KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR

Prof. IULIANA TANUR

Colegiul Național Pedagogic“Regina Maria” Ploieşti

Kary Banks Mullischimist, câştigător al Premiului Nobel

28 Decembrie 1944

S-a născut în Lenoir, Carolina de Nord, Statele Unite ale

Americii 1966

A obtinut diploma de licentain chimie la Facultatea de

chimie din Georgia

1972

A obtinut diploma de doctorat pentru biochimie la Universitatea Berkeley,

California

KARY B. MULLIS

1977

• A realizat cercetări în chimie farmaceutică la Universitatea California, San Francisco.

1979

• A ocupat postul de chimist pentru studiul ADN în cadrulCorporației Cetus din Emeryville, California

1983

• A conceptualizat tehnica PCR ,considerată ca fiind unadintre descoperirile marcante ale secolului douăzeci

KARY B. MULLIS

1986• A fost numit director de biologie moleculară la Xytronyx ,Inc. în San Diego , unde

munca sa a fost concentrată în fotochimia ADN.

1987

• A inceput sa fie consultant în domeniul chimiei acizilor nucleici pentru mai multe corporații , precum Angenics , Cytometrics, Eastman Kodak, Abbott Labs, Milligen/Biosearch si Specialty Laboratories.

1993 • A primit Premiul Nobel pentru chimie, pentru invenția reacției de polimerizare în lanț (PCR)

KARY B. MULLIS

Alte premii obținute:

◦ Premiul Japoniei in 1993 pentru inventarea PCR, acesta fiind unul dintre cele mai

prestigioase premii în ştiința internațională

◦ Premiul Thomas A. Edison (1993) , Omul de Ştiinta al Anului California (1992), Premiul

National de Biotehnologie (1991), Premiul Gairdner , Toronto, Canada (1991),Premiul

Omul de Ştiință Cercetare şi Dezvoltare (1991), Premiul Memorial William Allan al

Societății Americane de Genetică Umană (1990), şi Premiul Analizei Biochimice ale

Societății Germane a Chimiei Clinice şi Boehringer Mannheim (1990)

◦ A fost premiat cu diploma onorifică de Doctor al Ştiinței din partea Universității din

Carolina de Sud în 1994. A fost introdus în „Hall of Fame” al Inventatorilor în 1998.

KARY B. MULLIS

Publicații:

,,Semnificația Cosmologică a inversării Timpului’’(Natura) ,,Originea Neobişnuită a Reacției de Polimerizare în Lanț’’(AmericanŞtiințific) ,,Amplificarea Enzimatică a ADN-ului direcționată de către primer cu o ADN

polimeraza termostabilă’’(Ştiința),Sinteza Specifică a ADN-ului in vitro printr-o reacție în lanț catalizată depolimeraza’’ (Metode în enzimologie)

A scris o carte autobiografică intitulată ,,Dansând gol în câmpul minții”publicat de Pantheon Books in 1998

KARY B. MULLIS

Una din ultimele sale cereri de patentare reprezintă o abordare revoluționară legată de

mobilizarea instantanee a sistemului imunitar pentru a neutraliza agenții patogeni şi toxinele

invadatoare, proiect realizat la Altermune Technologies, unde a fost consilier ştiințific şef.

A fost consilier ştiințific la mai multe companii, oferind consultanță de specialitate în

probleme juridice care implică ADN şi un lector frecvent la campusurile facultăților,

corporațiilor şi întâlnirilor academice din jurul lumii.

A trăit în Newport Beach cu soția lui, Nancy Cosgrove Mullis, până la moartea sa ,cauzată de

pneumonie, pe data de 7 August , 2019 .

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR

◦Ca metodă de amplificare a ADN-ului , PCR multiplică de miliarde de ori

în câteva ore un singur fragment de material genetic( după modelul

replicării ADN “in vivo”)

◦Procesul are multe aplicații în medicină, genetică , biotehnologie şicriminalistică.

◦Datorită abilității sale de a extrage ADN de la fosile, poate fi consideratăbaza unei noi discipline ştiințifice, paleobiologia.

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCRClonarea unei secveţe de ADN de interes prin ligarea sa într-un vector cu obţinerea unei molecule ADN

recombinate şi replicarea acestei molecule intr-o gazdă, reprezintă o modalitate de copiere a secvenţei

(moleculei) de ADN de interes. Această abordare utilizează sistemul de replicare ADN existent în celula

gazdă. O modalitate mai directă de copiere a ADN-ului ce are la bază aceleaşi principii ca şi replicarea este

amplificarea in-vitro a ADN-ului.

◦ PCR este o tehnică de copiere a ADN-ului printr-o reacţie ciclică in-vitro ce se bazeză pe reacţia de

replicare a ADN-ului catalizată de o polimerază ADN-dependentă termorezistentă

◦ elementele esenţiale realizării unei reacţii PCR sunt:

a) molecula ADN de copiat – o moleculă de ADN (circulară sau liniară) bicatenară numită moleculă

matriţă (template)

b) deoxinucleotidele ce vor fi incorporate in molecula nou sintetizată (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

c) oligonucleotide amorsă (primer) complementare cu molecula matriţă şi care oferă un capăt 3' liber

d) ADN polimeraza

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR◦ Etapa 1. Denaturarea – temperatura amestecului de reacţie, care conţine ADN matriţă, este ridicată

până la 95ºC, ducând la ruperea punţilor de hidrogen stabilite pe bază de complementaritate între cele două

catene iar în soluţie vom regăsi ADN monocatenar.

◦ Etapa 2. Legarea (hibridizarea)primerilor pe bază de complementaritate la matriţa ADN: hibridizarea

primerilor se efectuează prin scăderea temperaturii amestecului de reacţie pănâ la o valoare care permite

refacerea punţilor de hidrogen dintre aceştia şi catena ADN matriţă în regiunea complementară

◦ Etapa 3. Polimerizarea sau sinteza unei noi catene având drept matriţă catena veche ADN: are loc

sinteza unei noi catene de ADN complementară cu secvenţa ADN matriţă pornind de la primeri cu ajutorul

unei ADN polimeraze în prezenţa deoxinucleotidelor trifosfat. La finele acestei etape, în amestecul de

reacţie, moleculele de ADN sunt dublucatenare. Dublarea cantităţii de ADN ţintă se poate realiza prin

reluarea celor trei paşi, iar acest fapt reprezintă intrarea într-un nou ciclu de amplificare. Fiecare catenă nou

sintetizată devine matriţă pentru un nou ciclu de amplificare, astfel încât secvenţa ţintă de ADN este

selectiv amplificată după fiecare ciclu de reacţie.Cele trei etape alcătuiesc 1 ciclu ce se repetă de până la 30

ori.

PCR permite obtinerea unei cantităti analizabile,specifică a regiunii determinate de către amorse

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR

Rezultatul reacţiei PCR este dependent de determinarea experimentală a concentraţiei

optime a componentelor amestecului de reacţie.

La ora actuală se folosesc aparate de PCR total automatizate, în care etapele de temperatură se

parcurg automat.

Aplicații ale tehnicii PCR :

• bază pentru tehnica PCR-RFLP prin care se detectează mutaţii punctiforme şi SNPs ;

• bază pentru tehnica de secvenţiere prin care se pot detecta mutaţii punctiforme şi SNPs ;

• bază pentru genotipare sau analiza fragmentelor marcate fluorescent prin care se realizează

teste de paternitate şi detectarea deleţiilor şi inserţiilor;

• detectarea infecţiilor parazitare, bacteriene şi virale.

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR

Teste RT-PCR - standardul de diagnostic al COVID-19

(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) RT- PCR se referă la reacția de polimerizare în lanț, otehnologie de biologie moleculară care este folosită pentru a amplifica şi transcrie secvențele de ARN viral (virusulSARS-CoV-2 este un virus de tip ARN) în fragmente de ADN, pe care le multiplică pentru a le putea detecta. Cuajutorul acestei reacții este posibilă identificarea fragmentelor de ARN viral în secrețiile respiratorii recoltate de lapacient.

Din secrețiile nazale şi/sau faringiene recoltate de un cadru medical cu ajutorul unui bețisor cu tampon de vată dinnas şi/sau faringe se poate pune în evidență, prin prelucrarea în laborator, ARN-ul viral (acid ribonucleic), materialulgenetic unic al noului coronavirus. Secrețiile recoltate de la pacient trec prin mai multe etape prin care secvențele deARN se separă, se amplifică, se transcriu în secvențe de ADN, care se multiplică pentru a putea fi detectate ulterior.Toate etapele trebuie realizate de personal specializat, pregătit, într-un laborator de biologie moleculară careîndeplineşte condiții înalte de siguranță.Un test RT-PCR cu rezultat pozitiv arată că persoana are o infecție activă, pecare ar putea să o răspândească. Odată ce o persoană se recuperează dupa infecție, rezultatele RT-PCR devin negative.

KARY B. MULLIS ŞI TEHNICA PCR◦ Puncte tari:Diagnostichează prezența infecției (daca ai infecția activă ),evidențiază virusul, chiar

dacă se găseste în concentrații scăzute;evidențiază virusul chiar şi la persoane fără simptome, dacă

sunt infectate;au validitate bună, indicând în mod corect cine are boala activă şi cine nu;sunt

precise, fiind şanse foarte mari ca cei care au rezultat pozitiv sa aibă intr-adevar infecția, iar cei cu

rezultat negativ să nu fie într-adevăr infectați la momentul respectiv.

◦ Puncte slabe:Trebuie recoltate cu grijă secrețiile, astfel încât să nu se deterioreze materialul

genetic viral;necesită un timp mai îndelungat pentru prelucrare,la timpul necesar prelucrării se

adaugă timpul de transport al probei de la locul recoltării către laboratorul dotat

corespunzător;necesită expertiză pentru realizare şi kituri de laborator costisitoare;există pericol de

contaminare la prelucrarea secrețiilor contaminate; testul nu arată dacă ai avut infecție în trecut.

KARY B. MULLIS –DIFERITE ASPECTE ALE VIEȚII SALE

Astăzi, testul PCR a ajuns să fie menționat în cele mai banale conversații,chiar daca

reprezinta o descoperire esentiala pentru genetică, biotehnologie şi criminalistică.

Departe de a fi stereotipul savantului serios și îngândurat, Mullis a fost un om cu o

personalitate ieșită din comun, cu multe fațete: scriitor, surfer și… conspiraționist.

La vârsta de 24 de ani, Mullis a publicat în revista Nature un articol intitulat

„Cosmological significance of time reversal” („Semnificația cosmologică a inversării

timpului”), care dezvăluie o curiozitate științifică întinsă mult dincolo de domeniul

chimiei.

KARY B. MULLIS –DIFERITE ASPECTE ALE VIEȚII SALE

◦ În 1983, în timp ce lucra la Cetus Corporation, Mullis a conceput tehnica PCR. După cum avea să

relateze el însuși ani mai târziu, ideea i-a venit în timp ce conducea într-o noapte, împreună cu prietena

sa, în nordul Californiei(linia discontinua, repetitiva, ce separa sensurile de mers ale şoselei, l-a inspirat)

◦ În principiu, ideea de a face rapid și ușor milioane de copii ale unui fragment de ADN era simplă și avea

potențial imens. Dar obstacolele tehnice în calea realizării acestui obiectiv erau numeroase.

◦ În 1989, procesul PCR a fost numit „descoperirea anului” de revista Science. Fără tehnica pentru care

Mullis a câștigat Premiul Nobel pentru Chimie în 1993, genomica pur și simplu nu ar exista.

◦ Kary Mullis a fost, de asemenea, un apărător fervent al teoriilor conspirației. A negat existența

schimbărilor climatice și a găurii din stratul de ozon, spunând că acestea sunt invenția unor campanii

mediatice ai căror beneficiari sunt anumite guverne și companii multinaționale.

◦ Mullis s-a remarcat prin afirmația că nu s-a dovedit că HIV provoacă SIDA și că acestea sunt invenții ale

unor companii farmaceutice și oameni de știință fără scrupule.

KARY B. MULLIS –DIFERITE ASPECTE ALE VIEȚII SALE• A fost surfer și probabil singurul laureat Nobel care a descris

o posibilă întâlnire cu extratereștrii.

• Om de știință cu o curiozitate nemărginită, Mullis a refuzat să

accepte idei bazate pe dovezi îndoielnice sau pe zvonuri și a

căutat întotdeauna să ia „urma banilor” din spatele diverselor

descoperiri anunțate de oamenii de știință.

• A scris cu pasiune și umor despre o gamă largă de subiecte:

de la încălzirea globală la procesul lui O. J. Simpson, de la

păianjeni otrăvitori la HIV, de la metoda științifică la

astrologie. „Dansând gol în câmpul minții” ne provoacă să

punem la îndoială autoritatea dogmei științifice, dezvăluind,

în același timp, mecanismele unei minți neobișnuit de

originale.

KARY B. MULLIS –DIFERITE ASPECTE ALE VIEȚII SALE

◦ Iată povestea modului în care și-a conceput

invenția:

„Emoționat, am început să calculez în minte puterile lui 2: 2, 4,

8, 16, 32. Mi-am amintit vag că 2 ridicat la puterea a zecea

înseamnă aproximativ 1.000 și, prin urmare, 2 la puterea 20

este aproximativ un milion. Am oprit mașina și am luat un

creion și hârtie din torpedo. Trebuia să-mi verific calculele.

Jennifer, pasagera mea somnoroasă, a protestat pentru că am

oprit și am aprins lumina, dar am exclamat că am descoperit

ceva fantastic. Mintea mea se întorsese în laborator. Spiralele

de ADN se înfășurau și pluteau. Imagini înfiorătoare albastre și

roz ale moleculelor electrice mi se injectaseră undeva între

drum și ochi. Nu am dormit în noaptea aceea. A doua zi

dimineață, aveam peste tot diagrame ale reacțiilor PCR.”

Bibliografie virtuala:

-Dr. Kary Banks Mullis (karymullis.com);

-Slide 1 (edu-veterinar.ro)

-QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System, 384-well, laptop

(thermofisher.com)

-COVID-19: avantaje si dezavantaje ale metodelor de testare |

Reginamaria.ro

-Kary Mullis, creatorul testului PCR, pasionat de LSD și teoria

conspirației (incredibilia.ro)

-curs_12_PCR.pdf (uaic.ro)

MULȚUMESCPENTRU ATENȚIE!

https://www.karymullis.com/biography.shtmlhttps://www.edu-veterinar.ro/files/download/prezentari/laborator/Aplicatii-biomedicale-ale-tehnicilor-de-biologie-moleculara.pdfhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A28570#/A28570https://www.reginamaria.ro/articole-medicale/covid-19-avantaje-si-dezavantaje-ale-metodelor-de-testarehttps://incredibilia.ro/kary-mullis-creatorul-testului-pcr/https://mail.uaic.ro/~marius.mihasan/teaching/pdfs/general_biology_courses/curs_12_PCR.pdf