noi metode pcr

47
NOI METODE P. C. R. Coordonator: Profesor doctor Candidat: ................................ Pintilescu (Budală) Mirela 1

Upload: budala-mirela

Post on 09-Dec-2015

337 views

Category:

Documents


5 download

TRANSCRIPT

Page 1: Noi Metode Pcr

NOI METODE P. C. R.

Coordonator:

Profesor doctor Candidat:

................................ Pintilescu (Budală) Mirela

2015

Reacția de polimerizare în lanț , prescurtat( PCR ) a fost numită de Lederberg ,,

instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară “ . Reacția PCR ((Polymerase

Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ) dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN

1

Page 2: Noi Metode Pcr

să poată fi extrasă o singură moleculă de ADN, care apoi poate fi amplificată enzimatic, cu

mijloace tehnice aparent simple, are loc in vitro. În vederea aplicabilității pe diferite domenii

(criminalistică, studii ecologice ,arheologie, științe medicale , industria

alimentară ,epidemiologie , biologie moleculară ) a fost dezvoltată o adevărată tehnologie

PCR, care din punct de vedere chimic , este construită din cicluri succesive de replicare ADN

in vitro , Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de

replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene

ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).Replicarea ADN in vivo diferă de

replicarea ADN in vitro doar prin faptul că , în reacția PCR etapa de desfacere a dublului

helix mariță și respectiv, cea de atașare a primerilor , nu sunt realizate enzimatic , ea

parcurgând unele trepte de temperatură , iar singura enzimă folosită în reacție este o ADN

polimerază , ADN-dependentă ( cu funcție de replicază ) .

PCR este o metodă cu un spectru larg de aplicabilitate datorită avantajelor .

Pentru ceretare nu este nevoie de o cantitate mare de ADN . Prin ,, agățarea unei

molecule de ADN se pot diagnostifica boli genetice , identifica criminali și putem găsi

răspunsuri la întrbările care nu ne dau pace ,, Cine suntem noi , de unde venim noi ? .

Polimerase chain reaction ( PCR) este o reacție care are la bază o tehnologie in vivo care

imită capacitatea naturală de replicare a ADN și care constă în generarea rapidă a unor copii

multiple a unei secvențe nucleotidice țintă ( ADN sau ARN )dintr-o genă de interes sau un

patogen specifi.. Copia rezultată este numită amplicon .Amplificarea se realizează într-un

analizator special ( thermal cycler). Amperaza este enzima care promovează amplificarea

selectivă a țintei și distrugerea produșilor de contaminare din cursul reacțiilor de amplificare

anterioare. Reacția PCR are loc în trei etape :

1. Denaturarea : amestecul se încălzește la 94 grade iar ADN se desface în două

catene.

2. Hibridizarea primerilor: temperatura va fi scăzută la 55-70 grade Celsius ,

primerii se vor atașa complementar la capetele 3 ale celor două catene.

3. Elongația are loc la o temperatură de 72 de grade și va extinde primerii

atașați în lungul matriței țintă și va produce un amplicon ADN. Analizatorul va repeta

automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35).

I. Aplicabilitatea practică a PCR-ului.

În anii 1980 , se folosea ADN – polimeraza Klenow (fragment de ADN –polimeraza

termostabilă , izolată de la bacteria Termus acquaticus. Astăzi tehnologia PCR a fost

2

Page 3: Noi Metode Pcr

revoluționată prin dezvoltarea metodelor de detecție în faza exponențială numită detecție în

timp real ( real-time PCR). Această reacție are ca și avantaj acuratețea rezultatelor obținute.

Comparativ cu tehnica PCR convențional ,detecția are loc în faza de platou, după ce a

fost stopată iar produșii au început să se degradeze. Domeniul de linearitate este mult extins

folosind mai puține diluții ale probelor. Limita inferioară de detecție este mult îmbunătățită

(se pot detecta cantități mai mici de ADN-ului țintă).

Produsele ADN obținute prin PCR sunt separate electoforetic în funcție de dimensiuni,

sub formă de benzi, în gelul de electoforeză, iar apoi benzile sunt făcute vizibile în lumina UV

prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. Se realizează hibridizarea ADN-ului cu

sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. Reacția de polimerizare în lanț poate

fi aplicată în foarte multe domenii de interes cu ar fi: medicină, ecologie, arheologie. În

diagnosticul medical reacția PCR este utilizată în diagnostificarea bolilor ereditare(fibroza

chistică, anemia Cooley, distrofia musculară Duchenne, fenilcetonuria).

Aceste boli pot fi depistate prenatal, grație metodei PCR, prin determinarea ADN-ului din

celulele trofoblastice. Se mai poate determina sexul copilului, dar și o boală genetică

II. Variante tehnice ale reacției PCR

Multiplex PCR constă în introducerea PCR a mai multor seturi de primeri, specifici

pentru secvențe diferite de ADN, care vor produce ampliconi de dimensiuni diferite.

Metoda este foarte utilă datorită faptului că furnizează informații multiple, care prin

PCR clasic ar fi posibile doar prin amplificări, cu consum de tipi și reactivi. Problematica

ridicată de multiplex PCR constă în alegerea setului de primeri care trebuie să se hibridizeze

eficient la o singură temperatură. Acest inconvenient duce la limitarea numărului de secvențe

amplificate. A doua situație dificilă este sortarea pentru amplificat a unor secvențe de

dimensiuni diferite care prin migrare electroforetică să nu producă suprapunerea benzilor.

Metodele de laborator convenționale, bazate pe cultivarea și identificarea agentului

etiologic prezent în produsul patologic, poate necesita câteva zile pentru obținerea unui

rezultat cert. În plus introducerea precoce a tratamentului cu antibiotice, înaintea recoltării

probelor biologice, a diminuat numărul cazurilor de meningită confirmate prin metode de

laborator tradiționale. Acest impas poate fi depășit prin identificarea microorganismului direct

în produsul patologic, utilizând în principal tehnica PCR. Este folosită o reacție PCR

multiplex care permite detectarea simultană a celor trei microorganisme care cauzează

majoritatea meningitelor bacteriene : Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae și

Haemophilus influenzae.

3

Page 4: Noi Metode Pcr

Această metodă țintește trei gene specifice speciilor menționate: ctrA – codifică o proteină

de membrană implicată în transportul capsulei la N. Meningitidis; ply- codifică pneumolizina

la S. pneumoniae; bexA – codifică o proteină implicată în exportul capsulei polizaharidice la

H. Influenzae. Studiile efectuate pe probe biologice în diferite laboratoare, au evidențiat

sporirea numărului de rezultate pozitive înregistrate în diagnosticul etiologic al meningitelor

acute bacteriene obținute prin utilizarea unei reacții PCR multiplex și sunt unanim de acord

asupra utilității includerii unor reacții de acest tip de acest tip în diagnosticul molecular de

rutină.

Identificarea serogrupului / serotipului reprezintă primul pas în caracterizarea tulpinilor

de meningococ și cel mai important pentru managementul prompt al contracțiilor. Pentru

acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de amplificare a acizilor nucleici, pentru

identificarea serogrupului la nivel molecular ( genogrup), care sunt sau trebuie să devină o

parte importantă într-un laborator. Pentru determinarea sensibilității la agenți antimicrobieni

în absența unor culturi bacteriene, s-a experimentat detectarea mutațiilor în secvența genelor

implicate în rezistența principalilor agenți cauzali ai MBA la substanțe antimicrobiene prin

amplificarea PCR urmată de secvențiere.

https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetic%C4%83&biw

NESTED PCR este o variantă modificată a amplificării PCR folosită pentru a reduce

formarea de produși nespecifici sau pentru a amplifica un produs a cărui matriță este în

cantitate foarte redusă. Metoda constă în amplificarea în două etape (reacții PCR) a unui

fragment, utilizând două seturi de primeri (un set de primeri externi și un set de primeri

4

Page 5: Noi Metode Pcr

interni). În prima reacție PCR se amplifică un fragment de dimensiuni mai mari prin utilizarea

primerilor externi, iar în a doua reacție PCR se utilizează primerii interni, rezultând un

fragment de dimensiuni mai mici dar într-o cantitate mai mare.

https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetică&biw

Hot start PCR o reacție PCR proiectată pentru a evita apariția de produși nespecifici

determinați de activitatea defectuasă a polimerazei la temperaturi reduse (sub Tm a

primerilor) în timpul manipulării reactivilor și realizarea mixului PCR. Se folosește o

polimerază care necesită o etapă de activare la temperatură ridicată. Sunt descrise mai multe

metode de inactivare a polimerazei care includ: modificare chimică(anhidride sau

formaldehide), modificări fizice(includerea în bile de parafină), legare cu anticorpi.

5

Page 6: Noi Metode Pcr

https://www.google.ro/search?q=v&biw=1600&bih=799&source

Touchdown PCR(step-down PCR) reprezintă o variație a reacției PCR menite să

limiteze formarea de legături nespecifice ale primerilor la matrița ADN. Temperatura de

hibridizare este definitorie pentru ligarea specifică a primerilor. Metoda constă utilizarea în

primul ciclu de amplificare a unei temperaturi de hibridizare crescute, pentru ca în

următoarele cicluri, primerii se vor fixa foarte specific și vor aduce un avantaj(este amplificat

exponențial) pentru apliconul de interes.

https://www.google.ro/search?q=migrare+electroforetică&biw

Reverse transcrption polymerase chain reaction (RT-PCR) este o variantă a PCR-

ului utilizată pentru identificarea calitativă sau semicantitativă a expresiei genice (transcripția

în ARNm). ARNm este în prima etapă reverstranscris în ADN complementar (ADNc)

6

Page 7: Noi Metode Pcr

utilizându-se o polimerază inversă(reverstrancriptaza) de origine virală. ADNc rezultat este

ulterior amplificat folosind reacția PCR clasic.

Real time o variantă a tehnicii PCR în care se poate vizualiza în timp real producerea

de apliconi, cu ajutorul unor fluorocromi. Tehnica poate fi utilizată pornind de la două tipuri

de matrițe: ADNg, ADNc în cazul în care se utilizează ca matriță ADNg se urmărește

identificarea variațiilor numărului de copiii pentru o anumită genă sau se identifică încărcările

virale. Deci în prima situație(cea a variațiilor numărului de copiii) se utilizează ca referință o

genă (preferabil mai multe gene care nu prezintă deleții sau amplificării în patologia

respectivă. În situația viremiilor realizează de obicei doar o cuantificare absolută. Real time

RT-PCR este o variantă PCR în care amplificarea (creșterea umărului de apliconi) poate fi

vizualizată în timp real utilizându-se fluorescența.

Există două mari categorii de obținere a fluorescenței proporționale cu creșterea

numărului de apliconi din reacție: metodă specifică și metodă nespecifică.

Real time PCR a fost dezvoltat pentru a obține rezultate cât mai curate. Un avantaj

suplimentar al acestei metode este ușurința de a compara rezultatele obținute din experimente

diferite.

Metode de identificare a mutațiilor prin biologie moleculară.

1. High resolution melting = tehnică ce constă în analizarea post-amplificare PCR a

curbelor de topire a fragmentelor de interes(apliconi) este o metodă atractivă simplă (doar un

set de primeri) și rapidă de realizat. Impune realizarea unor etape consistente de optimizare,

utilizarea unor fluorocromi cu sensibilitate foarte mare și de asemenea utilizarea unei

aparaturi(real-time PCR) care să permită înregistrarea unui număr mare de date cu o variație

constantă uniformă și precisă a temperaturii. Metoda se bazează pe utilizarea curbelor de

disociere(melting sau topire) a produșilor de interes fiind disponibilă datorită îmbunătățirii

coloranților care emit fluorescență la legarea de ADN-ul dublu catenar, și evoluției aparaturii

de real-time PCR(cu rotor, care asigură o omogenitate a temperaturii de topire) și a

programelor de analiză asociată fiecărui aparat în parte. Permite detecția rapidă a mutațiilor

genice(SNP) permițând identificarea unor noi variante(fără posibilitatea de a le caracteriza).

HRM începe cu amplificare PCR a regiunii de interes, în prezența coloranților care se

leagă de dublu helix și emit fluorescența. Fluorescența este mai intensă când sunt legați de

ADN dublu catenar(dsADN) și o fluorescență foarte slabă când sunt legați de dsADN.

Amplificarea este urmată de o curbă de topire la o rezoluție foarte înaltă(HRM)

alcătuită din pași mici(0,10 Celsius) și cu o citire a unui număr foarte mare de evenimente

7

Page 8: Noi Metode Pcr

fluorescente pentru fiecare pas cu o precizie foarte mare. Când dsADN se denaturează în

catenele componente fluorocromul este eliberat ducând la o scădere a fluorescenței generale

din tub. Rezultatul constă în obținerea unei curbe de melting caracteristic fiecărui aplicon.

Reacția HRM poate avea loc într-o singură etapă (PCR+MELT) sau poate fi realizată

reacția PCR într-un termociclor standard, și doar HRM într-un Real – Time PCR. Produsul

PCR obținut prin realizarea curbei de melting nu este unul nou, el utilizându-se de rutină în

Real-Time PCR nespecific. Acest procedeu se numește astăzi Lou Resoltion Melting(LRM).

Curba de topire în LRM este realizată prin creșterea temperaturii cu un pas mai mare de

temperatură de 0,5o Celsius. Cea mai mare rată de scădere a fluorescenței în procesul de topire

este la temperatura caracteristică a ampliconului obținut.

1. Amplification Refractory Mutation System(ARMS) denumită și Alelele specific

PCR(ASP) este o metodă care se bazează pe amplificarea PCR-ului standard folosită în

detecția STR-urilor (Newton et. al., 1989). ARMS utilizată pentru analiza unei palete largi de

polimorfisme, mutații germinale și somatice. Tehnica poate identifica nivele scăzute ale alelei

mutante.(Billadeau et. al., 1991). Tehnica poate identifica probe corespunzătore WT, MT, HZ,

doar pentru mutația vizată. Mai poate identifica mutații punctiforme sau SNP germinale

(moștenite) la care raportul dintre cele două alele(în cazul unui heterozigot), cu excepția

indivizilor cu mozaic cromozomial, este unu.

Tehnica PCR poate fi adaptată în mai multe variante pentru a putea răspunde unor

întrebări foarte precise legate de matrița care trebuie amplificată putând fi realizate într-o

singură amplificare sau în amplificări separate, calitativ sau cantitativ.

2. Restriction fragment length polymorphism este o tehnică ce utilizează capacitatea

enzimelor de restricție de a tăia foarte specific anumite modele de secvențe de ADN. Tehnica

RFLP are la bază o amplificare PCR, în urma căreia se obține un amplicon care conține

polimorfismul sau mutația punctiformă vizată. Se cunosc două variante RFLP: când

polimorfismul studiat transformă secvența ampliconului într-un situs de recunoaștere și când

acesta anulează situsul de recunoaștere a enzimei. Cel mai important în această tehnică este

distincția dintre o reacție de digestie completă și una incompletă. Fragmentele rezultate în

urma digerării polimorfismului vizat să aibă dimensiuni diferite, pentru a putea fi diferențiate

în gelul de agaroză și să fie destul de lungi pentru a nu se suprapune peste eventualii dimeri

deprimeri formați în reacția PCR.

Etapele tehnicii RFLP: în prima etapă se realizează amplificarea PCR cu primeri

specifici care încadrează polimorfismul vizat. În cea de a doua etapă se realizează o migrare

electroforetică pentru verificarea amplificării. Se migrează o cantitate de aproximativ 4 µl, iar

8

Page 9: Noi Metode Pcr

restul se păstrează pentru digestie și controlul nedigerat. Cantitatea de produs de amplificare

se împarte în două secțiuni: controlul nedigerat și produsul care va fi supus digestiei cu

enzima de restricție.

În ultima etapă cele două secțiuni migrează în paralel pentru a se identifica diferențele

3. TaqMan SNP Genotyping

TaqManassays(Applied Byositem, Life Tehnologies, Pleasanton, CA, USA) se bazează

pe discriminarea alelică prin Real –Time PCR în sistem TaqMan tehnică asemănătoare cu

ARMS cu diferența că în loc de primeri sunt utilizate sonde de hidrolize.

Pentru genotiparea prin sistem TaqMan assay se realizează designul de primeri astfel

încât acestea încadrează polimorfismul, iar cele două sonde să fie situate pe zona de interes

(STR), una pe varianta sălbatică și una pe varianta polimorfică. Pentru cele două sonde se

folosesc ca reporter clorocromi a căror emisie să nu se suprapună și să poată fi captată corect

pe canale diferite.

Prin suprapunerea fluorescențelor sau Ct-urilor obținute pe cele două canale, într-un

grafic bidimensional se pot identifica ușor cele patru categorii: dublu negativ(NTC și tuburile

unde amplificarea a eșuat), simplu-pozitiv pe una sau cealaltă fluorescență(homozigot sălbatic

într-un cadran și homozigot mutant în alt cadran) și dublu pozitiv(heterozigot).

În urma utilizării unor controale cu diferite procentaje alela MT, poate da informații de

raportul dintre cele două alele.

Această tehnică este cea mai utilizată pentru identificarea SNP-urilor , deoarece are o

rezoluție foarte bună, de până la 0,01%. Se mai utilizează la identificarea majorității

polimorfismelor, și mutațiilor.

Tehnica poate fi utilizată pentru identificarea mai multor ținte în același timp folosind

sonde de hidroliză cu fluorescențe de referință diferite .

Odată cu introducerea sondelor de hidroliză cuplate cu MinorGoveBinder (MGB) s-a

reușit creșterea sensibilității și specificității metodei, deoarece nepotrivirile la nivelul

secvenței de hibridare a sondei se fac practic fac practic imposibila cuplare a acesteia și

implicit obținerea unui semnal fals de amplificare.

4. Secvențierea Sânger reprezintă tehnica prin care sunt identificate bazele azotate

în ordinea înlănțuirii lor într-o secvență oligonucleotidică de ADN.

De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai multe metode de identificare a secvenței

nucleotidice, metode care diferă atât prin chimia reacției, cât și prin modul de migrare a

produșilor obținuți .În prezent cele mai utilizate metode sunt secvențierea Sânger Dye

Terminator(Sânger et al. , 1975) și metoda pirosecvențierii.

9

Page 10: Noi Metode Pcr

Tehnica Sânger se bazează pe utilizarea unor nucleotide modificate, numite

ddNTP( dideoxinucleotide trifosfat ).Aceste nucleotide nu prezintă în poziția 3 'gruparea-OH,

necesar[ polimerazei pentru a face leg[tura diester cu nucleotidul următor . Acest fenomen

duce la întreruperea bruscă a amplificării. Utilizând ddNTP fluorescente, fiecare fragment

format se va termina cu o anumită fluorescență caracteristică.

Etape de lucru:

amplificarea fragmentului de interes cu primeri specifici prin reacția PCR;

vizualizarea produsului din gelul de agaroză ( folosit când în setul de primeri duce la

obținerea unui număr mare de ampliconi) sau din produsul PCRrămas. Această etapă

este strict necesară pentru a îndepărta primerii neutilizați în reacția PCR și a

celorlalți compuși ai mixului de reacție( dNTP, enzima, buffer , etc.) ;

migrarea electoforetică de siguranță , pentru a verifica prezența produsului purificat.

Se pot identifica probele corespunzătoare fiecărei categorii WT, MT, HZ , pentru toate

mutațiile existente în ampliconul secvențiat. Mai poate identifica deleții, adiții, duplicații,

inversii, etc. , existente în fragmentul amplificat.

MAAP techniques (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling)

Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face

parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), alături de tehnicile DAF

(Amplification Fingerprinting ) şi AP-PCR (Arbitrary Primed PCR).

DAF technique (DNA Amplification Fingerprint) - Caetano-Anolles şi colab. (1991), au

introdus o metodă numită DNA

Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scurţi, cel mai adesea de

lungime între 5 – 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiţi parametrii PCR,

folosind paşi atât de joasă cât şi de înaltă stringenţă, precum şi un program al ciclurilor cu

numai două temperaturi în loc de standardul cu trei. Produşii de amplificare au fost

separaţi prin electroforeză în gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin colorare cu argint.

Nivelul complexităţii profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea

condiţiilor de reacţie. Ca urmare a apariţiei mai multor variante de amprentare a

întregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles şi colab., au

propus în (1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de Multiple

Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP).

Totuşi, datorită simplităţii şi utilităţii, numele şi metoda originală RAPD, cunoaşte

10

Page 11: Noi Metode Pcr

cea mai largă răspândire. Această tehnică permite amplificarea unui număr mai mare de

fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de

poliacrilamidă.

7. Identificarea alterării numărului de copii genice- metoda MLPA( Multiplex

Ligation- dependent Probe Amplification) . Este o metodă de PCR multiplex ce detectează

existența unui număr anormal de copii, până la cincizeci de secvențe de doar un nucleotid.

( Schouten JP et al. 2002) Poate fi folosită în mai multe laboratoare deoarece , nu necesită

decât un termociclor și un echipament de electroforeză prin capilar. Prin această tehnică pot fi

procesate până la 96 de probe simultan. Când comparăm MLPA cu FISH, MLPA-ul nu are

numai avantajul multiplex , dar de asemenea este una în care secvențe foarte mici devin

ținta( 50-70 nt) ceea ce permite MLPA-ului identificarea aberațiilor frecvente ale unei gene ce

sunt prea mici pentru a fi detectate prin FISH . De asemenea , MLPA poate fi folosit pe ADN

purificat . Comparat cu array CGH, MLPA este o metodă ieftină și ușor de realizat. Tipic

pentru MLPA este faptul că ținta nu este reprezentată de secvențele ce sunt amplificate ci de

sondele MLPA care hibridizează cu secvențele țintă , în contrast cu un PCR standard de tip

multiplex .

Reacția MLPA poate fi împărțită în 4 pași principali:

denaturarea ADN- ului și hibridizarea sondelor MLPA;

reacția de ligare;

reacția PCR;

separarea produșilor de amplificare prin electoforeză și analiza datelor.

Tipuri de MLPA: RT- MLPA - Un tip special de MLPA creat pentru caracterizarea

expresiei genice și în consecință a ARNm.( Elding , e. , et al . 2003 ) . Schimbarea

expresiei genice joacă un rol important în dezvoltarea celulei și în procesele de

diferențiere și patologie . RT- MLPA este disponibil pentru detectarea ARNm a

numeroase gene implicate în inflamație și apoptoză. Oferă numeroase avantaje în

comparație cu alte tehnici de caracterizare a expresiei genice cum ar fi Northern

blotting , Real time PCR și microarray. Permite procesarea rapidă a numeroase probe

într-un format standard de PCR de 96 godeuri. Al doilea tip special de MLPA este

Metylation – Specific MLPA ( MS- MLPA) folosit pentru caracterizarea atât a

cuantificării cât și a metilării numărului de copii.( Nygren AO , et al.2005) . Metoda

MS-MLPA s-a dovedit a fi o mre genică ( Bittel , D.C . ,et al. 2007. Dikow , N. , et al.

2007. Procter , M , et al . 2006 ) și mai ales pentru analiza aberațiilor de metilare a

probelor de tumori ( Jeuken , J., et al.2006. Hess, C.J. , et al. 2008) .

11

Page 12: Noi Metode Pcr

ARMS –PCR technique (Amplification Refractory Mutation System –PCR)

O modificare a metodei PCR, care permite detecţia mutaţiilor punctiforme

cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR.

Aceasta este o metodă care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar

genotipizarea este posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin elecroforeză

în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea mutaţiilor prin amplificare refractară,

descrisă pentru prima dată de Newton C.R. şi colab., 1989.

Metoda constă în utilizarea a doi primeri care prezintă aceeaşi secvenţă de

nucleotide cu excepţia nucleotidei terminale 3’ – unul complementar cu alela normală, iar

celălat cu alela mutantă. Pentru amplificarea enzimatică se foloseşte Taq-polimeraza,

enzimă care nu are activitate exonucleazică 3’5’, ceea ce implică necesitatea unei

perfecte complementarităţi a primerului cu capatul 3’ al matriţei ADN. Rezultatul se

obţine în urma electroforezei în gel de agaroză prin prezenţa sau absenţa produsului de

amplificare respectiv.

Specificitatea este obţinută dacă primerul oligonucleotidic este complementar cu

secvenţa alelei dorite, dar nu este complementar cu cealaltă alelă la capătul 3’, sau în

imediata vecinătate a capătului 3' al primerului specific de alelă. Neamplificarea este

rezultatul nepotrivirii dintre ADN matriţă şi oligonucleotidul din primer. Pentru că

Taqpolimeraza nu are activitate exonucleoazică în direcţia 3'5', această nepotrivire

împiedică eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei. Metoda este

aplicabilă, în general, în detecţia mutaţiilor punctiforme cunoscute, mici deleţii şi inserţii,

polimorfisme şi alte variaţii în secvenţa ADN. De aceea, o mutaţie (sau un polimorfism) poate

fi detectată prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o elongare

eficientă, în cazul unui cromozom mutant şi o elongare ineficientă, în cazul unui cromozom

normal.

SSCP TECHNIQUE (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)

Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului determinat de cel puţin o

nucleotidă. Evidenţierea polimorfismului se face în timpul electroforezei în gel de

poliacrilamidă. Acest polimorfism se bazează pe diferenţele de conformaţie ale unei

singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct, datorită unei

substituţii, deleţii sau inserţii (Barroso , A. şi colab., 1998). În anumite condiţii, acizii

nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluţie o structură secundară. Structura

secundară depinde de compoziţia în baze, structură care poate fi alterată şi de substituţia

12

Page 13: Noi Metode Pcr

unei singure nucleotide. Această diferenţă va determina o mobilitate electroforetică

diferită în condiţiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamidă nedenaturat).

Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi detectate se face după o prealabilă colorare

cu argint sau după marcarea radioactivă.(Abba , M.C. şi colab.,2001).

STS technique (Sequence –Tagged Site)

Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvenţă unică într-un punct definit

din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiţi markerii genetici RAPD în markeri

STS, pentru acelaşi locus. Tehnica nu necesită clonare dacă există informaţii anterioare

despre secvenţă, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi

conceput după secvenţa fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior

fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvenţa unui produs PCR - RAPD sau a

sondelor RFLP).

Polimorfismul este în general detectat ca o diferenţă de mărime în produsul de

amplificare STS faţă de produsul RAPD, de la acelaşi locus. Dacă nu există nici o

diferenţă de mărime, se apelează la restricţia enzimatică pentru a tăia produşii de

amplificare şi pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi astfel detectat un

polimorfism de câteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi decât

primerii RAPD şi bazaţi pe o secvenţă specifică, această metodă detectează

polimorfismul de la acelaşi locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică.

Dezavantajul metodei este că proiectarea şi crearea primerilor poate implica o investiţie

importantă ( Roach J. C. şi colab., 2000).

Aplicabilitatea tehnicilor în laboratoarele din țara noastră

Tehnica real-time PCR mai este folosită în determinarea cantitativă a viremiei la

pacienții infectați cu virusurile hepatice B și C ; analiza mutației factorului V Leiden și a

mutației protrombinei. De curând s-a trecut de la tehnologia convențională PCRla tehnologia

real-time PCR Taqman cu prelucrare automată a probelor.Diferența constă în metoda de

detecție a produsului PCR, care este cuantificat în cursul desfășurării reacției prin

monitorizarea fluorescenței emise la fiecare ciclu de amplificare , spre deosebire de detecția

colorimetrică care avea loc la sfârșitul reacției .

Determinarea cantitativă a viremiei ( VHB) se bazează pe două procese majore:

- pregătirea probei pentru a izola ADN-VHB;

13

Page 14: Noi Metode Pcr

- amplificarea PCR a ADN-ului țintă cu detecția simultană a sondei oligonucleotidice dublu

marcate clivate specifice țintei.

Cuantificarea viremiei se realizează cu ajutorul unei secvențe ADN neinfecțioase

denumită Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un număr cunoscut de copii este adăugat

în fiecare probă și parcurge aceleași etape de preparare a probei, amplificarea PCR si detecție,

ca și secvența țintă. QS conține secvențe VHB cu zone identice de legare a primerilor ca și

ADN-ul țintă, dar cu o zonă unică de legare a sondei de detecție care permite diferențierea

ampliconului QS de ampliconul țintei. Analizorul calculează concentrația ADN-VHB prin

comparararea semnalului țintei cu semnalul QS din fiecare probă și controale.

Extracția acizilor nucleici se face automat printr-o tehnică de captură la suprafața unor

biluțe magnetice de sticlă. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatură ridicată

cu o protează și un tampon care eliberează acizii nucleici și îi protejează de acțiunea DNA-

zelor din plasmă. În fiecare probă este introdus ADN QS într-o concentrație cunoscută,

împreună cu proteaza, agentul lizant și biluțele de sticlă. După ce are loc incubarea

amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captați la suprafața biluțelor de sticlă, în

timp ce substanțele nelegate vor fi îndepărtate printr-un proces de spălare. După încheierea

etapei de spălare, acizii nucleici adsorbiți vor fi diluați cu o soluție apoasă la temperatură

înaltă. Proba procesată, ce include biluțele de sticlă împreună cu ADN VHB si ADN VHB

QS, va fi adăugată amestecului de amplificare si transferată în analizorul în care vor avea loc

amplificarea și detecția. În cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face în prezența

unui sistem raportor care emite fluorescență. Detecția se realizează cu ajutorul sondelor de tip

5’ nuclează-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capăt cu o substanță fluorofora (“reporter

dye” R) și la celălat capăt cu o moleculă blocantă (“quencher dye” Q). Cât timp sonda este

intactă, fluorescența sistemului R va fi inhibată de molecula Q. In cazul în care amplificarea

este eficientă, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; în

cursul etapei de elongație, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa

enzimatică de 5’ endonuclează și va elibera astfel fluoroforul.

Analiza mutatiei factorului V Leiden

Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutații punctiforme a genei umane care

codifică factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigură amplificarea unui

fragment ADN țintă din gena factorului V, izolat printr-o tehnică automată dintr-o probă de

sânge integral.

14

Page 15: Noi Metode Pcr

Pentru efectuarea testului se utilizează sistemul PCR LightCycler care folosește o

detecție în timp real prin fluorescența produsului amplificat diferită de cea obținută cu

ajutorul sondei TaqMan. Astfel, pentru detecția ampliconului se folosesc 2 sonde care

hibridizează la o secvență internă a fragmentului amplificat, în cursul fazei de hibridizare a

primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2 secvențe oligonucleotidice specifice, marcate cu

fluorofori diferiți:

- sonda 1, marcată la capătul 3’ cu fluoresceina (fluoroforul donator D);

- sonda 2, marcată la capătul 5’ cu substanța LightCycler Red 640 (fluoroforul

acceptor A). Secvențele celor 2 sonde sunt astfel selectate încât să hibridizeze la secvențele

țintei într-un aranjament de tip cap-coadă, facilitând apropierea celor 2 fluorofori.

Fluoresceina este excitată de lumina albastră emisă de o sursă a LightCycler-ului și emite o

lumină fluorescentă verde. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de

hibridizare, energia emisă excită la rândul său fluoroforul Red 640, printr-un transfer de

energie a rezonanței fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer); acesta va

emite o lumină fluorescentă roșie, a cărei intensitate va fi măsurată în unitatea optică a

LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescență emisă va fi proporțională cu nivelul țintei.

Metoda de detectie a fluorescentei light cycler

Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutației,

prin analiza curbei de topire efectuată după încheierea ciclurilor de amplificare, când

ampliconul este prezent în concentrații crescute.

Sonda marcată cu Red 640 hibridizează la o secvență a țintei care nu conține situsul

mutației (sonda ancora); sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include

situsul respectiv (sondă a mutației). În cursul analizei curbei de topire, creșterea

semnificativă a temperaturii induce scăderea fluorescenței emise, deoarece sonda cu o

secvență mai scurtă (sonda mutației) este prima care disociază și cei 2 fluorofori nu mai sunt

in apropiere. Dacă este prezentă mutația factorului V, nepotrivirea sondei mutației cu țintă va

destabiliza hibridul, astfel că scăderea fluorescenței se va înregistra la temperaturi mai joase.

În prezenta genotipului sălbatic (fără mutație), heteroduplexul ADN este stabil și va

avea o temperatură de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezintă o combinație distinctă

de proprietăți.

Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie să prezinte întotdeauna un profil al

curbei de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot sălbatic (mutație absentă),

15

Page 16: Noi Metode Pcr

mutant homozigot sau genotip heterozigot. Dacă nu se produce acest lucru, testul va fi

considerat invalid și vor trebui repetate toate etapele.

În plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ si pozitiv, cu

mențiunea că, pentru acesta din urmă trebuie să se obtină obligatoriu un profil de genotip

heterozigot.

Detecţia tipurilor oncogene HPV .

Testul include 4 procese majore:

- pregatirea probei;

- amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV;

- hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei;

- detecția acestora printr-o metoda colorimetrica.

Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale

recoltate in mediu lichid, printr-o tehnica manuala. Amplificarea se realizeaza intr-un

termocycler, iar detecția pe un analizor ELISA automat. Pentru monitorizarea acuratetii

acestor 4 procese, se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul β-globinei umane

care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Amestecul de reactie contine perechi de

primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt, cat si pentru

ADN-ul β-globinei. Detecția ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde

oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui

corespunzator β-globinei.

Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv

pentru ADN-ul β-globinei.mbinei se folosește o metodă similară.

Genotiparea HPV

In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37

genotipuri HPV precum si a genei β-globinei. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un

ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub

forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale.

Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA

Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27, marker pentru

spondilita ankilopoietica.

Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru

tipizarea HLA. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri, fiecare continand una

sau mai multe perechi de primeri specifici, precum si o pereche de primeri de control

16

Page 17: Noi Metode Pcr

(specifici pentru o secventa nonalelica din proba, care functioneaza ca un control intern al

PCR, verificand eficiența procesului). Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri

cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient

decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3’.

Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare, iar

procesarea post-amplificare este redusa la maximum. In cazul in care are loc amplificarea,

identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza.

Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de

interpretare - Dynal SSP Tool, care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala,

reducând astfel riscul unor erori umane.

Chlamydia pneumoniae PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detectarea Chlamydia pneumoniae prin Reactia Real

Time in lanț a polimerazei. Detectarea C. pneumoniae se bazeaza pe amplificarea unei

secvențe ADN specifice unei singure copii a genei ompA si pe masurarea concentratiei

produsului de amplificare in cursul procesului PCR, prin intermediul unei sonde marcate

fluorescent.

Prezenta C. pneumoniae este indicata de cresterea fluorescentei fluoroforului FAM.

Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland posibila inhibare a

reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului

este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE. Kit-ul de detectare prezinta

avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-specifice si asigurand o

sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG), eliminand posibila

contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare.

Kit de diagnostic de o foarte mare sensibilitate folosind o singura copie a genomului in

reactia PCR. Acest lucru asigura ridicata sensibilitate in detectarea C. pneumoniae in

laborator din material clinic. Kit-ul este conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea

calitativă.

Legionella pneumophila PCR Kit

Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Legionella pneumophila

avand la baza amplificarea secvenței specifice L. pneumophila a genei care codifica

subunitatea 16S ARN ribozomal prin reactie de polimerizare in lanț (PCR) si prin masurarea

17

Page 18: Noi Metode Pcr

cresterii concentratiei produsului de amplificare in cursul PCR cu sonda marcata fluorescent

(Real time PCR).

Prezenta ADN-ului de Legionella in porba este indicata de cresterea fluorescentei

fluoroforului FAM. Un standard intern (IS) este inclus in amestecul de reactie, controland

posibila inhibare a reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea

pozitiva a IS-ului este detectat in canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.

Kit-ul de detectare prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-

specifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),

eliminand posibila contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare. Acest lucru asigura

ridicata sensibilitate in detectarea Legionella in laborator din material clinic. Kit-ul este

conceput pentru diagnostic in vitro si ofera detectarea calitativă.

Mycoplasma pneumoniae PCR Kit

Acest kit PCR este conceput pentru detecția Mycoplasma pneumoniae prin metoda

PCR. Detecția se bazeaza pe principiul amplificarii secvenței ADN specifica pentru M.

Pneumoniae, a genei M181 care codeaza toxina CARDS si masurarea cersterii concentratiei

produsului amplificat pe durata reacției PCR cu ajutorul unei sonde marcate fluorescent (real-

time PCR).

Prezenta Mycoplasma este indicata de cresterea fluorescentei floroforului FAM. In

mixul de reactie este inclus un Standard Intern (IS) care controleaza posibila inhibare a

reacției PCR sau eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea pozitiva a IS-ului

este detectata pe canalul fluorescent pentru fluoroforul JOE.

Kit-ul de detecţie prezinta avantajul tehnologiei "hot start", minimizand reacțiile non-

specifice si asigurand o sensibilitate maxima. Acesta contine uracil-ADN-glycosylase (UDG),

eliminand posibila contaminare a reacției PCR cu produsi de amplificare.

Acest kit de diagnostic asigura sensiblitatea foarte ridicata a a detectiei Mycoplasma in

laborator pornind de la materialul clinic. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si

asigura detecția calitativă.

Borrelia burgdoferi PCR Kit

Kit-ul este este conceput pentru detecția speciilor clinice importante din grupul

"Borrelia burgdoferi sensu lato" (B. burgdoferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B.

valasiana, B. lusitaniae, B. andersonii, B. bissettii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi, B. sinica).

18

Page 19: Noi Metode Pcr

Kitul se bazeaza pe principiul detectiei secvenței specifice a unei gene cromozomiale, care

codeaza proteina flagelata si a unei gene care codeaza 16S ARN bacterial, specific pentru

grupul B. Burgdoferi sensu lato grup.

Metoda a fost testata pe o gama larga de bacterii europene de tipul Borrelia si

Spirochete. Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la detectarea unei singure copii a

genomului borrelia intr-o reactie, asigurand sensibilitate maxima in detecția in laborator din

fluide organice (fluid sinovial, fluid cerebrospinal, urina) sau sânge. Kitul este destinat pentru

diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.

Neisseria gonorrhoeae PCR Kit

Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin

reactia de polimerizare in lanț (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenței

multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.

Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la o singura copie a ADN-ului

genomic gonococcus intr-o reactie, asigurând sensibilitatea maxima a detecției in laborator

din tampoane uretale sau vaginale.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.

Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit

Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu

cytomegalovirus. Detecția este bazata pe amplificarea unei secvențe conservative ADN

specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.

Sensibilitatea detecţiei cu ajutorul acestui kit constă in identificarea unui singur genom

al virusului apărut într-o reacție. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea

de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice

(spalatură bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral

pentru 2 x 10E5 leucocite).

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro și asigura detecția calitativă sau

cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente și pentru

monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluției unei boli.

Neisseria gonorrhoeae PCR Kit

Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic Neisseria gonorrhoeae prin

reactia de polimerizare in lanț (PCR). Aceasta detectie este concentrata asupra secvenței

multicopii a genei care codifica ARN-ul 16S bacterial, specific pentru Neisseria gonorrhoeae.

19

Page 20: Noi Metode Pcr

Sensibilitatea kitului de detectie PCR urca până la o singura copie a ADN-ului genomic

gonococcus intr-o reacție, asigurând sensibilitatea maxima a detecției in laborator din

tampoane uretale sau vaginale.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă.

Cytomegalovirus (CMV) PCR Kit

Acest kit PCR este conceput pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu

cytomegalovirus. Detecția este bazata pe amplificarea unei secvențe conservative ADN

specifice a unei singure gene pentru exon 4 IE antigen prin PCR.

Sensibilitatea detecţiei cu ajutorul acestui kit consta in identificarea unui singur genom

al virusului aparut intr-o reacție. Acest lucru asigura laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea

de 1 la 10 in cazul probelor de tesut (biopsii) si de sute per ml in probele de fluide biologice

(spălătura bronhoalveolara, ser, saliva) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral

pentru 2 x 10E5 leucocite).

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă sau

cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente si pentru

monitorizarea eficientei terapiei sau a evoluției unei boli.

Epstein-Barr virus (EBV) PCR Kit

Acest kit este destinat pentru diagnosticul cantitativ si sensibil al infectiilor cu Epstein-

Barr virus. Detecția este bazata pe amplificarea unei singure copii a genei EBNA1 nuclear

prin metoda reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei (PCR).

Sensibilitatea de detecţie a kitului ajunge până la o singura copie a genomului viral

/reactie. Acest lucru asigură laboratoarelor de diagnostic sensibilitatea de 1 la 10 in cazul

probelor de tesut (biopsii) și de sute per ml. in probele de fluide biologice (spălătura

bronhoalveolara, ser, salivă) sau probe de sânge (10 - 50 copii ale genomului viral pentru 2 x

10E5 leucocite).

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigură detecţia calitativă sau

cantitativă; de aceea, este recomandat pentru identificarea infecțiilor active/latente și pentru

monitorizarea eficienței terapiei sau a evoluției unei boli.

20

Page 21: Noi Metode Pcr

HSV/VZV PCR Kit

Acest kit este destinat pentru detecția simultana a virusului Herpes simplex (HSV) si

virusului Varicella-Zoster (VZV) prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea

polimerazei (PCR).

Detecția VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei

singure copii a genei pentru ORF62 (IE62 transactivator). Detecția ambelor tipuri de HSV

(HSV-1, HSV-2) este bazată pe amplificarea PCR a unei secvențe ADN conservative a unei

gene single-copy a glicoproteinei B (g.

Sensibilitatea de detecţie a kitului ajunge până la o singura copie a genomului viral

/reactie. Aceasta asigura o sensibilitate inalta pentru detecția in laborator a sute de virusi/ml in

probe de fluide biologice (ser, alte fluide) sau sânge.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigur detecţia calitativă.

Herpes Simplex Virus (HSV-1/2) PCR Kit

Acest kit este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) și Herpes

Simplex Virus de tip 2 (HSV-2) prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea

polimerazei (PCR). Detecția HSV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN

conservative a unei singure copii a genei pentru glicoproteina B (g și măsurarea concentraţiei

produsului de amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate

fluorescent, de EX cu colorant FAM pentru HSV-1 și Cy5 pentru HSV-2.

Mixul de reacţie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a

reacției PCR și eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un

semnal pozitiv pe canalul JOE.

Kitul de detecție este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice și asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de

amplificare. Aceasta asigură detecţia foarte sensibila in laborator a HSV-1 si HSV-2 in

probele de fluide biologice si sânge.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro și asigură detecţia calitativă și

cantitativă.

Herpes Simplex Virus (HSV-1) PCR Kit

Acest kit PCR este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 1 (HSV-1) prin

metoda reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei (PCR).

21

Page 22: Noi Metode Pcr

Detecția HSV este bazată pe amplificarea unei secvenţe ADN conservative, a unei

singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si măsurarea concentraţiei produsului de

amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Real-

time PCR). Probele pozitive HSV-1 duc la creșterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul

de reacție include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR și

eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un semnal pozitiv pe

canalul JOE.

Kitul de detecție este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice și asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de

amplificare.

Această metodă asigura detecţia foarte sensibilă in laborator a HSV-1 in probele de

fluide biologice si sânge. Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția

calitativă și cantitativă.

Herpes Simplex Virus (HSV-2) PCR Kit

Acest kit PCR este destinat pentru detecția Herpes Simplex Virus de tip 2 (HSV-2)

prin metoda reacției de amplificare in lanț sub acţiunea polimerazei (PCR).

Detecția VZV este bazată pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei

singure copii a genei pentru glicoproteina B (g si măsurarea concentraţiei produsului de

amplificare pe durata procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent (Real-

time PCR). Probele pozitive HSV-2 duc la cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul

de reactie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR și

eficiența procesului de izolare a ADN-ului. Amplificarea IS rezultă intr-un semnal pozitiv pe

canalul JOE.

Kitul de detecţie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice si asigurănd maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de

amplificare.

Aceasta metoda asigura detecția foarte sensibilă in laborator a HSV-2 in probele de

fluide biologice si sânge.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si

cantitativă.

22

Page 23: Noi Metode Pcr

Varicella - Zoster Virus (VZV) PCR Kit

Acest kit PCR este destinat pentru detecția Varicella-Zoster Virus (VZV) prin metoda

reacției de amplificare in lanț sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).

Detecția VZV este bazata pe pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei singure

copii a genei ORF62 si masurarea concentratiei produsului de amplificare pe durata

procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate cu colorantul fluorescent FAM. Mixul de

reactie include un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a reacției PCR si

eficiența procesului de izolare a ADN-ului (varianta ISEX). Amplificarea IS rezulta intr-un

semnal pozitiv pe canalul JOE.

Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice si asigurând maximul de sensibilitate. De asemenea, conținutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de

amplificare. Aceasta asigura detecția foarte sensibila in laborator a VZV in probele de fluide

biologice si sânge.

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si

cantitativă.

Hepatitis B Virus (HBV) PCR Kit

Acest kit este destinat pentru detecția Hepatitis B Virus (HBV) prin metoda reacției de

amplificare in lanț sub actiunea polimerazei in timp real (Real-time PCR).

Detecția HBV este bazată pe amplificarea unei secvențe ADN conservative a unei

singure copii a ORFx si măsurarea concentraţiei produsului de amplificare pe durata

procesului PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent. Prezenta HBV duc la

cresterea fluorescentei colorantului FAM. Mixul de reactie include un Standard Intern (IS)

care reglează posibila inhibare a reacției PCR si eficiența procesului de izolare a ADN-ului.

Amplificarea pozitiva a IS este detectată pe canalul de fluorescenta al fluoroflorului HEX.

Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controleaza posibila contaminare a reacției PCR de catre produsele de

amplificare.

Sensibilitatea kitului de diagnostic coboara până la o singura copie a virusului intr-o

reactie PCR. Aceasta asigura detecția foarte sensibila in laborator a HBV in probele de fluide

biologice (plasma, ser).

23

Page 24: Noi Metode Pcr

Kitul este destinat pentru diagnosticarea in vitro si asigura detecția calitativă si

cantitativă.

Hepatitis C Virus (HCV) PCR Kit

Acest kit este destinat pentru detecția RNA Hepatitis C Virus (HBV) bazată pe

amplificarea unei singure copii a secvenței 5 URT prin intermediul unei reactii de revers-

transcriptie urmata de amplificarea in lanț (RT-PCR) si măsurarea creşterii concentraţiei

produsului de amplificare pe durata PCR prin intermediul unei sonde marcate fluorescent

"real-time PCR".

Sonda destinată detecţiei patogene este marcată cu fluoroforul FAM. Mixul de reactie

"gata de utilizare" include toate componentele necesare pentru amplificarea ARN-ului

microorganismelor detectate.

Kitul de detectie este superior tehnologiei "hot start" reducând la minim reacțiile

nespecifice si asigurand maximul de sensibilitate. De asemenea, continutul de uracil-ADN-

glicozilaza (UDG) controlează posibila contaminare a reacției PCR de către produsele de

amplificare.

Kitul contine de asemenea un Standard Intern (IS) care reglează posibila inhibare a

reacției PCR si eficiența procesului de izolare a ADN-ului (sonda destinată detectiei IS este

marcata cu fluorofor HEX).

MTHFR A1298C PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei A1298C in gena pentru reductaza

methylentetrahydropholate (MTHFR) prin intermediul metodei Real-time PCR.

Această metodă se bazează pe amplificarea secvenței ADN a genei MTHFR purtătoare

de mutatie A1298C si hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluorescent pentru

alela standard C1298C si pentru alela mutanta A1298A a genei MTHFR.

Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutanta.

Factor II Prothrombin PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei G20210A in gena protrombinei (factor II)

prin metoda Real-time PCR.

Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvențe ADN de protrombina cu

mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru

alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.

24

Page 25: Noi Metode Pcr

Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.

Factor II Prothrombin PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detecția mutaţiei G20210A in gena protrombinei (factor

II) prin metoda Real-time PCR.

Aceasta metoda este bazata pe amplificare unei secvențe ADN de protrombina cu

mutatie G20210A si pe hibridizarea secvenței amplificate cu sonde marcate fluoroform pentru

alela G20210A si pentru alela mutanta A20210A a genei umane factor II.

Evaluare: homozigota standard, heterozigota mutanta, homozigota mutant.

Lawsonia intracellularis PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detecția agentului ce cauzeaza boala intestinala porcina,

bacteria patogena Lawsonia intracellularis.

Metoda este bazata pe amplificare unei secvențe specifice de codificare antigen LsaA.

Sensibilitatea kitului coboara până la apariţia unui singur genom bacterial intr-o reactie.

Aceasta oferă în laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece in frotiuri sau in

excremente si probe de tesut.

Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativă.

Porcine circovirus (PCV) PCR Kit

Acest kit este conceput pentru detecția circovirusului porcin, agentul ce cauzeaza boala

porcina "PMWS".

Metoda este bazata pe amplificare unei secvențe specifice de ORF1. Sensibilitatea kitului

coboara până la apariţia unei singure secvențe intr-o reactie. Aceasta oferă in laboratorul de

diagnostic o sensibilitate de unu la zece in probele de ser, in frotiuri, excremente si probe de

tesut, precum si sensibilitate de sute in 1 ml sânge.

Aceasta metoda este conceput pentru detectarea calitativă si semi-calitativă si prevede

stabilirea concentratiilor particulelor virusului in probele. Metoda poate detecta tipurile

veterinare patogene PCV-2 si PCV-1 ce contamineaza culturile de tesut provenite de la

rinichii porcilor (EX: PK-15).

O identificare ulterioara a tipurilor PCV-1 si PCV-2 pote fi efectuata prin metoda PCR-

RFLP, utilizand fragmentarea specifica a enzimei de restrictie Ncol, a carei secventa tinta este

gasita numai in produsul de amplificare al versiunii PCV2.

25

Page 26: Noi Metode Pcr

Porcine circovirus (PCV) PCR Kit

Kit-ul este conceput pentru detecția universala a virusurilor ARN de Pestivirus sp. (in

special pentru detectarea virusului viral diareic bovin / BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-1c,

BVDV-1d, BVDV-2 /; virusul bolii de granita (BDV); virusul pestei porcine clasice (CSFV))

prin reactie in lanț a revers polimerazei (RT-PCR).

Metoda se bazeaza pe amplificarea unei secvențe specifice a genei care codifica virusul

poliprotein. Diagnosticarea prevede o detectare de o mare sensibilitate a pestivirusurilor ce

contamineaza culturile de celule si soluțiile utilizate pentru culturile de tesuturi (de EX:

virusul culturi, BSA), precum şi controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de

celule (de ex: vaccinuri).

Aceasta metoda este unic adaptata pentru detectarea inhibarii reacției si, datorita

simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate standard, chiar si pentru analiza

materialelor cu continut ridicat de inhibitori PCR.

PathogenFree DNA Isolation Kit

Acest kit pentru izolarea ADN-ul este conceput pentru a fi utilizat in diagnosticare si

laboratoare de cercetare care se ocupa cu diagnosticarea prin PCR de rutina a

microorganismelor patogene (bacterii, candida si fungi, virusuri si protozoare) sau in

diagnostic genetic uman.

Datorită designului cu coloane kitul asigura o operare simpla, eficientă si rapidăpentru

izolarea ADN-ului din materiale clinice fără contaminare cu ADN microbian. Kit-ul este

conceput în principal pentru izolarea ADN-ului din sânge, fluide biologice si alte probe

clinice.

Mycoplasma species PCR Kit

Kit-ul este conceput pentru detectarea ADN-ului genomic in speciile de Micoplasma

prin reactia in lanț a polimerazei (PCR). Aceasta detectare este focusata pe o secventa multi-

copie a genei bacteriei codificate 16S ARN, specifica pentru speciile de Micoplasma.

Sensibilitatea kitului coboara până la aparitia unui singur genom bacterial intr-o reactie.

Kitul asigura detectie universala a tuturor micoplasme umane semnificative din punct de

vedere clinic si ureaplasme, inclusiv M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, U. urealitica

şi M. fermentans.

26

Page 27: Noi Metode Pcr

Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu la zece micoplasme in 1

ml fluid biologic fara celule (urina, lavaj bronhoalveolar, sputa) sau până la sute de

micoplasme in 1 ml sânge sau spermă.

Kit-ul este proiectat si certificat pentru diagnostic in vitro si ofera detectie calitativă.

Kit-ul este conceput, de asemenea, pentru o detectie sensibila a tuturor tulpinilor Micoplasma

ce contamineaza culturile de tesuturi si solutii pentru culturile de celule (de exemplu: culturi

virusuri, BSA), precum şi pentru controlul contaminarii cu produse preparate din culturi de

celule (de exemplu, vaccinuri). Acesta ofera in laboratorul de diagnostic o sensibilitate de unu

la zece micoplasme in 1 ml de TK sau solutie BSA. Aceasta metoda este unic adaptat pentru

detectarea inhibarii reacției si datorita simplicitatii procesului de detectare, ofera rezultate

standard, chiar si pentru analiza materialelor cu conținut ridicat de inhibitori PCR.

Aceasta metoda este capabila să detecteze toate tulpinile Micoplasma cunoscute (Centrul

National pentru Biotehnologie Informaţii SUA; 2006) si este ajustat pentru a detecta cel puțin

următoarele tulpini de industrial sau veterinare Mycoplasma specii semnificative:

Acholeplasma axanthum, Mycoplasma alvi, M. arginini, M. buccale, M. cavipharyngis,

M.cloacale, M. Fastidiosum, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. salivarium, M.

pulmonis, M. Orale, M. penetrans, M.pirum, M. pneumoniae, Ureaplasma urealyticum,

U.diversum , U. parvum , Acholeplasma sp., etc.

Concluzii :

Tehnicile PCR au un impact puternic în foarte multe domenii , cea ce ne lasă de

înțeles că sunt metode ușor de folosit, permisive din punct de vedere financiar, și care ar

trebui să se găsească în mai multe laboratoare din țara noastră . Utilizarea lor ar putea ajuta

foarte mult sistemul medical prin diagnostificarea precoce a anumitor boli ceea ce ar duce la

economisire datorată acestui diagnostic . O boală depistată devreme implică un cost mai mic

pentru sistem.

Studiile de cercetare din acest domeniu ar putea cât de curând să ne ajute la

personalizarea tratamentelor ceea ce ar duce la rezultate cât mai bune, sau chiar spre

vindecare a unor boli care momentan nu au răspuns .

Bibliografie:

1. Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de

laborator ;

27

Page 28: Noi Metode Pcr

2. CHUNG, H.Y., M.E. DAVIS, AND H.C. HINES, 2001, Relationship of two PCRRFLP

in the bovine calpastatin gene with calpastatin activity, meat tenderness, and carcass

traits. Ohio State University Research and Reviews: Beef and Sheep 2001.Circ. 181-01;

3. Florin Zugun-Eloae, Iuliu Cristian Ivanov - Tehnici de amplificative (PCR) și

nonamplificative(hibridizare in situ) de analiză a acizilor nucleici în diagnosticul

molecular, Editura ,,Grigore T. Popa”, 2013

28