecția ambelor tipuri de HSV
(HSV-1, HSV-2) este bazată pe amplificarea PCR a unei secvențe ADN conservative a unei
gene single-copy a glicoproteinei B (g.
Sensibilitatea de detecţie a kitului ajunge până la o singura copie a genomului viral
/reactie. Aceasta asigura o sensibilitate inalta pentru detecția in laborator a sute de virusi/ml in
probe de fluide biologice (ser, alte fluide) sau sânge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigur detecţia calitativă.
Herpes Simplex Virus (HSV-1/2) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) și Herpes
Simplex Virus de tip 2 (HSV-2) prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea
polimerazei (PCR). Detecția HSV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN
conservative a unei singure copii a genei pentru glicoproteina B (g și măsurarea concentraţiei
produsului de amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate
fluorescent, de EX cu colorant FAM pentru HSV-1 și Cy5 pentru HSV-2.
Mixul de reacţie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a
reacției PCR și eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un
semnal pozitiv pe canalul JOE.
Kitul de detecție este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice și asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de
amplificare. Aceasta asigură detecţia foarte sensibila in laborator a HSV-1 si HSV-2 in
probele de fluide biologice si sânge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro și asigură detecţia calitativă și
cantitativă.
Herpes Simplex Virus (HSV-1) PCR Kit
Acest kit PCR este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) prin
metoda reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei (PCR).
21
Detecția HSV este bazată pe amplificarea unei secvenţe ADN conservative, a unei
singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si măsurarea concentraţiei produsului de
amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Real-
time PCR). Probele pozitive HSV-1 duc la creșterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul
de reacție include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR și
eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un semnal pozitiv pe
canalul JOE.
Kitul de detecție este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice și asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de
amplificare.
Această metodă asigura detecţia foarte sensibilă in laborator a HSV-1 in probele de
fluide biologice si sânge. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția
calitativă și cantitativă.
Herpes Simplex Virus (HSV-2) PCR Kit
Acest kit PCR este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 2 (HSV-2)
prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea polimerazei (PCR).
Detecția VZV este bazată pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei
singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si măsurarea concentraţiei produsului de
amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Real-
time PCR). Probele pozitive HSV-2 duc la cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul
de reactie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR și
eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un semnal pozitiv pe
canalul JOE.
Kitul de detecţie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice si asigurănd maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de
amplificare.
Aceasta metoda asigura detecția foarte sensibilă in laborator a HSV-2 in probele de
fluide biologice si sânge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si
cantitativă.
22
Varicella - Zoster Virus (VZV) PCR Kit
Acest kit PCR este destinat pentru detecția Varicella-Zoster Virus (VZV) prin metoda
reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).
Detecția VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei singure
copii a genei ORF62 si masurarea concentratiei produsului de amplificare pe durata
procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate cu colorantul fluorescent FAM. Mixul de
reactie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR si
eficiența procesului de izolare a ADN-ului (varianta ISEX). Amplificarea IS rezulta intr-un
semnal pozitiv pe canalul JOE.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice si asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de
amplificare. Aceasta asigura detecția foarte sensibila in laborator a VZV in probele de fluide
biologice si sânge.
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si
cantitativă.
Hepatitis B Virus (HBV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecția Hepatitis B Virus (HBV) prin metoda reacției de
amplificare in lanț sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).
Detecția HBV este bazată pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei
singure copii a ORFx si măsurarea concentraţiei produsului de amplificare pe durata
procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent. Prezenta HBV duc la
cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul de reactie include un Standard Intern (IS)
care reglează posibila inhibare a reacției PCR si eficiența procesului de izolare a ADN-ului.
Amplificarea pozitiva a IS este detectată pe canalul de fluorescenta al fluoroflorului HEX.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de
amplificare.
Sensibilitatea kitului de diagnostic coboara până la o singura copie a virusului intr-o
reactie PCR. Aceasta asigura detecția foarte sensibila in laborator a HBV in probele de fluide
biologice (plasma, ser).
23
Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si
cantitativă.
Hepatitis C Virus (HCV) PCR Kit
Acest kit este destinat pentru detecția RNA Hepatitis C Virus (HBV) bazată pe
amplificarea unei singure copii a secvenței 5 URT prin intermediul unei reactii de revers-
transcriptie urmata de amplificarea in lanț (RT-PCR) si măsurarea creşterii concentraţiei
produsului de amplificare pe durata PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent
"real-time PCR".
Sonda destinată detecţiei patogene este marcată cu fluoroforul FAM. Mixul de reactie
"gata de utilizare" include toate componentele necesare pentru amplificarea ARN-ului
microorganismelor detectate.
Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile
nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADN-
glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de
amplificare.
Kitul contine de asemenea un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a
reacției PCR si eficiența procesului de izolare a ADN-ului (sonda destinată detectiei IS este
marcata cu fluorofor HEX).
MTHFR A1298C PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei A1298C in gena pentru reductaza
methylentetrahydropholate (MTHFR) prin intermediul metodei Real-time PCR.
Această metodă se bazează pe amplificarea secvenței ADN a genei MTHFR purtătoare
de mutatie A1298C si hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluorescent pentru
alela standard C1298C si pentru alela mutanta A1298A a genei MTHFR.
Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutanta.
Factor II Prothrombin PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei G20210A in gena protrombinei (factor II)
prin metoda Real-time PCR.
Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvențe ADN de protrombina cu
mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru
alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.
24
Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.
Factor II Prothrombin PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei G20210A in gena protrombinei (factor
II) prin metoda Real-time PCR.
Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvențe ADN de protrombina cu
mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru
alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.
Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.
Lawsonia intracellularis PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecția agentului ce cauzeaza boala intestinala porcina,
bacteria patogena Lawsonia intracellularis.
Metoda este bazata pe amplificare unei secvențe specifice de codificare antigen LsaA.
Sensibilitatea kitului coboara până la apariţia unui singur genom bacterial intr-o reactie.
Aceasta oferă în laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece in frotiuri sau in
excremente si probe de tesut.
Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativă.
Porcine circovirus (PCV) PCR Kit
Acest kit este conceput pentru detecția circovirusului porcin, agentul ce cauzeaza boala
porcina "PMWS".
Metoda este bazata pe amplificare unei secvențe specifice de ORF1. Sensibilitatea kitului
coboara până la apariţia unei singure secvențe intr-o reactie. Aceasta oferă in laboratorul de
diagnostic o sensibilitate de unu la zece in probele de ser, in frotiuri, excremente si probe de
tesut, precum si sensibilitate de sute in 1 ml sânge.
Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativă si semi-calitativă si prevede
stabilirea concentratiilor particulelor virusului in probele. Metoda poate detecta tipurile
veterinare patogene PCV-2 si PCV-1 ce contamineaza culturile de tesut provenite de la
rinichii porcilor (EX: PK-15).
O identificare ulterioara a tipurilor PCV-1 si PCV-2 pote fi efectuata prin metoda PCR-
RFLP, utilizand fragmentarea specifica a enzimei de restrictie Ncol, a carei secventa tinta este
gasita numai in produsul de amplificare al versiunii PCV2.
25
Porcine circovirus (PCV) PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detecția universala a virusurilor ARN de Pestivirus sp. (in
special pentru detectarea virusului viral diareic bovin / BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-1c,
BVDV-1d, BVDV-2 /; virusul bolii de granita (BDV); virusul pestei porcine clasice (CSFV))
prin reactie in lanț a revers polimerazei (RT-PCR).
Metoda se bazeaza pe amplificarea unei secvențe specifice a genei care codifica virusul
poliprotein. Diagnosticarea prevede o detectare de o mare sensibilitate a pestivirusurilor ce
contamineaza culturile de celule si soluțiile utilizate pentru culturile de tesuturi (de EX:
virusul culturi, BSA), precum şi controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de
celule (de ex: vaccinuri).
Aceasta metoda este unic adaptata pentru detectarea inhibarii reacției si, datorita
simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate standard, chiar si pentru analiza
materialelor cu continut ridicat de inhibitori PCR.
PathogenFree DNA Isolation Kit
Acest kit pentru izolarea ADN-ul este conceput pentru a fi utilizat in diagnosticare si
laboratoare de cercetare care se ocupa cu diagnosticarea prin PCR de rutina a
microorganismelor patogene (bacterii, candida si fungi, virusuri si protozoare) sau in
diagnostic genetic uman.
Datorită designului cu coloane kitul asigura o operare simpla, eficientă si rapidăpentru
izolarea ADN-ului din materiale clinice fără contaminare cu ADN microbian. Kit-ul este
conceput în principal pentru izolarea ADN-ului din sânge, fluide biologice si alte probe
clinice.
Mycoplasma species PCR Kit
Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic in speciile de Micoplasma
prin reactia in lanț a polimerazei (PCR). Aceasta detectare este focusata pe o secventa multi-
copie a genei bacteriei codificate 16S ARN, specifica pentru speciile de Micoplasma.
Sensibilitatea kitului coboara până la aparitia unui singur genom bacterial intr-o reactie.
Kitul asigura detectie universala a tuturor micoplasme umane semnificative din punct de
vedere clinic si ureaplasme, inclusiv M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, U. urealitica
şi M. fermentans.
26
Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece micoplasme in 1
ml fluid biologic fara celule (urina, lavaj bronhoalveolar, sputa) sau până la sute de
micoplasme in 1 ml sânge sau spermă.
Kit-ul este proiectat si certificat pentru diagnostic in vitro si ofera detectie calitativă.
Kit-ul este conceput, de asemenea, pentru o detectie sensibila a tuturor tulpinilor Micoplasma
ce contamineaza culturile de tesuturi si solutii pentru culturile de celule (de exemplu: culturi
virusuri, BSA), precum şi pentru controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de
celule (de exemplu, vaccinuri). Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu
la zece micoplasme in 1 ml de TK sau solutie BSA. Aceasta metoda este unic adaptat pentru
detectarea inhibarii reacției si datorita simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate
standard, chiar si pentru analiza materialelor cu conținut ridicat de inhibitori PCR.
Aceasta metoda este capabila să detecteze toate tulpinile Micoplasma cunoscute (Centrul
National pentru Biotehnologie Informaţii SUA; 2006) si este ajustat pentru a detecta cel puțin
următoarele tulpini de industrial sau veterinare Mycoplasma specii semnificative:
Acholeplasma axanthum, Mycoplasma alvi, M. arginini, M. buccale, M. cavipharyngis,
M.cloacale, M. Fastidiosum, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. salivarium, M.
pulmonis, M. Orale, M. penetrans, M.pirum, M. pneumoniae, Ureaplasma urealyticum,
U.diversum , U. parvum , Acholeplasma sp., etc.
Concluzii :
Tehnicile PCR au un impact puternic în foarte multe domenii , cea ce ne lasă de
înțeles că sunt metode ușor de folosit, permisive din punct de vedere financiar, și care ar
trebui să se găsească în mai multe laboratoare din țara noastră . Utilizarea lor ar putea ajuta
foarte mult sistemul medical prin diagnostificarea precoce a anumitor boli ceea ce ar duce la
economisire datorată acestui diagnostic . O boală depistată devreme implică un cost mai mic
pentru sistem.
Studiile de cercetare din acest domeniu ar putea cât de curând să ne ajute la
personalizarea tratamentelor ceea ce ar duce la rezultate cât mai bune, sau chiar spre
vindecare a unor boli care momentan nu au răspuns .
Bibliografie:
1. Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de
laborator ;
27
2. CHUNG, H.Y., M.E. DAVIS, AND H.C. HINES, 2001, Relationship of two PCRRFLP
in the bovine calpastatin gene with calpastatin activity, meat tenderness, and carcass
traits. Ohio State University Research and Reviews: Beef and Sheep 2001.Circ. 181-01;
3. Florin Zugun-Eloae, Iuliu Cristian Ivanov - Tehnici de amplificative (PCR) și
nonamplificative(hibridizare in situ) de analiză a acizilor nucleici în diagnosticul
molecular, Editura ,,Grigore T. Popa”, 2013
28