rst – raport științific și tehnic în extenso identităților

1

RST – Raport științific și tehnic în extenso

Titlul proiectului: Platformă pluridisciplinară complexă de cercetare integrativă și sistemică a

identităților și patrimoniului cultural tangibil și non-tangibil din România

SubProiect 3 - Noi tehnologii pentru prezervarea, conservarea și recuperarea și restaurarea

patrimoniului cultural”

Acronim: PATCULT

Numar contract: 52 PCCDI/2018 (PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0686)

Denumire etapa II:

Perioada raportată: 01-31 dec. 2019

Cuprins Pagină

1. Obiective / Activități etapa 2019 1

2. Rezumatul etapei II 1

3. Descrierea științifică și tehnică, evidențierea rezultatelor obtinute

Activitatea 2.13 - Evaluarea gradului de deteriorare a stării fizice şi degradare a

naturii chimice a obiectelor de patrimoniu în funcție de criterii prestabilite

Activitatea 2.15. Evaluarea stării de conservare/degradare a obiectelor de

patrimoniu prin metode și tehnici instrumentale (MO, SEM-EDX, micro-FTIR

etc)

Activitatea 2.17. Investigarea compoziției biofilmelor microbiene prin metode

independente de cultivare bazate pe PCR

Activitatea 2.18. Analiza biofilmelor microbiene prin metode dependente de

cultivare

Activitatea 2.19. Evaluarea cantitativă a contaminării microbiene prin tehnici

dependente de cultivare

Activitatea 2.20. Identificarea strategiilor de rezistență a organismelor

Activitatea 2.21. Investigarea influenței condițiilor de mediu asupra abundenței

și compoziției biofilmelor microbiene asociate materialelor.

Activitatea 2.22. Activități de documentare și diseminarea rezultatelor proiectului

2

5. Bibliografie

2.Rezumatul etapei II

Commented [I1]: geografie cred??

2

În cadrul acestei etape s-a realizat evaluarea gradului de deteriorare a monumentelor şi obiectelor

de patrimoniu prin analiza parametrilor fizico-chimici și microbiologici. Analiza micro-FTIR, prin benzile

caracteristice grupărilor funcționale, coroborată cu rezultatele EDX au contribuit la identificarea

compușilor formați în urma degradării obiectelor de patrimoniu investigate, în timp ce studiile de

microscopie optică (MO) și electronică (SEM) au permis localizarea şi identificarea preliminară a

factorilor biodegradatori.

Au fost recoltate 314 probe de la 15 biserici de patrimoniu din piatră şi lemn, dar şi de pe

numeroase obiecte de muzeu din cadrul Muzeului Ţăranului Român şi Muzeului de Istorie şi Arheologie

din Tulcea. În urma acestor deplasări au fost izolate un număr de 375 tulpini fungice şi 120 de tulpini

bacteriene. Tulpinile au fost incluse în colecţia de microorganisme a Departamentului de Microbiologie

din cadrul Facultăţii de Biologie şi au fost ulterior caracterizate în vederea stabilirii potenţialului de

deteriorare prin aplicarea unor tehnici multiple care au vizat producerea de enzime cunoscute ca fiind

implicate în procesele de biodegradare dar şi prin punerea în evidenţă a unor strategii de rezistență ale

microorganismelor (biofilm, capsulă, spori). Cu ajutorul tehnicilor moleculare s-a realizat identificarea

moleculară a fungilor implicaţi în procesele de biodeteriorare şi stabilirea variabilităţii genetice a tulpinilor

de Bacillus megaterium isolate de pe obiectele de patrimoniu din cadrul celor două muzee luate în studiu.

Rezultatele obţinute în cadrul acestei etape au permis publicarea a 2 brevete de inventie, 3 articole

ISI, 2 postere la conferinţe internaţionale; 1 poster la o conferinţă naţională; 1 prezentare la o sesiunea

ştiinţifică, 5 prezentări la workshop; 2 lucrări de licenţă şi 2 lucrări de dizertaţie.

Pentru această etapă s-au realizat toate activitățile de documentare, experimentale și

administrative prevăzute, necesare pentru întocmirea raportului științific și financiar.

3.Descrierea științifică și tehnică, evidențierea rezultatelor obținute

Biodeteriorarea este un fenomen inevitabil în societatea umană, aceasta fiind des definită ca o

schimbare indezirabilă ce afectează proprietățile materialelor (obiectele din metal, tablouri, hartie, lemn,

piele, pergament, piatră etc.), cauzată de cele mai multe ori de activitatea microorganismelor, insectelor,

lichenilor etc. ( Koul și Upadhyay, 2018).

Dintre microorganisme, fungii sunt principalii agenți biologici care cauzează biodeteriorarea

obiectelor casnice, arhivelor, colecțiilor din muzee, cărților, materialelor din lemn, textilelor, tablourilor

și a altor obiecte cu importanță istorică de neînlocuit. În timp ce unele specii de fungi produc doar simple

pete pe lemn, altele pot distruge complet materialul de baza din care este confectionat obiectul fie ca este

3

vorba de lenm, piatra, tesaturi (Koul și Upadhyay, 2018). Comunitățile mixte de bacterii şi fungi prezintă

o capacitate mult mai mare de deteriorare a diferitelor materiale comparativ cu cazurile de contaminare

monospecifică, în condiții nefarobabile, ca de exemplu la concentrații scăzute de oxygen, caz în care

majoritatea fungilor nu se dezvoltă, principalii agenţi degradatori fiind bacteriile (Kim și Singh

A.P, 2000).

Procesele de biodeteriorare ale monumentelor pot fi abordate din punct de vedere biofizic,

biochimic și estetic. În funcție de tipul de material, microorganisme și condițiile de mediu, aceste procese

ar putea debuta separat sau simultan, rezultatul fiind o deteriorare nu numai a aspectului, dar și a

performanței și funcționalității (Cwalina, 2014).

În funcție de modalitatea în care microorganismele acționează asupra diferitelor substraturi acestea

se împart în trei categorii: prima este acțiunea mecanică, care de cele mai multe ori acționează asupra

substraturilor stratificate (icoane), poroase sau fibroase, acestea fiind pătrunse de hifele ciupercilor care,

la nivel atomic, aduc modificări structurale ce cauzează creșterea umidității. O altă acțiune este cea

chimică, care în cazul fungilor nu cauzează întotdeauna modificări fizice, însă apar alterări cromatice și

de aspect datorită prezenței pigmenților ce pătrund în structura materialelor. O ultimă categorie este cea

biochimică, în cadrul căreia, pentru a-și obține carbonul necesar metabolismului, fungii acționează

enzimatic pentru a scinda diverse materiale (Șesan și Tănase, 2006).

Pentru stabilirea stării de conservare a bunurilor de patrimoniu se evaluează gradul de deteriorare

și degradare a acestora în funcție de natura materialelor.

Procesele de deteriorare se raportează la nivel de element structural sau funcţional şi în marea lor

majoritate apar ca efecte singulare (cauzate de o singură acţiune) a agenţilor sau factorilor fizico-mecanici

şi climatici, care schimbă starea fizică a elementului component, rezultând, de exemplu: fisurarea sau

fracturarea şasiului şi a panoului picturi, craclarea, alveolarea sau desprinderea stratului pictural şi a

mozaicurilor, detaşarea finisajelor, crăpare sau fisurarea ramei, craclarea straturilor de preparaţie, a

stratului policrom şi a vernisului picturilor etc. (Blanchette, 2000)

În schimb, procesele de degradare au la bază interacţii la nivel microstructural, prin care un anumit

material se transformă, schimbându-şi natura şi compoziţia chimică. Acesta este privit de obicei ca un

efect cumulativ, cauzat de acţiunea simultană sau consecutivă a mai multor factori. Deci, degradarea se

va raporta la nivel de material, deoarece schimbă natura chimică a acestuia sub acţiunea factorilor fizico-

chimici (inclusiv cei radiativi şi termici), biologici şi antropici, coasistaţi sau nu de factorii climatici.

4

Alterarea structurii materialelor se realizează prin mecanisme specifice, ca de exemplu: carbonizarea sau

putrezirea lemnului, decolorarea peliculelor policrome, coroziunea metalelor etc. (Blanchette, 1991)

Avem exemple de degradări şi deteriorări specifice, ca efecte datorate fie anumitor acţiuni

(cutremure, iradieri, vibraţii, inundaţii, avalanşe, foc, vânt/furtună, curenţi turbionari etc.), cum ar fi:

efectul aerofoil, efectul de ancrasare sau monolitizare, efectul de eroziune şi de fragilizare etc., pe care le

întâlnim la statui, ancadramente ornamentale, frontispicii, finisaje etc., fie specifice anumitor materiale,

cum ar fi: putrezirea lemnului, craclarea picturilor de şevalet.

Activităţile de cercetare desfăşurate în instituţii publice deţinătoare de bunuri care fac parte din

patrimoniul cultural naţional au ca obiect investigarea ştiinţifică prin expertize şi analize specifice,

tezaurizarea şi valorificarea a patrimoniului cultural naţional, în principal a celui deţinut de instituţia

respectivă.

Studiul actual se concentrează asupra microorganismelor izolate de pe diferite materiale de

construcție din cadrul unor clădiri de patrimoniu din România dar şi de pe obiecte muzeale cu scopul de

a identifica speciile asociate proceselor de biodegradare, precum și de a înţelege modul prin care acestea

acţionează şi se adaptează la diferite condiţii de mediu.

5

MATERIALE ȘI METODE

Evaluarea gradului de deteriorare a stării fizice şi degradare a naturii chimice a obiectelor de

patrimoniu în funcție de criterii prestabilite

Prima etapă în tezaurizarea şi valorificarea unui bun de patrimoniu o reprezintă clasarea şi indexarea

acestuia în diferite grupe sau nivele de clasificare. Prin clasare se înţelege procedura de stabilire a

bunurilor culturale care fac parte din categoriile juridice ale patrimoniului cultural naţional mobil, fond

sau tezaur şi evaluarea prin grile sau cifre de impact a cotei de catalog sau de bursă.

Clasificarea are în atenţie nivelele de conservare, funcţiile actuale sau cele dobândite în decursul

vremii, tipologii structural, cazuistici şi altele.

În acest sens, bunurile culturale pot fi clasate în următoarele grupe de conservare:

• Nivelul I. Acesta cuprinde bunuri cu valoare patrimonială deosebită, care prezintă fie o stare de

conservare precară sau care la scoaterea din situri cu acţiuni pedologice dure necesită intervenţii

suplimentare de prezervare curativă (păstrarea în medii similare sau în soluţii adecvate de consolidanţi şi

conservanţi) pentru a nu trece în stări de colaps ireversibil, fie reprezintă un unicat sau nu permite etalarea

din anumite considerente istorice (politice), ideologice, religioase etc. Nivelul cuprinde două subgrupe:

IA sau nivelul închis, la care au acces numai conservatorii (opere ce necesită intervenţii urgente de

conservare activă şi restaurare), şi IB sau nivelul deschis, la care au acces, alături de conservatori, experţii

în artă, istoricii sau documentariştii, cu aviz special.

• Nivelul II. Acest nivel cuprinde bunuri de patrimoniu cu valoare deosebită, dar cu o stare de

conservare relativ bună, la care au acces, alături de conservatori, diverşi specialişti pentru documentare.

Bunurile pot participa în circuitul muzeistic prin replici ştiinţifice sau sub o protecţie specială şi după o

prealabilă consolidare preventivă sau profilactică (după caz) şi o prezervare curativă.

• Nivelul III. Acest nivel cuprinde bunuri de patrimoniu bine conservate, ce pot fi etalate în muzee

şi care pot participa la expoziţii itinerante. Bunurile pot fi uşor manipulate, ambalate şi transportate, mai

mult, la ele pot avea acces direct vizitatorii (figurile 44, 45 şi 46).

• Nivelul IV. Acesta se referă la bunuri de patrimoniu existente în mai multe variante sau replici,

sub forma unui stoc excedentar, care poate participa la schimbul de valori între colecţii.

• Nivelul V. Acesta reprezintă fondul gri sau cenuşiu, care cuprinde bunurile de patrimoniu cu

deteriorări şi degradări ireversibile, aflate în colaps, cu o stare de conservare cuprinsă între 5 şi 10% (în

funcţie de tipul bunului), din care cauză nu mai pot fi expuse/etalate. Aceste bunuri sunt păstrate, în

vederea folosirii ca material didactic şi în experimentări. Este indicat să fie ţinute în depozite speciale, în

6

condiţii de climatizare, pentru a nu fi deteriorate sau degradate în continuare. În nici într-un caz nu vor fi

distruse sau eliminate.

Aceste nivele de conservare nu au fost gândite pentru a fi strict delimitate. Ele având aplicabilitate

îndeosebi pentru bunuri de patrimoniu mobil, obţinute în serie. De altfel, nu este posibil de a preciza în

mod expres locul unui obiect în aceste nivele fără a lua în considerare posibilitatea modificărilor de

semnificaţie sau chiar modificările politicii de conservare.

Atribuirea nivelelor de conservare pe categorii de obiecte este o misiune delicată, care trebuie

realizată de către specialişti cu experienţă în domeniul stabilirii stării de conservare şi a cotei valorice (de

catalog).

Evaluarea stării de conservare/degradare a obiectelor de patrimoniu prin metode și tehnici

intrumentale (MO, SEM-EDX, micro-FTIR)

Investigarea unei obiect de patrimoniu reprezintă un demers complex, care cuprinde o serie de

expertize specifice fiecărui element structural, depăşind cu mult o analiză simplă de material. Scopul

acesteia constă în interpretarea rolului şi funcţiei fiecărui strat component al obiectului, de multe ori

îngreunată de diversitatea cazuisticilor stării de conservare, de caracteristicile probelor, de performanţa

tehnicilor de analiză şi de condiţiile de studiu.

Teoretic ar trebui să se selecteze, în momentul prelevării probei, doar stratul sau zona care urmează

a fi analizată. Practic însă, la prelevarea probelor există riscul contaminării în mică sau în mare măsură,

cu materiale din straturile adiacente sau subiacente. Cel mai adesea, tehnicile implicate furnizează

informaţii despre structurile superficiale, vizibile (analiza vizuală, cu aparate de mărit, microscopia optică

şi electronică - SEM, AFM etc.), mergând de multe ori spre structurile profunde (implicând tehnici prin

transmisie sau penetrare, cum ar fi: radiografia, endoscopia, difracţia de raze X etc.).

În majoritatea cazurilor la investigarea obiectelor de patrimoniu vechi, mai ales a celor foarte

valoroase, cu stare de conservare precară, se realizează un protocol experimental, care are în vedere o

anumită metodologie de lucru. Într-o primă etapă, se realizează o analiză preliminară privind starea de

conservare, în vederea stabilirii unor priorităţi legate de consolidările profilactice, de modul de acţiune şi

de climatizare (păstrarea în laborator). După care, se efectuează analizele de fond, privind natura chimică

şi structura fizică a materialelor, cu precizarea cauzelor şi mecanismelor de degradare/deteriorare.

Un aspect foarte important, de care se ţine cont în demersul unei investigări ştiinţifice, îl reprezintă

cantitatea de probă ce urmează a fi prelevată şi care, în general, trebuie să fie cât mai redusă (micro-probe),

7

pentru ca metoda de analiză să fie ne-invazivă. Tehnicile moderne au precizii şi sensibilităţi ridicate, lucru

care permite operarea pe cantităţi minime de probă. Problema care se ridică este modul de prelevare şi

prelucrare a unei micro-probe, în vederea obţinerii prin analiză de maximum de date experimentale

(maximum de informaţii). Spre exemplu, o tempera cu un liant constituit din ou şi ulei în amestec, în

proporţie de 10% ulei reprezintă o tempera grasă. O probă de pictură ce cântăreşte 600 µg (cca. 0,5 mm

diametru), fiind formată din pigmenţi şi liant, va permite pentru analiza liantului doar 200 µg. Însă această

cantitate conţine doar 20 µg (corespunzător procentului de 10%) de ulei, deci o cantitate care se aproprie

de minimul ce poate fi determinată numai cu tehnici de analiză avansate. Prelevarea cantităţilor mici de

probă face dificilă identificarea componenţilor secundari, care se pot dovedi importanţi în caracterizarea

unei tehnici picturale în raport cu alta sau în autentificare.

Investigarea stratului pictural include o serie de tehnici moderne para-destructive, care fac uz de:

metode spectrale şi radiative (UV, Vis, IR, XR etc.), metode chimice de separare şi identificare a

componenţilor unui amestec, reacţii de colorare (histochimice) specifice pentru anumiţi componenţi şi

altele.

O serie de analize instrumentale, cum ar fi: gaz-cromatografia, microFT-IR şi spectrometria de

masă furnizează date importante în ceea ce priveşte identificarea şi caracterizarea chimică şi fizică a

constituenţilor organici din structura picturilor, analizele stratigrafice la microscopul optic şi analizele

microchimice pe secţiuni (sau „staining tests”) contribuie la stabilirea locului şi rolului precis a diverselor

substanţe organice prezente în straturile picturii. De obicei, se pleacă de la analiza stratigrafică a structurii

şi de la „staining tests” efectuate pe secţiuni, care împreună permit obţinerea unor informaţii preliminare

asupra prezenţei anumitor materiale, respectiv identificarea clasei de apartenenţă şi localizarea lor

stratigrafică. Aceste date permit prelevarea precisă a unor micro-probe pentru analize instrumentale

specifice, cum ar fi: gaz-cromatografia cuplată cu spectrometria de masă (PY-GC/MS), spectroscopia IR

cu transformată Fourier (FT-IR), cuplată cu microscopia şi colorimetria prin reflexie. Acestea oferă mai

curând o confirmare a identităţii compoziţiei a liantului anterior localizat. Astfel, de exemplu, o analiză

cu ajutorul tehnicilor de tipul PY-GC/MS şi FT-IR pentru un liant din preparaţia unei picturi vechi va

permite o caracterizare a naturii şi compoziţiei chimice, stabilind cu precizie dacă este un liant lipidic,

proteic sau mixt.

Avantajul cel mai important şi de mare utilitate practică constă în faptul că plecând de la o

prelevare selectivă, analizele de mai sus, furnizează informaţii care se pot coasista din punct de vedere

experimental pentru o riguroasă caracterizare chimică şi fizico-structurală. În cazul unei picturi, cu o

8

determinată succesiune a straturilor, stratigrafia poate indica zona (cu caracteristicile sale specifice,

observate la microscopul optic) în care se găseşte materialul ce se analizează prin spectrofotometrie FT-

IR şi PY-GC/MS în vederea identificării naturii sale chimice. De exemplu, un clei animal, identificat gaz-

cromatografic cu ajutorul „markerilor” specifici se poate găsi în preparaţie, dar şi în stratul pictural ca

liant, cât şi ca strat intermediar (de exemplu, stratul de clei pentru a marufla o pânză pe un suport rigid).

Evident, determinarea poziţiei precise în ansamblul straturilor constituie o informaţie deosebit de

importantă şi ca atare aceasta va constitui o etapă necesară în demersul analizei.

Probele selectate pentru realizarea activității din proiect au fost analizate prin microscopie optică

(OM) și electronica (SEM) pentru a stabili morfologia și dispunerea produșilor de degradre.

Analiza EDX, fiind de tip elementar, a permis identificarea calitativă/cantitativă a elementelor

chimice, în particular realizarea unor mape de distribuţie a elementelor pe zone mai largi. Astfel, de

exemplu, ghipsul (sulfat de calciu dihidrat) poate fi identificat prin co-prezenţa sulfului şi a calciului, albul

de plumb (carbonat bazic de plumb) doar prin prezenţa plumbului (cărbunele şi oxigenul fiind dificil de

mapat). Pe de altă parte miniul (tetraoxid de plumb) este identificat doar prin prezenţa plumbului. Pot

exista deci dificultăţi de interpretare, dacă nu se dispune de alte informaţii provenite de la microscopul

optic, şi în particular culoarea, care pentru pigmenţi este un parametru de identificare important (albul

ceruzei faţă de portocaliul-roş al miniului).

Analiza micro-FTIR, prin benzile caracteristice grupărilor funcționale, coroborată cu rezultatele

EDX au contribuit la identificarea compușilor formați în urma degradării obiectelor de patrimoniu

investigate.

Investigarea compoziției biofilmelor microbiene prin metode independente de cultivare bazate

pe PCR

Secventierea regiunilor intergenice ITS la tulpinile de fungi

Diversitatea genetică a speciilor de fungi atât microscopici, cât şi celor macroscopici a fost studiată

atăt pe baza metodelor clasice conventionale cât şi pe baza amplificarii prin metoda PCR a regiunii

Internal Transcribed Spacer (ITS), regiune înalt conservată a ADNr. ADN a fost extras prin metoda clasică

fenol/cloroform si ulterior a fost amplificat utilizând urmatoarea pereche de primeri:

ITS-1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)

ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)

9

În reacţia de amplificare au fost introduse 20ng ADN şi 0.5µM din fiecare primer. Programul de

amplificare a inclus: denaturare iniţială 95°C for 5 min şi 35 de cicluri care au inclus (95°C, 1 min.; 55°C,

60 sec.; 72°C,8 min).

Ampliconii obţinuţi în urma reacţiei PCR au fost verificaţi în gel de agaroza de 1.5% şi ulterior

secventiati utilizând secvenţiatorul ABI 3730xl DNA - Applied Biosystems la Institutul de Genomică din

Beijing (Beijing, China). Secvențele de baze azotate obținute au fost analizate utilizând programul

ChromasLite 2.1.1 (http://www.technelysium.com.au) şi au fost comparate cu secvențele existente în baza

de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), pentru identificarea

la nivel de specie.

Variabilitatea genetica a tulpininilor de bacterii

Tehnica rep-PCR permite amplificarea secvenţelor repetitive de la nivelul ADN-lui cromosomal.

Ampliconii obţinuţi sunt evidenţiaţi prin electroforeză, fiecare specie şi uneori chiar tulpină prezentând

un profil unic. Pentru stabilirea gradului de înrudire dintre tulpinile nou izolate a fost aplicată tehica rep-

PCR. În reacţia de amplificare au fost utilizaţi: 10μl PCR MasterMix 2X (Promega, USA), 10ng ADN,

0.5μM primer. S-a utilizat un singur primer (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’) iar programul PCR a inclus:

denaturarea iniţială (5 min la 95oC); amplificare (40 cicluri, 1 minut la 94 oC, 1 minut 53 oC, 8 min la 65 oC); elongare finală (15 min la 65 oC). Pentru evidenţierea produşilor de amplificare s-a realizat o migrare

în gel de agaroză de 1,5%, în TBE 1X, migarea s-a realizat la o tensiune de 5V/cm timp de 2h. După

migrare gelul a fost colorat în EtBr (0.2mg/ml) 10 min şi apoi fotografiat.

Pentru stabilirea relatiilor filogenetice profilele ADN obtinute prin tehnica rep-PCR au fost

analizate cu softul PyElph, care poate detectecta automat benzile de ADN, calcula greutatea moleculară a

fiecărui fragment separat, si poate analiza gradul de omologie dintre probe pe baza distanței de migrare,

calculand astfel matricele de similaritate care sunt apoi utilizate pentru generarea arborilor filogenetici.

Analiza biofilmelor microbiene prin metode dependente de cultivare

1. Prelevare și cultivare

În perioada iunie - august 2018, au fost prelevate probe din interiorul unor biserici de lemn aflate în

patrimoniul cultural al Muzeului Țăranului Român (MȚR) din București – biserica Sfântul Ierarh Nicolae

aflată în prezent în incinta MȚR, patru biserici din județele Hunedoara și Arad (biserica Adormirea Maicii

Domnului din Lunca Moților, biserica Sfinții Trei Ierarhi din Troaș; biserica Întâmpinarea Domnului din

Groșii Noi, comuna Bârzava și biserica Intrarea Maicii Domnului în Biserică din comuna Julița) și din

10

cadrul unor biserici de piatră din județul Hunedoara (Biserica Înălțarea Domnului din Nucșoara, Biserica

Pogorârea Sfântului Duh din Ostrov, Mănăstirea Prislop, Biserica Sf. Gheorghe din Streisângeorgiu,

Biserica Sîntămărie din Orlea, Biserica „Sfântul Mare Mucenic Gheorghe” din Sânpetru, Biserica

Pogorârea Sfântului Duh din Paroș și Biserica Adormirea Maicii Domnului din Strei, Călan), dar și de pe

diferite obiecte de patrimoniu incluse în colecțiile MȚR și Muzeului de Istorie și Arheologie componentă

principală a Institutului de Cercetări Eco-Muzeale ”Gavrilă Simion” Tulcea. Probele au fost prelevate

folosind proceduri neinvazive din pronaosul, naosul și altarul bisericilor, dar și din aeromicrobiota

bisericilor și de pe diferite obiecte de patrimoniu. După inoculare pe medii de cultură specifice –Potato

Dextrose Agar (PDA), Sabouraud (Sab), Yeast Peptone Glucose (YPG) și Rose Bengal şi incubare 4-5

zile la temperatura camerei (în cazul fungilor microscopici filamentoși și levurilor) și 24h în cazul

tulpinilor bacteriene pe mediu de cultură Plate Count Agar (PCA) și LB s-a realizat un prim pasaj pentru

izolarea în cultură pură a tulpinilor de fungi precum și a tulpinilor bacteriene, apoi un al doilea pasaj.

1. Examinarea caracterelor de cultură și de colonie

Identificarea fenotipică s-a realizat pe baza examinării caracterelor macroscopice observabile la 4-5

zile de incubare la 22°C, analizând aversul coloniilor și reversul acestora și ținând cont de momentul

apariției culturii, gradul de dezvoltare, consistența culturii, pigmentaţia culturii, dimensiunea, forma

coloniilor, profilul acestora etc.

2. Tehnica colorației Albastru-Coton-Lactofenol (ACL)

După al doilea pasaj de izolare, s-a trecut la determinarea prin analiză la microscopul optic, cu

obiectiv 10 X, 20 X, 40 X. Tehnica coloraţiei ACL este cea mai utilizată metodă de observare a fungilor.

Soluția are trei componente: fenol (omoară organismele vii), acid lactic (păstrează structura fungilor),

albastru-coton (colorează chitina din peretele celular al fungilor). Pentru preparare s-a lucrat în condiții

sterile; pe o lamă microscopică sterilă și degresată s-a plasat o picătură de albastru-coton ; cu o bucată de

scotch tăiată s-a desprins miceliu din placa cu mediu de cultură, după care s-a plasat scotch-ul peste

picătura de colorant, evitând formarea bulelor de aer; s-a analizat la microscop optic cu obiectiv 10 X, 20

X, 40 X.

Evaluarea cantitativă a contaminării microbiene prin tehnici dependente de cultivare

În etapa următoare s-a determinat numărul de unități formatoare de colonii (UFC/mL) aparținând

microorganismelor (bacterii, levuri și fungi filamentoși). Determinarea numărului total microorganisme

de interes/1m probă s-a calculat conform cu ajutorul formulei: UFC/mL= număr coloniix1/diluțiex10.

3. Caracterizarea biochimică a tulpinilor prin spectrometrie MALDI-TOF

11

Spectrometria de masă MALDI-TOF este o metodă analitică versatilă utilizată pentru detectarea și

caracterizarea amestecurilor de molecule organice, în special polimeri sintetici și biopolimeri. Etapele

MALDI-TOF sunt: ionizarea moleculei sau mixului de analizat (în prezența unei matrici care facilitează

ionizarea substratului iradiat cu un laser de 337nm și trecerea probei de analizat în forma gazoasă);

separarea ionilor, detectarea ionilor. Identificarea fungilor filamentoși prin spectrometria în masă MALDI-

TOF se bazează pe o bază de date ce necesită o actualizare permanentă pentru o identificare cât mai

precisă.

4. Descrierea activităţii enzimatice de tip celulazic la speciile de fungi microscopici filamentoşi

identificaţi anterior.

Evaluarea capacităţii de a produce celulaze s-a realizat pe mediu solid agarizat ce conţine celuloză ca

substrat (Yoon şi colab., 2007; Johnsenşi Krause, 2014). Pentru determinarea calitativă a activităţii

celulazice, mediul agarizat a fost inoculat cu cultură fungică de 5-7 zile. Plăcile Petri au fost incubate timp

de 5 zile, la 26 - 28ºC. Evaluarea activităţii enzimatice a fost realizată prin observarea şi măsurarea

diametrului zonei clare formate în jurul coloniei fungice.

5. Cuantificarea producției de celulaze.

Tulpinile identificate au fost inoculate in 50 ml mediu de creștere lichid Mendel Reese și ținute în

incubator cu agitare la temperatura de 28°C, 120 rpm timp de 5 zile. Compoziția mediului Mendel Reese

folosit pentru creștere și fermentație (g/1000ml): (NH4)2SO4 1.4, KH2PO4 2, CaCl2 0.3, MgS04⋅7H20

0.3, CoCl2 2, și 1 ml urme de minerale (compoziție minerale g/L: MnSO4⋅H2O, 1.56; FeSO4⋅7H2O, 5;

ZnSO4⋅7H2O, 1.4.), la care se adaugă celuloză 1%. Pentru testarea afinității tulpinilor pentru alte surse

de carbon, celuloza din mediul de creștere se poate înlocui cu: bumbac, Avicel, celuloză amorfă, chitină,

lignină, xylan.

După acest interval, culturile cu mediul lichid au fost centrifugate 10 min la 8000rpm și

supernatantul filtrat, filtratul fiind depozitat la frigider la 12°C pentru a fi supus analizelor cantitative

ulterioare.

Pentru evaluarea cantitativă a activității enzimelor implicate în degradarea lemnului s-a folosit

metoda reactivului dinitrosalicilic. Screening-ul s-a efectuat pe substraturile hârtie de filtru (pentru

celulazele totale) și carboximetilceluloză (pentru endoglucanaze).

Metoda hârtiei de filtru (pentru analiza celulazelor totale). Reactivi folosiți: hârtie de filtru

Whatman No.1, tăiată în fâșii de 1x6cm, rulate; buffer citrat pH 4,8; diluții standard de glucoză (interval

12

0-1 mg/ml); acid dinitrosalicilic (DNS). Pentru evaluarea endoglucanazelor, hârtia de filtru a fost înlocuită

cu carboximetilceluloză (1%).

Metoda acidului dinitrosalicilic pentru cuantificarea zaharurilor reducătoare:

În tuburile pentru testare se adaugă 1ml buffer citrat 0,05M, pH 4,8 apoi câte 0,5 ml din filtratul

enzimatic și substratul pentru test (hârtie de filtru 1cmx6cm, 1ml diluție 1% CMC). Se incubează mixul

la 50 °C timp de 60min; se scot tuburile dupâ incubare și se plasează pe gheață, adaugându-se 1 ml reactiv

DNS pentru a stopa reacția. Se amestecâ bine și se transferă în baie de apă la 98°C timp de 5 min; se scot

probele și se așează pe gheață, apoi se diluează cu 10 ml de apă și se citește absorbanța soluțiilor la 540

nm. În aceași mod, pentru repere, se face titrarea blancurilor de filtrat și a standardelor de glucoză.

Calcularea unităților de activitate enzimatică

Se realizează curba standard de glucoză pentru concentrații între 0-1 mg/ml, prin citiri

spectrofotometrice la 540 nm. Folosind ecuația dreptei, se transformă valoarea absorbanței probelor în mg

de glucoză, cuantificându-se astfel concentrația enzimatică în diluția de filtrat în funcție de cantitatea

zaharurilor eliberate.

În scopul caracterizării lor, patru dintre tulpinile de Aspergillus izolate din bisericile Boz și

Târnăvița au fost supuse variațiilor următorilor parametri de funcționare: temperatură de incubare (0-70

°C), timp de incubare (0-180 min), pH-ul bufferului citrat (4-7), concentrația filtratului enzimatic (0-1

mg/ml), concentrația substratului carboximetilceluloză testat (0-10 mg/L).

Identificarea strategiilor de rezistență a organismelor – evidențierea capacității de aderență la substrat

inert

Metoda microtitrării cu cristal violet (evidențierea cantitativă a gradului de aderență la substrat inert)

Biofilmele microbiene de densitate cunoscută dezvoltate pe mediu lichid se însămânțează în mediu

Sab./PDA lichid în plăci cu 96 godeuri și se incubează pentru 2-4 zile la 22°C la întuneric. După incubare

plăcile sunt golite de cultură microbiană, spălate de trei ori cu AFS, fixate cu metanol timp de 5 minute,

colorate cu cristal violet 1%, 15 minute, spălate cu AFS și resuspendate în acid acetic glacial 33%.

Intensitatea culorii suspensiei microbiene colorate, direct proporțională cu capacitatea de aderență la

substratul inert se măsoară spectrofotometric (A490nm) (fig. 1).

13

Fig. 1. Evidențierea capacității de a coloniza substratul inert – metoda microtitrării cu cristal violet.

Coloraţia Benito-Trujillo (evidenţierea sporilor bacterieni)

Sporii constituie forme de rezistență ale microorganismelor, una dintre metodele prin care aceştia

pot fi puşi în evidenţa este coloraţia Benito Trujillo cu verde malachit.

Tulpinile microbiene au fost cultivate în mediu LB suplimentat cu 0.5M CaCl2 şi incubate la 300 C

până la 72h. S-a efectuat un frotiu din cultura microbiană care a fost acoperit ulterior cu soluţie apoasă de

verde malachit 0,5% şi lăsat să acţioneze la cald timp de 5 minute. Frotiul a fost spălat cu apă de robinet

pentru îndepărtarea urmelor de colorant din celulele vegetative. Pentru evidenţierea celulei bacteriene

vegetative, frotiul a fost colorat cu un colorant de contrast (fuxină bazică 1/10 timp de 30 de secunde).

După spălare abundenţă cu apă de robinet, frotiul a fost uscat şi examinat la microscopul optic - 100X. În

funcţie de stadiul de dezvoltare, endosporii apar coloraţi în diferite nuanţe de verde, iar celulele vegetative

în roşu.

Coloraţia capsulei cu roşu de Congo (evidenţierea capsulei bacteriene)

Capsula bacteriană este prezentat la o serie de tulpini microbiene şi constituie un alt mecanism de protecţie

faţă de condiţiile nefavorabile din mediu. Capsulă a fost pusă în evidenţă prin realizarea unui frotiu dintr-

o cultură bacteriană şi o picătură de roşu de Congo 1%. Frotiul a fost uscat la temperatura camerei şi fixat

prin mordansare cu amestec fenol: acid acetic: FeCl3: fucsină acidă timp de 2 minute. Preparatul a fost

spălat şi vizualizat la microscopul optic.

14

REZULTATE

Evaluarea stării de conservare/degradare a obiectelor de patrimoniu prin metode și tehnici

intrumentale

Obiectele din lemn antice înhumate sunt supuse biodeteriorării în mare parte datorată dinamicii

apei provenită din condens, ploi și umezeală. Prezența sau absența oxigenului sunt factori determinativi

în selectarea tipului colonizatorilor, în funcție de metabolismul preferat, oxidativ sau fermentativ.

Biodeteriorarea materialului lemnos cunoaște trei etape: degradare inițială, degradare imediat după

înhumare, transformare de lungă durată, datorată diferiților factori fizici, chimici și biologici, parțial

cunoscuți și deteriorarea în urma excavării, datorată accesului la oxigen, nutrienți și alți contaminanți.

Au fost analizate fragmente de lemn provenind de la trei situri arheologice din județul Telorman,

atribuite culturii neolitice Starcevo-Cris, 6100-6000 BC (situl Măgura) și culturii eneolitice Gumelnița-

Vitănești și Gorgan-Alexandria, 4200-4400BC.

Metodele de analiză folosite: SEM (Scanning Electron Microscopy) este folosită și pentru

determinarea compoziției mineralelor; Computer tomograf (pentru determinarea structurii interioare a

meterialului), microscopie optică (pentru determinarea gradului de mineralizare), analize de microbiologie

(precedate de expunere de UV timp de 45 minute pentru eliminarea contaminanților superficiali;

revitalizarea microorganismelor prin imersie în mediu lichid YPG; cultivarea pe mediu solid PDA)

Concluzii:

Toate fragmentele lemnoase analizate prezintă un grad ridicat de mineralizare, evidențiat la

analizele de miscroscopie optică și SEM. Corelată cu compoziția solului, compoziția în elemente a relevat

o predominanță a anumitor elemente minerale, astfel: calciu și fosfor pentru probele excavate din siturile

eneolitice Vitănești și Alexandria Gorgan; siliciu și aluminiu pentru probele excavate din situl neolitic

Măgura.

Proveniență probe de lemn:

• Probe 12, 13, 14- loc. Măgura, jud Teleorman,

cultura Starcevo-Cris, 6100-6000 BC

• Probe 1,2,3,4,5,6,- loc. Vitănești, jud

Teleorman, cultura Gumelnița, 4400-4200 BC

• Probe 7, 8, 9- sit Gorgan, loc. Alexandria, jud.

Teleorman, cultura Gumelnița, 4400-4200 BC

0

10

20

30

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 13 14

Predominanța procentuală a elementelor minerale (primele 2 predominante/probă lemn)

calciu fosfor siliciu aluminiu

15

Analizele de microscopie optică și SEM (Fig.2) a confirmat nivelul ridicat de fosilizare/ mineralizare a

bucăților de lemn excavate:

Nr. proba

Microscopie optică SEM Fragment inițial

VIT

ĂN

EȘT

I, J

UD

. TE

LE

OR

MA

N

1

Ele

men

t de

cons

truc

ție

2

Ele

men

t de

cons

truc

tie

3

Ele

men

t de

cons

truc

tie

4

Ele

men

t de

cons

truc

tie

16

5

Ele

men

t de

cons

truc

tie

6

Ele

men

t de

cons

truc

tie

GO

RG

AN

-AL

EX

AN

DR

IA

7

Ele

men

t de

cons

truc

tie

8

Ele

men

t de

cons

truc

tie

9

Ele

men

t de

cons

truc

tie

17

MĂ

GU

RA

, JU

D. T

EL

EO

RM

AN

12

Frag

men

t vas

de

lem

n

13

Frag

men

t vas

de

lem

n

14

Frag

men

t vas

de

lem

n

Fig. 2. Analizele de microscopie optică și SEM și fragmentele analizate.

În scopul determinării biodeterioratorilor fungici care au contribuit la procesul de mineralizare,

bucățile de lemn au fost imersate în mediu nutritiv pentru revigorarea sporilor, apoi mojarate, iar suspensia

a fost inoculată pe mediu de creștere. S-a descoperit astfel prezența în bucățile de lemn a sporilor

provenind de la fungi din speciile Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, care cel mai probabil au jucat un

rol la momentul începerii procesului de biodeteriorare (fie în timpul folosirii, fie după înhumarea pieselor

originale) (Fig.3). Se elimină posibilitatea contaminării în timpul manevrelor post-excavare prin

expunerea probelor la UV un interval de 45 minute.

18

Rhizopus sp. (proba 1) Aspergillus sp. (proba 2) Aspergillus sp. (proba 3) Aspergillus sp. (proba 4)

Penicillium sp. (proba 5) Rhizopus sp. (proba 6) Penicillium sp. (proba 7) Aspergillus sp. (proba 14)

Fig. 3. Aspectul microscopic al sporilor provenind de la fungi din speciile Aspergillus, Rhizopus, Penicilliu.

Analiza biofilmelor microbiene prin metode dependente de cultivare

Izolarea și identificarea speciilor de fungi microscopici filamentoși de pe obiectele de patrimoniu

cultural din lemn din București si din județele Arad și Hunedoara

Identificarea prin metode clasice (examinarea caracterelor de cultură și de colonie precum și a

celor microscopice).

Identificarea fenotipică s-a realizat pe baza examinării caracterelor macroscopice observabile la 4-

5 zile de incubare la 22°C, analizând aversul și reversul coloniilor (Fig.4-5).

20

Fig. 4. Bazele de date cu tulpinile fungice izolate

din bis. Sf. Ierarh Nicolae și colecțiile MȚR; bis.

de lemn din jud. Arad și Hunedoara; bis. de piatră

din jud. Hunedoara; colecțiile Muzeului de Istorie

și Arheologie din Tulcea.

21

BISERICA DE PIATRĂ SF. GHEORGHE DIN STREISÂNGEORGIU- SEC. XIV- HD-II-m-A-03454 120 Trichoderma

sp. Perete nord

128 Fusarium

proliferatum Mortar perete sud

130 Fusarium

oxysporum Mortar perete sud

132 Fusarium

cerealis culmorum group Mortar perete sud

BISERICA DE LEMN ADORMIREA MAICII DOMNULUI LUNCA MOȚILOR- SEC. XVII- HD-II-m-A-03360 139 Aspergillus

flavus Colț sud-vest

140 Alternaria alternata Perete vest pronaos

143 Aspergillus niger Perete sud pronaos

22

141 Aspergillus parasiticus Perete sud pronaos

152 Penicillium glabratum Poartă altar

156 Fusarium

oxysporum Altar

158 Penicillium

corylophilum Perete naos nord

162 Aspergillus

niger Perete altar

170 Penicillium

corylophilum strana

177 Trichoderma

sp Șiță invelitoare

BISERICA DE LEMN CUVIOASA PARASCHIVA DIN TARNĂVIȚA- SEC. XVII- HD-II-m-A-03463

23

182 Penicillium glabratum Perete altar sud

189 Trichoderma sp. icoane

190 Penicillium

onobense icoane

191 Fusarium

cerealis icoane

193 Penicillium glabratum Grinda curbă naos

197 1

Fusarium proliferatum Grindă curbă naos

197 2

Aspergillus nidulans

24

198 Alternaria alternata Icoană altar

199 Penicillium

corylophilum Icoană altar

200 Aspergillus flavus oryzae group Cămașă in alb

204 Penicillium corylophilum Haine pronaos

214 Penicillium

citrinum Textil altar cu clei

215 Fusarium

incarnatum Textil altar cu clei

215 Aspergillus flavus oryzae group Textil altar cu clei

25

217 Penicillium chrysogenum Perete interior nord

218 Fusarium

verticilloides Perete interior nord

219 Aspergillus flavus oryzae group Perete interior nord

227 Penicillium glabratum Perete interior sud

BISERICA DE PIATRĂ ARHANGHELUL MIHAIL- GURASADA- SEC XIII- HD-II-m-A-03323

243 Fusarium proliferatum Perete intrior sud

253 Fusarium proliferatum Perete interior sud

259 Aspergillus flavus Perete altar

26

266 Fusarium proliferatum Perete altar

BISERICA DE LEMN SF. GHEORGHE BOZ- SEC XVIII- HD-II-m-B-03261 B2 3

Aspergillus iizukae Stalpi pronaos

B 5 1

Aspergillus tritici Altar stanga

B 5 5

Fusarium cerealis culmorum group Altar stanga

B 6 2

Aspergillus niger Altar interior

B 62 B

Aspergillus nidulans Altar interior

B 7 3

Trichoderma sp. Textil altar

27

B 7 3 1

Fusarium verticiloides Textil altar

B 8 1

Alternaria alternata Grinda exterioara

B 9 4

Alternaria alternata Perete naos sud

B 10

Penicillium corylophilum Textil clei sud

B 10 2


B 10 3


B 11 1b

Trichoderma sp. Grinda altar stanga

28

B 13 2

Penicillium corylophilum Usi altar

B 14

Alternaria alternata Clei altar

B 14 2

Aspergillus flavus Clei altar

B 14 5

Aspergillus calidoustus Clei altar

B 14 5

Aspergillus nidulans Clei altar

B 15 3

Aspergillus flavus oryzae group Stalpi usi altar

B 15 3

Aspergillus flavus oryzae group Stalpi usi altar

29

B 20

Alternaria alternata

BISERICA DE PIATRĂ SF. NICOLAE- DENSUȘ- SEC XII- HD-II-m-A-03307 D4 Fusarium

oxysporum Interior perete nord

D3 4

Penicillium digitatum Coloana naos nord

D5 4

Penicillium verucosum Perete interior nord

D9 2

Arthrinium arundis Soclu stâlp interior

D10 1

Mucor circineloides Coloană nord

D11 1

Penicillium glabratum Soclu stâlp nord

30

D11 2

Aspergillus niger Soclu stâlp nord

D13 5

Fusarium solani Piatră neagră sud exterior

D14 2

Aspergillus flavus oryzae grup Piatră neagră sud exterior

D14 3

Trichoderma hamatum Piatră neagră sud exterior

D17 3

Penicillium roqueforti Stâlp interior pictură (sus)

D17 7

Penicillium crysogenum Stâlp interior pictură (sus)

CAPELA ROMANICĂ GEOAGIU- SEC. XI- HD-II-m-A-03316 G4 13

Penicillium crysogenum Mortar exterior

31

G4 15

Aspergillus nidulans Mortar exterior

G4 17

Fusarium incarnatum Mortar exterior

G4 8

Alternaria alternata Mortar exterior

G5 Epicoccum nigrum Tencuială interior

G5 22

Aspergillus parasiticus Tencuială interior

G5 23

Aspergillus niger Tencuială interior

32

41 Fusarium equiseti Tencuială interior

45 Fusarium equiseti Tencuială interior

G6 42

Penicillium corylophilum Tencuială interior

G6 43

Talaeomyces ruguloses Tencuială interior

G6 46

Fusarium incarnatum Tencuială interior

G6 49

Fusarium equiseti Tencuială interior

G6 51

Fusarium incarnatum Tencuială interior

33

Fig. 5. Aspectul microscopic al principalelor genuri de fungi microsopici izolați din bisericile de lemn și piatră din județul Hunedoara: Biserica de piatră din Streisângeorgiu, Biserica de lemn din Lunca

Moților, Biserica de lemn din Târnăvița, Biserica de piatră din Gurasada, Biserica de lemn din Boz, biserica de piatră din Densuș, capela rotondă din Geoagiu.

Caracterizarea şi identificarea tulpinilor bacteriene izolate de pe monumentele/ obiectele de

patrimoniu

Există puţine studii privind diversitate bacteriană de la nivelul obiectelor din lemn şi piatră însă se

pare ca acestă comunitate bacteriană variază în funcție de starea de degradare a obiectului, crescand odata

cu avansarea procesului de deteriorare. Tulpinile bacteriene au fost izolate prin cultivare pe mediu LB şi

TSB la temperatura camerei, dupa dezvoltare au fost realizate preparate microscopice în vederea

observării caracterelor celulare. După stabilirea caracterului Gram s-a determinat prezenţa/absenţa

catalazei şi respectiv oxidazei (Fig 6).

Nr crt

Denumire Probă

Identificare MALDI

Gram

Catalază/ Oxidază

Poze Gram

Morfologia coloniei

1 Biserici lemn 1

Bacillus mojavensis

G+ bacilli lungi

C+

2 Biserici

lemn 2 Bacillus subtillis

G+ bacilli lungi

C+

G7 57

Fusarium cerealis culmorum group Lemn buiandrug

G7 59

Fusarium equiseti Lemn buiandrug

34

3 L6886 Bacillus megaterium

G+ bacilli grosi

C+

4 T7229B Staphylococcus

equorium G+ coci C+

5 T7229A Bacillus

subtillis G+ bacilli

lungi C+

6 S1651 Bacillus

mojavensis G+ bacilli

lungi C+

7 T3403 Bacillus


lungi C+

8 R1794 Bacillus


lungi C+

9 M3960 Bcillus mojavensis

G+ bacilli lungi

C+

35

10 L1008 Bacillus subtilis

G+ bacilli lungi

C+

11 M3950 Bacillus

subtilis G+ bacilli

lungi C+

12 T12847 Pseudomonas

luteola G- bacilli

scurti O-

13 8055 Bacillus

endophyticus G+ bacilli

lungi C+

14 T5379 Bacillussp. G+ bacilli

lungi C+

15 P1458 Staphilococcus

epiderminis G+ coci C+

16 MTR36A Bacillus

megaterium G+ bacili C+

36

17 MTR38A Bacillus megaterium

G+ bacili C+

18 MTR26A Bacillus

therigensis G+ bacili C+

19 MTR26 Bacillus

licheniformis G+bacili C+

20 MTR34 Bacillus


21 MTR20 Bacillus


22 MTR33usc

at Bacillus subtilis

G+ bacili C+

23 MTR33

cremos Bacillus pumillus

G+ bacili C+

Fig. 6 Aspectul macro și microscopic al principalelor grupe de bacterii din colecția Muzeului Ţăranului

Român.

37

În urma acestei etape au fost izolate 128 tulpini bacteriene şi 5 tulpini de drojdii. Majoritatea

tulpinilor bacteriene izolate au prezentat morfologie bacilară, caracter Gram pozitiv şi au fost positive

pentru testul catalazwi. După izolare tulpinile bacteriene au fost conservate la -800C cu glicerol.

Identificarea prin spectrometrie de masă MALDI-TOF

Prelevarea realizată in luna iulie 2018 din interiorul bisericii de lemn ce aparține Muzeului

Țăranului Român din București a permis identificarea unui număr de 35 de tulpini de fungi microscopici

filamentoşi distribuite pe următoarele surse de izolare/specii: în zona pronaosului (34.28% din tulpinile

identificate în cadrul acestui sit); au fost identificate ascomicete aparținând speciilor Aspergillus terreus

și Rhizopus oryzae cu câte 2 tulpini (16.16%) precum și două bazidiomicete aparținând speciei

Schizophyllum commune (16.16%); în naos (34.28%) au predominat ascomicetele Penicillium digitatum

și Alternaria alternata (câte 25%). Din probele de aeromicrobiotă tupinile aparținând speciilor R. oryzae

și Trichoderma orientale au fost preponderente (22.22%) iar în altarul bisericii (5.71% din tulpini) s-au

izolat tulpini de R. oryzae și Cladosporium sp. (fig. 7).

Fig. 7. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în bis. Sf. Ierarh Nicolae – MȚR.

Prelevarea realizată în luna iulie 2018 din interiorul bisericilor de lemn din jud. Arad a permis

izolarea și identificarea următoarelor genuri și specii de fungi:

Ø Biserica de lemn Întâmpinarea Domnului – Groșii Noi, com Bârzava (Cod LMI: AR-II-m-A-

00607): au fost identificate un număr de 16 tulpini de fungi microscopici filamentoşi, aparținând

genului Penicillium majoritatea (50%) în naos. În pronaos (37.5% dintre tulpini) speciile P.

chrysogenum și A. alternata au reprezentat câte 33.33% din tulpinile identificate iar din altarul bisericii

s-au izolat și identificat tulpini de R. stolonifer și Cladosporium sp. (12.5%) (fig. 8).

38

Fig. 8. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în bis. Întâmpinarea Domnului-

Groșii Noi.

Ø Biserica Sfinții Trei Ierarhi din Troaş – com. Săvârșin (Cod LMI: AR-II-m-A-00655), s-au izolat

10 tulpini, în naos și altar predominantă fiind specia P. corylophilum, specie exclusiv izolată în

pronaosul bisericii (fig. 9).

Fig. 9. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în bis. Sf. Trei Ierarhi – Troaș.

Ø Bis. Intrarea Maicii Domnului în Biserică din comuna Julița (Cod LMI: AR-II-m-A-00615) au

fost identificate 36 de tulpini, 36.11% dintre acestea în naosul bisericii și aparținând speciilor P.

corylophilum (38.46%) și P. chrysogenum (30.76%), în pronaosul si podul bisericii (25% dintre

tulpini) au fost identificate speciile P. corylophilum și Mucor circinelloides iar în altarul bisericii

(11.11%) speciile P. corylophilum și P. expansum (câte 50% fiecare) (fig. 10).

00,5

11,5

22,5

P. coryl

ophylum

P. chrys

ogenum

A. alte

rnata

A. och

raceus

R. stolonife

r

Cladosporiu

m sp.

Penicilliu

m sp.

Fusa

rium in

carnatum

Fusa

rium sp

.

P. glabrum

num

ăr tu

lpin

i

specia identificată

Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în Bis. Întâmpinarea Domnului - Groșii Noi

pronaos

naos

altar

0

0,5

1

1,5

2

2,5

P. coryl

ophylum

Penicilliu

m sp.

R. stolonife

r

A. flavu

s

P. chrys

ogenum

num

ăr tu

lpin

i

specia identificată

Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în Bis. Sf. Trei Ierarhi - Troaș

naos

pronaos

altar

39

Fig. 10. Distribuția pe surse de izolare a speciilor de fungi - bis. din com. Julița.

În ceea ce privește biserica de lemn inclusă în patrimoniul cultural al MȚR - Biserica Adormirea Maicii

Domnului din Lunca Moților jud. Hunedoara (Cod LMI: HD-II-m-A-03360), s-a constatat prevalența

speciei P. corylophilum în toate punctele de prelevare din cadrul bisericii (fig. 11).

Fig. 11. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate in cadrul bis. din Lunca Moților.

În intervalul octombrie-decembrie 2018 au fost vizitate pentru analize de microbiologie următoarele

contrucții de patrimoniu din lemn din județul Hunedoara:

Bisericile Boz și Târnăvița sunt incluse în planuri de restaurare, derulate sau în proiect. S-au prelevat

probe de pe materialele interioare- lemn, textile, vopsea, clei îmbinat cu textil, precum și exterioare- grinzi

în putrezire, șiță, portaluri.

Ø Biserica de lemn Cuvioasa Paraschiva din Târnăvița SEC. XVII- HD-II-m-A-03463

S-au identificat 14 specii de fungi, din 29 de tulpini (Fig. 12)

40

Penicillium glabratum 1 Aspergillus niger 2 Aspergillus _flavus_oryzae group 6 Penicillium glabratum 3 Penicillium onobense 3 Penicillium corylophilum 2 Penicillium citrinum 4 Penicillium chrysogenum 1 Fusarium verticillioides 1 Fusarium proliferatum 1 Fusarium equiseti 1 Fusarium cerealis 1

Aspergillus pulvinus 1 Alternaria alternata 2

total 29

E PFig. 12. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Tarnavita.

Ø Biserica de lemn Sf. Gheorghe Boz- SEC XVIII- HD-II-m-B-03261

S-au ideentificat 16 specii de fungi din 40 de tulpini anaizate.(Fig. 13)

Alternaria alternata 6 Aspergillus _flavus_oryzae group 6 Aspergillus calidoustus 1 Aspergillus iizukae 1 Aspergillus nidulans 4 Aspergillus niger 3 Aspergillus ochraceus 1 Aspergillus sclerotiorum 1 Fusarium cerealis culmorum group 1 Fusarium oxysporum 1 Fusarium verticillioides 2 Penicillium corylophilum 6 Penicillium glabratum 2 Penicillium namylowskii 1 Talaromyces ruguloses 2 Trichoderma sp. 2

Total 40

Fig. 13. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Boz.

Ø Biserica de lemn Adormirea Maicii Domnului din Alun- sec XVII- HD-II-m-B-03239

S-a reușit identificarea a 5 tulpini, izolate în interiorul clădirii, pronaos, naos și altar, aparținând a 3

specii, predominând specia Fusarium verticilloides. Suprafețe: lemn, clei, pictură pe lemn, zone cu

infiltrații. (Fig. 14)

41

Fusariumsolani 1

Fusariumverticillioides 3

Penicilliumcorylophilum 1

Total 18

Fig. 14. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. de lemn din Alun.

Izolarea speciilor de fungi microscopici filamentoși de pe obiectivele de patrimoniu cultural

din piatră din județul Hunedoara. Izolarea în cultură pură urmată de identificarea cu ajutorul sistemului

MALDI-TOF a tulpinilor provenite din probe de pe materiale degradate din interiorul Bisericilor de piatră

din județul Hunedoara a demonstrat prezența următoarelor genuri și specii:

Ø Biserica Înălțarea Domnului din Nucșoara (Cod LMI: HD-II-m-B-03370): au predominat

tulpinile din specia Aspergillus versicolor (32.55%) urmate de A. alternata (9.30%), M. circinelloides,

P. chrysogenum și Aspergillus sydowii (câte 6.97%) (fig. 15)

Fig. 15. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Nucșoara.

Ø Biserica Sfântul Gheorghe din Sânpetru (Cod LMI: HD-II-m-A-03442) au fost identificate 11

tulpini de ascomicete dintre care cele mai frecvente au fost Aspergillus niger, Penicillium sp., A.

nidulans, și Purpureocillium lilacium (câte 18.18%) (fig. 16).

42

Fig. 16. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Sânpetru.

Ø Biserica Pogorârea Sfântului Duh din Ostrov (Cod LMI: HD-II-a-A-03400): specia dominantă a

fost A. alternata (40%) urmată de Penicillium roqueforti, P. digitatum și P. expansum (Fig. 17).

Fig. 17. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Ostrov.

Ø Mănăstirea Prislop (Cod LMI: HD-II-A-03446.03): specia dominantă a fost A. niger, urmată de

A.alternata, Trichoderma sp., Penicillium commune și Mucor circinelloides (Fig. 18).

Fig. 18. Distribuția speciilor de fungi identificate în M-rea Prislop.

43

Ø Biserica Adormirea Maicii Domnului din Strei, Călan (Cod LMI: HD-II-m-A-03452): din cele 7

tulpini izolate, majoritatea au aparținut speciei A. Alternata, urmată de A. niger și A. arundinis (fig.

19).

Fig. 19. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Strei.

Ø Biserica Sîntămarie din Orlea (Cod LMI: HD-I-s-B-0320): au fost izolate majoritar tulpinile de A.

alternata și Fusarium cerealis culmorum group, urmate de cele de R. oryzae, Penicillium citrium,

Aspergillus flavus oryzae group și P. corylophylum (Fig. 20).

Fig. 20. Distribuția speciilor identificate cu sistemul automat Maldi din Biserica Sîntamărie.

Ø Biserica Pogorârea Sfântului Duh din Paroș (Cod LMI: HD-II-m-A-03401): din cele 17 tulpini

izolate, 17 % au aparținut speciilor A. versicolor și altor specii ale genului, iar câte 12% dintre tulpini

au fost încadrate în speciile Cladosporium sp. și A. alternata (fig. 21).

44

Fig. 21. Distribuția speciilor de fungi identificate cu sistemul automat Maldi din bis. din Paroș.

Ø Biserica de piatră Arhanghelul Miha Gurasada- SEC XIII- HD-II-m-A-03323

S-au identificat un număr de 9 tulpini, încadrate in 7 specii. Prelevarea s-a realizat din tencuiala

interioară căzută și dezafectată, atinsă de infiltrații, în special în zona de altar și abside. (Fig.22)

Fusariumproliferatum 3

Trichophytoninterdigitale 1

Talaromycesrugulosus 1

Penicilliumcorylophilum 1

Fusariumproliferatum 1 Aspergillus_flavus_oryzaegroup 1 Penicilliumcitrinum 1 Total 9

Fig. 22. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Gurasada.

Ø Capela Romanică Geoagiu- SEC. XI- HD-II-m-A-03316

Alternariaalternata 1 Aspergillusnidulans 2 Aspergillusniger 1 Aspergillusparasiticus 1 Aspergillusversicolor 1 Epicoccumnigrum 2 Fusariumcerealisculmorumgroup 2 Fusariumequiseti 4 Fusariumincarnatum 3 Penicilliumchrysogenum 2 Penicilliumcorylophilum 2 Talaromycesruguloses 1

Total 22

Fig. 23. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Geoagiu

45

Un total de 22 de tulpini izolate au putut fi încadrate în 12 specii de fungi. Rotonda romanică se află

într-o stare avansată de degradare datorată neutilizării. S-au prelevat probe de pe lemn de construcție,

mortar, cărămizi expuse, tencuială. (Fig. 23)

Ø Biserica de piatră Sf. Nicolae, Densuș- SEC XII- HD-II-m-A-03307

Din totalul de 18 tulpini identificate, se poate determina incaadrarea acestora în 15 specii. S-a

realizat prelevare din zonele problematice ale construcției, din degradările exteiroare de tip pitting, din

zone interioare cu tencuialaă dezafectată, de pe picturile deteriorate. Suprafețe și materiale: lemn,

tencuială, frescă, piatră. (Fig. 24)

Alternariaalternata 1 Arthriniumarundinis 1 Aspergillusniger 2 Aspergillus_flavus_oryzaegroup 2 Fusariumoxysporum 1 Fusariumsolani 1 Mucorcircineloides 1 Penicilliumbrevicompactum 1 Penicilliumchrysogenum 2 Penicilliumcorylophilum 1 Penicilliumdigitatum 1 Penicilliumglabratum 1 Penicilliumroqueforti 1 Penicilliumverrucosum 1 Trichodermahamatum 1

RHANGHELUL MIHAIL-RASADA- SEC XIII- HD-II--03323

Fig. 24. Distribuția speciilor de fungi identificate în bis. din Densuș.

În ceea ce priveste distribuția pe specii a tulpinilor izolate din colecțiile MȚR și identificate prin

spectrometrie de masă s-a constatat că dintr-un număr total de 43 de tulpini cu diverse surse de izolare

(fig. 25), 32.55% au provenit de pe țesături iar din acestea 42.85% au fost încadrate în specia A. flavus

oryzae group. De pe obiecte din lemn au fost izolate 20.93% dintre tulpini, din care 33.33% au fost de P.

chrysogenum. În ordine descrescătoare a frecvenței au urmat tulpinile izolate de pe obiecte din stofă

(18.60%), sursă de izolare în care de asemenea majoritare au fost tulpinile de P. chrysogenum.

46

Fig. 25. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în colecțiile MȚR.

Din cadrul Muzeului de Istorie și Arheologie din Tulcea au fost izolate și identificate 33 de tulpini.

Din situl Ratman au fost izolate tulpini de A. flavus oryzae group (33.33%), A. alternata, A. ustus și A.

Minisclerotigenes, iar din situl Nufăru tulpini de M. circinelloides și Fusarium sp. (fig. 26).

Fig. 26. Distribuția pe surse de izolare a speciilor identificate în colecțiile Muzeului de Arheologie din Tulcea.

Diversitatea speciilor de bacterii și levuri nou izolate

Conform rezultatelor MALDI majoritatea tulpinilor bacteriene izolate atat de pe obiectele de

patrimoniu din cele doua muzee cat si din interiorul bisericilor luate in studiu apartin genului Bacillus.

47

Figura 27. Diversitatea speciilor bacteriene din cadrul MȚR.

De pe obiectele de la MȚR au fost izolate 34 de tulpini bacteriene, specia predominantă fiind B.

subtilis (20%), urmata de specia B. megaterium (17%) in timp ce speciile B. mojavensis si B. pumillus

reprezinta 8.8% din totalul de tulpini bacteriene. Tulpinile din genul Stahpylococus sp. sunt considerate

contaminanti antropici ai obiectelor fara impact direct asupra degradarii acestora (Fig 27).

Au fost izolate 36 de tulpini bacteriene si 3 tulpini de fungi care apartin genului Cryptococcus din

cadrul bisericilor din judetul Arad. Pe langa speciile din genul Bacillus care predomina si in cadrul

bisericilor (13%) au fost izolate diferite specii din genul Arthrobacter (11%) (Fig 28).

Figura 28. Diversitatea speciilor bacteriene izolate din cadrul bisericilor din lemn - judeţul Arad.

Bacillus megaterium

Bacillus pumillus

Bacillus subtilis

Arthrobacter globiformis

Arthrobacter aurescens

Arthrobacter bergeriRodococcus

erithropolysPs. enthomophilaLb. alimetariusS. epidermidis

No Id

48

De asemenea au fost izolate 37 de tulpini bacteriene din bisericile de piatră din regiunea Hategului.

Specia predominata a fost B megaterium (27%) urmată de B. pumillus (10%). Au fost izolate şi 3 tulpini

de levuri din genul Candida şi 2 tulpini care aparţin speciei Cryptococcus neoformans (Fig 29).

Fig 29. Diversitatea speciilor bacteriene izolate din cadrul bisericilor din piatră – regiunea Haţegului.

Din cadrul Muzeului de Istorie și Arheologie din Tulcea au fost izolate și identificate 23 de tulpini

bacteriene, dintre care 65% aparţin genului Bacillus, specia predominanta fiind B. megaterium (26%)

urmată de B. arthrophaeus (13%). Au fost izolate de asemenea tulpini din genurile Acinetobacter şi

Rhodotorula (Fig 30).

Fig. 30. Diversitatea speciilor bacteriene izolate din cadrul colecțiilor din Muzeului de Arheologie - Tulcea.

Aproximativ 20% dintre tulpinile nou izolate nu au putut fi identificate în urma analizei MALDI-

TOF, acestea urnând a fi investigate prin teste suplimentare în vederea încadrării taxonomice.

Bacillus megaterium

Bacillus pumillusBacillus thuringiensis

Ps koreensisPenibacillus sp.

Candida sp

No Id

49

Investigarea compoziției biofilmelor microbiene prin metode independente de cultivare bazate pe

PCR

Regiunea ITS a fost utilizată ca regiune țintă în analiza filogenetică, deoarece prezintă, în

general, variații de secvență între specii, dar numai variații minore în cadrul tulpinilor aceleiași specii.

Identificarea moleculară a fungilor până la nivel de specie a fost bazată în mare parte pe analiza

regiunilor variabile ITS (internally transcribed spacer) care include ITS1, ADNr 5,8S si ITS4. De

asemenea secvenţele de ADN din regiunea ITS sunt foarte variabile si ar putea servi ca marker al

grupurilor taxonomice mai îndepărtate filogenetic.

Fig. 31. Interfața de lucru a programului ChromasLite 2.1.1.

Analiza si interpretarea secvenţelor cu ajutorul soft-ului NCBI-BLAST (prezentată în figura 31) a dus la

identificarea următoarelor specii pe baza secvenţei ITS.

- Alternaria alternata

- Penicillium polonicum

- Penicillium crustosum

- Cladosposrium cladosporoides

- Penicillium glabrum

- Penicillium chrysogenum

Stabilirea gradului de înrudire al tulpinilor de Bacillus

Speciile dominate respectiv B. megaterium şi B. mojavensis izolate de la nivelul monumentelor/

obiectelor de patrimoniu au fost selectate în vederea stabilirii gradului de înrudire prin analiza rep-PCR.

Tehnica rep-PCR presupune amplificarea unor fragmente repetitive de la nivelul genomului bacterian. În

urma reacţiei de amplificare se obţine un profil ADN care poate permite încadrarea până la nivel de specie

50

şi uneori poate face diferenţierea până la nivel de tulpină (Fig. 32). În cadrul acestei etape am urmărit

variabilitatea tulpinilor apartianand celor specii din cadrul colectiei de bacterii nou izolate.

Fig. 32 Profilul repPCR al tulpinilor de B.megaterium si B. mojavensis.

Fig 33 Dendrograma obţinută în urma analizei rep-PCR

În urma analizei filogenetice se observă că tulpinile aparţinând speciei B. megaterium izolate din

MTR (MTR 20, MTR 36A, MTR 34) sunt grupate în acelaşi cluster, în timp ce tulpinile Mormânt A şi

Lemn coşar izolate din Muzeului de Arheologie - Tulcea, au fost grupate în alt cluster. Tulpinile de B.

mojavensis S1651 şi B. mojavensis M3960 prezintă acelaşi profil rep-PCR, în timp ce tulpina B.

mojavensis Isaccea 1979 prezintă un profil foarte diferit de cele două. Cel mai probabil la nivelul muzeului

MTR predomină aceleaşi tulpini de Bacillus, care sunt însă diferite de cele din cadrul Muzeului de

Arheologie – Tulcea (Fig 33).

51

Activitate enzimatică de tip celulazic a speciilor de fungi

În urma inoculării mediului agarizat care a conţinut celuloză ca substrat, s-a observat că tulpinile

fungice izolate de pe pe cladiri și obiecte de patrimoniu identificate anterior au avut activitate enzimatică

de tip celulazic la 24h, 48h sau 72h.

În ceea ce privește tulpinile fungice izolate din bisericile din lemn din jud. Arad și Hunedoara s-

au constatat capacități diferite de metabolizare a celulozei (Fig. 34). Astfel, 5 dintre tulpinile isolate din

Biserica din com. Bârzava prezintă activitate enzimatică de tip celulazic, dintre care 2 tulpini de

Penicillium glabrum şi Fusarium roseum au prezentat activitate celulazică la 24h, o tulpină de Fusarium

incarnatum la 48 h, respective o tulpină de Aspergillus ochraceus şi o tulpină de Alternaria sp. la 72 h.

Dintre cele 7 tulpini izolate din Biserica Sfinţii Trei Ierarhi din Troaş cu activitate enzimatică de tip

celulazic 3 tulpini de P. corylophilum şi o tulpină de A. flavus au prezentat activitate celulazică dupa 48

h, iar 3 tulpini de P. corylophilum după 72h. La citirea după 24h de la însămânţare, nici una dintre tulpini

nu prezentau activitate celulazică). Dintre cele 16 tulpini care prezintă activitate enzimatică de tip celulazic

izolate din Biserica din Juliţa, câte o tulpină de R. oryzae și P. corylophilum şi 3 tulpini de P. expansum

au prezentat activitate celulazică după 24h, 7 tulpini de P. corylophilum şi 1 tulpină de P.oxalicum după

48 h și câte o tulpină de A. pseudoglaucus, R. stolonifer şi Penicillium roqueforti după 72 h. Cele 10 tulpini

izolate din bis. din Lunca Moților (jud HD) au fost pozitive la 48h pentru activitatea celulazică.

Fig. 34. Distribuția tulpinilor cu activitate celulazică identificate în bis. de lemn

52

Studiul echipamentului enzimatic de tip celulazic pentru tulpinile fungice izolate din bisericile de

piatră a evidențiat un nivel ridicat al activității celulazice la tulpinile izolate din bis. din Nucșoara, 25 de

tulpini fiind positive la 72h, 19 la 48h și doar 9 tulpini la 24h (Fig. 35). Din cele 11 tulpini izolate din bis.

Sf. Gheorghe (Sînpetru) majoritatea au fost pozitive pentru celulază la 72h, 63.63% (toate cu exc. unei

tulpini de P. lilacinum) la 48h și 45.45% la 24h. În cazul bis. din Ostrov o singură tulpină aparținând

speciei P. expansum a fost pozitivă la testul celulazei la 48h și două tulpini de P. digitatum și P. roquefortii

la 72h. În M-rea Prislop au fost identificate 7 tulpini pozitive la testul celulazei, 33.33% fiind pozitive la

48h si 72h. Două tulpini de Trichoderma sp. au fost pozitive atât la 48 cât și la 72h. Un procent de 42.85%

din tulpinile izolate din bis. din Strei (Călan) au prezentat activitate celulazică, două tulpini de A. alternata

și A. arundinis fiind pozitive atât la 48h, cât și 72h (fig..). Un procent de 62.5% din tulpinile izolate din

bis. din Sântămarie au fost pozitive pentru producerea de celulază, toate cu excepția unei tulpini de P.

corylophylum (S 16) fiind pozitive la toți timpii analizați. Studiul activității de tip celulazic la tulpinile

identificate în bis. din Paroș a evidențiat că 58.82% au fost pozitive la 72h, 41.16% la 48h i 29.41% la

24h.

53

Fig. 35. Distribuția tulpinilor cu activitate celulazică identificate în bis de piatră din jud. HD.

Evaluarea calitativă a activității celulazice a tulpinilor izolate de pe obiectele din colecțiile MȚR

a demonstrat că 65% din tulpinile analizate au fost pozitive, mai ales la 48h și 72h. În ceea ce privește

distribuția pe specii s-a demonstrat că tulpinile cu activitate celulazică ridicată au fost cele de A. flavus

oryzae group și de P. chrysogenum (fig. 36). Studiul activității de tip celulazic pe tulpinile izolate din

colecțiile Muzeului de Arheologie din Tulcea a demonstrat că majoritatea tulpinilor au fost pozitive la

acest test după 48 și 72h.

Fig. 36. Distribuția pe specii a tulpinilor cu activitate celulazică identificate în colecțiile celor

două muzee luate în studiu.

Activitate celulozolitică a speciilor de bacterii

Toate tulpinile izolate de pe obiectele din cadrul MTR şi identificate conform profilelor proteice

ca aparţinând speciilor: B. atrophaeus, B. mojavensis, B. subtilis şi B. pumillus au prezentat activitate

celulazică ridicată. Tulpinile încadrate taxonomic ca aparţinând speciei B. megaterium au prezentat o

creștere redusă pe mediu cu celuloza şi Roşu de Congo (Fig 37).

54

Fig. 37. Activitatea celulazică a tulpinilor bacteriene evidențiată pe mediu cu celoloză și Roșu de Congo.

Dintre speciile microbiene izolate din bisericile din lemn B. subtilis, Ps. entomophila şi Arthrobacter

aurescens au prezentat cea mai ridicată activitate celulazică, în timp ce tulpinile bacteriene izolate din

bisericile din piatră din regiunea Hategului au prezentat activitate celulazică mai redusă. Tulpina de Ps.

koreensis şi cele din genul Candida au prezentat cea mai ridicată activitate celulazica.

Rhodotorula mucilaginosa alături de Acinetobacter ursiugii au prezentat activitatea celulozolitica

cea mai ridicată comparativ cu restul tulpinilor izolate de pe obiectele din cadrul Muzeului de Arheologie

Tulcea.

Screening-ul cantitativ al producției de celulaze (endoglucanaze, exoglucanaze, celobiaze)

Dintre cele 4 tulpini de Aspergillus analizate, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus

sclerotiorum, Aspergillus tritici, cea mai mare producție de enzime a fost inregistrată pentru specia

Apergillus niger, după cum relevă citirile spectrofotometrice la 490, respectiv 610nm. Cea mai redusă

cantitate de enzimă a fost notată pentru specia Aspergillus tritici.

0,1563002

0,3527460,375488

0,5613546

0,22142840,1441374

0,079601 0,0575202

0

0,2

0,4

0,6

filter paper CMC

mg

gluc

oza/

ml

Concentrația de glucoză eliberată(mg/ml)-490nm

A. nidulans

A. niger

A sclerotiorum

A. tritici

0,1563002

0,3527460,375488

0,5613546

0,22142840,1441374

0,079601 0,0575202

0

0,2

0,4

0,6

filter paper CMC

mg

gluc

oza/

ml

Concentrația de glucoză eliberată(mg/ml)-610nm

A. nidulans

A. niger

A sclerotiorum

A. tritici

55

Cele patru filtrate au fost supuse incubării

la intervale de timp variabile: 0 min, 30

min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min,

180min.

Pentru toate probele se remarcă o creștere

parabolică, substanțială începând de la 60

min, cu un maxim atins la 15 min. După

acesta, urmează o scădere, corelată

probabil cu stabilitatea proteinei la

temperatură înaltă și cu consumarea

substratului existent.

Varierea concentrației filtratului enzimatic

în procente 20%, 40%, 60%, 80%, 100%

din concentrația inițială a relevat o

corelație aproproximativ liniară cu

capacitatea de degradare a substratului și

producerea de zaharuri reducătoare, cu o

tendință de scădere după pragul de 80%

pentru Aspergillus niger, corelată probabil

cu consumarea carboximetilcelulozei.

Odată cu creșterea concentrației

substratului CMC (concentrații 0, 0,2, 0,4,

0,6, 0,8, 1 mg/ml) se remarcă o creștere

liniară a degradări acestuia si producerii de

zaharuri reducătoare.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 50 100 150 200

D.O

. 540

NM

timpul de incubare (min.)

Influența timpului de incubare(T=50grade)

A. nidulans

A. niger

A. sclerotiorum

A. tritici

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

D.O

. (54

0 nm

)

concentrația filtratului (mg/ml)

influența concentrației filtratului ∆t=60min

00,20,40,60,8

11,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

D.O

. (54

0 nm

)

Conc. de substrat CMC (mg/ml)

Influența concentrației substratului∆t=60min

56

Pentru a se determina temperatura optimă

pentru eficiența celulazei, s-au testat

incubarea la diferite valori termice: 20, 30,

40, 50, 60, 70°C. Graficul arată o creștere

sinusoidală, cu un maxim de eficiență

obținut la 60°C, urmat de o scădere

datorată denaturării protinei la temepratură

înaltă.

Tamponul utilizat pentru screening, acid

citric, a fost ajustat la diferite valori de Ph

: 4, 4,5, 4,8, 5, 5,5, 6, 7. S-a remarcat o

valoare de eficiența maximă a enzimei în

cazul valorii 5 a bufferului, cu concentrație

de 0,05M.

Rezultatele au fost raportate la o curbă

standard a concentrației de glucoză pentru

a se calcula cantitatea de zaharuri

reducătoare eliberate in fiecare probă în

urma degradării substratului la incubare. În

afara timpului de incubare, probele au fost

ținute pe gheață pentru a se împiedica

procesul.

Fig. 38 Influența condițiilor fizico-chimice asupra producerii de celulaze

Evaluarea cantitativă a contaminării microbiene prin tehnici dependente de cultivare

Studiul comparativ al încărcăturii microbiene în probele izolate de pe șase obiecte de patrimoniu

cultural din jud. Arad și HD (bis. din Bârzava, bis. din Lunca Moților, bis. din Troaș, bis. din Densuș, bis.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

20 30 40 50 60 70

D.O

. (54

0 nm

)

Temperatura (grade Celsius)

Influența temperaturii de incubare

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5D.O

. (54

0.nm

)

pH buffer citrat 0,05 M

Influența pH-ului

A. nidulans

A. niger

A. sclerotiorum

A. tritici

00,1

0,20,3

0,40,5

0,60,7

0,80,9

1

y = 0,496x + 0,0027R² = 0,9989

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5GLU

COSE

CO

NC.

(mg/

ml)

O.D. 540 nm

Curba concentrației de glucoză

57

din Julița și bis. din Strei) în perioada iulie – august 2018 din diferite puncte de prelevare a permis

determinarea încărcăturii microbiene în probele recoltate demonstrând că cel mai mare număr de UFC/mL

a fost în bis. din Julița (2,18x107), bis. din Groșii Noi – Bârzava (2x107), urmate de bis. din Troaș (1,2x106)

și bisericile din Lunca Moților, Densuș și bis. din Strei (3x105) (fig. 39).

Fig. 39. Prevalența tulpinilor de microorganisme în probele prelevate din diferite situri.

Identificarea strategiilor de rezistență a organismelor

Evaluarea cantitativă a gradului de aderență a biofilmelor la substrat inert s-a realizat pentru un

număr de 77 de tulpini fungice izolate din interiorul bisericilor de lemn din București, Arad și Hunedoara,

55 de tulpini izolate de pe biserici de piatră din jud. Hunedoara și 39 de tulpini izolate din colecțiile celor

două muzee luate în studiu (fig. 40). S-a demonstrat că tulpinile fungice izolate din interiorul bisericilor

de lemn și piatră au capacitatea de a forma biofilme, rezultat corelat cu încărcătura microbiană mare și

gradul avansat de deteriorare ceea ce determină impunerea de măsuri de intervenție bazate pe soluţii

ecologice pe bază de compuşi microbieni cu activitate antimicrobianã fațã de principalele categorii de

microorganisme cu rol în biodegradarea obiectelor de patrimoniu.

58

Fig. 40. Rezultatele evaluării capacității tulpinilor fungice de a colonzia substratul inert.

59

Tulpinile bacteriene au fost testate în vederea capacității de formare a biofilmului pe suport inert.

Aproximativ 40% dintre tulpinile izolate din cadrul MTR au prezentat o capacitate ridicată de a forma

biofilm pe suport inert, tulpinile aparţinând speciilor B. mojavensis, B subtilis, B. pumillus fiind cele mai

eficiente (Fig 41).

Fig. 41 Biofilmul format de tulpinile bacteriene izolate din MTR pe suport inert

Rata de formare a biofilmelor a fost mai scăzută în cazul tulpinilor izolate din cadrul bisericilor din

lemn din Arad doar 16% dintre acestea aderând la suportul inert. Două dintre tulpinile formatoare de

biofilm aparţin speciei B. mojavensis (Fig. 42).

Fig. 42 Biofilmul format de tulpinile bacteriene izolate din bisericile din lemn- Arad.

Numărul tulpinilor producătoare de biofilm izolate din bisericile din piatră din Haţeg a fost de

aproximativ 55%, tulpinile de Penibacillus peoriae, Pseudomonas koreensis şi B. megaterium producând

cea mai mare masă de biofilm (Fig 43).

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

16256-2

3585 vas l

ut

8055 lem

n

Bis lem

n 1

Bis lem

n 2L1

008L1

049

Lem

n 35961

M3960

M3950

MTR

20

MTR

26A

MTR

33 crem

os

MTR

33 uscat

MTR

34

MTR

36A

MTR

36B

R1794-27

S1651

T15780

T3403

T5379

OD

590n

m

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

BS 3

-1

BS 3

-3 p

rona

os

BS3

alta

r

BS3

NA

OS

Bz 1

1

Bz 1

6

Bz 1

7 us

i int

Bz 3

per

eteE

Bz 6

alt

ar A

Bz 8

pro

naos J20

J23A

J23B

J29A

J29B J3

8

J44

pod

J45

pod

1

J45

pod

2

J45

pod

3

J45

pod

4 J5

BLLM

18

BLLM

34

BLLM

5

OD

590n

m

60

Fig. 43 Biofilmul format de tulpinile bacteriene izolate din bisericile din piatră - Haţeg.

Tulpinile bacteriene izolate din Muzeului de Arheologie din Tulcea cu cea mai mare capacitate de

aderenţă aparțin speciilor B. megaterium B atrophaeus şi B mojavensis (Fig 44).

Fig. 44 Biofilmul format de tulpinile bacteriene izolate din Muzeului de Istorie şi Arheologie din

Tulcea.

Evidenţierea bacteriilor sporogene

Speciile dominante au fost cele ale genului Bacillus, acestea fiind cunoscute ca

producătoare de endospori (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium şi Bacillus mojavensis)

extrem de rezistenți la privarea de nutrienți și la alte condiţii de stres din mediu.

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

Ghe

10D

Ghe

10R

Ghe

2D

mar

eG

he 2

D m

ica

Ghe

3D

Ghe

6D

Ghe

4N

S10D

NS1

2DN

S20D

NS2

3RN

S5R

OS7

BO

S7C

OS7

RPL

6DPL

7DPL

8DPR

10D

PR11

DPR

13PR

6S1

7DS1

7R S1R

S23D S2

RS3

DS3

RS5

RS6

RS6

RA

S9D

Stre

i 2St

rei 4

Stre

i 6

OD

590n

m

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

AE1

R

AE2

D

AE3

R

Baba

dag

65A

Baba

dag

65B

Cora

bie

rom

ana

1

Cora

bie

rom

ana

2

Cora

bie

Sf G

he A

Cora

bie

Sf G

he B

Enis

ala

Pala

nca

A

Enis

ala

Pala

nca

B

Gro

pi le

mn

1

Isac

cea

1979

Isac

cea

79B

Lem

n Co

sar

Nuf

arul

Mor

man

t A

Mor

man

t B

Nuf

arul

pro

ba 6

1

Nuf

arul

pun

ga2

Ratm

an 2

013M

5

OD

590n

m

61

Fig. 45 Colorație pentru evidențierea sporilor formaţi de tulpina B. megaterium MTR34 (100X).

Toate tulpinile aparţinând speciei Bacillus megaterium au produs spori după 28h de incubare pe

mediu LB, în timp ce restul speciilor au început procesul de sporulare mai târziu după 48-72h de incubare

la mediu LB suplimentat cu CaCl2 (Fig. 45).

Evidenţierea capsulei bacteriene

Tulpinile bacteriene au fost cultivate în mediu LB suplimentat cu 2% glucoză pentru stimularea

formării capsulei. După dezvoltare tulpinile au fost colorate cu roşu de Congo în vederea evidenţierii

capsulei.

Fig 46. Colorație pentru evidențierea capsulei formată de tulpina B. pumillus OS7C.

Majoritatea tulpinilor care au aderat la suportul inert au prezentat şi capsula, cee ace sugerează că

polizaharidele capsulare facilitează procesul de aderență.

Tulpinile de bacterii nou izolate de pe obiectele de patrimoniu prezinta multiple mecanisme de

protectie fata de factorii externi nocivi (capsula, spori, biofilm) si aproximativ jumatate dintre acestea

produc celulaza.

Diseminarea rezultatelor

62

Dosare de invenții

1. IURCOVSCHI Cosmin Tudor, SANDU Ion, VASILACHE Viorica, SANDU Andrei Victor, SANDU Irina Crina Anca, SANDU Ion Gabriel, Compoziție și proceseu de curățare umedă a

picturilor, artefactelor policrome și poleirilor vechi, Dosar OSIM nr. 15086, 09.08.2019;

2. COLBU Dumitru Eugen, SANDU Ion, VASILACHE Viorica, SANDU Irina Crina Anca, COLBU Gheorghe, SANDU Ioan-Gabriel, COLBU Nicoleta, SANDU Andrei-Victor Compoziție

și procedeu de insectofungicizare și hidrofobizare a artefactelor din lemn vechi, Dosar OSIM nr. A/00271, 03.05.2019

Articole ISI

1. Limban C., Diţu L-M, Măruțescu L., Missir AV, Chifiriuc M.C., Căproiu MT, Morusciag L, Chiriţă C, Udrea A-M, Nuţă DC, Avram S, 2019, Design, Synthesis and Biopharmacological Profile Evaluation of New 2-((4- Chlorophenoxy)Methyl)-N-(Arylcarbamothioyl)Benzamides with Broad Spectrum Antifungal Activity, Current Organic Chemistry, 2019, Vol. 23, No. 12 1361, DOI: 10.2174/1385272823666190621162950

2. Sirghi A.C., Gheorghe I., Sarbu I., Marutescu L., Gheorghe Stoian G., Zhiyong Z., Chifiriuc M.C. 2018. Identification of fungal strains isolated from buildings of cultural importance in Romania and antagonistic relationships amongst them. Romanian Biotechnological Letters, DOI 10.26327/RBL2018.206.

3. Rădulescu H.C., Gheorghe I., Gradisteanu G., Ispas A., Popescu C., Roşu G., Avram I., Lazăr V. Molecular characterization based on Internal Transcribed Spacer (ITS) marker sequence of fungal strains isolated from heritage ethnographic textiles. Romanian Biotechnological Letters Rom Biotechnol Lett. 2019; 24(5): 906-912.

Lucrari stiintifice prezentate si publicate în volume de conferinţe din domeniul proiectului

1. C.T. IURCOVCHI, O.P. TĂNASĂ, D.E. COLBU, I.C. NEGRU, O. FLORESCU, V. VASILACHE, I.C.A. SANDU Știința, tehnica și arta conservării artefactelor vechi de patrimoniu cultural, EUROINVENT - INTERNATIONAL WORKSHOP, Scientific, Technological and Innovative Research in Current European Context, 11th edition, 16 May 2019, Iasi, Topics: Scientific Inquiries through Elective Elaborations, (Editors: I.G. Sandu, I. Sandu, I.C. Negru and A.S. Ciornei), Ed. PIM, 2019, pp. 9-30.

2. M. BOUTIUC (HAULICĂ), V. VASILACHE, I. SANDU, Biodegradarea documentelor de arhivă cu suport celulozic, EUROINVENT - INTERNATIONAL WORKSHOP, Scientific, Technological and Innovative Research in Current European Context, 11th edition, 16 May 2019, Iasi, Topics: Scientific Inquiries through Elective Elaborations, (Editors: I.G. Sandu, I. Sandu, I.C. Negru and A.S. Ciornei), Ed. PIM, 2019, pp. 31-46.

3. D.E. COLBU, C.T. IURCOVCHI, I. SANDU, V. VASILACHE, Investigarea artefactelor vechi de patrimoniu prin implicarea de tehnici moderne, EUROINVENT - INTERNATIONAL

63

WORKSHOP, Scientific, Technological and Innovative Research in Current European Context, 11th edition, 16 May 2019, Iasi, Topics: Scientific Inquiries through Elective Elaborations, (Editors: I.G. Sandu, I. Sandu, I.C. Negru and A.S. Ciornei), Ed. PIM, 2019, pp. 47-60.

4. M. HAULICĂ (căs. HAULICĂ), V. VASILACHE, I.G. SANDU, Date din documente de arhivă şi consemnări despre biserica de piatră din Câmpeni – Bacău, EUROINVENT - INTERNATIONAL WORKSHOP, Scientific, Technological and Innovative Research in Current European Context, 11th edition, 16 May 2019, Iasi, Topics: Scientific Inquiries through Elective Elaborations, (Editors: I.G. Sandu, I. Sandu, I.C. Negru and A.S. Ciornei), Ed. PIM, 2019, pp. 91-124.

5. O. FLORESCU, I. SANDU, L. STRATULAT, V. VASILACHE, M. NĂNESCU, Academicianul Gheorghe G. Longinescu (1869-1939), EUROINVENT - INTERNATIONAL WORKSHOP, Scientific, Technological and Innovative Research in Current European Context, 11th edition, 16 May 2019, Iasi, Topics: Scientific Inquiries through Elective Elaborations, (Editors: I.G. Sandu, I. Sandu, I.C. Negru and A.S. Ciornei), Ed. PIM, 2019, pp. 175-184.

Participare la Conferințe

1. M. BOUTIUC (căs. HAULICĂ), O. FLORESCU, V. VASILACHE, I. SANDU, Cercetări actuale privind investigarea, prezervarea şi restaurarea patrimoniului arhivistic, A 42-a ediții a Sesiunii de comunicări științifice ”Acta Moldaviae Meridionalis”, 26-27 Septembrie 2019, organizată de Muzeul Județean ”Ștefan cel Mare” Vaslui (comunicare)

2. V. VASILACHE, Studiul unei monede din secolul al II-lea descoperită la Roșiori, județul Neamț, Conferința Internațională ”MATCONS 2019”, 8-12 Noiembrie 2019, organizată de Muzeul Olteniei Craiova (comunicare).

3. V. VASILACHE, O. MIRCEA, G.D. HÂNCEANU, Studiul unor piese de vestimentație descoperite la Arhiepiscopia Romanului și Bacăului, Conferinţa Naţională de Conservare - Restaurare „Doina Darvaş” – CONScience 2019, 6-8 noiembrie 2019, organizată de Muzeul Național al Satului „Dimitrie Gusti”, Bucureşti (comunicare)

4. Irina Gheorghe, Ionela Avram, Lia-Mara Ditu, Irina Balotescu, Ion Blajan, Venus Mateescu, Petronela Fotea, Violeta Corina Cristea, Ionut Pecete, Veronica Lazar, Carmen Chifiriuc. Biodiversity and enzymatic activity of wood degrading fungi on heritage churches in Transylvania. [RICCCE 21 - 21st Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering Constanta – Mamaia -04-07 sept. 2019].

5. Alina Sirghi, Ionela Sarbu, Irina Gheorghe, Luminita Marutescu, Irina Balotescu, Ion Blajan, Mateescu Venus, Fotea Petronela, Zaharia Daniela, Cristea Violeta Corina, Ionut Pecete, Veronica Lazar, Mariana Carmen Chifiriuc, Biodiversity and enzymatic activity of wood degrading fungi isolated from Transilvanian heritage wooden churches, FEMS 8th Congress of European Microbiologists, 7-11 July 2019, Glasgow, Scotland.

Coordonare Lucrări de licență și disertație

2 lucrări de licență

64

. • Facultatea de Biologie- Caracterizarea fenotipică a tulpinilor de fungi microscopici filamentoși implicați în procese de biodeteriorare a unor obiecte de patrimoniu cultural din lemn - Coord. Șt. Lector dr. Irina Gheorghe

• -Facultatea de Biologie- Caracterizarea fenotipică a unor grupuri de fungi filamentoși implicați în biodeteriorarea unor obiecte de patrimoniu cultural din piatră- Coord. Șt. Lector dr. Irina Gheorghe

• 3 lucrări de disertație – Facultatea de Biologie

o Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor asupra unor specii de fungi filamentoși izolați de pe obiecte de patrimoniu cultural- Coord. Șt. Lector dr. Irina Gheorghe

o Identificarea şi caracterizarea activităţii enzimatice de tip celulazic la specii de fungi microscopici filamentoşi implicaţi în procesul de deteriorare a unor obiecte de patrimoniu cultural din lemn- Coord. Șt. Lector dr. Irina Gheorghe

o Bacterii implicate în degradarea clădirilor de lemn din patrimoniul României- Coord. Șt. Conf.dr.Diana Pelinescu, Îndrumător șt. Lector dr. Ionela Avram

În concluzie, în cadrul acestei etape s-a realizat recoltarea și analiza a unui număr de 314 probe,

dintre care 129 probe de pe obiecte de patrimoniu din lemn, 108 de pe obiecte de patrimoniu cultural din

piatră și 77 de pe obiecte din colecțiile MȚR și Muzeului de Istorie și Arheologie din Tulcea. Au fost

izolate și caracterizate un număr de 375 tulpini fungice şi 120 de tulpini bacteriene, de pe obiectele de

patrimoniu incluse în studiu. Evaluarea activităţii enzimatice împreună cu studiile de microscopie au

permis stabilirea potenţialului de deteriorare a obiectelor/monumentelor de patrimoniu luate în studiu.

Investigarea strategiilor de rezistență ale microorganismelor prin cuantificarea biofilmului, evidenţierea

capsulei şi prin inducerea procesului de sporulare a permis înţelegerea mecanismelor de protecţie prezente

la aceste tulpini, ne vor permite dezvoltarea unor strategii de combatere a acestora.

Rezultatele obţinute în cadrul acestei etape au permis publicarea a 2 brevete de inventie, 3 articole

ISI, 2 postere la conferinţe internaţionale; 1 poster la o conferinţă naţională; 1 prezentare la o sesiunea

ştiinţifică, 5 prezentări la workshop; 2 lucrări de licenţă şi 2 lucrări de dizertaţie.

Pentru această etapă s-au realizat toate activitățile de documentare, experimentale și

administrative prevăzute, necesare pentru întocmirea raportului științific și financiar.

Bibliografie:

1. Blanchette, R.A., 2000. A review of microbial deterioration found in archaeological wood from different environments. Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 189–204.

65

2. Blanchette, R.A., Cease, K.R., Abad, A.R., Koastler, R.J., Simpson, E., Sams, G.K., 1991. An evaluation of different forms of deterioration found in archaeological wood. Int. Biodeterior. Biodegrad. 28, 3–22.

3. Cwalina B., 2014. Biodeterioration of concrete, brick and other mineral-based building materials. In Understanding Biocorrosion: Fundamentals and Applications.

4. Kim, Y.S., Singh, A.P., 2000. Micromorphological characteristics of wood biodegradation in wet environments: a review. IAWA J. 21, 135–155.

5. Koul B., Upadhyay H., 2018. Fungi-Mediated Biodeterioration of Household Materials, Libraries, Cultural Heritage and Its Control. Fungi and Their Role in Sustainable Development: Current Perspectives, 597–615.

6. Șesan T. E., Tănase C., 2006. Concepte actuale în taxonomia fungilor Iași: Editura Universității „Alexandru Ioan Cuza”.

rst – raport științific și tehnic în extenso identităților

Documents