tehnica histopatologica l.p.1

TEHNICA HISTOPATOLOGICĂPENTRU INCLUDERA LA PARAFINĂ

1 Recoltarea

Pentru a realiza o recoltare în condiţii optime, instrumentarul folosit trebuie să fie bine

ascuţit, evitând astfel strivirea ţesuturilor.

Locul din care se recoltează proba va fi ales în funcţie de contextul lezional şi de scopul

investigaţiilor. Se preferă zonele reprezentative de la marginea leziunii, în aşa fel încât

fragmentul să cuprindă atât ţesut modificat cât şi normal. Dimensiunile prelevatului vor fi de

aproximativ 1cm3 : 15mm lungime, 10 mm lăţime şi 5- 7mm grosime, pentru ca fixatorul să

pătrundă repede în toată proba. După o fixare de 24-48 ore, probele vor fi fasonate cu lame

ascuţite, noua grosime fiind de 4-5 mm, apoi vor fi introduse în fixator proaspăt.

2 Fixarea

Fixarea histologică are un triplu scop:

1. oprirea fenomenelor vitale din ţesuturile fixate, pentru a surprinde microscopic

aspectele histopatologice existente în piesă în momentul respectiv şi pentru a preveni

fenomenul de autoliză;

2. întărirea pieselor fixate în vederea operaţiunilor histologice ulterioare;

3. sterilizarea pieselor, majoritatea fixatorilor chimici fiind buni dezinfectanţi.

Fixarea se realizează în flacoane de sticlă de 100-200 ml, în care volumul fixatorului

trebuie să depăşească de aproximativ 20 ori pe cel al pieselor din interior.

S-a utilizat ca fixator chimic simplu formaldehida (formol) 10% soluţie apoasă. S-a

preferat acest fixator pentru capacitatea de fixare prin coagulare a proteinelor structurale, bună

viteza de penetrare, toleranţa şi intervalul de timp foarte mare pe durata căruia asigură

conservarea.

Pentru extragerea sărurilor de calciu (demineralizare) s-a utilizat lichidul Bouin în

compoziţia căruia intră 15 părţi acid picric, 5 părţi formol şi o parte acid acetic glacial.

3. Includerea la parafină

Acest timp operator se derulează în patru faze succesive:

I. Deshidratarea

Deshidratarea este necesară pentru eliminarea apei din ţesuturi, în vederea impregnării

ulterioare în parafină, a pieselor.

1

Deshidratarea s-a executat trecând piesele prin trei băi cu alcool în concentraţii

progresiv crescânde: 80%, 90% şi alcool absolut. Durata de menţinere a fragmentelor în

fiecare baie a fost de două ore.

II. Clarificarea

A fost executată în vederea extragerii etanolului din piese, acesta nefiind miscibil cu

parafina.

Operaţiunea a fost executată cu două băi de acetonă şi apoi două băi cu benzen, în

fiecare baie câte două ore.

III. Impregnarea cu parafină

Obiectivul acestui timp operator este de a aduce piesa într-o stare de rigiditate şi de

omogenitate optimă în vederea secţionării.

Operaţiunea se realizează în termostatul de includere în parafină, la temperatura de

560C, în trei băi de parafină lichidă, câte două ore în fiecare baie.

IV. Includerea propriu-zisă

Includerea propriu-zisă sau turnarea blocului are drept scop încorporarea piesei

impregnată cu parafină într-un bloc din acelaşi material.

Turnarea blocului se poate realiza cu ajutorul unor forme din aluminiu care au permis

includerea simultană a 10-12 piese sau în casete speciale cu dimensiuni diferite funcţie de

mărimea pieselor de inclus.

4. Secţionarea

Secţionarea histologică se realizează cu ajutorul microtomului (manual sau

semiautomat) pentru parafină care oferă condiţii pentru obţinerea unor secţiuni cu

grosimea de 5-6 µm.

În timpul secţionării ţesuturile incluse în parafină vor fi uşor comprimate şi vor apare

pliuri, ambele fenomene făcând secţiunile improprii pentru examenul microscopic. Pentru

eliminarea acestui inconvenient se recurge la etalarea secţionărilor pe lame de sticlă port-

obiect.

4.1. Etalarea secţiunilor

Etalarea se poate realiza, utilizând “acele de disociere”, prin două procedee:

- direct pe lama port-obiect, pe o picătură de apă încălzită la becul de gaz;

- prin scufundarea secţiunilor într-o baie de apă la 40 ̊ -50̊C şi preluarea lor de pe

suprafaţa apei direct cu lama port-obiect;

2

5. Colorarea

Secţiunile au fost colorate prin următoarele metode de colorare histologică, în funcţie

de scopul urmărit:

- Hematoxilină-Eozină- Albastru de metil (HEA), pentru orientare generală;

- Acid Periodic- Fuxină Schiff (PAS), pentru mucopolizaharide şi miceţi.

- coloraţia Azan, pentru evidenţierea fibrinoidului (roşu-portocaliu);

- coloraţia Perls, pentru evidenţierea compuşilor feruginoşi (albastru-verzui);

- coloraţia Kossa, pentru evidenţierea calciului (galben-brun)

1. Metoda Hematoxilină-Eozină- Albastru de metil (HEA) – pentru orientare

generală

I. Deparafinare:

1. Benzen I - 10 minute

2. Benzen II - 10 minute

3. Benzen III - 10 minute

4. Benzen IV - 10 minute

5. Benzen V - 10 minute

II. Rehidratare

1. Alcool etilic absolut - 10 minute

2. Alcool etilic 90% - 10 minute


4. Apa robinet - 10 minute

5. Apă distilată - pasaj

III. Colorare

1. Hematoxilină Mayer - 10 minute

2. Apă robinet - pasaj

3. Apă litinată - 10 minute


5. Eozină - 10 minute


7. Acid fosfomolibdenic 1% - 10 minute


9. Albastru de metil 1% - 3 minute


3

IV. Deshidratare




V. Clarificare

1. Benzen I - 10 minute

2. Benzen II - 10 minute

3. Benzen III - 10 minute

4. Benzen IV - 10 minute

5. Benzen V - 10 minute

2. Metoda Acid Periodic - Fuxină Schiff (PAS)

I. Deparafinare

II. Rehidratare

III .Colorare

1. Acid periodic 1% - 10 minute

2. Apă robinet - 5 minute


4. Reactiv Schiff - 15 minute

5. Apă sulfuroasă - 3 minute




9. Hematoxilină Mayer - 4 minute


11. Apă litinată - 5 minute


IV. Deshidratare




V. Clarificare

3. Metoda May- Grűnwald- Giemsa (MGG)

I. Deparafinare

II. Rehidratare

4

III. Colorare

1. Soluţia May- Grűnwald - 5 minute

2. Soluţie Giemsa - 15 minute


4. Apă acetată 0,5% - 20 secunde


6. Alcool metilic 80% - pasaj

IV. Deshidratare

V. Clarificare

6. Montarea. După clarificare secţiunile se montează cu balsam de Canada şi apoi se

examinează la microscopul fotonic.

5

tehnica histopatologica l.p.1

Documents