MORFOLOGIA I STRUCTURA BACTERIILOR

1

MORFOLOGIA I STRUCTURA BACTERIILOR1. Morfologia bacteriilor1.1. Dimensiuni Lumea bacterian este populat de entiti microscopice ce nu pot fi vzute cu ochiul liber. Dimensiunile sunt att de reduse, nct un volum de 1cm3 poate cuprinde 1012 bacterii cu o greutate de aproximativ 1g, iar ntr-un mediu lichid limpede sunt necesare cel puin 1-10 milioane de bacterii pentru a produce o turbiditate sesizabil macroscopic. n intestinul nostru sunt prezente n jur de 10-100 de trilioane de bacterii, numrul lor depind cu mult cel al propriilor noastre celule.Dimensiunea bacteriilor se exprim n micrometri (1=10-3 mm), variaiile fiind n funcie de specie, form, mediu i vrsta culturii. n general, este cuprins ntre 1-10. Cele mai mici bacterii sunt cele din genul Mycoplasma, cu diametrul de 0,3-0,8, pe cnd cele mai mari ca, de pild, spirochetele ajung pn la o lungime de 15-20. Formele filamentoase, cum sunt actinomicetele, pot atinge o lungime pn la 500. Aprecierea dimensiunii, a formei i aezrii bacteriilor sunt posibile la microscopul optic, iar a detaliilor morfologice i structurale numai prin microscopie electronic.1.2. Form n raport cu forma lor deosebim 4 categorii de bacterii: rotunde (cocii), alungite (bacili), ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) i filamentoase (actinomycetele).cocii sunt bacterii rotunde (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) cu de 0,8 - 1;bacilii sunt bacterii cu form alungit de bastona cu dimensiuni ntre 1,5 - 10. La bacili este important examinarea extremitilor, aspectul acestora avnd rol n identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), tiate drept (Bacillus anthracis - bacilul crbunos), mciucate (Corynebacterium diphteriae - bacilul difteric), n form de suveic (Fusobacterium);cocobacilii sunt bacterii uor alungite, fiind forme intermediare ntre coci i bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae);vibrionii sunt bacterii ncurbate n form de virgul (Vibrio cholerae);spirilii sunt bacterii spiralate avnd 1-2 spire rigide (Spirillum volutans);spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil avnd 12-20 de spire (Treponema pallidum), foarte multe spire strnse (Leptospira) sau 2-3 spire (Borrelia): actinomicetele sunt bacterii foarte asemntoare fungilor i formeaz filamente sau hife lungi i ramificate care se rup, rezultnd forme bacilare (Actinomyces).1.3. DispunereBacteriile sunt organisme unicelulare care se multiplic prin diviziune binar. La unele specii, dup diviziune urmeaz separarea complet a celulelor fiice, rezultnd bacterii izolate. La alte specii, dup diviziune, celulele fiice rmn legate ntre ele, grupndu-se n mod caracteristic datorit unei substane vscoase dispus fie pericelular, fie localizat n anumite regiuni determinnd diferite tipuri de aezare a celulelor.Aezarea bacteriilor permite uneori recunoaterea genului, sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopul optic a preparatelor colorate efectuate din culturi, sau direct din produsul recoltat de la pacient.Cocii se dispun:n grmezi sau asemntor unei ciorchini de struguri ca, de exemplu, germenii din genul Staphylococcus;n tetrade la genul Micrococcus;n baloturi de cte 8 coci orientai n cele 3 direcii ale spaiului la genul Sarcina;n lanuri la genul Streptococcus;n diplo, ca dou flcri de lumnare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae;n diplo, ca dou boabe de cafea care se privesc fa n fa prin concavitile lor ca, de pild, la Neisseria gonorrhoeae (gonococ) i Neisseria meningitidis (meningococ);izolai, care nu sunt de interes medical.Bacilii se dispun:cel mai ades izolai i n poziii ntmpltoare unul fa de cellalt ca, de exemplu, majoritatea bacililor gram-negativi;grupai cte doi (diplobacili) sau n lanuri scurte ca, de exemplu, genul Klebsiella;dispui n lanuri ca bacilii din genul Bacillus (bacilul crbunos);dispui n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeti cum sunt bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae);n palisad, ca scndurile unui gard (bacilii difterimorfi).2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENEUnitatea morfofuncional a bacteriilor este celula, un complex autoorganizat de molecule organice care schimb energie cu mediul nconjurtor i este capabil s-i regleze n mod autonom funciile vitale.Bacteriile au o structur foarte complex, fiind alctuite din componente obligatorii, prezente la toate speciile bacteriene (nucleu, citoplasm, membran citoplasmatic, mezozomi, perete celular) i componente facultative ce se gsesc doar la unele specii (capsul, flageli, fimbrii, spor).2.1. Componentele obligatorii2.1.1. Nucleul bacterian Este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o structur primitiv n comparaie cu nucleul celulelor eucariote i reprezint 2% din greutatea uscat a bacteriei. Nucleoidul este format dintr-o molecul circular de ADN, organizat sub forma unui cromozom unic care este n contact direct cu citoplasma datorit lipsei membrane nucleare. Molecula de ADN dublu spiralat este la rndul ei suprahelicat n jurul unui miez de ARN, dispoziie necesar funcionalitii materialului nuclear. n mod obinuit, nucleoidul este situat n centrul celulei bacteriene i poate fi legat de membrana citoplasmatic prin intermediul mezozomilor. Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia. Nucleul reprezinta o ttinta pentru antibiotice (fluorochinolone)n afar de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide i care se replic independent de cromozomul bacterian. Vom reveni asupra lor n capitolul de genetic bacterian.2.1.2. Citoplasma Situat ntre materialul nuclear i faa intern a membranei citoplasmatice, citoplasma este un sistem coloidal alctuit din 80% ap, n care se gsete o cantitate mare de molecule organice, ioni anorganici, enzime, ARN (de transport, mesager i ribozomial), vacuole i incluzii. Este lipsit de organitele celulare prezente la celulele eucariote cum sunt reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile, centrul celular, ergastoplasma.La microscopul optic citoplasma apare omogen, amorf, iar la cel electronic fin granulat datorit unui numr mare de ribozomi. Se apreciaz c o celul bacterian are 20.000 de ribozomi ce conin 80-90% din ARN-ul citoplasmatic.Ribozomii sunt structuri sferice cu diametru de aproximativ 180nm i constanta de sedimentare de 70S. n absena ionilor de Mg2+ se desfac n dou subuniti cu constanta de sedimentare de 50S i 30 S. Din punct de vedere chimic sunt alctuii din 65-70% ARN i 30-35% proteine. O parte din ribozomi se asociaz formnd polizomi (mai ales n timpul sintezelor proteice), alii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataeaz mezozomilor sau membranei citoplasmatice. Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul si tinta pentru anumite antibiotice (tetracicline).Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind n funcie de specia bacterian i condiiile de mediu. Compoziia lor chimic este diferit, ele putnd fi de glicogen sau amidon (la unii bacilii aerobi sporulai), lipide (la genul Bacillus), polimetafosfai (sau incluziile de volutin descrise mai nti la Spirillum volutans i apoi de Babe i Ernst la bacilii difterici) etc. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie.2.1.3. Membrana citoplasmaticEste o membran fin (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic ce mrginete la exterior citoplasma bacteriilor i o separ de peretele celular. Pe seciune apare trilaminat, fiind alctuit din dou straturi fosfolipidice dispuse cu prile hidrofobe fa n fa. Printre moleculele fosfolipidice se gsesc molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele dou straturi fosfolipidice, fie le traverseaz fiind expuse la ambele fee ale membranei. Aceast structur dinamic, fluid, temporar i reversibil n funcie de factorii de mediu este o structur n mozaic, modelul ei fiind descris n 1972 de Singer i Nicholson.Funciile membranei citoplasmatice:este o membran cu permeabilitate selectiv, ndeplinind funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, n ambele sensuri cu mediul nconjurtor. Permeabilitatea selectiv a membranei citoplasmatice permite realizarea n interiorul celulei, pentru unele substane, concentraii de 105 ori mai mari dect n afara celulei,secret numeroase enzime hidrolitice ce se elibereaz n mediul nconjurtor unde scindeaz substratul nutritiv n uniti absorbabile,unele proteine legate de membrana citoplasmatic joac rolul de chemoreceptori,ndeplinete rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind sediul enzimelor lanului respirator i al fosforilrii oxidative, deci centrul energogenezei celulare, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor,este implicat n sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participnd activ la creterea i diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian,constituie o posibil int pentru aciunea unor antibiotice ca, de pild, polimixinele.2.1.4. MezozomiiSunt structuri membranare care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice sub form de buzunar sau n deget de mnu, prezente la bacteriile gram - pozitive i ocazional la cele gram - negative. Ei nu formeaz n citoplasm caviti inerte, ci deschise spre spaiul periplasmic (spaiul dintre membrana citoplasmatic i peretele celular) i sunt n contact direct cu materialul nuclear.Dup morfologia lor, mezozomii sunt lamelari, veziculari i tubulari, iar dispoziia lor n celula bacterian poate fi septal, periferic i nuclear. Funciile mezozomilor:particip la replicarea cromozomului bacterian i diviziunea celular,particip la reaciile de fosforilare oxidativ i oxidoreducere, dar n msur mai mic dect membrana celular,sediul unor enzime hidrolitice care ndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote,sinteza i secreia unor exoenzime, ca de exemplu penicilinaza sau cefalosporinaza,sinteza peretelui celular i formarea sporului bacterian.2.1.5. Peretele celularComponent celular obligatorie care nconjoar membrana citoplasmatic, peretele celular este o structur rigid, specific bacteriilor. El este format dintr-un strat bazal, asemntor la toate bacteriile i un strat al structurilor superficiale, foarte difereniat, n funcie de care bacteriile manifest caractere tinctoriale diferite: bacterii gram - pozitive, gram- negative i acido-alcoolorezistente.Structura stratului bazal. Peptidoglicanul sau mureina este structura chimic responsabil de rigiditatea peretelui celular i care asigur forma i rezistena mecanic a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el const dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamin i acid N-acetil-muramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanurile vecine sunt legate ntre ele prin puni polipeptidice, transversale, a cror structur difer la bacteriile gram- pozitive de cele gram-negative i chiar de la specie la specie. Astfel, de fiecare molecul de acid N-acetil-muramic se leag un tetrapeptid ce conine D i L aminoacizi. De exemplu, tetrapeptidul la Staphylococcus aureus este format din L-alanin - D-glutamin - L-lizin - D-alanin, iar la bacteriile gram negative conine acid diaminopimelic. La bacteriile gram - pozitive dou tetrapeptide de pe 2 lanuri paralele nvecinate sunt legate printr-un pentapeptid. La bacteriile gram - negative, tetrapeptidele se leag ntre ele printr-o simpl legtur peptidic. Menionm c acidul diaminopimelic i acidul N-acetil-muramic sunt componente care nu au fost gsite n natur dect la bacterii.Structura stratului structurilor speciale. Deosebim 3 tipuri de structuri speciale: gram-pozitiv, gram-negativ i acido-alcoolorezistent.La bacteriile gram - pozitive, peptidoglicanul reprezint 50-90% din greutatea uscat a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm i conine pn la 200 de lanuri paralele de murein.Stratul structurilor speciale este redus i alctuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic i gliceroltheicoic. Acetia pot ptrunde pn la membrana citoplasmatic legndu-se covalent de aceast - acizii theicoici de membran sau numai pn la perete - acizi theicoici de perete. Ei reprezint antigenele de supafa ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la aciunea lizozimului care rupe legturile dintre acidul N-acetil muramic i N-acetilglucozamin i a penicilinei care nhib sinteza peptidoglicanului.La bacteriile gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm, reprezentnd numai 10% din greutatea uscat a bacteriei. Stratul superficial este ns mult mai complex dect la bacteriile gram - pozitive fiind alctuit dintr-o membran extern, lipoproteine i lipopolizaharidul de perete.Membrana extern este format dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Aceste proteine, bine definite la majoritatea speciilor bacteriene, sunt denumite Omp (outer membrane proteins) sau Momp ( major outer membrane proteins). Membrana extern se leag de protoplast prin intermediul unei lipoproteine i a proteinei OmpA din membrana extern. Proteinele nespecifice ale membranei externe cu funcie de porine, cum sunt trimerii OmpF i OmpC, delimiteaz nite canale umplute cu ap prin intermediul crora pot difuza n spaiul periplasmic substane hidrosolubile.Proteinele specifice au funcii de transport pentru anumite substane, unele dintre ele fiind i receptori pentru bacteriofagi. De exemplu, proteina LamB este responsabil pentru transportul maltozei i receptor pentru fagul lambda al bacilului coli.Proteinele de suprafa pot avea la unele bacterii rol n patogenitate, ca de exemplu cele 7 proteine de suprafa al shigellelor care le asigur invazivitatea.Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afl lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. Aceasta este alctuit din:lipidul A care are o structur particular, fiind format din uniti dizaharidice de glucozamin, legate de beta-hidroxiacizi grai cu 10-16 atomi de carbon fixai direct de membrana extern,miezul sau core, numit i antigen R, comun tuturor bacteriilor gram - negative i care include 2 zaharuri caracteristice: acidul keto-deoxyoctanoic i o heptoz.uniti monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie i tip i constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative.LPZ este o toxin termolabil, care se elibereaz n mediul nconjurtor de ctre bacteriile gram-negative numai dup liza lor i foarte reactiv n organismul gazd. Astfel, lipidul A produce febr, activeaz mecanismele aprrii antiinfecioase i n exces produce ocul endotoxic cu evoluie grav, chiar fatal.Spaiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creeaz un compartiment ce se ntinde de la membrana celular pn la membrana extern, numit spaiu periplasmic. El conine peptidoglicanul i un gel care favorizeaz nutriia bacteriei prin coninutul n enzime degradative ca, de pild, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele i cefalosporinazele.Bacteriile acido-alcoolorezistente de interes medical sunt bacilul tuberculos i bacilul leprei a cror perete celular se aseamn cu cel al bacteriilor gram-pozitive. Structurile speciale conin acid micolic i o cear ce confer acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite i rezisten crescut la factorii de mediu. Astfel dac, dup o nclzire de scurt durat ce topete cerurile, un colorant ptrunde n celula bacterian, decolorarea acesteia sub aciunea acizilor sau alcoolilor nu se mai produce ca la alte bacterii. Acest caracter se numete acido-alcoolo-rezisten. Bacteriile acido-acoolo-rezistente se coloreaz foarte slab cu coloraia gram, evidenierea lor fcndu-se la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen.Bacterii cu perete alterat sau formele L. Sunt bacterii cu stratul bazal viciat sub aciunea unor factori din mediu ca, de exemplu, lizozimul i penicilina, care lizeaz, respectiv mpiedic sinteza peptidoglicanului.Bacteriile lipsite total de perete celular se numesc protoplati i provin din rndul bacteriilor gram - pozitive, iar cele cu perete parial lezat, sferoplati din bacteriile gram-negative, care i pierd mai greu peretele. Formele L sunt foarte sensibile la variaiile osmotice, putnd supravieui numai n condiii speciale de osmolaritate, dar sunt foarte rezistente la antibioticele beta-lactamice. Dac factorii nocivi dispar din mediu, formele L se pot transforma n bacterii normale prin resinteza peretelui celular. Unele teorii mai vechi susin c formele L pot ntreine i croniciza o infecie, dar dovezile n acest sens lipsesc.Funciile peretelui celular:asigur forma, rezistena mecanic i osmotic a bacteriei;asigur protecia membranei citoplasmatice fa de presiunea intern a celulei bacteriene, care este foarte mare: 5-6 atm la E. coli, 20-30 atm. la S. aureus;regleaz traficul molecular de perete n ambele sensuri, deci schimbul de substane dintre bacterie i mediul nconjurtor, fiind permeabil pentru molecule cu o GM mai mic de 10.000 daltoni i cu un diametru mai mic de 1nm;stocheaz unele enzime n spaiul periplasmic la bacteriile gram-negative ce vor fi eliberate dup necesiti, spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care i elimin enzimele direct n mediul extern;prezint receptori pentru bacteriofagi;este sediul antigenelor de suprafa, fiind deci implicat n rspunsul imun al macroorganismului;este sediul unor factori de patogenitate;are rol n diviziunea bacterian i n procesul de sporulare tinta pentru antibiotice (peniciline, cefalosporine).2.2. Componente bacteriene facultative2.2.1. CapsulaMajoritatea bacteriilor patogene i comensale sunt capabile s produc in vivo un material de nveli extracelular. Capsula este un nveli compact, intim legat de celula bacterian, cu o lime de cel puin 0,2m. Este vizibil pe preparatele uzuale sau n coloraiile negative sub forma unui halou clar ce nconjoar bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natur polizaharidic (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepia capsulei bacilului crbunos care este polipeptidic.Capsula are rol n rezistena bacteriilor fa de fagocitoz, fiind astfel un factor de virulen. Variantele necapsulate ale acelorai specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la oarecele alb de laborator o septicemie mortal, pe cnd varinata necapsulat nu este patogen.Capsula este o structur cu proprieti antigenice specifice (antigenele K) care permit diferenierea unor serotipuri n cadrul speciei. Bacteriile nu sintetizeaz material capsular in vitro pe mediile uzuale, coloniile rezultate fiind rugoase, de tip R =rough. Pe medii speciale, ns, bacteriile pot crete capsulate, coloniile fiind mucoase, de tip S =smooth.Structura descris mai sus este capsula clasic a bacteriilor, la care ne referim atunci cnd vorbim de bacterii capsulate. La unele bacterii s-au mai evideniat i alte structuri de nveli, cum sunt:Microcapsula este o structur discret cu o grosime sub 0,2m care nu se evideniaz la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulen.Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf i vscos ce nvelete bacteria. El este format din lanuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii i dextranii, cu rol major n adezivitatea bacteriilor de suprafee. Astfel, de pild, Streptococcus mutans produce cantiti mari de dextran i levan prin intermediul crora se ataeaz de suprafaa diniilor contribuind la formarea cariilor i a plcii dentare. Un alt exemplu este Pseudomonas aeruginosa, care secret un strat mucos dens care i crete rezistena la antibiotice.Funciile capsulei:este un factor de aderen i colonizare a bacteriile pe suprafee;protejeaz bacteriile de diferii ageni antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice;protejeaz bacteriile de aciunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulen;reprezint sediul antigenelor capsulare, importante n identificarea acestor bacterii.2.2.2. Cilii sau flagelii bacterieniSunt apendici filamentoi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea n citoplasma bacterian, i servesc ca organe de locomoie. Ei sunt prezeni mai ales la bacili (Enterobacteriaceae) dar i la unii coci (enterococ). Cilii sunt structuri helicoidale, cu dimensiunea n general mai mare dect cea a celulei bacteriene creia i aparin (2-15/2-20 nm) i se evideniaz microscopic prin coloraii speciale.Dispoziia i numrul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fr cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situai la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) i peritriche - cu cilii dispui pe ntreaga suprafa a bacteriei (Salmonella, E. Coli, Proteus etc.).Structura cililor este tubular, ei fiind formai dintr-o protein contractil, flagelina, sub form polimerizat. Cilul se ataeaz de bacterie printr-un corpuscul bazal i un crlig de articulaie aflate n citoplasma bacteriei. Corpusculul bazal se inser prin crligul de articulaie de membrana citoplasmatic i peretele celular.Mobilitatea i direcia micrii cililor pot fi influenate de concentraia unor substane din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) i de temperatur. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriilor.Cilii bacterieni nu se observ dect pe preparate colorate special. n practica de rutin nu se evideniaz flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lam i lamel n care se urmresc micrile bacteriilor, fie prin nsmnarea tulpinii pe un mediu semisolid prin neparea n profunzime a mediului. Dac bacteria crete nu numai pe traseul nsmnrii i difuzeaz n mediu, ea este mobil.2.2.3. Pilii bacterieniNumeroase specii bacteriene gram-negative au pe suprafaa lor lor nite apendici filamentoi, rigizi, mai scuri dect flagelii, n numr mare (100-500/celul) i cu dispoziie n general peritrich. Ei se evideniaz numai prin microscopie electronic.Din punct de vedere chimic sunt polimeri proteici de pilin, dispui helicoidal ntr-o structur tubular. Natura proteic a pililor le confer proprieti antigenice. Din punct de vedere funcional, pilii se mpart n:sex pili - codificai de formaiunile genetice extracromozomiale (plasmide) i care prezint o importan deosebit n transferul de material genetic ntre bacterii. Sunt prezeni mai ales la bacteriile gram-negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas), pili comuni sau pili de aderen (fimbrii), n numr mare, codificai cromozomial, i care servesc bacteriilor la fixarea ferm de mediul de cultur sau de celulele pe care se afl. Ei constituie, deci, un factor important de virulen (de exemplu la gonococ). n afar de aderen, pilii comuni mai au i proprieti antifagocitare.Ambele categorii de pili prezint antigene specifice piliare i pot fi receptori pentru bacteriofagi. 2.2.4. SporiiUnele bacterii se transform n spori, care sunt forme primitive de difereniere celular, cu rezisten crescut la factorii de mediu i care apar endocelular n condiii nefavorabile de via. Sporogeneza se ntlnete numai la 3 genuri de bacterii gram-pozitive, Clostridium i Bacillus care sunt bacili i Sporosarcina care sunt coci.Sporii nu sunt forme de nmulire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativ se formeaz un singur spor, care n condiii favorabile de via va da natere unei singure celule bacteriene.Forma sporului poate fi rotund sau oval. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulai aerobi, nedepind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe cnd la genul anaerob Clostridium, sporul are un diamentrul mai mare dect bacteria, producnd deformarea acesteia. Acest caracter al sporului se numete caracter clostridial i este important n identificarea bacililor gram-pozitiv anaerobi.Poziia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi central, ca la bacilul crbunos (Bacillus anthracis), subterminal, ca la B.cereus, sau terminal, ca bacilul tetanic (Cl.tetani).n coloraiile obinuite sporul apare ca o zon incolor n corpul bacterian. El se evideniaz ns prin coloraii speciale, la cald, care permeabilizeaz nveliurile sporale pentru colorani (coloraia Mller). Pe preparatele native ntre lam i lamel efectuate din culturi, sporii apar ca nite formaiuni rotunde, refringente.Ultrastructura i compoziia chimic a sporilor asigur acestora o mare rezisten la agenii fizici i chimici, ceea ce face ca ei s fie considerai forme de rezistena ale bacteriilor. De importan deosebit pentru medicin este rezistena sporilor la cldur, de care trebuie s se in cont la sterilizare. Sporularea. Este un proces ce se declaneaz n condiii nefavorabie de via, cnd bacteriile sunt lipsite de surse nutritive. Ea presupune formarea unor structuri noi i dispariia altor structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei.Din punct de vedere morfologic, sporularea ncepe prin condensarea la un capt al celulei a materialului nuclear. Acesta va fi separat de un sept ce provine din invaginarea membranei citoplasmatice. Septul crete, se desprinde de membrana citoplasmatic i formeaz n jurul materialului nuclear o membran dubl a crei fee care se privesc sunt cele ce sintetizeaz peretele bacterian. Acesta este stadiul de prespor.Cele dou lamele ale membranei presporale vor sintetiza nveliurile sporale: peretele sporal i cortexul situate ntre cele dou lamele ale membranei presporale i o tunic proteic i exosporiumul n afara membranei presporale.Structura sporului variaz de la specie la specie, dar organizarea general se aseamn. De la interior spre exterior, sporul este format din: core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear inconjurat de membrana citoplasmatic. Aici este depozitat DNA i o substan care are rol n rezistena sporului la cldur - dipicolinatul de Ca, care nu s-a mai evideniat nicieri n natur, cortexul intern sau peretele sporal format din peptidoglican i care este peretele celular primordial, membrana extern sau cortexul sporal, care este stratul cel mai gros al sporului i care conine i el un peptidoglican, cu o structur particular, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie n transformarea sporului n forma vegetativ, tunica proteic este format din proteine chitinoase cu numeroase legturi disulfitice. Ea este impermeabil, fiind responsabil de rezistena sporilor la unele dezinfectante, exosporiumul este prezent numai la unii spori i conine lipoproteine i zaharide.Germinarea sporului. n condiii de mediu favorabile, sporul germineaz i va da natere unei bacterii vegetative identice cu aceea n care s-a format. Germinarea are loc n 3 etape:Activarea sporului. Se produce cnd acesta ntlnete condiii favorabile de via, dar i un factor care s lezeze nveliul sporal (mecanic sau chimic ca, de exemplu, lizozimul, compui cu grupri sulfhidrilice libere etc.).Iniierea este declanat de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru altele adenozina. Acesta duce la activarea unei enzime autolitice care degradeaz cortexul sporal. Are loc absorbia de ap, eliberarea dipicolinatului de calciu i degradarea unor compui sporali.Dezvoltarea sporului. Protoplastul sporal se transform n bacterie vegetativ, care trece printr-o perioad metabolic activ de refacere a constituenilor celulari normali i a echipamentului enzimatic complet.3. STUDIUL MORFOLOGIC AL BACTERIILORExaminarea microscopic este frecvent primul pas n identificarea unor bacterii. Caracterele morfologice i tinctoriale ncadreaz bacteriile ntr-unul din grupurile majore stabilind conduita diagnosticului bacteriologic. Elementele morfologice importante n identificarea unei bacterii sunt: dimensiunea, forma, aezarea, prezena unor structuri speciale ca, de pild, endospori, flageli, capsul sau incluzii intracelulare.Microscopul cu cmp luminos. Acesta are 2 sisteme de lentile care mresc imaginea obiectului studiat: lentilele obiectivului i lentilele ocularelor. n mod obinuit se folosesc 3 obiective: un obiectiv care mrete de 10x i care se folosete pentru obinerea unei imagini de ansamblu a preparatului examinat, un obiectiv ce mrete de 40x, cu care se examineaz microorganisme mai mari ca, de pild fungi, parazii i n fine obiectivul cu imersie care amplific imaginea de 90 sau 100x i cu care se examineaz bacteriile. Imaginea mai este amplificat nc de 7 sau 10 ori de lentilele ocularelor. Puterea de rezoluie (distana cea mai mic ntre 2 puncte ce poate fi perceput) a unui microscop fotonic este de 0,2. La microscopul cu cmp luminos se examineaz preparatele colorate, dar uneori i preparate native.Microscopul cu fond ntunecat. Are un condensator special, cardioid, care permite ptrunderea luminii numai de la periferia obiectivului. La acest tip de microscop se examineaz preparatele native, ntre lam i lamel, efectuate direct dintr-un produs, n care se caut bacterii a cror lime nu depete 0,1-0,2 (ca, de exemplu, evidenierea treponemelor din ancrul sifilitic), sau dintr-un mediu de cultur lichid, n care se urmrete dezvoltarea unei culturi (Leptospira etc.).Microscopul cu contrast de faz se folosete tot la examinarea preparatelor native. El are un sistem de filtre care permit sesizarea diferenelor de faz a luminii cnd aceasta trece prin obiecte de densitate diferit. Microorganismele examinate la acest microscop au aspect tridimensional.Microscopul cu raze UV. Unii compui ca, de exemplu, fluorocromii sunt capabili s absoarb lumina ultraviolet i s emint o energie cu lungime de und superioar. Preparatele de examinat sunt colorate n prealabil cu un compus fluorescent ca, cum este, izotiocianatul de fluorescein iar apoi sunt examinate. Particulele colorate vor apare luminoase, fluorescente pe cmpul ntunecat al microscopului.Microscopul electronic. Lumina este nlocuit cu un fascicul de electroni. n microscopia electronic cu transmisie, electronii trec direct prin preparat, iar n microscopia prin baleiaj ei trec dintr-un anumit unghi prin preparat, astfel nct imaginea ce apare pe ecran este tridimensional.Examinarea morfologiei bacteriene se efectueaz pe diverse preparate microscopice. Efectuarea frotiurilor fixate i colorate este o metod de rutin n laboratorul de bacteriologie. Frotiurile se pot colora simplu cu un singur colorant, elementele preparatului avnd toate aceeai culoare, eventual de intensitate diferit, sau difereniat cu mai muli colorani, bacteriile colorndu-se diferit n funcie de afinitatea lor tinctorial.Dup efectuarea frotiurilor, acestea se usuc la temperatura camerei i se fixeaz cel mai des prin cldur, trecnd frotiul de 2-3 ori prin flacr. n timpul fixrii, formele vegetative ale bacteriilor sunt omorte i devin permeabile pentru colorani. Fixarea chimic (cu alcool metilic, aceton, May-Grnwald, acid osmic etc.) se utilizeaz mai ales cnd preparatele sunt seciuni de esuturi sau frotiuri de snge, deoarece protejeaz celulele din produs de degradare.Coloraiile simple folosesc soluii apoase a unui colorant bazic ca, de exemplu, albastru de metilen, violet de metil, fuxin bazic etc. Cationii coloranilor bazici se combin cu anionii protoplastului bacterian i cu fosfaii acizilor nucleici. Dup colorare, frotiurile se spal pentru ndeprtarea excesului de colorant. Coloranii acizi nu coloreaz bacterii dect la un pH foarte acid, dar pot fi folosii pentru coloraii negative. Precizm c peretele celular nu se coloreaz n mod obinuit, structura colorat observabil la microscop fiind protoplastul bacterian. Spaiul dintre bacteriile dispuse n lanuri corespunde tocmai pereilor celulari nvecinai necolorai. Unii microbi se coloreaz bipolar datorit dispoziiei citoplasmei la ambele capete ale bacteriei.Coloraia negativ este o metod rapid i simpl de studiu a morfologiei bacteriene. Bacteriile se amestec cu colorantul (tu de China) i se ntind ca un film pe lam. Bacteriile apar incolore pe fondul colorat al preparatului.Impregnarea argentic se utilizeaz pentru colorarea spirochetelor, mai ales cnd se urmrete evidenierea lor n esuturi. n aceast coloraie, spirochetele se coloreaz n brun-negru pe fondul galben al preparatului.Coloraiile difereniale sunt cele mai importante n laboratorul de bacteriologie. Cel mai des folosit este coloraia gram, introdus de studentul danez Christian Gram la sfritul secolului trecut. Dup cum apar bacteriile n aceast coloraie ele se mpart n gram-pozitive i gram-negative. Coloraia gram const n colorarea iniial a bacteriilor cu cristal-violet sau violet de geniana. Mordansarea se face cu lugol. Urmeaz decolorarea n urma creia unii microbi, cei gram-pozitivi, pstreaz colorantul violet, iar alii, cei gram-negativi, vor fi decolorai cu un amestec de alcool-aceton. Acetia din urm se vor recolora cu fuxin bazic. Bacteriile gram-pozitive vor aprea deci de culoare violet iar cele gram-negative roii. Este important de menionat faptul c bacteriile i pot schimba caracterele tinctoriale n condiii neprielnice de via, cele gram-pozitive mai ales putndu-se decolora.Proprietatea bacteriilor de a se colora diferit prin aceast coloraie exprim diferene de structur a peretelui celular. Mecanismul care st la baza acestei coloraii nu este nc elucidat.