Ing. Laura Gabriela Fogaraşi (căs. Doboş)

Studii privind bioremedierea solurilor poluate cu

petrol folosind microorganisme selecţionate din

microflora autohtonă

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific

Prof. univ. dr. Carmen PUIA

CLUJ-NAPOCA

– 2011 –

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

ŞCOALA DOCTORALĂ

241

REZUMAT

Poluarea mediului înconjurător reprezintă contaminarea cu diverse materiale care

interferează cu sănătatea umană, calitatea vieţii sau funcţia naturală a ecosistemelor

(organismele vii şi mediul în care trăiesc).

Bioremedierea solurilor contaminate cu petrol şi produse petroliere constituie

procesul biologic în care hidrocarburile acestora sunt degradate prin intermediul

microorganismelor. Microorganismele folosite în acest proces sunt cu preponderenţă cele

indigene, dar pot fi folosite şi microorganismele izolate din altă parte şi inoculate pe

solurile contaminate.

În acest sens s-a observat faptul că numeroase microorganisme au capacitatea de a

utiliza hidrocarburile atât în stare gazoasă cât şi în stare lichidă şi solidă din seriile

alifatice, aromatice şi asfaltice, pe care le folosesc ca sursă de carbon şi energie (Zarnea,

1994). Acestea degradând hidrocarburile parţial sau complet iar rezultatul rămas în urma

activităţii lor microbiene este nepoluant pentru mediu fiind alcătuit din apă, CO2 şi

substanţe netoxice.

Microorganismele care participă în procesul de biodegradare a hidrocarburilor

sunt: bacteriile, fungii, levurile şi algele. Cele mai importante grupe de microorganisme

care participă la biodegradarea hidrocarburilor sunt bacteriile şi fungi.

OBIECTIVELE TEZEI

Obiectivele propuse pentru realizarea temei de cercetare au fost următoarele:

Izolarea pe diferite medii de cultură a principalelor grupe de microorganisme

(bacterii şi fungi) din solurile poluate cu petrol.

Obţinerea de tulpini pure şi identificarea lor taxonomică.

Testarea capacităţii de biodegradare a microorganismelor selectate şi izolate în

cultură pură, pe medii cu petrol.

Multiplicarea microorganismelor şi crearea de consorţii microbiene în vederea

degradării hidrocarburilor petroliere din solurile poluate.

Studiul sinergismului microorganismelor implicate în consorţii.

Aplicarea şi verificarea consorţiilor microbiene în casa de vegetaţie, pe

variante de sol poluate cu petrol.

242

MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic folosit în realizarea experienţelor privind depoluarea biologică

a solurilor contaminate cu petrol a fost constituit din microorganismele izolate din

probele de sol poluate şi prelevate de pe două situri petroliere aflate în două zone

geografice diferite: Ploieşti şi Suplacu de Barcău.

Din probele de sol prelevate de pe situl petrolier Ploieşti au fost izolate 21 tulpini

bacteriene (CBP) şi nouă tulpini fungice (FP) iar din probele de sol recoltate de pe situl

petrolier Suplacu de Barcău au fost izolate 20 tulpini bacteriene (CBS) şi 12 tulpini

fungice (FS).

Pentru testarea efectului bioremediator al consorţiilor microbiene aplicate pe solul

poluat artificial cu diferite concentraţii de petrol s-a folosit ca plantă indicatoare salata

(Lactuca sativa var. capitata), soiul Attraktion, deoarece perioada de vegetaţie este scurtă

şi este sensibilă la toxicitatea solului (Banks and Schultz, 2005; Hubálek et al., 2007).

METODELE DE CERCETARE ÎN LABORATOR

Metodele de cercetare folosite în experienţele din laborator au constat în:

izolarea principalelor grupe de microorganisme din probele de sol;

obţinerea culturilor pure;

testarea capacităţii de biodegradare a microorganismelor (izolate în cultură

pură);

identificarea microorganismelor care au prezentat capacitate ridicată în

biodegradarea hidrocarburilor petroliere;

multiplicarea tulpinilor bacteriene şi a tulpinilor fungice;

crearea consorţiilor microbiene.

Izolarea, cuantificarea şi menţinerea tulpinilor microbiene s-a realizat în plăci Petri

pe mediu nutritiv agarizat iar multiplicarea tulpinilor microbiene s-a efectuat în vase

Erlenmeyer în mediu nutritiv lichid.

Pentru a preveni aglomerarea celulelor microbiene s-a utilizat metoda diluţiilor

decimale.

243

Pentru izolarea coloniilor bacteriene şi fungice s-a folosit metoda de însămânţare

în profunzime. Însămânţarea, în acest caz s-a realizat cu ajutorul unei micropipete înainte

de solidificarea mediului de cultură.

Pentru testarea capacităţii biodegradative a hidrocarburilor petroliere, tulpinile

bacteriene şi fungice izolate au fost cultivate pe mediu mineral la care s-au adăugat

concentraţii diferite de ţiţei provenit de la Ploieşti şi Suplacu de Barcău.

METODELE DE CERCETARE ÎN CASA DE VEGETAŢIE

Efectul bioremediator al consorţiilor microbiene

Pentru testarea capacităţii biodegradative a consorţiilor microbiene au fost

înfiinţate trei experienţe amplasate în casa de vegetaţie a Universităţii de Ştiinţe Agricole

şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca.

Prima experienţă urmăreşte efectul bioremediator al celor trei tipuri de consorţii

microbiene asupra solului poluat cu diferite cantităţi de ţiţei.

Experienţa cuprinde variante de sol poluate cu diferite concentraţii de ţiţei, la care

s-au adăugat consorţiile microbiene obţinute în laborator. În cadrul experienţei fiecare

variantă luată în studiu a fost reprezentată de un vas de vegetaţie cu capacitatea de cinci

litri. Variantele din cadrul experienţei au fost repartizate într-un număr de trei repetiţii, cu

aşezare randomizată conform schemei din figura 4.13.

Factorii experimentali au fost:

factorul A = locaţia ţiţeiului - Ploieşti (P)

- Suplacu de Barcău (S)

factorul B = cantitatea de ţiţei aplicată pe sol: - 1% (10.000 mg/kg)

- 3% (30.000 mg/kg)

- 5% (50.000 mg/kg)

factorul C = consorţiul microbian - Ploieşti (CMP)

- Suplacu de Barcău (CMS)

- combinat (CMC)

În cadrul experienţei, la intervale de 60 de zile după aplicarea consorţiilor

microbiene, au fost recoltate probe de sol pentru a se determina conţinutul de

hidrocarburi petroliere. Prelevarea probelor s-a realizat din mai multe puncte din cadrul

244

fiecărui recipient pentru a se obţine un rezultat cât mai exact al conţinutul de ţiţei rămas

în sol.

Analiza solului privind conţinutul de hidrocarburi petroliere a fost realizată în

laboratoarele Institutului de Cercetări pentru Instrumentări Analitice Cluj (ICIA Cluj).

Conţinutul de hidrocarburi petroliere a fost determinat prin analiza FTIR. Analiza

care are la bază metoda spectrofotometrică prin infraroşu.

Eficacitatea bioremedierii pe plante de salată

Pentru verificarea eficacităţii bioremedierii, cu ajutorul plantelor de salată, au fost

înfiinţate două experienţe:

prima experienţă s-a înfiinţat după două luni de bioremediere a solurilor

contaminate;

a doua experienţă a fost înfiinţată la finalizarea procesului de bioremediere

(după patru luni).

Înfiinţarea celor două experienţe s-a realizat simultan cu perioada în care au fost

efectuate analizele biochimice ale solului cu privire la conţinutul hidrocarburilor

petroliere din sol.

Principalele obiective urmărite în fiecare experienţă au constat în:

influenţa concentraţiilor de ţiţei asupra creşterii şi dezvoltării plantelor de

salată;

influenţa tipului de ţiţei folosit în experienţă asupra creşterii şi dezvoltării

plantelor salată;

influenţa consorţiilor microbiene asupra creşterii şi dezvoltării plantelor de

salată.

Observaţiile fenologice urmărite au fost creşterea şi dezvoltarea plantelor de salată

precum şi numărul de frunze formate. Observaţiile şi măsurătorile asupra plantelor de

salată s-au efectuat la diferite intervale de timp: la 28 zile, 43 zile şi 57 zile de la semănat.

Aceste experienţe cuprind variante de sol poluate cu diferite concentraţii de ţiţei la

care s-au adăugat consorţiile microbiene. Din fiecare variantă s-au prelevat câte 0,5 kg

sol în trei repetiţii. Probele de sol din cele trei repetiţii au fost omogenizate obţinându-se

245

proba medie. Fiecare probă medie a fost repartizată în câte trei vase de vegetaţie cu

diametrul de 12 cm în care au fost semănate un număr de 20 seminţe de salată.

Vasele de vegetaţie s-au amplasat randomizat conform schemei din figura 4.14.

REZULTATE EXPERIMENTALE OBŢINUTE

Degradarea hidrocarburilor petroliere

Tulpinile bacteriene CBP1, CBP2, CBP6, CBP7, CBP8, CBP10, CBP11, CBP13,

CBP14, CBP15, CBP16, CBP17, CBP18, CBP19, CBP20, CBP21, CBS1, CBS2, CBS3, CBS4,

CBS8, CBS10, CBS15, CBS16, CBS17, CBS18, CBS19, CBS20 au folosit ca sursă de carbon

hidrocarburile din ţiţei. Acestea au fost utilizate în vederea creării consorţiilor microbiene

alături de fungii izolaţi din probele medii de pe siturile petroliere Ploieşti şi Suplacu de

Barcău.

În urma procesului de testare a tulpinilor fungice se remarcă faptul că toate

tulpinile fungice au avut o foarte bună şi bună dezvoltare pe una dintre mediile minerale

cu adaos de ţiţei.

Identificarea şi încadrarea taxonomică a tulpinilor bacteriene şi fungice

Din proba de sol de pe situl petrolier Ploieşti au fost identificate 16 tulpini

bacteriene din genurile Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus (şase tulpini), Burkholderia,

Pseudomonas şi speciile Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (trei tulpini),

Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia şi nouă tulpini fungice din genurile

Aspergillus, Fusarium, Paecylomices, Penicillium (două tulpini), Rhizopus,

Scopulariopsis, Trichoderma (două tulpini).

Din proba de sol de pe situl petrolier Suplacu de Barcău au fost identificate 12

tulpini bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus (trei tulpini), Burkholderia şi

speciile Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia,

Burkholderia gladioli (două tulpini), Enterobacter clocae (două tulpini) şi 12 tulpini

fungice din genurile Aspergillus (cinci tulpini), Acremonium, Crysosporium, Mortierella

(două tulpini), Paecylomices, Penicillium (două tulpini) izolate din proba de sol prelevată

de pe situl petrolier Suplacu de Barcău.

246

Efectul bioremediator al consorţiului microbian Ploieşti

În urma analizelor efectuate, la finalizarea experienţei s-a observat o scădere a

conţinutului de hidrocarburi la toate variantele experimentale, cele mai evidente rezultate

fiind remarcate în cazul solului contaminat cu ţiţei de pe situl petrolier Ploieşti.

În cazul solurilor poluate cu 1% ţiţei se observă o reducere a conţinutului de

hidrocarburi sub 5000 mg/kg începând cu intervalul 0 - 60 zile de la aplicarea

consorţiului microbian, ceea ce indică, conform anumitor autori (Zisu şi Ianoş, 2008),

pretabilitatea reintegrării acestor soluri în circuitul agricol, această cantitate de petrol

favorizând creşterea şi dezvoltarea plantelor.

La finalizarea experienţei, în cazul variantelor poluate cu petrol de la Ploieşti şi

bioremediate, s-a observat intensitatea maximă a activităţii microbiene la varianta poluată

cu 5% petrol, cu o reducere a conţinutului de hidrocarburi de 333,33 mg/kg/zi, urmată de

varianta contaminată cu 3%, cu 175,83 mg/kg/zi hidrocarburi reduse/zi şi varianta

poluată cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 66,67 mg/kg/zi.

După finalizarea procesului de bioremediere, în cazul variantelor contaminate cu

ţiţei de la Suplacu de Barcău, s-a înregistrat cea mai intensă activitate microbiană la

varianta poluată cu 5%, conţinutul de hidrocarburi fiind redus cu 300,00 mg/kg/zi, urmată

de varianta contaminată cu 3%, cu 100,00 mg/kg/zi hidrocarburi reduse şi varianta

poluată cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 51,66 mg/kg/zi.

Aceste aspecte indică necesitatea unei perioade de bioremediere mai lungi decât

120 zile în cazul solurilor poluate cu concentraţii de petrol mai mari de 1%.

Efectul bioremediator al consorţiului microbian Suplacu de Barcău

Analizând capacitatea biodegradativă a consorţiului microbian Suplacu de Barcău

asupra variantelor de sol poluate cu ţiţei provenit de pe situri diferite, se constată o

capacitate ridicată de biodegradare în primele 60 de zile pe solul poluat cu ţiţei de la

Suplacu de Barcău. În a doua perioadă de bioremediere (120 zile) acest consorţiu

microbian a fost mai eficient în biodegradarea hidrocarburile provenite din ţiţeiul de la

Ploieşti, ceea ce confirmă datele din literatura de specialitate (Rodica Stănescu şi colab.,

2006), adică bioremedierea solurilor poluate se poate realiza atât cu microorganismele

indigene cât şi cu microorganismele izolate din altă parte şi inoculate pe sol poluat.

247

În cazul variantelor contaminate cu 3%, respectiv 5% petrol chiar dacă activitatea

microbiană a fost foarte intensă, conţinutul de hidrocarburi rămas în sol după 120 de zile

nu este favorabil creşterii şi dezvoltării plantelor, conform datelor din literatura de

specialitate (Zisu şi Ianoş, 2008; Baek et al., 2004). Din acest considerent se recomandă

ca procesul de bioremediere să aibe o durată mai mare de 120 zile.

Efectul bioremediator al consorţiului microbian combinat

În urma datelor obţinute se poate concluziona faptul că solul contaminat cu 1%

ţiţei şi remediat biologic atât 60 de zile cât şi 120 de zile poate fi folosit ca şi suport

pentru cultivarea plantelor, în timp ce solul poluat cu 3%, respectiv 5% ţiţei şi

bioremediat 120 de zile nu este pretabil în circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui

tratament biologic cu un interval de timp mai mare de 120 zile.

Înălţimea plantelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Ploieşti

Solul poluat cu o concentraţie de 1% ţiţei şi bioremediat două luni poate fi folosit

ca suport pentru cultivarea plantelor de salată precum şi a altor specii legumicole (figura

5.165).

La variantele poluate cu 3% ţiţei şi bioremediate, plantele de salată au avut o

dezvoltare foarte viguroase, înălţimile medii înregistrând valori mult mai mari în cadrul

experienţelor realizate după finalizarea procesului de bioremediere - solul remediat

biologic cu ajutorul consorţiilor Ploieşti şi Suplacu de Barcău timp de patru luni (figura

5.166) se poate folosi în circuitul agricol.

La sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă creşterea plantelor pe sol

contaminat cu 5% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni, comparativ cu plantele care au

pierit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de ţiţei dar bioremediat timp de două

luni însă nu se recomandă folosirea solului pentru cultivarea plantelor, deoarece plantele

au o dezvoltare slabă.

Cele mai bune rezultate s-au înregistrat pe solurile contaminate cu petrol de pe

situl petrolier Ploieşti şi bioremediate cu consorţiu microbian format din

microorganismele izolate de pe aceleaşi sit petrolier.

248

Înălţimea plantelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Suplacu de

Barcău

Solul poluat cu concentraţia de 1% ţiţei şi remediat biologic două luni cu consorţiu

Ploieşti şi consorţiu combinat (figura 5.171) este pretabil pentru cultivarea plantelor de

salată sau a altor specii legumicole.

Solul poluat cu concentraţia de 3% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni cu

consorţiu microbian Suplacu de Barcău poate fi folosit pentru cultivarea plantelor de

salată.

În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de

bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu

5% şi bioremediat comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeaşi

concentraţie de petrol dar bioremediat timp de două luni.

Numărul frunzelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Ploieşti

Plantele de salată au format un foliaj bogat, numărul mediu de frunze înregistrând

valori mult mai mari în cadrul experienţelor realizate după finalizarea procesului de

bioremediere comprativ cu variantele bioremediate timp de două luni.

În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de

bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu

5% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni comparativ cu plantele care s-au ofilit pe solul

contaminat cu aceeaşi concentraţie de petrol dar bioremediat timp de două luni.

Numărul frunzelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Suplacu de

Barcău

Plantele de salată au format un foliaj dens, verde, frumos; numărul mediu de

frunze înregistrând valori mult mai mari în cadrul variantelor bioremediate timp de patru

luni faţă de variantele bioremediate timp de două luni.

La sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor

dezvoltate pe sol contaminat cu 5% şi inoculat cu consorţiile microbiene, comparativ cu

plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de petrol dar

bioremediat timp de două luni.

249

CONCLUZII

Au fost izolate un număr de 21 tulpini bacteriene şi 9 tulpini fungice de pe situl

petrolier Ploieşti iar de pe situl petrolier Suplacu de Barcău au fost izolate un număr de

20 tulpini bacteriene şi 12 tulpini fungice.

Tulpinile bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia,

Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas şi tulpinile fungice din genurile

Aspergillus, Acremonium, Crysosporium, Fusarium, Mortierella, Paecilomyces,

Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma au fost utilizate în vederea creării

consorţiilor microbiene.

Identificarea bacteriilor izolate s-a efectuat pe baza caracterelor morfologice,

aspectelor culturale ale coloniei şi caracterelor biochimice.

Identificarea fungilor izolaţi s-a realizat pe baza caracterelor morfologice şi

culturale ale fiecărei tulpini fungice.

În cazul solurilor poluate cu 1% ţiţei (Ploieşti şi Suplacu de Barcău), s-a observat,

o reducere a conţinutului de hidrocarburi la o valoare sub 5000 mg/kg, la 60 de zile de la

aplicarea consorţiilor microbiene, ceea ce înseamnă că solurile pot fi folosite ca suport

pentru cultivarea plantelor, această cantitate favorizând creşterea şi dezvoltarea lor.

În cazul solului poluat cu 3%, respectiv 5% ţiţei (Ploieşti şi Suplacu de Barcău), s-

a constatat, o reducere a conţinutului de hidrocarburi, însă aceste soluri bioremediate nu

sunt pretabile în circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui tratament biologic cu un

interval de timp mai mare de 120 zile.

Plantele de salată au fost folosite pentru a se urmări efectul bioremediator al

consorţiilor microbiene create asupra solului contaminat cu ţiţei de pe siturile petroliere

Ploieşti şi Suplacu de Barcău.

În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de

bioremediere s-a observat o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate la toate variantele

contaminate şi bioremediate comparativ cu plantele dezvoltate la aceleaşi variante însă

bioremediate timp de două luni

250

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. BAEK K.H., H.S. KIM, H.M. OH, B.D. YOON, J. KIM, I.S. LEE, 2004, Effect

of crude oil, oil components and bioremediation on plant growth, Journal of

environmental science and health, Part A – Toxic/Hazardous Substances &

environmental engineering vol. A39 (9): 2465-2472.

2. BANKS M.K., K.E. SCHULTZ, 2005, Comparison of plants for germination

toxicity tests in petroleum - contaminated soils, Water, Air and Soil Pollution

167: 211-219.

3. HUBÁLEK T., SIMONA VOSÁHLOVA, V. MATĚJU, NORA KOVÁČOVÁ,

ČENĚK NOVOTNÝ, 2007, Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated

soil during bioremediation: A Case Study, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 52:

1–7.

4. STĂNESCU RODICA, LILIANA BOBIRICĂ, OANAMARI ORBULEŢ, 2006,

Remedierea solurilor contaminate, Ed. Agir, Bucureşti, 235 pag.

5. ZARNEA G., 1994, Tratat de microbiologie generală. Bazele teoretice ale

ecologiei microorganismelor. Microorganismele şi mediile lor naturale, Ed.

Academiei Române, Bucureşti, 943-947.

6. ZISU I., GH. IANOŞ, 2008, Aspects regarding the pollution of agricultural lands

from banat with petroleum hydrocarbons, Annals of West University of Timisoara,

Series Chemistry, 17 (1): 97-102.