SECTIUNEA 1

RAPORTUL STIINTIFIC SI TEHNIC

(RST)

ETAPA DE EXECUTIE NR. 3 CU TITLUL Monitorizarea performanŃelor berbecilor nominalizaŃi. Realizarea băncii de spermă

€ RST - Raport stiintific si tehnic in extenso*

€ Proces verbal de avizare interna

€ Procese verbale de receptie a lucrarilor de la parteneri

€ Raport final de activitate (numai pentru etapa finala)

* pentru Programul 4 “Parteneriate in domeniile prioritare” se va utiliza modelul din Anexa 1

Cod: PO-04-Ed3-R1-F5

Cuprins

1. Obiectivul general al proiectului 7 2. Obiectivul specific al etapei 7 3. Rezumat 8 4. Descrierea ştiinŃifică şi tehnică 10 4.1. Monitorizarea performanŃelor de reproducŃie a berbecilor 10 4.1.1. ConsideraŃii bibliografice 10 4.1.2. Pregătirea şi antrenamentul berbecilor pentru recoltare 16 4.1.3. Caracterizarea berbecilor nominalizaŃi din punct de vedere reproductiv 17 4.1.3.1.Comportamentul sexual la recoltare 17 4.1.3.2. Recoltarea şi evaluarea spermei brute 20 4.2. Realizarea băncii de spermă 24 4.2.1. Determinarea influenŃei duratei perioadei de echilibrare asupra mobilităŃii spermatozoizilor

24

4.2.2. Determinarea influenŃei concentraŃiei de glicerol din diluant asupra mobilităŃii spermatozoizilor conservaŃi prin refrigerare

27

4.2.3. Crioconservarea 29 5. Concluzii 34 Anexe 36 Bibliografie 37

1. Obiectivul general al proiectului : Formarea unui consorŃiu de unităŃi partenere care au competenŃe complementare pentru evaluarea potenŃialului genetic şi conservarea ex situ a rasei Tigaie.

2. Obiectivul specific al etapei : Monitorizarea performanŃelor berbecilor nominalizaŃi. Realizarea băncii de spermă.

3. Rezumat

La realizarea băncii de spermă în vederea conservării potenŃialului genetic reprezentat de rasa łigaie este important ca berbecii aleşi anterior (nominalizaŃi) să fie cunoscuŃi sub aspectul aptitudinilor de repreoducŃie. De la aceştia să se obŃină material spermatic, care ulterior să fie crioconservat. Evaluarea ejaculatelor crioconservate să se facă prin metode acvate care să dea certitudinea că este păstrată capacitatea fecundantă a spermatozoizilor. Capitolul dinraport “Monitorizarea performanŃelor de reproducŃia a berbecilor nominalizaŃi “ cuprinde mai multe subcapitole care tratează aspecte de interes pentru realizarea obiectivului propus. Astfel, se fac investigaŃii bibliografice abazate pe lucrări de specialitate actuale, privind particularităŃile comportamentului sexual al berbecilor, principalele caracteristici ale spermei de berbec şi influenŃa scăderii temperaturii (refrigerare, congelare) asupra spermatozoizilor. Subcapitolul 4.1.2. prezintă materialul biologic pe care s-a lucrat în cele două unităŃi de cercetare partenere şi care sunt deŃinătoare a efectivelor din rasa łigaie, ecotipurile de colină şi de munte, considerate stoc genetic. Sunt referiri la întreŃinerea, furajarea şi antrenamentul berbecilor pentru recoltare spermei cu ajutorul vaginei artificiale. În subcapitolul 4.1.3. sunt carcaterizaŃi berbecii nominalizaŃi din punct de vedere al aptitudinilor de reproducŃie. Ca şi o componentă a acestei caracterizări se prezintă cercetările referitoare la comportamntul sexula la recoltare a berbecilor care urmează să fie utilizaŃi în continuare. Referitor la cercetările menŃionate precizăm aspectele de interes care pot fi considerate ca şi contribuŃii originale la cunoaşterea particularităŃilor privind comportamentul sexual şi antrenamentul pentru recoltare a berbecilor din rasa łigaie. Acestea se referă la următoarele aspecte: - antrenamentul pentru recoltare utilizând metoda „şcolii berbecilor” dă rezultate foarte bune pentru că rasa se caracterizează prin predominanŃa sistemului nervos echilibrat şi temperament vioi; - miorii au durata antrenamentului mai lungă comparativ berbecilor adulŃi datorită absenŃei experienŃei sexuale anterioare; - berbecii foarte buni pentru recoltarea cu vagina artificială au reflexele sexuale foarte corect şi intens manifestate. Pentru a fi încadraŃi în această categorie nu este absolut necesar ca toate reflexele să fie evaluate cu nota maximă; - notele obŃinute pentru comportament sexual caracteristic berbecilor la recoltarea cu vagina artificială pot oscila între 3-5. FrecvenŃa notelor minime trebuie să fie redusă fiind acceptată doar în cazul a 1-2 reflexe sexuale; - reflexele sexuale a berbecilor şi miorilor care prezintă variabilitatea maximă în cadrul rasei łigaie sunt cele de apropiere, salt şi erecŃie. În general masculii ezitanŃi nu realizează intromisiunea şi depunerea vaginală a spermei.

O a doua componentă a cunoaşterii berbecilor este dată de rezultatele evaluării spermei brute. Recoltarea spermei a fost realizată cu ajutorul vaginei artificiale, iar la evaluare s-a folosit examenul macroscopic şi microscopic. Numărul berbecilor nominalizaŃi aparŃinând ecotipului de colină a fost de 20 capete, iar din ecotipul de munte a făcut parte 16 capete. De la aceştia s-a obŃinut ejaculate de două ori pe săptămână. Comparând mediile caracteristicilor ejaculatelor la cele două ecotipuri ale rasei łigaie remarcăm următoarele aspecte de interes: - valorile medii ale caracteristicilor ejaculatelor obŃinute de la berbecii nominalizaŃi aparŃinând ecotipurilor de colină şi de munte se încadrează între limitele caracteristice rasei łigaie; - berbecii cu volum mic al ejaculatelor au, de regulă şi mobilitatea spermatozoizilor cea mai redusă; - berbecii ecotipului de munte au ejaculate cu volum mai redus comparativ berbecilor din ecotipul de colină, dar concentraŃia în spermatozoizi este mai mare; - procentele reduse de anomalii demonstrează că frecvenŃa recoltărilor este optimă, iar berbecii sunt furajaŃi cu nutreŃuri de calitate şi întreŃinuŃi în condiŃii optime; - majoritatea berbecilor nominalizaŃi pot fi utilizaŃi pentru recoltare în vederea obŃinerii de ejaculate destinate crioconservării. Capitolul intitulat „Realizarea băncii de spermă „ corespunde celei de-a doua componente a obiectivului proiectului de cercetare din 2010. Anterior congelării spermei s-au efectuat cercetări care au avut ca scop alegerea duratei perioadei şi a vitezei optime de scădere a temperaturii ejaculatului diluat de 37oC la 5oC. De asemenea s-a determinat influenŃa gradului diluŃiei asupra păstrării calităŃii spermei în perioada de echilibrare (scădere a temperaturii). În urma cercetărilor a rezultat că în cazul spermei provenite de la cele două ecotipuri reducerea duratei perioadei de echilibrare (creşterea vitezei de scădere a temperaturii) nu influenŃează negativ mobilitate spermatozoizilor. Gradul optim al diluŃiei este de 1:4, iar depăşirea acestuia, chiar dacă se păstrează acelaşi volum şi concentraŃie a spermatozoizilor are efecte negative asupra mobilităŃii.

Un al doilea set de cercetări preliminare crioconservării a avut ca Ńintă determinare influenŃei concentraŃiei de glicerol din diluant asupra mobilităŃii spermatozoizilor conservaŃi la temperatura de refrigerare. Rezultatele ne arată că procentul optim de glicerol din diluant este de 7%. Ca urmare pentru congelare se va utiliza un diluant la care glicerolul este asigurat la această valoare.

MenŃionăm de asemenea că aceste cercetări pot fi considerate ca un „experiment adiŃional” la obiectivul principal al etapei, întrucât conservarea spermei prin refrigerare are un impact major asupra practicii însămânŃărilor artificiale la această specie.

În urma conservării şi evaluării spermei congelate se desprind următoarele aspecte:

- mobilitatea spermatozoizilor post-congelare se reduce drastic, dependent de berbec şi mai puŃin în funcŃie de ecotip;

- aplicarea testului de analiză privind termorezistenŃa spermatozoizilor decongelaŃi oferă posibilitatea aprecierii cu mai mare precizie a calităŃii acestora comparativ determinării mobilităŃii imediat după decongelare;

- valorile HOST pozitive scăzute demonstrează că integritatea funcŃională a membranei spermatozoizilor a avut de suferit în urma procesului de congelare-decongelare;

- anomaliile morfologice sunt reprezentate preponderent de acrozom în diferite stadii de detaşate, ceea ce demonstrează că aprecierea calităŃii spermei numai prin mobilitatea acesteia nu redă cu fidelitate măsura capacităŃii fecundante a spermatozoizilor crioconservaŃi;

- există posibilitate evitării risipei de gene valoroase din banca de spermă prin utilizarea spermatozoizilor cu acrozom detaşat pentru obŃinerea embrionilor prin metoda de fecundaŃie asistată ICSI (intracytoplasmatic sperm injection);

- modelul de evaluare elaborat de colectivul de cercetare a proiectului dă posibilitatea aprecierii cu fidelitate a calităŃii spermei crioconservate fiind totodată economică (materiale consumabile şi echipamente accesibile);

- există o mare variabilitate individuală a berbecilor privind pretabilitatea spermei la congelare;

- între cele două ecotipuri ale rasei łigaie nu există diferenŃe importante privind calitate a spermei crioconservată.

4. Descrierea ştiin Ńific ă şi tehnic ă

Introducere Folosirea reproducătorilor masculi de interes zootehnic la însămânŃări

artificiale este un mijloc important prin care se răspândesc în populaŃie sau se conservă caractere valoroase. Totodată această opŃiune are un mare grad de risc pentru că dacă masculii nu sunt bine cunoscuŃi pot avea gene care codifică însuşiri nedorite ce vor influenŃa negativ nivelul şi calitatea produselor obŃinute.

Pornind de la acest adevăr de incontestat în etapele anterioare ale proiectului s-au derulat activităŃi care vizau realizarea de obiective ce privesc caracterizarea genetică şi din punct de vedere al activităŃii de reproducŃie a efectivelor de rasă Tigaie din cele două ecotipuri existente în Transilvania.

Pentru că realizarea băncii de spermă presupune conservarea prin congelare a materialului spermatic provenit de la berbeci este necesar ca aceştia să fie foarte bine cunoscuŃi nu numai din punct de vedere a caracterelor morfo-productive ci şi în ceea ce priveşte aptitudinile de reproducŃie.

La alegerea berbecilor folosiŃi pentru recoltarea spermei studierea modului de manifestare a reflexelor sexuale este esenŃială pentru a obŃine ejaculate de calitate, cu volum mare care să permită prelucrarea lor în vederea conservării. Aceste cercetări sunt necesare pentru că există o mare variabilitate individuală în privinŃa comportamentului sexual indusă de tipul de sistem nervos şi temperamentul masculilor.

Alături de obŃinerea ejaculatelor de mare importanŃă este pretabilitatea lor la crioconservare. Se cunoaşte că sunt indivizi la care ejaculatele nu pot fi crioconservate deoarece procentul de spermatozoizi care îşi păstrează capacitatea fecundantă după decongelare este prea mic.

Nu numai anumiŃi indivizi ridică probleme de crioconservare a spermei. Specia în ansamblul ei manifestă o serie de probleme care se cer rezolvate pentru a favoriza extinderea însămânŃărilor artificiale la ovine.

După alegerea berbecilor de interes pentru constituirea băncii de spermă realizarea acesteia era dependentă de calitatea lor de reproducători.

În acest scop berbecii nominalizaŃi au fost studiaŃi din punct de vedere al aptitudinilor de reproducŃie. Ejaculatele recoltate s-au caracterizat în vederea prelucrării şi crioconservării.

Considerăm că obstacolele întâmpinate în derularea tuturor acestor activităŃi au fost depăşite de un colectiv de cercetare valoros constituit din cadre didactice, cercetători, doctoranzi, masteranzi şi studenŃi aparŃinând coordonatorului de proiect (USAMV Cluj-Napoca) şi institutelor de cercetare partenere (SCDA Turda, SCDCOC Reghin).

4.1. Monitorizarea performan Ńelor de reproduc Ńie a berbecilor

4.1.1. Considera Ńii bibliografice

ParticularităŃi privind comportamentul sexual al berbecilor

Activitatea sexuală normală a reproducătorilor masculi este condiŃionată de integritatea morfofuncŃională a aparatului genital. Cunoaşterea aspectelor teoretice şi practice asupra biologiei reproducŃiei la berbec are o importanŃă deosebită în organizarea şi desfăşurarea tehnologiei reproducŃiei la această specie şi mai ales pentru practica însămânŃărilor artificiale.

Maturitatea sexuală la berbeci apare, în medie, la vârsta de 8-9 luni. Vârsta pubertăŃii variază în funcŃie de rasă şi condiŃiile de creştere, respectiv furajare. La rasele ameliorate maturitatea sexuală este atinsă la 7,5 luni. Greutatea masculilor ajunşi la pubertate reprezintă 40-60% din masa corporală de adult. Vârsta optimă pentru folosirea la reproducŃie a berbecilor din rasele precoce este de 1-1,5 ani, a celor din rasele tardive fiind de 1,5-2,5 ani. Durata vieŃii sexuale este în medie de până la 4-6 ani.

În alegerea berbecilor pentru reproducŃie, un criteriu esenŃial este comportamentul sexual al acestora. În cadrul comportamentului sexual al berbecului se disting următoarele reflexe sexuale:

- reflexul de apropiere – constă în interesul berbecului pentru oaia în călduri şi în căutarea ei (depistarea oii în călduri);

- reflexul de erecŃie – se realizează prin ştergerea S-ului penian şi mai puŃin pe baza unei erecŃii propriu - zise;

- reflexul de salt – constă în saltul berbecului pe oaia în călduri şi cuprinderea crupei acesteia între membrele anterioare ale berbecului;

- reflexul de intromisiune – constă în căutarea vulvei cu vârful penisului, prin mişcări ale trenului posterior, urmate de introducerea penisului în interiorul vaginului şi efectuarea unor mişcări de pistonare;

- reflexul de ejaculare – este foarte rapid din cauza faptului că excitaŃiile sexuale asupra receptorilor penieni se produc aproape instantaneu cu introducerea penisului în vagin. Ejacularea se observă printr-o zvâcnire o întregului corp al berbecului şi mai ales a trenului posterior.

Manifestarea reflexelor sexuale la berbeci este influenŃată direct de tipul de sistem nervos. La berbeci există 4 tipuri de sistem nervos (PARASCHIVESCU şi FEREDEAN, 1964):

-tipul slab – berbecii se excită greu, durata pregătirii pentru salt fiind lungă; -tipul liniştit – berbecii prezintă reflexe sexuale mai lente, dar manifestate

constant; -tipul nereŃinut – berbecii manifestă reflexe sexuale puternice, chiar

exagerate; -tipul vioi – reflexele sexuale ale berbecilor sunt puternice şi bine

manifestate. Principalele caracteristici ale spermei de berbec

Începerea procesului de spermatogeneză este asociat cu sporirea secreŃiei de testosteron, accelerarea ritmului de creştere a testiculelor şi apariŃia comportamentului sexual specific. Creşterea testiculelor debutează la vârsta de 10-12 săptămâni şi greutatea corporală în jur de 20 kg, când se formează spermatocitele primare şi are loc alungirea tubilor seminiferi. Durata medie a formării spermatozoizilor în testicul este de 49 zile, iar tranzitul epididimal de 12-15 zile. Ciclul epiteliului tubilor seminiferi se extinde pe 10,3 zile. În repaus sexual epididimul este parcurs de spermatozoizi în 20 zile. Creşterea frecvenŃei recoltărilor reduce cu câteva zile tranzitul epididimal al spermatozoizilor. Epididimul conŃine peste 8x1010 spermatozoizi din care 6x1010 sunt stocaŃi în coadă. Astfel berbecii au o rezervă de spermatozoizi pentru 25-30 ejaculări. Această rezervă este împrospătată permanent de o producŃie cifrată la 12-15x106 spermatozoizi pe zi şi gram de Ńesut testicular, respectiv 6-10x109 pe zi şi testicule. Testiculele produc mai mulŃi spermatozoizi decât cei conŃinuŃi de un ejaculat. Această particularitate face posibilă efectuarea mai multor monte sau recoltări în aceaşi zi. Factorul limitant rămâne perioada de timp necesară maturării. Durata păstrării capacităŃii fecundante a spermatozoizilor în epididim este de 45-60 zile.

Formarea şi calitatea spermei la berbeci este influenŃată de zestrea ereditară, sezon, condiŃii de întreŃinere, alimentaŃie şi regimul de folosire la reproducŃie. Factorul ereditar acŃionează preponderent prin mecanisme neuroendocrine implicate în dezvoltarea şi reglarea funcŃionării aparatului genital mascul. Sezonul de reproducŃie este determinat de nivelul şi dinamica luminii, respectiv a temperaturii. Cu toate că spermatogeneza nu este stopată complet în timpul anului, ejaculatele de cea mai bună calitate se obŃin toamna, când durata zilei lumină se micşorează treptat. Fotoperioada scurtă este asociată cu

sporirea proporŃiei spermatozoizilor vii, a celor mobili şi reducerea frecvenŃei anomaliilor acrozomale. Temperatura testiculară este de 32°C. Cre şterea temperaturii influenŃează în primul rând epiteliul tubilor seminiferi. Învelirea testiculelor în lână face ca termoreglarea la acest nivel să se realizeze dificil în perioadele cu temperaturi ambientale ridicate.

AlimentaŃia este cel mai important factor care influenŃează formarea spermatozoizilor şi secreŃia glandelor anexe ale aparatului genital mascul. SubnutriŃia pe perioade mari de timp dereglează secreŃia de hormoni sexuali care diminuează instinctul genezic şi produc degenerescenŃa epiteliului germinativ. Hrănirea necorespunzătoare pe perioade mai mici se reflectă negativ în valoarea biologică a spermei prin reducerea conŃinutului în hialuronidază care este cauza diminuării capacităŃii fecundante a spermatozoizilor.

Din punct de vedere al aspectului citomorfologic, există mai multe caracteristici ale producŃiei spermatice la berbec. Astfel lungimea totală a spermatozoidului de berbec este de 70-80 microni, lungimea capului acestuia fiind de aproximativ 8,2 µ, iar lăŃimea capului de 4,2 microni (OBREGON-BUSTOS şi FLECHON, 1975). Piesa intermediară are lungimea de 14µ si grosimea de 0,8µ. Partea principală a cozii are o lungime de 40-50 microni si o grosime de 0,5µ. Formele patologice de spermatozoizi ce pot exista în sperma normală de berbec nu trebuie să depăşească 20% (LUNCA şi col., 1960; PARASCHIVESCU, 1969 ).

Volumul spermei este în medie de 1,5 ml, cu variaŃii de 0,7-3 ml, dar au existat cazuri în care berbecii au avut un ejaculat de 5 ml sau chiar 6 ml. Sperma are o culoare albă-lăptoasă, cu aspect cremos. ConcentraŃia este în medie de 1-3x109 spermatozoizi/ml. Limitele de variaŃie ale concentraŃiei sunt cuprinse între 0,5-6x109 spermatozoizi/ml. În cazul în care concentraŃia se exprimă în spermatozoizi/mm³, aceasta este în medie de 1-3x106 spermatozoizi/mm³. Cantitatea totală a spermatozoizilor dintr-un ejaculat este în medie de 1,5-4x109 spermatozoizi. ReacŃia spermei este uşor sub valoare neutră, având pH-ul de 6,8 cu variaŃii între 5,9-7,3 (WHITE, 1958). Presiunea osmotică, exprimată prin punctul crioscopic, este în medie de 0,63, cu variaŃii între 0,55 şi 0,70.

Din punct de vedere a compoziŃiei biochimice, sperma de berbec are în general componente anorganice reduse comparativ cu sperma celorlalŃi reproducători. Astfel, după WHITE (1958), ionograma la berbec prezintă următoarele valori medii: Na 110 mg%, Cl 86 mg%, K 74 mg%, Ca 10 mg%, Mg 2mg%, Pa 12 mg%. Spermatozoizii de berbec conŃin de 33 ori mai mult sulf decât cei de armăsar şi de 20 ori mai mult decât cei de taur, existând astfel o legătură între cantitatea de sulf din spermatozoizi şi producŃia de lână. Componentele organice din sperma de berbec sunt reprezentate de proteine, lipide, glucide şi enzime. Proteinele se află în cantităŃi destul de ridicate. Astfel, după WHITE (1958), cantitatea de N total de natură proteică este în medie de 875 mg%. Una din principalele componente ale spermei de berbec este reprezentată de lipide. Glicerilfosforilcolina se află în cantitate medie de 1650 mg%, cu variaŃii între 1100-2100 mg%. Glucidele se află şi ele în cantitate mare în sperma de berbec. Astfel cantitatea medie de fructoză este de 500 mg%.

Acidul citric se află în cantitate de 140 mg%, iar inozitolul se află în cantitate de 40 mg% WHITE (1958).

Metabolismul spermei de berbec este atât de tip glicolitic, cât şi oxidativ (BOGDAN, 1976). Valoarea coeficientului respirator CO2 este la berbec de 22 mm³. Un rol important în furnizarea energiei necesare mişcării spermatozoizilor îl are acidul adenozin trifosforic (ATP) . După MANN (1961), cantitatea de ATP variază între 3 si 9 mg%. în sperma de berbec conservată la 0°C, cantitatea de ATP scăzând în funcŃie de durata de conservare. Viteza medie de înaintare a spermatozoizilor este de 3 mm/min. InfluenŃa scăderii temperaturii asupra spermei de berbec

Problema conservării “in vitro” la temperaturi scăzute a spermatozoizilor de berbec este încă nerezolvată pe deplin.

Atunci când sperma de berbec este stocată la temperaturi scăzute mai mult de 24 h, apare reducerea treptată a mobilităŃii, integrităŃii funcŃionale a membranei spermatozoizilor şi a fertilităŃii acestora (MAXWELL şi SALAMON, 1993; MAXWELL şi WATSON, 1996; DE LAMIRANDE şi col., 1997; SALAMON şi MAXWELL, 2000; MEDEIROS şi col., 2002). Capacitatea de fertilizare a spermatozoizilor este influenŃată de o mulŃime de factori cum ar fi mobilitatea, viabilitatea, disponibilitatea de a realiza capacitarea şi reacŃia acrozomală în tractul genital femel (MARTÍ şi col., 2003).

RelaŃia dintre mobilitatea spermatozoizilor şi fertilitate rămâne controversată (AMANN şi PICKETT, 1987; HARRISON şi col., 1982; KJAESTAD şi col., 1993; WIERZBOWSKI şi KARETA; 1993).

Capacitatea spermatozoizilor de a rezista şocului termic este importantă în menŃinerea membranelor plasmatice şi a celor acrozomale externe intacte şi nedeteriorate în timpul proceselor de refrigerare şi congelare. În plus, anumite proteine din plasma seminală protejează membrana spermatozoizilor împotriva şocului termic şi această protecŃie poate fi asociată cu activitatea de decapacitare (BARRIOS şi col. 2005).

O condiŃie esenŃială pentru menŃinerea potenŃialului de membrană, a micromediului ionic şi a pH-ului este ca plasmalema să fie intactă şi funcŃională (JANUSKAUSKAS şi RODRIGUEZ-MARTINEZ, 1995; RODRIGUEZ-MARTINEZ şi col., 1997). De fapt, spermatozoizii nu pot supravieŃui în tractul genital femel şi nu se pot ataşa la zona pellucida şi membrana vitelină fără a avea plasmalema intactă. Procesele de capacitare, reacŃie acrozomală şi de ataşare a spermatozoizilor la suprafaŃa ovocitei necesită existenŃa unei membrane active adică integră funcŃional (TOPFER-PETERSEN şi col., 1990). AnumiŃi parametri, printre care şi mobilitatea spermatozoizilor, sunt în mod curent folosiŃi pentru evaluarea stării morfologice şi fiziologice a spermatozoizilor de berbec, aceştia fiind diferiŃi prin specificitatea lor şi prin corelaŃia cu fertilitatea (EVANS şi MAXWELL, 1990; GARDE LÓPEZ-BREA, 1993; SAACKE, 1982). În plus, alături de mobilitate, şi menŃinerea integrităŃii funcŃionale a membranei spermatozoidului este importantă pentru păstrarea capacităŃii de fertilizare a spermatozoizilor de berbec (VAZQUEZ şi colab., 1988; VALCÁRCEL şi colab., 1994).

O cauza importantă a descreşterii fertilităŃii spermatozoizilor în timpul conservării spermei de berbec la temperaturi scăzute este formarea peroxizilor lipidici a radicalilor liberi ai oxigenului cum ar fi radicalul superoxid anion, radicalul hidroxil, şi peroxidul de hidrogen (DEL-MAESTRO, 1980; AURICH şi col., 1997). Radicalii liberi ai oxigenului sunt produşi de spermatozoizii de berbec morŃi (UPRETI şi col., 1994) şi joacă un rol important în capacitatea de supravieŃuire a spermatozoizilor diluaŃi (SHANNON şi CURSON, 1982).

Temperaturile scăzute pot determina alterarea permeabilităŃii membranei plasmatice, cauzate de expunerea şi reorganizarea legăturilor de actină (HOLT şi NORTH, 1991), precum şi detaşarea capului şi a cozii spermatozoizilor (AISEN şi col. 2005). În plus, scăderea temperaturii provoacă creşterea sensibilităŃii la peroxidarea lipidică, sperma refrigerată şi cea congelată fiind mai susceptibile la peroxidare faŃă de sperma proaspătă (BECONI şi col., 1993; BELL şi col. 1993).

Peroxidarea lipidică joacă un rol impotant în activarea prematură a spermatozoizilor, scurtând viabilitatea acestora atât în timpul conservării “in vivo”, cât şi în cazul celei “in vitro”. Aceasta induce alterarea structurală a membranelor, în special în regiunea acrozomală, cauzând o pierdere a componentelor intracelulare (JONES şi MANN, 1977; JONES şi col. 1979; BECONI şi col., 1991;1993; SHARMA şi AGARWAL, 1996; LEWIS şi col., 1997).

Procentul de acizi graşi nesaturaŃi din membranele spermatozoizilor de berbec este mai ridicat decât la alte specii, făcându-i mai susceptibili la procesele de oxidare (WHITE, 1993; ALVAREZ şi STOREY, 1989; ALVAREZ şi col., 1987; GRIVEAU şi col., 1995).

Radicalii liberi ai oxigenului sunt din punct de vedere fiziologic implicaŃi şi în hiperactivarea spermatozoizilor iar producerea continuă a acestora reprezintă o condiŃie esenŃială pentru capacitarea spermatozoizilor. Sinteza în exces a radicalilor liberi ai oxigenului sau o descreştere a nivelului enzimelor antioxidante afectează mobilitatea şi viabilitatea spermatozoizilor şi cauzează defecte ale spermatozoizilor prin iniŃierea unei reacŃii de oxidare în lanŃ, denaturând lipidele, proteinele şi ADN-ul (DE LAMIRANDE şi GAGNON, 1992; MAXWELL şi WATSON, 1996; AITKEN, 1995; AITKEN şi BAKER 2004; SIKKA, 2004).

Deci, la berbec, efectele adverse ale radicalilor liberi ai oxigenului se pare că sunt cauzate şi de oxidarea directă a proteinelor, de permeabilitatea membranară, alături de dereglarea la nivel lipidic (CHRISTOVA şi col., 2004).

PosibilităŃi de reducere a efectelor temperaturii scăzute asupra spermei de berbec

Enzimele oxidative ale spermatozoizilor, ce ajută la contracararea efectelor radicalilor liberi ai oxigenului sunt reprezentate de superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza şi glutation reductaza (SLAWETA şi col., 1998; GADEA şi col., 2004; BILODEAU şi col., 2001; AITKEN şi BAKER, 2004; KANTOLA şi col., 1988; JEULIN şi col., 1989; GRIVEAU şi col., 1995; SIKKA, 2004).

CantităŃi apreciabile de superoxid dismutază şi concentraŃii scăzute de glutation peroxidază şi de catalază au fost găsite în ejaculatele de berbec (ABU-

ERREIS şi col., 1978; MANN şi LUTWAK-MANN, 1981). Prin adăugarea anumitor antioxidanŃi ca glutation reductaza şi acidul ascorbic la spermatozoizii de cabaline (AURICH şi col., 1997; BAUMBER şi col., 2000; BECONI şi col., 1993), taurina la spermatozoizii de iepure (ALVAREZ şi STOREY, 1983) sau superoxid dismutaza şi catalaza la spermatozoizii de berbec (MAXWELL şi STOJANOV, 1996; LINDEMANN şi col., 1988) s-a demonstrat ca are loc o protecŃie a spermatozoizilor împotriva efectelor dăunătoare ale radicalilor liberi ai oxigenului şi se îmbunătăŃeste mobilitatea acestora şi integritatea membranară în timpul stocării lor în stare lichidă sau decongelată.

De asemenea, suplimentarea diluanŃilor materialului seminal cu diferiŃi agenŃi antioxidanŃi ca tocoferolul (BECONI şi col., 1993), glutationul (LINDEMANN şi col., 1988) sau β carotenul poate fi benefică pentru viabilitatea spermatozoizilor crioconservaŃi (BECONI şi col., 1993; SINHA şi col., 1996; AURICH şi col., 1997; MOLINIA şi col., 1994; SANCHEZ-PARTIDA şi col., 1997) şi protejează membrana acestora împotriva denaturării oxidative prin prevenirea formării peroxizilor.

KASIMANICKAM şi col. (2006) au obŃinut, în cazul spermatozoizilor de berbec, o corelaŃie negativă între parametrii spermei, peroxidarea lipidică şi activitatea glutation peroxidazei. Există anumiŃi indicatori care ne arată că atât superoxid dismutaza, cât şi glutation peroxidaza au un rol protector crucial împotriva efectului toxic al radicalilor liberi ai oxigenului în cadrul spermei de berbec.

Prin adăugarea superoxid dismutazei, a catalazei, a glutationului sau a citocromului la diluanŃi, se îmbunătăŃeşte procentul spermatozoizilor mobili şi a celor integri din punct de vedere acrozomal (FOOTE şi col., 2002), creşterea cantităŃii de antioxidanŃi adăugaŃi la diluanti îmbunătăŃind rata viabilităŃii spermatozoizilor (MAXWELL şi STOJANOV, 1996). CombinaŃia dintre superoxid dismutază şi catalază, într-un diluant pe bază de Tris-glucoză-gălbenuş de ou a avut un efect suplimentar de îmbunătăŃire a ratei de supravieŃuire a spermatozoizilor conservaŃi la temperatura de 5°C (ANEL şi col., 2006).

FOOTE şi col. (2002) au descoperit efectul benefic al catalazei, în sensul creşterii viabilităŃii spermatozoizilor, asupra spermei refrigerate folosind un diluant pe baza de gălbenuş de ou, faŃă de rezultatele inferioare obŃinute în cazul folosirii unui diluant pe bază de lapte.

Pentru a supravieŃui suficient timp în vederea realizării ferilizării, spermatozoizii trebuie să utilizeze sistemul enzimatic glutation peroxidaza-glutation reductaza care se pare că este destul de constant, în comparaŃie cu superoxid dismutaza, care este variabilă (ALVAREZ şi col., 1987).

Nivelul de glutation, procentul de glutation oxidat şi nivelul de peroxidare lipidică sunt buni indicatori ai stresului oxidativ.

Stresul oxidativ provoacă o schimbare substanŃială a metabolismului spermatozoizilor şi o ireversibilă pierdere a mobilităŃii acestora. De obicei, în timpul stresului oxidativ, glutationul este oxidat cu ajutorul glutation peroxidazelor, dând naştere la glutationul oxidat, nivelul total de glutation rămânând neschimbat (MICHIELS şi col., 1994).

Împiedicarea propagării radicalilor liberi prin intermediul glutation peroxidazelor pare a fi principala protecŃie împotriva peroxidării şi morŃii spermatozoizilor (HAMMERSTEDT, 1993).

Cisteamina stimulează sinteza de glutation reductază în timpul maturării “in vitro” a ovocitelor (DE MATOS şi col., 2002).

Hialuronanul, un component esenŃial al matricei extracelulare este implicat în funcŃii fiziologice importante ca mobilitatea şi capacitarea spermatozoizilor (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2003; GHOSH şi DATTA, 2003; BUCAK şi col., 2007) precum şi viabilitatea şi stabilitatea membranară a spermatozoizilor în timpul crioconservării acestora (PENA şi col., 2004).

BUCAK şi col. (2007) au ajuns la concluzia că prin adăugarea la sperma de berbec a unui diluant conŃinând trehaloză, taurină, cisteamină şi hialuronan, creşte nivelul de vitamina E din sperma decongelată.

Deci, adăugarea exogenă a enzimelor antioxidante este capabilă să îmbunătăŃească procentele de fertilitate, crescând şi viabilitatea spermatozoizilor.

De fapt, adăugarea antioxidanŃilor la mediul de cultură în timpul conservării materialului seminal de berbec întârzie procesul de destabilizare a membranei spermatozoizilor (STEFANOV şi col., 2004; UPRETI şi col., 1995; KELSO şi col., 1997; BECONI şi col., 1993).

Vitamina C poate juca un rol important în protejarea spermatozoizilor de diferite tipuri de reacŃii de oxidare (BUETTER, 1992) şi în menŃinerea integrităŃii genetice a spermatozoizilor prin prevenirea degradării oxidative a ADN-ului acestora (FRAGA şi col.,1991).

Obiectivul unui studiu publicat de către SONMEZ şi DEMIRCI în anul 2004 a fost investigarea efectelor vitaminei C asupra capacităŃii de congelare şi asupra altor caracteristici ale spermei de berbec, diluată cu Tris, conŃinand diferite proporŃii de acid ascorbic si glicerol. În acest studiu, prin adăugarea unei cantităŃi mai mari de 2mg/ml de vitamina C în probele cu sperma diluată s-a redus mobilitatea spermatozoizilor în timpul stocării spermei diluate la +4ºC. Aceasta ar putea fi asociată cu descreşterea pH-ului, cauzată de acidul ascorbic, acesta fiind puternic acid (10% soluŃie; pH=2), un pH scăzut putând induce reduceri reversibile sau ireversibile ale mobilităŃii (ACOTT şi CARR, 1984). De asemenea, s-a observat că vitamina C nu are efect crioprotector, iar prin adăugarea ei la sperma diluata, nu s-a îmbunătăŃit nici una din caracteristicile spermatologice, în urma decongelării. Reducerea mobilităŃii din timpul crioconservării spermatozoizilor a fost atribuită toxicităŃii agenŃilor crioprotectori adăugaŃi la diluanŃi în cazul congelării (FISER şi col.,1981), denaturării membranelor din timpul procesului de congelare-decongelare (FISER şi col., 1989) şi prezenŃei radicalilor liberi, care ar putea induce peroxidarea lipidică (JONES şi MANN, 1977; AITKEN şi col., 1989).

SANCHEZ-PARTIDA şi col. (1997) au relatat că includerea vitaminei C în concentraŃie de 50mM sau 100mM în sperma diluată de berbec, reduce procentul de spermatozoizi mobili. În mod similar, AURICH şi col. (1997) au relatat faptul că vitamina C, în concentraŃie de 0,9g/l în sperma diluată de armăsar, scade procentul de spermatozoizi mobili.

4.1.2. Pregătirea şi antrenamentul berbecilor pentru recoltare Berbecii nominalizaŃi pentru recoltarea materialului spermatic în vederea crioconservării au fost anterior analizaŃi prin determinarea amprentei genetice. Pe baza acesteia s-a stabilit apartenenŃa şi gradul de consangvinizare existent în cadrul efectivelor analizate. La berbecii adulŃi nominalizaŃi se adaugă descendenŃii lor fătaŃi în primăvara anului 2009. Miorii respectivi au originea cunoscută pentru că determinări ale amprentei genetice s-au realizat şi la oile mame. Berbecii nominalizaŃi aparŃin atât ecotipului de colină cât şi ecotipului de munte. Pregătirea berbecilor pentru sezonul de montă din toamna anului 2010 a debutat la mijlocul lunii august. Aceştia sunt întreŃinuŃi la păşune separat de oile mame. Seara, berbecii au fost aduşi în adăpost fiindu-le administrat suplimentar concentrate, formate din uruială de orz, în cantitate de 300g/cap/zi. Alături de concentrate, în raŃie a fost introdus şi un premix mineralo-vitaminic specific. În perioada de recoltare a materialului spermatic (lunile septembrie, octombrie) masculii s-au scos în continuare la păşune separat de oile mame. NutreŃul concentrat din raŃie a ajuns la cantitatea de 424,2 g/cap/zi fiind format din uruială de orz (250 g) şrot de floarea soarelui (150 g), sare (20g) şi premix mineralo-vitaminic (4,2g). La întocmirea raŃiei furajere s-a avut în vedere ca acesta să conŃină toate substanŃele nutritive necesare susŃinerii spermatogenezei. Se cunoaşte că nutreŃurile echilibrate în proteine, vitamine, săruri minerale şi asigurate la nivelul cerinŃelor, determină obŃinerea unor ejaculate de calitate care pot fi folosite în continuare pentru prelucrare în vederea crioconservării. De asemenea libidoul masculilor se menŃine pe întreaga durată a sezonului de reproducŃie facilitând astfel antrenamentul pentru recoltare şi obŃinerea întregii cantităŃi de spermă necesară constituirii băncii de spermă. Se cuvine să menŃionăm că păşunea a fost bogată pentru că lucrările de întreŃinere s-au efectuat la timp, iar condiŃiile climatice caracteristice anului 2010 au favorizat producŃia de masă verde chiar şi în luna august când, de regulă, covorul vegetal are de suferit din cauza secetei. CompoziŃia floristică a păşunii a cuprins următoarele specii de plante: Dactilis glomerata, Poa pratense, Phleum pratense, Trifolium multiflorum, Festuca rubra, Lotus corniculatus, Trifolium hibridum. Ponderea acestor specii furajere a fost caracteristică păşunilor din zona Turda şi a celor din jurul oraşului Reghin. Antrenamentul berbecilor pentru recoltare reprezintă o etapă importantă în cercetare chiar dacă pare o activitate de rutină. Ea durează 2-4 săptămâni (în funcŃie de individ) şi presupune respectarea cu stricteŃe a unei anumite conduite pe întreaga perioadă. Reuşita antrenamentului se concretizează prin obŃinerea de ejaculate superioare din punct de vedere a parametrilor cantitativi şi calitativi. În condiŃiile experienŃelor efectuate de noi, au existat constrângeri suplimentare datorate unei alegeri prealabile a berbecilor după criteriile genetice menŃionate în prima etapă a proiectului. Ca urmare numărul berbecilor supuşi

antrenamentului a fost mai redus, posibilităŃile de selecŃie după caracteristicile de reproducŃie diminuându-se.

La antrenarea berbecilor pentru recoltare s-a practicat aşa numita „şcoală a berbecilor” ce a constat în alegerea a câte unui berbec şi separarea acestuia de restul efectivului de masculi, alături de o oaie (preferabil în estru) într-o boxă simplă de recoltare, amplasată în imediata vecinătate a locului de cazare al tuturor berbecilor, astfel încât restul acestora să sesizeze toate manifestările berbecului şi ale oii din boxa respectivă. În primul rând, s-a realizat obişnuirea berbecului cu locul recoltării şi cu recoltatorul datorită faptului că este absolut necesară stabilirea unei relaŃii de încredere între om şi animal. În acest sens, a existat o comunicare permanentă cu fiecare berbec în parte, atât verbal cât şi prin atigeri pentru efectuarea de observaŃii legate de particularităŃile comportamentale individuale, tipul de sistem nervos, temperament, receptivitate, adaptabilitate. De asemenea, persoana care a efectuat recoltarea a fost aceeaşi cu cea care a administrat zilnic furaje berbecilor. S-a lucrat cu răbdare şi blândeŃe faŃă de berbeci, alocându-se timp suficient fiecărei etape de învăŃare , fiecare operaŃiune repetându-se cu regularitate pe întreaga perioadă de desfăşurare a antrenamentului.

În spaŃiul de recoltare s-a acordat timp suficient masculului să se obişnuiască cu noile condiŃii, a fost încurajat pentru a stabili contacte şi a efectua saltul pe oaia în călduri. S-a evitat prezenŃa altei persoane sau schimbarea condiŃiilor din sala de recoltare. Antrenamentul pentru salt s-a reluat zilnic în reprize de cca. 15-30 minute, până când acesta s-a efectuat constant şi corect.

4.1.3.Caracterizarea berbecilor nominaliza Ńi din punct de vedere reproductiv

4.1.3.1.Comportamentul sexual la recoltare Berbecii nominalizaŃi s-au diferenŃiat în privinŃa manifestării comportamentului sexual specific, dependent de vârstă. Berbecii maturi au răspuns mai bine antrenamentului pentru recoltare, iar intensitatea de manifestare a reflexelor sexuale (apropiere, salt, erecŃie, intromisiune şi ejaculare) a fost mai ridicată comparativ berbecilor miori. În general berbecii maturi nominalizaŃi au manifestat reflexele sexuale puternic s-au chiar exagerat făcând parte, în majoritatea cazurilor din categoria celor cu temperament vioi sau nereŃinut. Miorii, datorită lipsei de experienŃă în efectuarea montei, se manifestă ezitant fiind mult mai dificil antrenamentul lor pentru recoltare, iar rezultatul incert. MenŃionăm că la această categorie de vârstă au fost eliminaŃi unii indivizi care nu au răspuns antrenamentului. Am avut posibilitatea de a alege pentru că numărul berbecilor masculi descendenŃi ai berbecilor caracterizaŃi genotipic reŃinuŃi a fost ridicat .

Fig.1. Berbeci din rasa łigaie

Redăm în continuare rezultatul aprecierii comportamentului sexual al berbecilor grupaŃi pe categorii de calitate.

Berbeci foarte buni pentru recoltarea cu vagina art ificial ă Tabel 1

Nota Manifestarea reflexului de apropiere 5 Berbecul manifestă interes faŃă de oaia în călduri încă înainte de

contactul vizual al acestora 4 Manifestarea interesului berbecului faŃă de oaia în călduri apare odată cu

introducerea oii în standul de recoltare Manifestarea reflexului de salt

5 Saltul este energic, fiind executat corect 4 Saltul este violent, necontrolat, berbecul alunecând de pe oaie în

momentul efectuării acestuia Manifestarea reflexului de erec Ńie

5 Reflexul de erecŃie se manifestă încă din momentul vizualizării oii 4 ErecŃia este bine exteriorizată în apropierea oii în călduri 3 ErecŃia este bine exteriorizată în urma efectuării saltului în gol

Manifestarea reflexului de intromisiune şi ejaculare 5 Berbecul caută energic vulva sau vagina artificială, executând

intromisiunea în mod corect, ejacularea fiind rapidă manifestându-se printr-o zvâcnire evidentă

4 Berbecul caută energic vulva sau vagina artificială, executând intromisiunea în mod corect, ejacularea fiind întârziată.

Berbeci buni pentru recoltarea cu vagina artificia lă

Tabel 2 Nota Manifestarea reflexului de apropiere

4 Manifestarea interesului berbecului faŃă de oaia în călduri apare odată cu introducerea oii în standul de recoltare

Manifestarea reflexului de salt 4 Saltul este violent, necontrolat, berbecul alunecând de pe oaie în

momentul efectuării acestuia 3 Berbecul execută saltul doar după o cunoaştere prealabilă a oii în călduri

Manifestarea reflexului de erec Ńie 4 ErecŃia este bine exteriorizată în apropierea oii în călduri 3 ErecŃia este bine exteriorizată în urma efectuării saltului în gol

Manifestarea reflexului de intromisiune şi ejaculare 4 Berbecul caută energic vulva sau vagina artificială, executând

intromisiunea în mod corect, ejacularea fiind întârziată. 3 Berbecul caută insistent vulva sau vagina artificială, ejaculare precipitată

*Este importantă aplicarea corectă a tehnicii de recoltare sau să se Ńină seama de preferinŃele şi particularităŃile berbecului.

Repartizarea berbecilor în func Ńie de comportamentul sexual Tabel 3

Specificare Foarte buni pentru recoltarea cu vagina

artificial ă (cap.)

Buni pentru recoltarea cu vagina artificial ă

(cap.) Berbeci 22 6

Miori - 8

La finele observaŃiilor privind antrenamentul şi comportamentul sexual al berbecilor din rasa Tigaie precizăm următoarele aspecte: - antrenamentul pentru recoltare utilizând metoda „şcolii berbecilor” dă rezultate foarte bune pentru că rasa se caracterizează prin predominanŃa sistemului nervos echilibrat şi temperament vioi, - miorii au durata antrenamentului mai lungă comparativ berbecilor adulŃi datorită absenŃei experienŃei sexuale anterioare, - berbecii foarte buni pentru recoltarea cu vagina artificială au reflexele sexuale foarte corect şi intens manifestate. Pentru a fi încadraŃi în această categorie nu este absolut necesar ca toate reflexele să fie evaluate cu nota maximă, - notele obŃinute pentru comportament sexual caracteristic berbecilor la recoltarea cu vagina artificială pot oscila între 3-5. FrecvenŃa notelor minime trebuie să fie redusă fiind acceptată doar în cazul a 1-2 reflexe sexuale, - reflexele sexuale a berbecilor şi miorilor care prezintă variabilitatea maximă în cadrul rasei łigaie sunt cele de apropiere, salt şi erecŃie. În general masculii ezitanŃi nu realizează intromisiunea şi depunerea vaginală a spermei.

4.1.3.2. Recoltarea şi evaluarea spermei brute

Recoltarea spermei brute. Materiale utilizate. Recoltarea materialului seminal s-a realizat cu ajutorul

a două tipuri de vagine artificiale, ambele fiind compuse din: tub vaginal, cu o lungime de 20 cm şi un diametru de 4,5 cm, cămaşă vaginală, cu o lungime de 38 cm şi o lăŃime de 6 cm, pahar colector asemănător unei eprubete gradate sau sub forma unei pâlnii, cu partea mai îngustă gradată, inele fixatoare şi robinet. Alături de forma paharului colector, vaginele se diferenŃiază şi prin faptul că primul tip prezintă în plus o cămasă externă ce face legătura între tubul vaginal şi paharul colector.

Fig.2.Vagină artificială pentru berbeci – model I

Fig.3. Vagină artificială pentru berbeci – model II

Tehnica recoltării presupune pregătirea vaginei artificiale, urmată de recoltarea propriu-zisă.

Pregătirea vaginei artificiale a constat în spălarea, igienizarea şi uscarea părŃilor componente şi apoi asamblarea acestora pentru a crea condiŃiile de

temperatură, presiune şi lubrefiere existente în vagina naturală. Temperatura de 37-38°C s-a ob Ńinut prin introducerea apei calde în spaŃiul dintre peretele tubului vaginal şi cămaşa vaginală. În momentul pregătirii vaginului artificial, apa caldă a avut aprox. 45-50°C, deoarece în momentul recolt ării propriu-zise s-a pierdut o parte din căldură. Presiunea a fost obŃinută artificial prin introducerea aerului între tubul vaginal şi cămaşa vaginală, prin robinetul lateral. În momentul realizării intromisiunii, pereŃii cămăşii vaginale ce sunt compresaŃi de apa caldă şi aer, exercită o presiune asemănătoare cu cea exercitată de vaginul natural al oii asupra terminaŃiilor nervoase de pe mucoasa penisului în erecŃie. Lubrefierea necesară desfăşurării mişcărilor caracteristice actului copulator , care în mod natural se realizează prin secreŃiile vaginale ale oii în călduri, s-a obŃinut artificial prin lubrefierea cămăşii vaginale cu gel pentru ecograf. După ce vagina artificială a fost complet pregătită pentru recoltare, s-a utilizat imediat sau a fost depozitată în termostat, la temperatura de 45°C. Înaintea fiec ărei utilizări la recoltare, a avut loc controlul temperaturii din interiorul vaginei cu ajutorul unui termometru electronic, plasat între faldurile interioare ale cămăşii vaginale.

Recoltarea propriu-zisă s-a efectuat pe oaie în călduri sau pe oaie în anestru, şi chiar prin metoda berbec pe berbec . Recoltarea materialului seminal s-a realizat prin înclinarea vaginei artificiale, astfel încât să se asigure un unghi de 45° între vagina artificial ă şi abdomenul berbecului. Întotdeauna, poziŃionarea persoanei care a realizat recoltarea a fost pe partea dreaptă a berbecului. Pentru a stimula reflexul de ejaculare, fiecare berbec a efectuat înaintea recoltării unul-două salturi în gol. În timpul saltului, penisul aflat în erecŃie a fost dirijat spre vagina artificială Ńinută înclinat, astfel încât intromisiunea să se realizeze uşor. În urma fiecărei ejaculări, vagina artificială a fost orientată vertical în vederea scurgerii materialului seminal în interiorul paharului colector. După fiecare recoltare, vagina artificială a fost spălată, igienizată şi uscată pentru a putea fi refolosită. Evaluarea spermei brute

Analizele macroscopice referitoare la aspectul şi volumul spermei au fost urmate de cele microscopice, cu privire la mobilitatea, concentraŃia şi anomaliile spermatozoizilor. Volumul şi aspectul ejaculatelor au fost determinate imediat după recoltare, în paharul colector. Mobilitatea spermatozoizilor s-a determinat prelevând din paharul colector o picătură de spermă care a fost analizată la microscop (20x) între lamă şi lamelă, pe o placă de încălzire montată pe platina microscopului. În vederea determinării concentraŃiei spermatozoizilor s-au efectuat diluŃii de 1:1000. Din sperma astfel diluată s-a prelevat o picătură care s-a analizat la microscop între camera de numărat şi lamelă. Pentru fiecare determinare au fost număraŃi spermatozoizii de pe 5 pătrate mari. Pentru determinarea procentului de anomalii de la nivelul capului, piesei intermediare şi ale cozii s-au efectuat frotiuri prin tehnica coloraŃiei intravitale. Astfel, pe o lamă bine degresată şi încălzită s-a pus o picătură de soluŃie de colorare Eozină-Nigrozină în apropierea căreia s-a pus o picătură de spermă. Picăturile au fost apoi amestecate cu ajutorul colŃului unei alte lame şi s-a tras frotiul. După uscarea frotiurilor, s-a trecut la analiza anomaliilor la microscop (40x).

Fig.4. Recoltarea materialului seminal

Datele referitoare la parametrii cantitativi şi calitativi ai spermei s-au

prelucrat statistic prin metoda analizei varianŃei fiind în final organizate tabelar. Rezultate privind calitatea spermei brute destinate crioconservării Recoltarea şi evaluarea spermei brute s-a realizat diferenŃiat în funcŃie de

ecotipul rasei łigaie căreia îi aparŃineau berbecii. Numărul berbecilor nominalizaŃi din ecotipul de colină a fost de 20 capete,

iar pentru ecotipul de munte s-au utilizat la recoltare 16 capete. FrecvenŃa recoltărilor a fost de două ori pe săptămână, obŃinându-se de la fiecare berbec câte două ejaculate succesive în ziua de recoltare. Astfel s-a putut realiza cantitatea de spermă necesară prelucrării în vederea congelării.

Independent de ecotip numărul zilelor de recoltare pe individ a oscilat între 6-10 rezultând un număr dublu de ejaculate.

Datele obŃinute în urma evaluării volumului, concentraŃiei, mobilităŃii şi analizelor morfologice ale spermatozoizilor din fiecare ejaculat s-au organizat ca medii individuale pe berbec. Acestea, într-o etapă ulterioară, au fost prelucrate statistic şi prezentate tabelar.

În tabelul numărul 4 sunt redate mediile şi indicii de dispersie ale caracteristicilor spermei brute obŃinută de la berbecii ecotipului de colină.

Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei brute ob Ńinut ă de la berbecii ecotipului de colin ă

Tabel 4 Berbecii łigaie

Parametrii statistici

Caracteristicile ejaculatului

Unitate de

măsură

N

_ _ X±sX

s

s2

V%

Vmin

Vmax

Volum ml 20 0,98±0,03 0,176 0,031 18,01 0,7 1,3 Mobilitate

note

zecimale 20 0,90±0,01 0,075 0,005 8,38 0,8 1,0

ConcentraŃie 109sz/ml. 20 1,47±0,10 0,482 0,232 32,81 0,687 2,313 Nr.sz./ejac. 109sz./ejac. 20 1,38±0,08 0,361 0,130 25,97 0,769 2,035

TOTAL % 20 13,65±0,50 2,277 5,186 16,68 8 17 Cap % 20 5,20±0,33 1,507 2,273 28,99 3 8 P.int. % 20 4,35±0,36 1,631 2,660 37,49 2 7

Anomalii

Coadă % 20 4,10±0,31 1,410 1,989 34,40 2 8

Urmărind datele tabelare constatăm că valorile caracteristicilor

ejaculatelor se încadrează în limitele specifice rasei łigaie. Media volumului ejaculatelor este de aproape un ml (0,98 ± 0,03) cu limite individuale de variaŃie de până la dublu (minim 0,7 ml şi maxim 1,3 ml).

Mobilitatea spermatozoizilor este foarte ridicată, respectiv 0,90 ± 0,01, iar limitele de variaŃie reduse. Nota minimă pentru mobilitate de 0,8 permite utilizarea chiar şi a ejaculatelor calitativ mai slab clasate la prelucrare pentru crioconservare. În acest sens este important să precizăm că cerinŃa minimă pentru mobilitate a fost 0,7.

ConcentraŃia spermatozoizilor oscilează între 0,687 miliarde şi 2,313 miliarde cu o medie de 1,47± 010 miliarde pe mililitru. Limitele largi între care concentraŃia oscilează arată că masculii sunt de vârste diferite ceea ce afectează major producŃia testiculară de spermatozoizi. Alături de cauza majoră reprezentată de vârstă există şi alte variaŃii date de caracteristicile individuale ale masculilor respectivi.

Procentul total de anomalii este acceptabil (13,65±050) şi uniform repartizat. Cele mai numeroase sunt anomaliile prezente la nivelul capului spermatozoizilor (5,20%) urmată de piesa intermediară (4,35%) şi coadă (4,10%).

Tabelul numărul 5 prezintă mediile caracteristicilor spermei brute obŃinute de la berbecii ecotipului de munte al rasei Tigaie.

Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei brute

ob Ńinut ă de la berbecii ecotipului de munte al rasei łigaie Tabel 5

Berbecii łigaie Parametrii statistici

Caracteristicile

ejaculatului

Unitate de

măsură

N

_ _ X±sx

s

s2

V%

Vmin

Vmax

Volum ml 16 0,84±0,06 0,241 0,058 28,53 0,4 1,2 Mobilitate note

zecimale 16 0,91±0,01 0,040 0,001 4,38 0,9 1,0

ConcentraŃie 109sz/ml. 16 1,98±0,12 0,493 0,243 24,79 1,061 2,918 Nr.sz./ejaculat 109sz./ejac 16 1,59±0,05 0,213 0,045 13,38 1,167 1,863

TOTAL % 16 12,25±0,63 2,542 6,466 20,75 7 16 Cap % 16 4,00±0,25 1,032 1,066 25,81 2 6 P.int. % 16 3,62±0,32 1,310 1,716 36,14 2 6

Anomalii

Coadă % 16 4,37±0,20 0,806 0,650 18,42 3 6

Asemănător situaŃiei remarcate la analiza spermei brute provenită de la berbecii ecotipului de colină şi în cazul ecotipului de munte caracteristicile ejaculatelor se încadrează în valorile specifice rasei łigaie. Volumul mediu al ejaculatelor este de 0,84 ml cu limite de variaŃie foarte largi (0,4-1,2 ml). Deoarece valorile individuale ale caracteristicilor spermei sunt medii ale unor ejaculate rezultă că în cadrul ecotipului există berbeci care au caracteristic puŃin material spermatic. De regulă aceştia sunt eliminaŃi pentru că numărul de doze pentru inoculare obŃinute pe ejaculat este mult prea mic. Mobilitatea spermatozoizilor are media de 0,91 ± 0,01 aproape invariabil de la un berbec la altul. ConcentraŃia spermatozoizilor oscilează între 1,061 – 2,918 miliarde/ml media fiind de 1,98± 0,12 miliarde/ml. În general valorile minime se întâlnesc la berbecii care au şi volumul mai redus al ejaculatelor ceea ce întăreşte decizia de eliminare a lor din efectivul destinat recoltării pentru crioconservare. Procentul total al anomaliilor este cel unanim acceptat respectiv 12,25%. Acesta rezultă din anomalii ale capului (4,00%), piesei intermediare (3,62%) şi cozii spermatozoizilor (4,37%). Comparând mediile caracteristicilor spermei brute la cele două ecotipuri ale rasei łigaie remarcăm următoarele aspecte de interes: - valorile medii ale caracteristicilor ejaculatelor obŃinute de la berbecii nominalizaŃi aparŃinând ecotipurilor de colină şi de munte se încadrează între limitele caracteristice rasei łigaie; - berbecii cu volum mic al ejaculatelor au, de regulă şi mobilitatea spermatozoizilor cea mai redusă; - berbecii ecotipului de munte au ejaculate cu volum mai redus comparativ berbecilor din ecotipul de colină, dar concentraŃia în spermatozoizi este mai mare; - procentele reduse de anomalii demonstrează că frecvenŃa recoltărilor este optimă, iar berbecii sunt furajaŃi cu nutreŃuri de calitate şi întreŃinuŃi în condiŃii optime; - majoritatea berbecilor nominalizaŃi pot fi utilizaŃi pentru recoltare în vederea obŃinerii de ejaculate destinate crioconservării. 4.2. Realizarea b ăncii de sperm ă 4.2.1. Determinarea influen Ńei duratei perioadei de echilibrare asupra mobilit ăŃii spermatozoizilor Scopul determinării influenŃei duratei perioadei de echilibrare asupra mobilităŃii spermatozoizilor este de a stabili dinamica optimă a scăderii temperaturii materialului spermatic diluat astfel încât să se păstreze capacitatea fecundantă a spermatozoizilor crioconservaŃi. În vederea realizării experimentului s-au utilizat berbecii nominalizaŃi aparŃinând celor două ecotipuri ale rasei łigaie. De la aceştia, la începutul sezonului de reproducŃie s-au recoltat câte şase ejaculate (în primele două

săptămâni) care s-au evaluat după volum, mobilitate şi concentraŃie.Ejaculatele cu mobilitatea minimă de 0,7 au fost admise pentru prelucrare. Întrucât caracteristicile acestora s-au diferenŃiat în funcŃie de individ sau chiar ejaculat au fost realizate grade ale diluŃiei diferite, respectiv de la 1:1 până la 1:4. Criteriul care a stat la baza stabilirii gradului diluŃiei a fost numărul minim de spermatozoizi necesari pe doza de inoculare adică 4 x 108. Practic ejaculatele cu volum mare şi concentraŃie ridicată s-au diluat la un grad al diluŃiei de 1:4, iar cele cu volum mic şi concentraŃie scăzută, provenite chiar de la acelaşi individ au avut gradul diluŃiei de 1:1. Diluantul utilizat a fost Triladyl. În momentul efectuării diluŃiei diluantul a avut aceeaşi temperatură cu a ejaculatului, respectiv 370C. După diluare sperma a fost analizată din punct de vedere al mobilităŃii spermatozoizilor (mobilitate iniŃială). Timpii de echilibrare aleşi au fost de 5,4 şi 2 ore, perioade întâlnite în cercetările efectuate de diferiŃi alŃi autori (Bucak, M.N. şi col., 2007, Berlinger, F şi col 2007, Fernandez Abela şi col.2003). În acest interval temperatura probelor a scăzut până la 50C, iar din oră în oră a fost determinată mobilitatea spermatozoizilor.

Dinamica mobilit ăŃii spermatozoizilor în perioada de echilibrare cu durata de 5 ore

Tabel 6 Mobilitatea la: Berbeci Gradul

dilu Ńiei ini Ńială 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 1:1 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 1:2 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 1:3 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8

Ecotipul de

colină 1:4 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,6 1:1 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 1:2 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 1:3 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7

Ecotipul de

colină 1:4 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 0,7 1:1 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 1:2 1,0 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 1:3 1,0 1,0 0,9 0,9 0,9 0,9

Ecotipul de

munte 1:4 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 1:1 1,0 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 1:2 1,0 0,9 0,9 0,8 0,8 0,7 1:3 1,0 0,9 0,8 0,7 0,7 0,7

Ecotipul de

munte 1:4 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7

Dinamica mobilităŃii medii (%din valoarea iniŃială) 1:1 100 97,05 94,11 91,17 88,23 85,29 1:2 100 94,44 94,44 88,88 88,88 86,11 1:3 100 97,22 91,89 86,48 83,78 83,78

Berbecii ecotipurilor de colină şi munte 1:4 100 100,00 96,77 96,77 93,54 87,09

Analiza valorilor tabelare demonstrează că mobilitatea spermatozoizilor nu se reduce major în primele ore de echilibrare, independent de gradul diluŃiei şi ecotipul rasei łigaie căruia îi aparŃin berbecii. În general probele cu mobilitatea iniŃială de 0,7-0,8 au durata păstrării mobilităŃii mai lungă în perioada de echilibrare. Nu aceeaşi situaŃie se remarcă la probele cu mobilitatea iniŃială de 0,9-1,0 la care aceasta scade cu o unitate după 1-2 ore de echilibrare. Rezultă că în cazul berbecilor din rasa łigaie ejaculatele cu mobilitatea de 0,7 pot fi utilizate cu succes pentru prelucrare în vederea conservării la temperaturi scăzute. În funcŃie de gradul diluŃiei, mobilitatea reprezintă după o oră de echilibrare între 94,44% - 100%, la două ore 91,89% - 96,77%, la 3 ore 86,48%-96,77% şi la final 83,78%-87,09% din mobilitatea iniŃială. Constatăm că mobilitatea spermatozoizilor are un prim prag de scădere după 3 ore de echilibrare şi un al doilea prag mult mai intens la 4 ore. Nu am remarcat existenŃa unei corelaŃii stricte între gradul diluŃiei şi dinamica mobilităŃii la echilibrare. Constatăm totuşi că în cazul nostru cel mai bine şi de durată îşi păstrează mobilitate ejaculatele diluate într-un raport de 1:4

Dinamica mobilit ăŃii spermatozoizilor în perioada de echilibrare cu durata de 4 ore

Tabel 7 Mobilitatea la: Berbeci Gradul

dilu Ńiei ini Ńială 1 h 2 h 3 h 4 h 1:1 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 1:2 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 1:3 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Ecotipul de colină

1:4 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 1:1 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 1:2 1,0 1,0 0,9 0,9 0,8 1:3 1,0 0,9 0,9 0,8 0,8

Ecotipul de colină

1:4 1,0 0,9 0,9 0,9 0,8 1:1 0,8 0,7 0,7 0,7 0,6 1:2 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 1:3 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7

Ecotipul

de munte 1:4 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 1:1 0,9 0,8 0,8 0,8 0,7 1:2 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 1:3 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8

Ecotipul

de munte 1:4 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 Dinamica mobilităŃii medii (% din valoarea iniŃială) 1:1 100 94,11 94,11 88,23 82,35 1:2 100 97,14 91,42 88,57 85,71 1:3 100 97,22 97,22 88,88 88,88

Berbecii ecotipurilor de colină şi munte 1:4 100 97,29 97,29 94,59 89,18

Comparativ analizei efectuate anterior când dinamica scăderii temperaturii în perioada de echilibrare a fost lentă (5 ore), la echilibrarea cu durata de 4 ore se constată, în general, aceleaşi aspecte. Dorim să accentuăm că sporirea vitezei de reducere a temperaturii până la +50C nu afectează major mobilitatea spermatozoizilor în primele două ore. Aceasta rămâne la valori ridicate, respectiv de 91,42%-97,29% din mobilitatea iniŃială. După trei ore şi mai ales 4 ore de echilibrare mobilitatea spermatozoizilor se reduce substanŃial. Referitor la influenŃa gradului diluŃiei asupra mobilităŃii şi în acest caz constatăm că după 3-4 ore de echilibrare ejaculatele diluate în raport de 1:4 au cele mai ridicate valori.

Dinamica mobilit ăŃii spermatozoizilor în perioada de echilibrare cu durata de 2 ore

Tabel 8 Mobilitatea la : Berbeci Gradul

dilu Ńiei ini Ńială 1 h 2 h 1:1 0,8 0,8 0,7 1:2 0,9 0,9 0,8 1:3 0,9 0,9 0,9 1:4 0,8 0,8 0,8

Ecotipul de colină

1:5 0,8 0,8 0,7 1:1 0,8 0,8 0,7 1:2 0,8 0,8 0,8 1:3 0,8 0,8 0,8 1:4 0,8 0,8 0,7

Ecotipul de

colină

1:5 0,8 0,8 0,7 1:1 0,8 0,8 0,7 1:2 0,8 0,8 0,8 1:3 0,9 0,9 0,8 1:4 0,9 0,9 0,9

Ecotipul de

munte

1:5 0,9 0,9 0,9 1:1 0,9 0,9 0,8 1:2 1,0 1,0 0,9 1:3 0,9 0,9 0,8 1:4 0,9 0,9 0,9

Ecotipul de

munte

1:5 0,9 0,9 0,9

Dinamica mobilităŃii medii (%din valoarea iniŃială) 1:1 100 100 87,87 1:2 100 100 94,28 1:3 100 100 94,28 1:4 100 100 97,05

Berbecii

ecotipurilor de colină şi munte 1:5 100 100 91,42

ÎncurajaŃi de rezultatele experienŃelor prezentate anterior am redus timpul de scădere a temperaturii (2 ore) datorită avantajului reprezentat de scurtarea

duratei perioadei de congelare. S-a constatat că toŃi spermatozoizii după o oră de echilibrare îşi păstrează mobilitatea independent de gradul diluŃiei. Acesta se reduce puŃin după două ore, dar rămâne la valori ridicate şi apropiate mobilităŃii iniŃiale. Din dorinŃa de a stabili dacă gradul diluŃiei de 1:4 este cel mai favorabil păstrării mobilităŃii în perioada de echilibrare am realizat şi o variantă la care acesta a fost de 1:5. Mobilitatea spermatozoizilor s-a păstrat destul de bine (scăzând doar cu 8,58%), dar a fost sub valoarea realizată de gradul diluŃiei 1:4. MenŃionez că în perioada de echilibrare, odată cu scăderea temperaturii intensitatea mişcării cozii spermatozoizilor se reduce dar acest aspect nu a fost urmărit fiind considerat ca şi o situaŃie de aşteptat. ToŃi spermatozoizii care prezentau bătăi ale cozii au fost consideraŃi ca fiind mobili. Concluzia cea mai importantă care rezultă din cercetările privind influenŃa duratei perioadei de echilibrare asupra mobilităŃii spermatozoizilor este că aceasta poate să se reducă la 2 ore şi în cazul materialului spermatic recoltat de la berbecii aparŃinând ecotipurilor de colină şi munte a rasei łigaie. Creşterea vitezei de scădere a temperaturii de la 370C la +50C nu influenŃează negativ mobilitatea. De asemenea gradul diluŃiei de 1:4 este optim. Adăugarea la ejaculate a unor cantităŃi sporite de diluant, chiar dacă se păstrează aceeaşi concentraŃie de spermatozoizi, are efecte negative asupra mobilităŃii. 4.2.2. Determinarea influen Ńei concentra Ńiei de glicerol din diluant asupra mobilit ăŃii spermatozoizilor conserva Ńi prin refrigerare Cercetările privind determinarea concentraŃiei optime de glicerol din diluant s-au realizat utilizând sperma provenită de la berbecii nominalizaŃi dar nediferenŃiaŃi pe ecotipuri. Ele sunt o continuare a cercetărilor anterioare pentru că preiau gradele diluŃiei şi timpul de echilibrare care au fost cele mai favorabile menŃinerii mobilităŃii spermatozoizilor. În acest sens menŃionăm că scăderea temperaturii de la 370C la +50C s-a realizat în două ore, iar ejaculatele s-au diluat în raport de 1:3 şi 1:4. Aceste probe s-au conservat la +40C determinându-se la intervale regulate (24 ore) mobilitatea spermatozoizilor până când aceasta a ajuns la zero. Urmărirea duratei de conservare a spermei refrigerate este importantă nu numai pentru alegerea diluantului care va fi folosit la congelare şi ci în scop practic, respectiv extinderea însămânŃărilor artificiale în cadrul rasei. Din acest punct de vedere cercetările pot fi considerate ca făcând parte dintr-un experiment adiŃional la obiectul anului 2010. DiluanŃii utilizaŃi au fost Triladyl şi un diluant preparat de colectivul nostru. Triladylul conŃine glicerol în procent de 7% alături de Tris, acid citric, fructoză, antibiotice şi 20% gălbenuş de ou, componente dizolvate în apă bidistilată. Diluantul preparat de colectivul nostru a cuprins citrat monosodic, fructoză, glicerol, gălbenuş de ou, antibiotice şi apă bidistilată. Specific este că procentul de glicerol a fost variabil şi asigurat la concentraŃii de 2,5%, 5%, 7%, 10% şi 12,5%.

Utilizarea acestui diluant ne-a dat posibilitatea să studiem influenŃa concentraŃiei de glicerol asupra păstrării mobilităŃii spermatozoizilor la temperatura de refrigerare. Testul de conservare prin refrigerare considerăm că este important pentru cunoaşterea reacŃiei spermatozoizilor crioconservaŃi la sporirea glicerolului din reŃeta de diluant.

Dinamica mobilit ăŃii spermatozoizilor conserva Ńi la temperatura de refrigerare

Tabel 9 Diluant cu adaos de glicerol (%) Triladyl

Gradul dilu Ńiei 1:4 1:3

Interval de

control (h) 2,5 5 7 10 12,5 2,5 5 7 10 12,5

1:4

1:3

După echilibrare

0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

24 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 48 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 72 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 0,9 0,8 0,8 96 0,7 0,7 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 0,8

120 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 0,8 0,8 0,8 0,7 144 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,8 0,8 0,7 0,7 168 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,8 0,8 0,7 0,7 192 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,9 0,8 0,8 0,7 0,7 216 0,7 0,7 0,8 0,7 0,8 0,8 0,7 0,8 0,7 0,8 0,7 0,7 240 0,7 0,7 0,8 0,7 0,8 0,8 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 264 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 288 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 312 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,6 0,7 0,6 0,7 0,7 0,7 336 0,6 0,6 0,7 0,4 0,5 0,7 0,6 0,7 0,5 0,7 0,7 0,7 360 0,6 0,7 0,7 0 0 0,7 0,5 0,7 0,4 0,7 0,7 0,6 384 0,5 0,6 0,7 0 0 0,7 0,3 0,7 0,3 0,6 0,7 0,6 408 0,5 0,6 0,7 0 0 0,6 0 0,7 0 0,6 0,6 0,5 432 0,2 0,5 0,7 0 0 0,4 0 0,6 0 0,6 0,4 0,5 456 0 0,2 0,5 0 0 0 0 0,5 0 0,5 0,2 0,3 480 0 0 0,4 0 0 0 0 0,1 0 0,3 0 0 504 0 0 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Din urmărirea datelor tabelare specifice diluantului preparat de noi se observă că independent de gradul diluŃiei (1:3, 1:4) procentele de 2,5 şi 5% glicerol au capacitatea de a păstra mobilitatea spermatozoizilor perioade mai lungi comparativ concentraŃiilor de 10% şi 12,5%. Cele mai bune rezultate se obŃin dacă în diluant, glicerolul se găseşte în procent de 7%. În acest caz după 18 zile mobilitatea spermatozoizilor refrigeraŃi este încă de 0,7 scăzând în continuare la 0,5 în ziua 10, 0,4 la 20 zile şi la doar 0,2 în final (ziua 21). Din rezultatele noastre se desprinde observaŃia că la gradul diluŃiei de 1:3 şi 7% glicerol durata de conservare este mai redusă cu aproximativ 24 ore comparativ diluŃiei de 1:4 si acelaşi procent de crioprotector.

La diluantul Triladyl care conŃine 7% glicerol durata păstrării mobilităŃii spermatozoizilor este, cu mici diferenŃe, asemănătoare diluantului propriu. Şi în acest caz, ritmul scăderii mobilităŃii spermatozoizilor în perioada de conservare este mai redus pentru gradul de diluare de 1:4. DiferenŃele sunt de aproximativ 1-2 zile. La finalul cercetării concluzionăm că procentul optim de glicerol din diluant este de 7%, mobilitatea spermatozoizilor refrigeraŃi păstrându-se perioade mai lungi de timp dacă gradul diluŃiei de 1:4. 4.2.3. Crioconservarea materialului spermatic Diluantul folosit pentru congelarea spermei a fost întocmit pe structura diluantului comercial Tryladil, suplimentat cu 20% gălbenuş de ou. Protocolul a presupus recoltarea spermei cu ajutorul vaginei artificiale preîncălzite la 43° C şi lubrifiate, saltul fiind realizat pe oi în călduri depistate la primele ore ale dimineŃii cu ajutorul berbecilor încercători cu şorŃ. Imediat după recoltare material seminal a fost supus unei evaluări uzuale, urmărindu-se volumul şi culoarea ejaculatului, precum şi mobilitatea spermatozoizilor. Cu privire la acest ultim parametru, precizăm că pentru congelare au fost selectate ejaculatele care prezentau o mişcare bună de înaintare notată cu cel puŃin 0,7. Prepararea spermei pentru congelare a presupus diluŃia în raport de 1:4 cu diluantul menŃionat anterior preîncălzit la 37°C. Dup ă preparare temperatura probelor biologice a fost scăzută treptat până la 4°C cu o rat ă de 0,3°C/minut. În continuare a urmat o etap ă de echilibrare la 4°C timp de 2 ore. Ambalarea s-a f ăcut în paiete de 0,25 ml, urmată de sigilarea. Ambele operaŃiuni fiind efectuate la temperatura de 4°C. Dup ă care paietele au fost trecute în cuva ce congelare iniŃială, respectiv în vapori de azot la 6 cm de suprafaŃa azotului lichid pentru o perioadă de 13 minute. Pentru congelarea finală paietele au fost plonjate în azot lichid (-196,8oC), după care au fost grupate în goblete şi trecute în canistrele containerelor de stocare.

Evaluarea materialului spermatic reprezintă un factor definitoriu ce trebuie analizat cu acurateŃe în ideea caracterizării indivizilor cu fertilitate ridicată şi pretabili la crioconservare. Analizele uzuale de evaluare a materialului spermatic, nu pot evidenŃia deteriorări subtile ale spermatozoizilor, evidenŃierea acestora având un rol definitoriu în succesul crioconservarii sau în determinarea capacităŃii de fertilizare a spermatozoizilor. Teste de evaluare au fost de multe ori utilizate în clasificarea reproducătorilor în ceea ce priveşte pretabilitatea la crioconservare, ca fiind ˝buni˝, ˝moderaŃi˝ sau ˝slabi˝ (Holt şi col., 2005, Roca şi col., 2006). Oricum este interesant sa fie punctat că nu toŃi reproducătorii clasificaŃi ca ˝buni˝ sunt capabili de a atinge rate înalte de fertilizare in vitro, în timp ce aceia clasificaŃi ca fiind ˝slabi˝ pot prezenta rate de fertilizare acceptabile, evidenŃiind limita testelor de evaluare a spermei disponibile la ora actuală (Gil şi col., 2005). Mai mult, se pare că alte caracteristici ale spermei în legătură cu fertilitatea pot fi de asemenea afectate negativ în procesele de congelare decongelare (Hermandez şi col., 2006).

În acest sens în prezenta lucrare, au fost identificate, implementate şi îmbunătăŃite un set de teste de evaluare a materialului seminal ce prezintă un

înalt grad de acurateŃe. acestea se constituie ca şi model pentru evaluarea materialului spermatic crioconservat de berbec. Implementarea în practica de laborator a acestui model prezintă avantaje incontestabile pentru cercetarea andrologică, în domeniul criobiologiei, pentru dezvoltarea biotehnologiilor de reproducŃie cu aplicabilitate directă în conservarea biodiversităŃii animale prin crearea de bănci de gene.

Ceea ce propunem noi corespunde tendinŃei din cercetarea andrologică care s-a orientat în ultimii ani spre dezvoltarea de metode avansate pentru testarea cât mai precisă a calităŃii spermei. Aceste metode sunt complementare celor propuse de cercetarea de specialitate care nu sunt întotdeauna simple, comprehensive sau economice.

Evaluarea materialului spermatic post congelare a presupus determinarea mobilităŃii spermatozoizilor prin testul de anduranŃă, a funcŃionalităŃii membranei plasmatice prin testul hipo-osmotic (HOST) şi a morfologiei detaliate prin metoda Hancock.

Evaluarea mobilităŃii - Testul de anduranŃă Pentru determinarea mobilităŃii post congelare, o picătură de spermă a

fost analizată între lamă şi lamelă la microscop în câmp luminos. Pe platforma încălzitoare s-a pus o lamă de sticlă şi o lamelă preîncălzite la 38oC. Cu ajutorul unei pipete s-a extras din tubul cu proba de analizat o picătură de spermă care apoi s-a pus pe lamă şi s-a acoperit cu lamela. S-a stabilit grosismentul microscopului (100x), iar după obŃinerea unei imagini clare s-a examinat câmpul microscopic. Separat, în trei câmpuri microscopice, a fost apreciat raportul între spermatozoizii cu mişcări progresive şi spermatozoizii imobili sau mobili local. Aprecierea mobilităŃii a fost efectuată de către trei evaluatori. Rezultatul analizei exprimat prin media celor trei aprecieri notate de la 0 la 1, reprezintă mobilitatea spermatozoizilor cu mişcări progresive. Evaluarea materialului seminal decongelat a fost efectuată după incubarea acestuia la 38oC timp de 10 minute, 30 minute şi o oră.

Evaluarea funcŃionalităŃii - Testul hipo-osmotic HOST (Hypo Osmotic

Swelling Test) Testul hipo-osmotic, iniŃial conceput pentru sperma umană (Jeyendran şi

col., 1984), este de asemenea aplicat şi la câteva specii de animale domestice (taur, vier, armăsar, câine).

Reprezintă un test de laborator destinat determinării integrităŃii funcŃionale a membranei spermatice (Chan şi col, 1990). Integritatea funcŃională şi structurală a membranei este crucială pentru vitalitatea spermatozoizilor. Testul uzual de colorare (eozină-nigrozină) pentru evidenŃierea membranei pune în evidenŃă doar integritatea sa structurală. Testul hipo-osmotic, iniŃial conceput pentru sperma umană (Jeyendran şi col., 1984), este de asemenea aplicat şi la câteva specii de animale domestice (taur, vier, armăsar, câine). Dacă plasmalema este intactă, dar funcŃional instabilă, spermatozoidul este incapabil să interacŃioneze cu mediul în care este suspendat. Ca urmare capacitatea sa fecundantă se reduce până la dispariŃie.

Procedeele de congelare-decongelare cauzează schimbări în stabilitatea membranei plasmatice a spermatozoizilor (Maxwell şi Johnson, 1997), structura şi funcŃionalitatea acesteia putând fi afectată fără ca membrana să fie erodată. Modificări subtile la nivelul stratului bilipidic destabilizează membrana plasmatică şi îi compromite funcŃionalitatea fără să cauzeze moartea imediată a celulei, periclitând totuşi abilitatea de fertilizare a spermatozoizilor.

Când spermatozoizii sunt suspendaŃi într-o soluŃie hipo-osmotică, apa va intra în spermatozoid, pentru obŃinerea echilibrului osmotic. Astfel volumul celulei va creşte, reducându-se drastic mărimea iniŃială a flagelului în urma formării unei ondulaŃii la acest nivel. Influxul de apă are loc doar la nivelul cozii. PrezenŃa ondulaŃiei cozii spermatozoidului, reprezintă o dovadă că apa a fost transportată într-o manieră fiziologică în celulă, pentru a atinge echilibrul osmotic. Acest fapt indică o membrană flagelară intactă funcŃional, spermatozoidul fiind considerat HOST pozitiv.

Principiul testului HOST este bazat pe transportul apei de-a lungul membranei spermatice de la nivelul cozii în condiŃii hipo-osmotice.

Aplicarea testului HOST pentru aprecierea calităŃii spermei crioconservată de berbec reclamă următoarele etape:

- suspendarea a 0,1 ml de material seminal decongelat într-un ml soluŃie hipo-osmotică (soluŃia stoc hipo-osmotică este formată din 0,375g de citrat de sodiu, 1,35 g fructoză şi 100 ml apă bidistilată),

- menŃinerea amestecului timp de o oră în incubator la temperatura de 38ºC. - examinarea unei picături de spermă între lamă şi lamelă la microscop în

câmp luminos cu obiectiv de 40X. Spermatozoizii a căror coadă a prezentat s-a ondulat sunt catalogaŃi

drept hipo-osmotic pozitivi (integritate membranară funcŃională normală). Pentru fiecare preparat au fost examinaŃi un număr de 200 de spermatozoizi, iar rezultatele s-au raportat procentual.

Evaluarea morfologică detaliată - metoda Hancock Metoda Hancock reprezintă o metodă de evaluare morfologică a

spermatozoizilor, caracterizată de un înalt grad de acurateŃe. Multe metode sau teste nu au capacitatea de a evidenŃia cu precizie anomaliile spermatozoizilor, oferind informaŃii doar despre anumite componente ale celulei spermatice, în condiŃiile in care morfologia spermatozoizilor are efect direct asupra reuşitei crioconservării sau mai mult, asupra procesului de fertilizare. Această metodă evidenŃiază atât anomaliile primare cât şi cele secundare sau provenite de la manipularea excesivă a materialului spermatic, oferind de asemenea şi informaŃii cruciale despre statusul funcŃional testicular al reproducătorului. Mai mult în condiŃiile crioconservării spermei pentru crearea băncilor de gene, caracterizarea morfologică detaliată a materialului seminal crioconservat este un aspect imperios necesar. Această evaluare este necesară atât pentru cunoaşterea reuşitei procesului de crioconservare cât şi pentru aprecierea pretabilităŃii materialului spermatic provenit de la un anumit individ la crioconservare.

Pentru aprecierea morfologică a spermei după crioconservare se suspendă 30-50 µl material seminal în 300 µl soluŃie stoc Hancock şi se lasă 5

minute pentru fixare. O picătură de spermă s-a analizat între lamă şi lamelă la microscopul cu contrast de fază (Karl-Zeiss) în imersie. La fiecare preparat au fost examinate 200 celule urmărindu-se anomaliile morfologice (acrozom, cap, gât piesa intermediară, piesă principală, duble şi multiple) conform unui model de fişă conceput de colectivul proiectului de cercetare. SoluŃia stoc Hancock conŃine 2,9 g citrat trisodic dihidrat, 4 ml soluŃie formalină (37%). Se completează apoi cu apă distilată până la 100 ml şi se păstrează la 4oC.

Din totalul celor 28 berbeci aparŃinând ecotipurilor rasei łigaie au fost luaŃi în considerare pentru prelucrare statistică doar indivizii la care, după decongelare, mobilitatea spermatozoizilor s-a situat peste valoarea de 0,3. În aceste condiŃii au fost considerate ca nepretabile pentru congelare ejaculatele provenite de la 9 berbeci. Dintre aceştia 6 aparŃin ecotipului de colină şi 3 ecotipului de munte.

Analiza mediei şi indicilor de dispersie a caracteristicilor spermei congelate provenită de la berbecii ecotipului de colină prezintă aspecte care vor fi menŃionate în continuare. Mobilitatea post-congelare este cuprinsă între 0,32-0,42 valori obŃinute la cele trei determinări. Păstrarea mobilităŃii spermatozoizilor la valoarea de 0,32 până la 60 minute după decongelare demonstrează că până la inoculare timpul trebuie să fie cât mai scurt. Între indivizi diferenŃele privind mobilitatea determinată postcongelare la 10, 30 şi 60 minute sunt medii, fapt demonstrat de valorile coeficientului de variaŃie.

Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei congelate ob Ńinut ă de la berbecii ecotipului de colin ă

Tabel 10 Berbecii łigaie

Parametrii statistici Caracteristici Unitate de

măsură N

_ X ± sx

S

s2

V%

Vmin

Vmax

10 min note

zecimale 10

0,42 ± 0,033

0,105 0,011 25,03 0,28 0,57

30 min note

zecimale 10 0,42 ± 0,033

0,104 0,011 24,82 0,33 0,63 Mobilitate

1 h note

zecimale 10 0,32 ± 0,026

0,081 0,007 25,70 0,23 0,45

Testul HOST % 10 25,00 ±

4,64 14,67 215,33 58,70 5 45

TOTAL % 10 50,10 ± 3,35

10,59 112,10 21,13 35 75 Anomalii

Acrozom % 10 34,20 ± 2,59

8,19 67,07 23,95 26 54

Testul hipo-osmotic arată că în medie la 25% dintre spermatozoizii

ejaculatelor membrana plasmatică prezintă integritate morfo-funcŃională. Cu toate că valorile sunt mai mici decât cele specifice mobilităŃii, le considerăm

normale pentru că aceeaşi situaŃie se întâlneşte şi la analizele efectuate pe sperma brută. MenŃionăm că valorile HOST obŃinute sunt apropiate de cele existente în lucrările de profil realizate de alŃi cercetători.

Anomaliile morfologice sunt bine reprezentate atingând valori de 50% din totalul spermatozoizilor crioconservaŃi analizaŃi. Dintre acestea 34,20% sunt reprezentate de anomalii la nivelul acrozomului. Majoritatea sunt reprezentate de detaşări ale acrozomului, care pot fi considerate ca reacŃie acrozomală ce urmează crio-capacitării spermatozoizilor de berbec congelaŃi. Alături de detaşare, acrozomul mai este umflat (1-5 %) şi deformat (1-6%). Această situaŃie explică de ce procentele de fecunditate realizate prin folosirea spermei crioconservate la oi sunt reduse indiferent de metoda de inoculare (intracervical sau laparascopic). În cazul caracteristicilor spermei congelate obŃinută de la berbecii ecotipului de munte se remarcă aspecte asemănătoare, dar sunt prezente şi unele diferenŃe. Astfel, mobilitatea are valori de peste 0,40 indiferent de momentul determinării. Remarcăm de asemenea că după o perioadă de 30 minute de incubare mobilitatea creşte de la 0,41 la 0,49. Valorile testului HOST sunt mai mari, respectiv 27,78%. Creşterea acestora consecutiv sporirii mobilităŃii ne conduce la aprecierea că între cele două caracteristici există o corelaŃie pozitivă. Anomaliile morfologice ajung la 47,89%, iar cele acrozomale la 38,44%. În aceste condiŃii considerăm că între cele două ecotipuri nu există diferenŃe marcante în privinŃa caracteristicilor spermei şi a pretabilităŃii la congelare. Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei congelate obŃinută de la berbecii rasei łigaie redaŃi în tabelul 12, se constituie ca şi o medie a celor două ecotipuri analizate anterior.

Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei congelate ob Ńinut ă de la berbecii ecotipului de munte

Tabel 11 Berbecii łigaie

Parametrii statistici Caracteristici

Unitate de

măsură

N

_ X±sx

s

S2

V%

Vmin

Vmax

10 min note

zecimale 9

0,41 ± 0,038

0,114 0,013 27,72 0,28 0,60

30 min note

zecimale 9 0,49 ± 0,043

0,129 0,017 26,18 0,30 0,65 Mobilitate

1 h note

zecimale 9 0,40 ± 0,045

0,136 0,019 33,78 0,20 0,60

Testul HOST % 9 27,78 ±

4,16 12,47 155,44 44,88 12 48

Anomalii TOTAL % 9 47,89 ± 3,17

9,51 90,36 19,85 30 57

Acrozom % 9 38,44 ± 3,10

9,30 86,53 24,20 27 49

În aceste condiŃii mobilitatea oscilează între 0,36-0,45, valorile HOST sunt de 26,89%, iar anomaliile reprezintă 49,05% din totalul spermatozoizilor crioconservaŃi. Referitor la limitele minime şi maxime întâlnite la analizeze efectuate, o remarcăm pe cea caracteristică testului HOST. Aici ele sunt cuprinse între 5 şi 48%. Considerăm că pentru funcŃionalitatea membranei plasmatice a spermatozoizilor factorii de influenŃă sunt mult mai numeroşi, ceea ce determină o variabilitate ridicată în cazul acestui caracter.

Media şi indicii de dispersie a caracteristicilor spermei congelate ob Ńinut ă de la berbecii rasei łigaie

Tabel 12

Cu toate că detaşarea acrozomului este cauzată în principal de crio-capacitare, din experienŃa de laborator a noastră apreciem că şi manipularea excesivă are acelaşi efect.

În urma conservării şi evaluării spermei congelate se desprind următoarele aspecte:

- mobilitatea spermatozoizilor post-congelare se reduce drastic, dependent de berbec şi mai puŃin în funcŃie de ecotip;

- aplicarea testului de analiză privind termorezistenŃa spermatozoizilor decongelaŃi oferă posibilitatea aprecierii cu mai mare precizie a calităŃii acestora comparativ determinării mobilităŃii imediat după decongelare;

- valorile HOST pozitive scăzute demonstrează că integritatea funcŃională a membranei spermatozoizilor a avut de suferit în urma procesului de congelare-decongelare;

- anomaliile morfologice sunt reprezentate preponderent de acrozom în diferite stadii de detaşate, ceea ce demonstrează că aprecierea calităŃii spermei

Berbecii łigaie Parametrii statistici

Caracteristici

Unitate de

măsură

N

_ X ± sx

s

s2

V%

Vmin

Vmax

10 min note

zecimale 19 0,42 ±

0,024 0,106 0,011 25,59 0,28 0,6

30 min note

zecimale 19 0,45 ± 0,027

0,119 0,014 26,20 0,3 0,65 Mobilitate

1 h note

zecimale 19 0,36 ± 0,027

0,116 0,014 32,62 0,2 0,6

Testul HOST % 19 26,89 ±

2,80 12,19

148,65

45,33 5 48

TOTAL % 19 49,05 ± 2,27

9,87 97,50 20,13 30 75 Anomalii

Acrozom % 19 36,21 ± 2,01

8,76 76,73 24,19 26 49

numai prin mobilitatea acesteia nu redă cu fidelitate măsura capacităŃii fecundante a spermatozoizilor crioconservaŃi;

- există posibilitate evitării risipei de gene valoroase din banca de spermă prin utilizarea spermatozoizilor cu acrozom detaşat pentru obŃinerea embrionilor prin metoda de fecundaŃie asistată ICSI (intracytoplasmatic sperm injection);

- modelul de evaluare elaborat de colectivul de cercetare a proiectului dă posibilitatea aprecierii cu fidelitate a calităŃii spermei crioconservate fiind totodată economică (materiale consumabile şi echipamente accesibile);

- există o mare variabilitate individuală a berbecilor privind pretabilitatea spermei la congelare;

- între cele două ecotipuri ale rasei łigaie nu există diferenŃe importante privind calitate a spermei crioconservată.

5. Concluzii Ca o sinteză a rezultatelor cercetării din acest an prezentăm în continuare

aspectele pe care le considerăm de interes.

a) Antrenamentul pentru recoltare utilizând metoda „şcolii berbecilor” dă rezultate foarte bune pentru că rasa se caracterizează prin predominanŃa sistemului nervos echilibrat şi temperament vioi;

b) Miorii au durata antrenamentului mai lungă comparativ berbecilor adulŃi datorită absenŃei experienŃei sexuale anterioare;

c) Berbecii foarte buni pentru recoltarea cu vagina artificială au reflexele sexuale foarte corect şi intens manifestate. Pentru a fi încadraŃi în această categorie nu este absolut necesar ca toate reflexele să fie evaluate cu nota maximă;

d) Notele obŃinute pentru comportament sexual caracteristic berbecilor la recoltarea cu vagina artificială pot oscila între 3-5. FrecvenŃa notelor minime trebuie să fie redusă fiind acceptată doar în cazul a 1-2 reflexe sexuale;

e) Reflexele sexuale a berbecilor şi miorilor care prezintă variabilitatea maximă în cadrul rasei łigaie sunt cele de apropiere, salt şi erecŃie. În general masculii ezitanŃi nu realizează intromisiunea şi depunerea vaginală a spermei.

f) Valorile medii ale caracteristicilor ejaculatelor obŃinute de la berbecii nominalizaŃi aparŃinând ecotipurilor de colină şi de munte se încadrează între limitele caracteristice rasei łigaie;

g) Berbecii cu volum mic al ejaculatelor au, de regulă şi mobilitatea spermatozoizilor cea mai redusă;

h) Berbecii ecotipului de munte au ejaculate cu volum mai redus comparativ berbecilor din ecotipul de colină, dar concentraŃia în spermatozoizi este mai mare;

i) Procentele reduse de anomalii demonstrează că frecvenŃa recoltărilor este optimă, iar berbecii sunt furajaŃi cu nutreŃuri de calitate şi întreŃinuŃi în condiŃii optime;

j) Majoritatea berbecilor nominalizaŃi pot fi utilizaŃi pentru recoltare în vederea obŃinerii de ejaculate destinate crioconservării;

k) Mobilitatea spermatozoizilor post-congelare se reduce drastic, dependent de berbec şi mai puŃin în funcŃie de ecotip;

l) Aplicarea testului de analiză privind termorezistenŃa spermatozoizilor decongelaŃi oferă posibilitatea aprecierii cu mai mare precizie a calităŃii acestora comparativ determinării mobilităŃii imediat după decongelare;

m) Valorile HOST pozitive scăzute demonstrează că integritatea funcŃională a membranei spermatozoizilor a avut de suferit în urma procesului de congelare-decongelare;

n) Anomaliile morfologice sunt reprezentate preponderent de acrozom în diferite stadii de detaşate, ceea ce demonstrează că aprecierea calităŃii spermei numai prin mobilitatea acesteia nu redă cu fidelitate măsura capacităŃii fecundante a spermatozoizilor crioconservaŃi;

o) Există posibilitate evitării risipei de gene valoroase din banca de spermă prin utilizarea spermatozoizilor cu acrozom detaşat pentru obŃinerea embrionilor prin metoda de fecundaŃie asistată ICSI (intracytoplasmatic sperm injection);

p) Modelul de evaluare elaborat de colectivul de cercetare a proiectului dă posibilitatea aprecierii cu fidelitate a calităŃii spermei crioconservate fiind totodată economică (materiale consumabile şi echipamente accesibile);

q) Există o mare variabilitate individuală a berbecilor privind pretabilitatea spermei la congelare;

r) Între cele două ecotipuri ale rasei łigaie nu există diferenŃe importante privind calitate a spermei crioconservată.

Anexa 1 Fişă de analiză a anomalii morfologice a spermatozoizilor de berbec

(model elaborat de consorŃiul POTGENOCRIO)

Evaluare morfologică

Nr. matricol Data Proprietar Evaluator

Anomalii acrozom Procent: Umflat Acrozom în detaşare Acrozom detaşat Deformat Granulă acr. persistentă

Anomalii cap Procent: Deformat Conic Îngust Microcefalic Macrocefalic

Anomalii gât Procent: Gât rupt Coadă paraxială Coadă retroaxială Picătură citoplasmatică

Anomalii piesă intermediară Procent: Picătură citoplasmatică

Anomalii piesă principală Procent: Încolacită Supraîncolacită Supraîncolacită în jurul capului

Rudimentară Picătură citoplasmatică

Anomalii duble şi multiple Procent: Cap dublu cu o coadă Cap cu coadă dublă

Total Total:

Bibliografie

1. Abu-Erreis G., L. Magnes, T.K. Li, 1978, Isolation and properties of superoxide dismutase from ram spermatozoa and erythrocytes, Biol. Reprod. 18 : 554–560

2. Aisen E., M. Quintana , V. Medina , H. Morello , A. Venturino, 2005, Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders, Cryobiology 50: 239–249.

3. Aitken R.J. and M.A. Baker, 2004, Oxidative stress and male reproductive biology, Reprod Fertil Dev 16 pp. 581–588.

4. Alvarez J.G., J.C. Touchstone, L. Blasco, B.T. Storey, 1987, Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protectant against toxicity. J Androl, 8:338–48.

5. Alvarez J.G., B.T. Storey, 1989, Role of glutathione peroxidase protecting mammalian spermatozoa from loss of motility caused by spontaneous lipid peroxidation. Gamete Res, 23:77–90.

6. Alvarez J.G., B.T. Storey, 1983, Taurine, hypotaurine, epinephrine and albumin inhibit lipid peroxidation in rabbit spermatozoa and protect against loss of motility. Biol Reprod, 29:548–55

7. Anel L., M. Alvarez, F. Martinez-Pastor, V. Garcia-Macias, E. Anel, P. de Paz, 2006, Improvement Strategies in Ovine Artificial Insemination, Reprod Dom Anim 41 (Suppl. 2), 30–42

8. Aurich J.E. , U. Schönherr, H. Hoppe, C. Aurich, 1997, Effect of antioxidants on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen, Theriogenology 48 : 185–192.

9. Barrios B., M. Fernandez-Juan, T. Muino-Blanco, J.A. Cebrian-Perez, 2005, Immunocytochemical localization and biochemical characterization of two seminal plasma proteins that protect ram spermatozoa against cold shock. J Androl, 26 : 539–549.

10. Baumber J., B.A. Ball, C.G. Gravance, V. Medina, M.C.G. Davis-Morel, 2000, The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential, and membrane lipid peroxidation. J. Androl. 21: 895–901.

11. Beconi M., C. Francia, N. Mora, M. A. Vrachino, 1993, Effect of natural antioxidants on frozen bovine semen preservation, Theriogenology, 40: 841–851.

12. Beconi M.T., M.A. Affranchino, L.M. Schang, N.B. Beorlegui, 1991, Influence of antioxidants on SOD activity in bovine sperm. Biochem Int, 23: 545–553.

13. Bell M., R. Wang, W.J.G. Hellstrom, S.C. Sikka, 1993, Effect of cryoprotective additives and cryopreservation protocol on sperm membrane lipid peroxidation and recovery of motile human sperm. J. Androl., 14: 472-478.

14. Berlinguer F., G.G. Leoni, S. Succu, F. Mossa, M. Galioto, M. Madeddu, S. Naitana, 2007, Cryopreservation of European Mouflon (Ovis Gmelini Musimon) Semen During the non-Breeding Season is Enhanced by the Use of Trehalose, Reprod Dom Anim, 42: 202–207

15. Bilodeau J.F., S. Blanchette, C. Gagnon, M.A. Sirard, 2001, Thiols prevent H2O2-mediated loss of sperm motility in cryopreserved bull semen. Theriogenology, 56:275–86.

16. Bucak M.N., N. Tekin, 2007, Protective effect of taurine, glutathione and trehalose on the liquid storage of ram semen, Small Ruminant Research.

17. Bucak M.N., A. Ateşşahin, O. Varışlı, A. Yüce, N. Tekin, A. Akçay, 2007, The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen; Microscopic and oxidative stress parameters after freeze–thawing process Theriogenology, 67: 1060–1067.

18. Buetter G.R., 1992, The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys., 300: 349-351.

19. Christova Y., P.S. James, R. Jones, 2004, Lipid diffusion in sperm plasma membranes exposed to peroxidative injury from oxygen free radicals. Mol Reprod Dev, 68: 365–372.

20. De Lamirande E., C. Gagnon, 1992, Reactive oxygen species and human spermatozoa. I. Effects on the motility of intact spermatozoa and on sperm axonemes. J. Androl., 13: 368–378.

21. De Lamirande E., H. Jiang, A. Zini, H. Kodama, C. Gagnon, 1997, Reactive oxygen species and sperm physiology, Rev. Reprod. 2: 48–54.

22. Del-Maestro R.F., 1980, An approach to free radicals in medicine and biology. Acta Physiol Scan, 492: 153–68.

23. De Matos D.G., B. Gasparrini, S.R. Pasqualini, J.G. Thompson, 2002, Effect of glutathione synthesis stimulation during in vitro maturation of ovine oocytes on embryo development and intracellular peroxide content. Theriogenology, 57:1443–51

24. Evans G., W.M.C. Maxwell, 1990, Inseminación ArtiWcial De Ovejas Y Cabras, Editorial Acribia S.A, Zaragoza.

25. Fernandez Abella D., M.O. Preve, N. Villegas , 2003, Insemination time and dilution rate of cooled and chilled ram semen affects fertility, Theriogenology, 60: 21-26

26. Fiser P.S., L. Ainsworth, G.A. Langford, 1981, Effects of osmolarity of skim milk diluents and thawing rate on cryopreservation of ram spermatozoa. Cryobiology., 18: 399-403.

27. Fiser, P.S., Fairfull, R.W.(1989).The effect of glycerol-related osmotic changes on post-thaw motility and acrosomal integrity of ram spermatozoa. Cryobiology, 26: 64-69.

28. Foote R.H., 2002, The history of artificial insemination: Selected notes and notables1, Department of Animal Science, Cornell University, Ithaca, NY 14853-4801

29. Fraga C.D., P.A. Motchnik, M.K. Shinegana, H.J. Helbock, R.A. Jacob, B.N. Ames, 1991, Ascorbic acid protects against oxidative DNA damage in human sperm. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 11003-11006.

30. Gadea J., E. Selles, M.A. Marco, P. Coy, C. Matas, R. Romar, et al., 2004, Decrease in glutathione content in boar sperm after cryopreservation. Effect of the addition of reduced glutathione to the freezing and thawing extenders. Theriogenology, 62: 690–701

31. Ghosh I., K. Datta, 2003, Sperm surface hyaluronan binding protein (HABP1) interacts with zona pellucida of water buffalo (Bubalus bubalis) through its clustered mannose residues. Mol Reprod Dev, 64:235–244.

32. Griveau J.F., E. Dumont, P. Renard, J.P. Callegari, D. Le Lannou, 1995, Reactive oxygen species, lipit peroxidation and enzymatic defence systems in human spermatozoa, J Reprod Fertil, 103: 17–26.

33. Harrison R.A.P., H.M. Dott, G.C. Foster, 1982, Bovine serum albumin, sperm motility, and the ‘‘dilution effect’’. J Exp Zool, 222:81–88.

34. Hernandez Marta, J. Roca, J. Ballester, J. M. Vaszquez, E. A. Martynez, A. Johannisson, F. Saravia, H. R. Martynez, 2006, Differences in SCSA outcome among boars with different sperm freezability, International Journal of Andrology 29: 583–591.

35. Holt W.V., R.D. North, 1991, Cryopreservation, actin localization and thermotropic phase transitions in ram spermatozoa, J. Reprod. Fert. 91: 451–461.

36. Januskauskas A., H. Rodriguez-Martinez, 1995, Assessment of sperm viability by measurement of ATP, membrane integrity and motility in frozen/thawed bull semen. Acta Vet Scand;36:571–4. C.

37. Jeulin C., J.C. Soufir, P. Weber, D. Laval-Martin, R. Calvayrac, 1989, Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma, Gamet. Res. 24:185–196.

38. Jones R., T. Mann, R.J. Shreins, 1979, Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa: spermicidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma. Fertil Steril, 31:531–537.

39. Jones R., T. Mann, 1977, Damage to ram spermatozoa by peroxidation of endogenous phospholipids.J Reprod Fertil , 50:261-268.

40. Kantola M., M. Saaranen, T. Vanha-Perttula, 1988, Selenium and glutathione peroxidase in seminal plasma of men and bulls, J. Reprod. Fertil. 83: 785–794.

41. Kasimanickam R., V. Kasimanickam, K.D. Pelzer, J.J. Dascanio, 2006, Effect of breed and sperm concentration on the changes in structural, functional and motility parameters of ram-lamb spermatozoa during storage at 4◦C, Animal Reproduction Science, ANIREP-3174.

42. Lewis S.E.M., E.S.L. Sterling, L.S. Young, 1997, Comparison of individual antioxidants of semen and seminal plasma in fertile and infertile men. Fertil. Steril., 67: 142-147.

43. Lindemann C.B., J.A. O’Brein, F.J. Giblin, 1988, An investigation of the effectiveness of certain antioxidants in preserving the motility of reactivated bull sperm models. Biol Reprod, 38:114–120

44. Lunca N., M. Paraschivescu, Oltea Seserman, V. OŃel, I. Dumitrescu, 1960, Extinderea însămânŃărilor artificiale la oi prin folosirea spermei diluate şi conservate, Probl. zoot. Vet., 9, 3.

45. Mann T., C. Lutwak-Mann, 1981, Male reproductive function and semen. New York: Springer

46. Maxwell W.M.C., P.F. Watson, 1996, Recent progress in the preservation of ram semen. Anim. Reprod. Sci., 42: 55-65.

47. Maxwell W.M.C., T. Stojanov, 1996, Liquid storage of ram semen in absence or presence of some antioxidants, Reprod. Fertil. Dev., 8: 1013-1020.

48. Maxwell W.M.C., S. Salamon, 1993, Liquid storage of ram semen. Reprod. Fertil. Dev., 5: 613-638

49. Maxwell W.M.C., R.L. Nebel, G.S. Lewis, 1996, Survival and fertility of microencapsulated ram spermatozoa stored at 5°C. Re prod Domest Anim 31, 665–673.

50. Medeiros C.M.O., F. Forell, A.T.D. Oliveira, J.L. Rodrigues, 2002, Current status of sperm cryopreservation: Why isn’t better? ; Theriogenology; 57:327-344.

51. Miclea V., 2003, ÎnsămânŃarea artificială la animale de fermă. Ed. Argonaut, Cluj-Napoca.

52. Miclea V., I. Ladoşi, 1997, Biologia reproducŃiei animalelor de fermă. Ed. Baha’I, Cluj-Napoca.

53. Miclea V., M. Zăhan, 2005, Biologia reproducŃiei şi însămânŃări artificiale, Lucr. Practice, USAMV Cluj

54. Molinia F.C., G. Evans, W.M.C. Maxwell, 1994, Effect of polyols on the post-thaw motility of pellet-frozen ram spermatozoa. Theriogenology., 42: 15-23.

55. Michiels C., M. Raes, O. Toussant, J. Remacle, 1994, Importance of Se glutathione peroxidase, catalase and Cu/Zn–SOD for cell survival against oxidative stress, Free Radic. Biol. Med., 17: 235–248.

56. Obregon-Bustos E., E. Flechon, 1975, Comparative Scaning Electron Microscope Study of Boor, Bull and Ram speratozoa.Cell.Tire.Res., vol.161, p.519.

57. Paraschivescu M., 1969, ReproducŃia la ovine, Ed. Agrosilvică, Bucureşti. 58. Rodriguez-Martinez H., 2003, Laboratory semen assessment and

prediction of fertility: still utopia? Reprod Domest Anim, 38:312–318. 59. Rodriguez-Martinez H., B. Larssom, H. Pertoft, 1997, Evaluation of sperm

damage and techniques for sperm clean-up. Reprod Fertil Dev, 9:297–308.

60. Salamon S., W.M.C. Maxwell, 2000, Storage of ram semen. Anim Reprod. Sci., 62: 77-111

61. Saacke R.G., 1982, Components of semen quality, J. Anim. Sci. 55 (Suppl. II) 1–13.

62. Sikka S.C., 2004: Role of oxidative stress and antioxidants in andrology and assisted reproductive technology. J Androl 25: 5–18.

63. Sinha M.P., A.K. Sinha, B.K. Singh, P.L. Prasad, 1996, The effect of glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen, Theriogenology 41: 237–243.

64. Slaweta R., T. Laskowska, E. Szymanska, 1998, Lipid peroxides, spermatozoa quality and activity of glutathione peroxidase in bull semen. Acta Physiol Pol, 39:207–214.

65. Shannon P, B. Curson, 1982, Kinetics of the aromatic L-amino acid oxidase from dead bovine spermatozoa and the effect of catalase on fertility of diluted bovine semen stored at 5 8C and ambient temperatures. J Reprod Fertil, 64:463–467.

66. Sharma R.K., A. Agarwal, 1996, Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology 48: 835–850.

67. Sonmez M., E. Demirci, 2004, The Effect of Ascorbic Acid on the Freezability of Ram Semen Diluted with Extenders Containing Different Proportions of Glycerol, Turk J Vet Anim Sci, 28 : 893-899

68. Topfer-Petersen E., D. Cechova, A. Henschen, M. Steinberger, A.E. Friess, A. Zucker, 1990, Cell biology of acrosomal proteins. Andrologia, 22:110–121.

69. Upreti G.C., K. Jensen, R. Munday, J.F. Smith, 1994, Studies on ram spermatozoal aromatic amino acid oxidase. In: Proceedings of the Australian Society for Reproductive Biology, vol. 26, Brisbane, Australia. p. 115.

70. Upreti G.C., J.E. Oliver, D.M. Duganzich, R. Munday, J.F. Smith, 1995, Development of a chemically defined ram semen diluent (RSD-1). Anim Reprod Sci, 37:143-157.

71. Valcarcel A., M.A. de las Heras, L. Perez, D.F. Moses, H. Baldassarre, 1994, Fluorescent staining as a method of assessing membrane damage and post-thaw survival of ram spermatozoa. Theriogenology, 41:483–489.

72. Vazquez I.A., E.F. Graham, F. Martinez, M. Alcaide, I. Soriano, 1988, Fertility with frozen ram semen in Manchego sheep. In: Proceedings of the Eleventh International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, Dublin, Ireland

73. Wierzbowski S., W. Kareta, 1993, An assessment of sperm motility estimation for evaluation in rams. Theriogenology, 40:205–209.

74. White J.G., 1958, Biochemical aspects of mammalian semen, Anim. Breed. Abstr., 26, 109.

75. White I.G., 1993, Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review, Reprod. Fertil. Dev. 5: 639–658.