1

Raport științific 

privind  implementarea  proiectului  „Instrumente  nanobiotehnologice  cu  aplicații  în medicina moleculară:  sinteză,  caracterizare  și  studii  in  vitro”  în  perioada  ianuarie  –decembrie 2012 

În conformitate cu planul de activitate propus pentru etapa anuală 2012, au fost efectuate lucrări experimentale ce au dus la îndeplinirea obiectivelor propuse pentru primele 12 luni de desfasurare a proiectului. În următoarele sunt discutate punct cu punct activitățile aferente obiectivelor propuse pentru anul 2012.

Obiectiv 1. Sinteza și funcționalizarea de nanoparticule de aur cu potențiale aplicații în medicina moleculară (LUNILE 1-9 din proiect)

A1.1. Optimizarea metodologiei pentru sinteza nanoparticulelor de aur în scopul obținerii de particule stabile ți de dimensiuni corespunzătoare.

În cadrul activității, nanoparticulele de aur au fost sintetizate prin reducerea HAuCl4 cu un agent reducător, care este un extract obținut din Allium sativum (usturoi). S-au testat mai multe condiții de

reacție pentru identificarea si optimizarea procedurii de sinteza. S-au încercat sinteze atât la temperatura camerei, cât și în condiții de fierbere, s-au utilizat concentrații de HAuCl4 de 10mM, respectiv 0.2 mM si, de asemenea, s-a incercat utilizarea de diferite cantități de agent reducător, precum și folosirea de diferite metode de adăugare a extractului peste sarea de aur, respectiv adăugare „rapidă” si adăugare “lentă” sau “picătură cu picătură”. Metoda care a furnizat rezultatele cele mai bune, adică nanoparticule de dimensiuni sub 20 nm, ale caror solutii coloidale prezinta o stabilitate foarte bună în timp, foloseste ca si temperatură optimă pentru reacție temperatura de fierbere, iar concentrația optimă de sare de aur de 0.2mM. Astfel, pentru sinteza nanoparticulelor, 25 ml de HAuCl4*4H2O 0.2 mM au fost aduși la fierbere, după care cantități diferite de extract de Allium sativum (50 μl, 100 μl, 200 μl, 250 μl, 300 μl, 500 μl, 750 μl, 1000 μl) au fost adăugate sub agitare intensă. Adăugarea rapida, intr-un singur pas, a furnizat rezultate optime cu privire la stabilitatea particulelor fata de adaugarea lenta, picătură cu picătură. Schimbarea culorii de la aproape incolor la diferite nuanțe de roz apare în 20-40 secunde, indicând formarea nanoparticulelor de aur.1-3 Probe de nanoparticule sintetizate vor fi denumite in funcție de cantitatea de extract folosită la sinteză, respectiv 50 μl, 100 μl, 200 μl, 250 μl, 300 μl, 500 μl, 750 μl și 1000 μl . Extractul de usturoi a fost obținut prin fierberea a 20 g caței de usturoi măruntiti, cu 150 ml apa distilată, într-un pahar Erlenmeyer de 250 ml. După 5 minute de fierbere, amestecul a fost decantat, iar supernatantul a fost filtrat și folosit mai departe ca agent reducător pentru obținerea nanoparticulelor.

A1.2. Funcționalizarea nanoparticulelor de aur cu agenți fibrinolitici de interes. Prima încercare constă în utilizarea agentului fibrinolitic atât ca agent reducător, cat și ca agent de funcționalizare și stabilizare.

A1.3. Optimizarea procedurii de funcționalizare a nanoparticulelor de aur (identificare condiții optime de reactie, concentratii optime reactanti).

Practic în studiul de fața s-a reusit atat sinteza cat si funcționalizarea nanoparticulelor intr-o singura etapă, în cadrul activității A1.1. De aceea, activitățile A1.2 si A1.3 au fost îndeplinite odată cu realizarea activității A1.1. Așa cum va fi detaliat în cele ce urmează, agentul fibrinolitic utilizat în cazul de față este extractul de Allium sativum, iar nanoparticulele obținute sunt direct funcționalizate cu substanțe proteice din extract. Pe langa faptul ca este un foarte bun agent fibrinolitic, Allium sativum posedă multe alte efecte benefice pentru sănătate, datorită multitudinii de compuși bioactivi pe care îi conține:4 are efect de scădere a nivelelor de colesterol și trigliceride, acționeaza ca și protector împotriva afecțiunilor cardiovasculare, este un antidiabetic, antihipertensiv, antioxidant si fibrinolitic.5 Protocolul de sinteza utilizat in cazul de fata este de importanta deosebita, deoarece

2

utilizarea nanoparticulelor pentru aplicatii biomedicale necesita particule non-toxice, biocompatibile, iar metodele conventionale de cele mai multe ori implica substante care nu sunt benefice mediului inconjurator sau care nu sunt biocompatibile. Deci, o modalitate de a imbunatati biocompatibilitatea nanoparticulelor este folosirea de agenti de functionalizare biocompatibili, cum ar fi moleculele naturale din plante si microorganisme - proteinele din extractul de Allium sativum in cazul de fata.6-9

Obiectiv 2. Caracterizarea morfologică și structurală a nanoparticulelor de aur obținute utilizând tehnici de spectroscopie ți microscopie (SEM, UV-VIS, FTIR, Raman, SERS)

A2.1. Efectuarea de experimente UV-VIS și SEM în scopul caracterizării morfologice a nanoparticulelor obținute. (LUNILE 6-9 din proiect)

Utilizarea microscopiei electronice de trasmisie (TEM) a fost preferata față de SEM, datorită rezoluției mult mai bune pe care TEM o oferă comparativ cu SEM (0.5 Å comparativ cu 0.4 nm), aspect important in analiza nanoparticulelor. Imediat dupa adăugarea agentului reducător la soluția de HAuCl4, se observă schimarea de culoare de la aproape incolor la diferite nuanțe de roz, în funcție de cantitatea de extract adăugată. Formarea nanoparticulelor de aur este confirmata de spectrofotometic (Figura 1(a), (b)). Soluțiile coloidale obținute absorb radiație în domeniul spectral 528-577 nm, care coincid cu benzile plasmonice de suprafață caracteristice nanoparticulelor de aur.1-3 Pentru potențiale aplicații în demeniul medicinei moleculare, este esențial ca nanoparticulele să fie stabile în timp, adică să nu aibă tendința de agregare. Stabilitatea nanoparticulelor de aur a fost evaluată prin monitorizarea evoluției spectrelor UV-VIS caracteristice în timp, observîndu-se stabilitate foarte bună pentru probele obtinute prin adaugare rapida de extract, pe perioade de cel puțin șase luni (Figura 1(c)). În afară de probele 50 μl și 100 μl rapid care sunt instabile deoarece cantitatea de agent reducător este insuficientă pentru reducerea completă a sării de aur și care nu vor fi luate in discuție în continuare, toate celelelte probe obținute prin adăugare rapidă prezintă o stabilitate foarte bună în timp, mult mai bună față de cele obținute prin adăugare lentă (Figura 1(d)), motiv pentru care experimentele ulterioare vor fi concentrate asupra probelor de nanoparticule obținute prin adăugare rapidă.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 1. spectre de absorbție UV-VIS ale nanoparticulelor sintetizate prin (a) adăugarea rapidă și (b) adăugare lentă de diferite cantități de extract de Allium sativum; evoluția în timp a spectrelor UV-VIS pentru proba (c) 250 μl rapid si (d) 250 μl lent (celelalte probe se comportă similar).

3

Pe baza imaginilor de microscopie electronică TEM (Figura 2) s-a determinat forma și dimensiunile nanoparticulelor. Toate nanoparticulele au formă sferică, cu dimensiuni cuprinse între 6-20 nm, iar dimensiunile medii între 9 nm (proba 1000 μl rapid) și 14 nm (proba 250 μl rapid). Dimensiunea medie scade cu creșterea cantității de agent reducător, informația care confirma datele obținute prin UV-VIS, care la fel indicau dimensiunea cea mai mică pentru proba 1000 μl, informație derivată din observația că maximele de absorbție și lungimea de undă a picurilor descrește cu creșterea cantității de extract.10

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Figura 2. Imagini TEM pentru trei probe reprezentative: (a) 250 μl rapid, (b) 1000 μl rapid, (c) 250 μl lent, precum și distribuția mărimii nanoparticulelor pentru probele (d) 250 μl rapid, (e) 1000 μl rapid, (f) 250 μl lent.

A2.2. Inregistrarea si interpretarea de spectre FTIR si Raman/SERS in scopul caracterizarii structurii moleculare a nanoparticulelor de aur inainte si dupa functionalizare, precum si optimizarea conditiilor de inregistrare a spectrelor acolo unde este necesar.

Spectrele FTIR au fost înregistrate pe intervalul 600-4000 cm-1, cu o rezoluție de 4 cm-1, fiecare spectru fiind obținut prin co-adăugarea a 64 de interferograme. Pentru studiile Raman/SERS, din cele trei lasere cu care este echipat aparatul (633 nm, 785 nm și 1064 nm) s-a identificat ca optimă linia de 633 nm, care a fost folosită la o putere de 17 mW. Laserul a fost focalizat pe probe prin intermediul unui obiectiv 40x Olympus LUCPlanFLN. Spectrele Raman/SERS au fost înregistrate cu o rezoluție de 8 cm-1, fiecare spectru fiind obținut din media a 2 înregistrări, cu timpi de integrare pentru fiecare spectru de 10 secunde.

Utilizarea spectroscopiei FTIR a fost extrem de utilă pentru identificarea agentului de funcționalizare al nanoparticulelor (Figura 3(a)). Spectrul FTIR al Allium sativum prezintă o multitudine de picuri vibraționale, caracteristice unei matrici complexe (după cum se știe conține o multitudine de compuși bioactivi), dintre care se remarca benzile amidă caracteristice proteinelor. Aceste benzi amidă sunt prezente și în spectrul nanoparticulelor obținute pe baza reducerii cu extractul de Allium sativum la 1524, 1651 și 3289 cm-1. În concluzie, rezultatele FTIR demonstrează că agenții de funcționalizare ai nanoparticulelor sunt în principal proteine din extractul de Allium sativum. Extractul funcționează atât ca agent reducător, cât și ca agent de funcționalizare și stabilizare.

Capacitatea nanoparticulelor de aur de a funcţiona ca şi substrat SERS pentru amplificarea semnalului a fost investigată prin folosirea unor molecule reporter, cum ar fi : rodamina 6G (R6G), cristal violetul (CV), para-amino tiofenolul, rodamina 123, albastrul de metilen, 9-amino acridina, acridin orange, roz bengalul. Rezultatele cele mai bune s-a obţinut folosind moleculele de R6G şi CV. Experimentele s-au efectuat în prezenţa şi în absenţa NaCl ca şi agent de agregare. Cromoforii CV şi R6G au fost adăugaţi direct sau după adăugarea prealabilă de 10 μl soluţie 1 M NaCl la 300 μl solutie coloidala de aur, rezultând intr-o concentraţie finală de NaCl de 30 mM. Deoarece s-a

4

identificat că NaCl îmbunătăţeşte intensitatea semnalului SERS, doar spectrele SERS obţinute în prezenţă de NaCl 30 mM sunt prezentate în Figura 3(b). Atât spectrele SERS obţinute instant, cât şi după 24 ore sunt illustrate.

Figura 3. (a) spectre FTIR ale extractului de Allium sativum și ale nanoparticulelor de aur; (b) spectre SERS pentru (i) nanoparticulele de aur imediat după obținere (proba blank, fără fluorofori)–denumită blank; (ii) pentru moleculele de R6G and CV adsorbite pe suprafața nanoparticulelor, spectre înregistrate instant și denumite - R6G instant și CV instant; (iii) pentru moleculele de R6G și CV adsorbite pe suprafața nanoparticulelor, spectre înregistrate după 24 ore si denumite – R6G 24h si CV 24h.

Se poate observa foarte clar o intensificare semnificativă a semnalului SERS după 24 ore. Spectrele instant prezintă picuri foarte mici comparatic cu spectrele SERS după 24 ore. De obicei, este de aşteptat ca semnalul SERS să apară instant.11, 12 Faptul că semnalul maxim apare în acest caz după o zi, este o dovadă că proteinele din extractul reducător de Allium sativum oferă nanoparticulelor un înveliş protector, relativ inert, care este dificil de penetrat, ceea ce dovedeşte că nanoparticulele de aur sintetizate sunt candidaţi foarte buni pentru aplicaţii biologice şi biomedicale, în care asemenea particule inerte şi stabile sunt necesare.

Obiectiv 3. Studii in vitro pe culturi de celule fibroblaste pentru testarea biocompatibilitatii nanoparticulelor de aur cu celulele, a interactiunii nanoparticule-celule, precum si a localizarii nanoparticulelor la nivel celular (LUNILE 9-18 din proiect)

A3.1. Studii de citotoxicitate folosind metoda MTT.

A3.2. Determinarea localizarii nanoparticulelor de aur la nivel celular prin microscopie confocala.

Linia celulară aleasă pentru testarea biocompatibilității și a localizării nanoparticulelor la nivel celular este linia HFL-1 (celule fibroblaste de plămân de fetus uman). Celulele au fost cultivate într-un mediu care conține amestec 1:1 v/v Ham’s F12 și DMEM cu 4.5 g/L glucoză, suplimentat cu 10% FBS (ser fetal), 2 mM glutamină, 1% penicillină și streptomicină, 0.1% amphotericină. Condițiile de cultură implică utilzarea unui incubator pentru culturi celulare cu o atmosferă umedă cu 5% CO2 la 37◦ C. Celulele sunt lăsate 24 ore să se atașeze în vase de cultură cu 96 de godeuri, după care sunt tratate cu opt concentrații diferite de nanoparticule și se mai așteapă încă 24 de ore. După aceasta, metoda MTT de testare a viabilității celulare este aplicată. Metoda este una colorimetrică care imiplică citirea rezultatelor prin utilizarea unui microplate reader (BioTek Instruments, USA). Citirea se face la 550 nm, cu lungimea de undă de referință la 690 nm. Rezultatele testelor MTT (Figura 4(a)) arată că nanoparticulele nu sunt citotoxice, dimpotriva, la concentratii sufficient de mici par chiar sa aiba effect de stimulare a viabilitatii celulare. Faptul ca nanoparticulele nu sunt citotoxice este o condiție esențială atunci când se iau în considerare orice aplicații biomedicale ale particulelor.

5

Pe lângă biocompatibilitate, un alt aspect esențial este studiul internalizării și localizării la nivel celular. Internalizarea nanoparticulelor a fost determinată prin studii de microscopie confocală (Figura 4(b)). Microscopia confocală este o metodă care se bazează pe fluorescență, de aceea nanoparticulele au fost modificate cu o moleculă de fluorofor, respectiv cu rodamină 123 înainte de efectuarea experimentelor. Așa cum se poate observa din figură, nanoparticulele sunt localizate la nivelul citoplasmei celulelor (zonele colorate în roșu reprezintă nucleii celulelor, iar zonele colorate in verde sunt datorate nanoparticulelor modificate cu molecula de rodamină 123).

0. 1.88 4.70 9.40 18 47 94 141 188 2990

20

40

60

80

100

120

140

160

Nanoparticle concentration (*10-11 M)

Via

bili

ty (

% o

f co

ntro

l)

(a) (b)

Figura 4. (a) Rezultatele testelor de citotoxicitate MTT pentru celulele fibroblaste HFL-1 tratate cu nanoparticule de aur în diferite concentrații; (b) imagine obținută prin microscopie confocală care dovedește internalizarea nanoparticulelor de aur în celulele fibroblaste la nivelul citoplasmei (în roșu sunt colorați nucleii celulelor, iar în verde nanoparticulele modificate cu R123).

A3.5. Diseminarea rezultatelor: prezentarea rezultatelor în comunitatea științifică prin intermediul participărilor la conferințe, a elaborării de manuscrise și trimiterea lor spre publicare (publicații ISI/BDI).

Participare cu prezentare orală la conferința EUCMOS 2012 (31st European Congress on Molecular Spectroscopy), 26 - 31 August, 2012, Cluj-Napoca, România (dovada participării, respectiv copie după rezumatul din cartea de abstracturi a conferinței și copie după programul conferinței sunt atașate raportului).

Elaborarea unui manuscris pe baza rezultatelor cele mai semnificative obținute și trimiterea lui spre publicare la revista NANOSCALE, revista cu factor de impact foarte ridicat de 5.914. (copii după dovada submiterii și textul manuscrisului sunt atașate raportului).

REFERINȚE 1. M. C. Daniel and D. Astruc, Chemical Reviews, 2004, 104, 293-346. 2. A. M. Alkilany and C. J. Murphy, Journal of Nanoparticle Research, 2010, 12, 2313-2333. 3. E. C. Dreaden, A. M. Alkilany, X. Huang, C. J. Murphy and M. A. El-Sayed, Chemical Society

Reviews, 2012. 4. K. Rahman, Molecular Nutrition and Food Research, 2007, 51, 1335-1344. 5. M. Corzo-Martinez, N. Corzo and M. Villamiel, Trends in Food Science and Technology, 2007, 18,

609-625. 6. G. S. Ghodake, N. G. Deshpande, Y. P. Lee and E. S. Jin, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,

2010, 75, 584-589. 7. K. B. Narayanan and N. Sakthivel, Advances in Colloid and Interface Science, 2010, 156, 1-13. 8. K. B. Narayanan and N. Sakthivel, Advances in Colloid and Interface Science, 2011, 169, 59-79. 9. S. S. Shankar, A. Ahmad, R. Pasricha and M. Sastry, Journal of Materials Chemistry, 2003, 13, 1822-

1826. 10. W. Haiss, N. T. K. Thanh, J. Aveyard and D. G. Fernig, Analytical Chemistry, 2007, 79, 4215-4221. 11. S. Boca, D. Rugina, A. Pintea, L. Barbu-Tudoran and S. Astilean, Nanotechnology, 2011, 22. 12. N. Leopold and B. Lendl, Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107, 5723-5727. Director proiect, Cristina Coman (Isvoranu)