rolul celulelor stem progenitoare circulante si al receptorilor factorilor de crestere in...

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICIN GENERAL

REZUMAT

TEZ DOCTORAT

Rolul celulelor stem progenitoare circulante

i al receptorilor factorilor de cretere

n diagnosticul i terapia tumorilor cerebrale

CONDUCTOR TIINIFIC

Prof. Univ. Dr. Dricu Anica

DOCTORAND

Bnicioiu Mihai Daniel

Studiile au fost finanate din proiectele:

FONDUL SOCIAL EUROPEAN, COD: POSDRU/6/1.5/S/8

PARTENERIATE IN DOMENII PRIORITARE, COD PROIECT: PNI/ 4.1/41-063/2007

CRAIOVA

2011

2

Investete n oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Axa Prioritar: 1. Educaia i formarea profesional n sprijinul creterii

economice i dezvoltrii societii

Domeniul Major de Intervenie: 1.5. Programe doctorale i postdoctorale n

sprijinul cercetrii

Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecven prin acordarea de

burse doctorale"

Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8

Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie din Craiova

3

CUPRINS

PARTEA GENERAL (STADIUL CUNOATERII)

1. TUMORILE CEREBRALE

1.1 Consideraii generale..............................................................................................................................................................................................................................5

1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale......................................................................................................................................................................................5

1.3 Epidemiologie........................................................................................................................................................................................................................................................6

1.4 Simptomatologie...............................................................................................................................................................................................................................................6

1.5 Diagnostic i investigaii..................................................................................................................................................................................................................6

1.6 Tratamente......................................................................................................................................................................................................................................................................6

1.7 Celulele stem canceroase cerebrale............................................................................................................................. ..............................................7

2. GLIOBLASTOMUL

2.1 Inciden............................................................................................................................. .................................................................................................................................................8

2.2 Etiologie i factori predictivi....................................................................................................................................................................................................8

2.3 Tablou clinic................................................................................................................................................................................................................................................................8

2.4 Biologie molecular.....................................................................................................................................................................................................................................9

2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante n diagnosticul glioblastoamelor............10

3. TIPURI DE TRATAMENT N GLIOBLASTOM

3.1 Terapia chirurgical...................................................................................................................................................................................................................................10

3.2 Radioterapia................................................................................................................................................................................................................................................................10

3.3 Chimioterapia.....................................................................................................................................................................................................................................................11

4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI I LIGANZII LOR

4.1 Familia IGF ..............................................................................................................................................................................................................................................................11

4.2 Familia EGF..............................................................................................................................................................................................................................................................12

4.3 Familia PDGF........................................................................................................................................................................................................................................................12

4.4 Familia VEGF........................................................................................................................................................................................................................................................12

PARTEA SPECIAL (STUDIU EXPERIMENTAL)

5. OBIECTIVE......................................................................................................................................................................................................................................................13

6. MATERIAL I METOD..............................................................................................................................................................................................14

6.1 Materiale...........................................................................................................................................................................................................................................................................14

6.2 Celule i culturi celulare.................................................................................................................................................................................................................14

6.3 Tratarea celulelor...........................................................................................................................................................................................................................................14

6.4 Determinarea viabilitii celulare............................................................................................................................. ...................................................15

6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2) .............................................................................. ....................15

6.6 Western Blotting.............................................................................................................................................................................................................................................16

6.7 Citometrie de flux.........................................................................................................................................................................................................................................16

6.8 Analiza statistic.............................................................................................................................................................................................................................................17

7. REZULTATE.................................................................................................................................................................................................................................................17

8. DISCUII................................................................................................................................................................................................................................................................28

9. CONCLUZII.....................................................................................................................................................................................................................................................31

BIBLIOGRAFIE SELECTIV..................................................................................................................................................................................32

4

INTRODUCERE

n ciuda descoperirilor recente din lumea medical, una dintre principalele cauze de

mortalitate i morbiditate n intreaga lume o reprezint cancerul. n ara noastr, incidena

tumorilor cerebrale maligne este de 4,3/100000 locuitori, ele constituind 2% din totalitatea

neoplaziilor la adult, mortalitatea general fiind de 4,65/100000 locuitori. (Iacob et al. 2004).

n aceast tez de doctorat, cercetarea a fost restrns la studierea unor aspecte

neelucidate nc, referitoare la clasa tumorilor cerebrale. Tumorile cerebrale prezint o mare

varietate ca tip, localizare, rat de cretere i sunt extrem de heterogene din punct de vedere

fenotipic i genotipic. Cea mai frecvent i cea mai agresiv tumor cerebral la aduli este

reprezentat de glioblastomul multiform, caracterizat de o cretere rapid i de capacitatea de a

infiltra esuturile adiacente, avnd o rat medie de supravieuire de aproximativ 14 luni.

Lucrarea de fa este un rspuns la necesitatea observat i prin studierea literaturii de

specialitate n ceea ce privete diagnosticul i terapia tumorilor cerebrale. Acest domeniu este n

continuu cercetat i are extraordinar de multe aspecte neexploatate nc. n aceste condiii, am

considerat oportun sa elucidez, mcar n parte, urmtoarele probleme legate de

- corelaia dintre gradul tumoral i numrul de celule endoteliale progenitorii circulante,

- efectul produs de inhibitorul STI571 (Imatinib mesylate) asupra celulelelor de

glioblastom n vitro i

- evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare S-adenozil-metionina (SAM)

asupra tumorilor cerebrale de grad nalt (high grade glioma, HGG) i a interferenei cu expresia

IGF-1R n vitro.

La finalizarea acestei teze, doresc sa menionez c lucrarea de fa nu ar fi putut fi dus la

bun sfrit fr ndrumarea competent i susinut a doamnei Prof. Dr. Anica Dricu,

conductorul meu de doctorat, creia i adresez sincere mulumiri.

Cuvinte cheie:tumori cerebrale, celule stem progenitoare circulante, receptori ai

factorilor de cretere.

5

PARTEA GENERAL (STADIUL CUNOATERII)

1. TUMORILE CEREBRALE

1.1 Consideraii generale

Dei cele mai recente tratamente mpotriva cancerelor controleaz creterea i

proliferarea celulelor tumorale, acestea nu sunt capabile de a eradica n totalitate masa de celule

tumorale (Schulenburg 2006). Metodele terapeutice folosite n tratamentul tumorilor cerebrale

sunt foarte variate i alegerea lor este dictat de factori precum vrsta pacientului, dimensiunea i

localizarea tumorii sau rata de cretere estimat postterapeutic. n prezent, biologia tumorilor

cerebrale este incomplet cunoscut, mai ales n ceea ce privete relaia cu parenchimul adiacent

indemn.

1.2 Clasificarea tumorilor cerebrale

n conformitate cu clasificarea WHO, Organizaia Mondial a Sntaii (WHO) a

clasificat tumorile cerebrale astfel:

1. Tumori neuroepiteliale: a) Tumori gliale; b) Tumori neuronale i neuronal-gliale

mixte; c) Tumori nongliale

2. Tumori meningeale: a) Meningioame; b) Hemangiopericitoame; c) Leziuni

melanocitice

3. Tumori ale celulelor germinale:a) Germinoame; b) Carcinoame embrionare;

c)Tumori ale sinusului endodermal; d) Coriocarcinoame; e) Teratoame; f) Tumori mixte ale

celulelor germinale

4. Tumori ale regiunii selare: a) Adenoame pituitare; b) Carcinoame pituitare;

c)Craniofaringioame

5. Tumori cu histogenez nesigur:

6. Limfomul primar al SNC

7. Tumori ale nervilor periferici ce afecteaz SNC:

8. Tumorile metastatice

6

Glioamele maligne reprezint o clas de tumori cerebrale care include mai multe entiti

heterogene cu origine comun, derivnd din celulele gliale. Din punct de vedere histopatologic,

glioamele sunt clasificate n astrocitoame, oligodendroglioame, oligoastrocitoame i tumori

ependimale.

Glioblastoamele sunt stadializate n 4 grade, gradul IV fiind reprezentat de glioblastomul

multiform cu gradul cel mai nalt de malignitate, acesta fiind cea mai agresiv i cea mai

frecvent form, fiind caracterizat prin celularitate intens, activitate mitotic, proliferri

microvasculare i necroz (Louis et al. 2007).

1.3 Epidemiologie

Etiologia tumorilor cerebrale este necunoscut pn n prezent. Totui sunt cteva

sindroame ereditare familiale care au fost asociate cu apariia tumorilor cerebrale primare:

neurofibromatoza 1 i 2, sindromul Li-Fraumeni i sindromul Turcot (Louis and von Deimling

1995).

1.4 Simptomatologie

Creterea masei tumorale determin semnele specifice hipertensiunii intracraniene i

simptome nespecifice ale tumorilor cerebrale precum: convulsii, hemipareze, dificulti de

vorbire, tulburri de personalitate, crize convulsive aceast simptomatologie depinznd de

localizarea tumorii.

1.5 Diagnostic i investigaii

Diagnosticul de certitudine al tumorilor cerebrale este histopatologic i se pune dup

analiza unui fragment de esut tumoral n urma unei biopsii. De asemeni, investigaiile imagistice

au o importana deosebit n stabilirea diagnosticului, examinarea tomografiei computerizate

(CT) furniznd date importante n legtur cu diametrele, localizarea i caracteristicile tumorii,

iar rezonana magnetic nuclear (RMN) permite identificarea cu precizie a caracteristicilor

tumorale ct i raporturile acesteia cu structurile anatomice nvecinate. Spectroscopia prin

rezonan magnetic (RMS) este o metod imagistica relativ nou ce vizualizeaz distribuia

regional a substanelor chimice asociate cu metabolismul tumoral i modificrile biochimice.

1.6 Tratamentul tumorilor cerebrale

Terapia standard pentru patologia tumoral cerebral este reprezentat de chirurgie,

radioterapie i chemoterapie, aceste metode avnd ns o specificitate redus pentru celulele

7

tumorale precum i efecte adverse semnificative. n plus, ele pot determina apariia de novo a

unei alte tumori.

Chirurgia reprezint n prezent principala modalitate de tratament a tumorilor cerebrale.

Radioterapia s-a dovedit util n tratamentul majoritii tumorilor cerebrale i a

metastazelor. Radioterapia poate fi util ca i monoterapie, pre- sau postoperator, sau n asociere

cu chimioterapia.

Dezavantajele chimioterapiei sunt reprezentate de rezistena intrinsec la agenii

chimioterapici i de dezvoltarea chimiorezistenei pe parcursul tratamentului. De aceea se

recurge adesea la tratamente care utilizeaz combinaii dintre diferii ageni chimioterapici.

1.7 Celulele stem canceroase cerebrale

Conform teoriei moderne, transformarea malign a celulei normale n celula canceroas

se petrece la nivelul celulelor stem existente n esutul adult. n pofida cercetrilor intense din

ultima perioad, originea exact a celulelor stem canceroase (CSC) rmne necunoscut.

n tumorile cerebrale, celulele stem canceroase se gsesc n procent de 1% pn la 30%

i, conform datelor publicate n literatura de specialitate, prezint proprieti similare celulelor

stem neurale (Beier et al. 2007) .n prezent, markerii de suprafa ai celulelor stem canceroase au

fost identificai n numeroase tipuri de cancere.

La nivel molecular, o etap important n apariia celulelor stem tumorale (CST) ar putea

fi reprezentat de alterarea cilor de autoregenerare a celulelor stem adulte existente n tesutul

cerebral. n tumorile cerebrale sunt afectate deopotriv cile proliferrii i diferenierii celulare,

ct i mecanismele morii celulare. Proto-oncogenele sunt convertite n oncogene i devin

amplificate sau sufer mutaii activatoare.

Conceptul ca dezvoltarea i progresia tumorala s depind de evoluia CST schimb

dramatic posibilitile prin care boala canceroas poate fi vindecat. Identificarea i terapia intit

mpotriva CST reprezint o provocare major n terapia modern anticanceroas, cercettorii

ncercnd s gseasc noi terapii molecular intite mpotriva acestor celule.

8

Figura 1. Terapia intit mpotriva CST. Noul tip de terapie tumoral

2.GLIOBLASTOMUL

2.1.Incidena

Glioamele maligne sunt cele mai frecvente tipuri de tumori cerebrale primare la aduli n

unele studii, fiind relatate ca reprezentnd aproximativ 50% din tumorile cerebrale primare,

glioblastomul fiind cel mai ntlnit subtip histologic la aduli (Lonn et al 2005).

2.2. Etiologie i factori predictivi

Glioblastomul primar apare cu predilecie la aduli, cu vrsta ntre 40 i 70 ani, brbaii

fiind mai frecvent afectai. Radiaiile ionizante au fost de asemenea asociate cu o probabilitate

crescut de apariie a acestuia (Ohgaki and Kleihues 2005).

2.3. Tablou clinic

Simptomatologia glioblastoamelor primare se instaleaz relativ rapid, n mai puin de 3

luni, n cazul glioblastoamelor secundare istoricul clinic al bolii fiind mai lung - intre 1 i 5 ani

(Ohgaki and Kleihues 2005). Cele mai frecvente localizri sunt: lobul frontal, lobul parietal,

lobul temporal i lobul occipital.

Simptomatologia poate fi nespecific, cuprinznd semnele presiunii crescute

intracraniene sau specific localizrii tumorii. Simptome generale cuprind: cefalee, vrsturi,

tulburri vestibulare, crize comiiale.

9

2.4. Biologie molecular

Procesul de transformare neoplazic const n modificri la nivelul oncogenele, genelor

supresoare tumorale, genelor ce sunt implicate n repararea AND-ului celular i genelor ce

mediaz ciclul celular i apoptoza.

Glioblastoamele primare se caracterizeaz prin amplificarea sau supraexpresia EGFR

(receptorul factorului de cretere epidermal) i supraexpresia MDM2, LOH 10q (mutaii ale

genelor PTEN i RB1), mutaii ale genei TP53 fiind gsite mai rar n acest grup de tumori

(Ohgaki and Kleihues 2007). n cazul astrocitoamelor de grad inferior frecvent apar mutaii ale

genei TP53, acestea fiind cele mai timpurii alterri genetice detectate. De asemenea,

supraexpresia factorului de cretere plachetar (PDGF) este un eveniment timpuriu n dezvoltarea

astrocitoamelor de grad inferior. n progresia ctre glioblastomul secundar grad IV, LOH 10q

intervine ca un eveniment tardiv.

Mutaiile genetice pot aprea i progresiv, de la tumorile de grad inferior, grad II ctre

cele de grad III i apoi ctre glioblastomul secundar, grad IV. Durata pn la progresia ctre

gradul IV poate varia ntre 1 i 5 ani.

Figura 2. Progresia de la glioamele cu grad mic de malignitate la glioblastomul primar si

secundar.

10

2.5 Rolul celulelor stem progenitoare circulante n diagnosticul glioblastoamelor

Glioblastoamele sunt caracterizate de o neovascularizaie bogat, ce joac un rol deosebit

de important n dezvoltarea i progresia tumoral. Celulele endoteliale progenitorii (CEP) sunt

celule derivate din mduva hamatogen i au proprietatea de a se diferenia n celule endoteliale

mature. Fenotipul CEP este caracterizat de expresia markerului specific hematopoietic CD34,

markerul specific celulelor stem CD133 i a markerului endotelial VEGFR2 (Peichev et al.

2000). Eliberarea i mobilizarea CEP este influenat de factorii de cretere pro-angiogenici

(Kalka et al. 2000).

Rafat et al. a desfurat un studiu n care a inclus pacieni cu glioblastom (GBM) i

pacieni cu metastaze cerebrale, numrul de CEP circulante fiind semnificativ crescut la pacienii

cu GBM fa de cei cu metastaze i fa de grupul control.

Dei mecanismele fiziopatologice prin care intervin i influenteaz angiogeneza i

progresia tumoral nu sunt pe deplin cunoscute, CEP s-au dovedit a fi un potenial marker att

pentru neoangiogeneza tumoral ct i pentru rspunsul la terapia antiangiogenic.

3. TIPURI DE TRATAMENT N GLIOBLASTOM

3.1 TERAPIA CHIRURGICAL

Intervenia chirurgical are un rol important n managementul terapiei glioblastomului.

Scopurile interveniei chirurgicale sunt obinerea materialului bioptic necesar examenului

histopatologic i extirparea tumorii n scop curativ. Glioblastomul ct i astrocitomul de grad III

WHO sunt tumori cu caracter infiltrativ, marginile tumorii fiind neregulate i insotite de edem

peritumoral, astfel o rezecie total fiind greu de realizat.

3.2 RADIOTERAPIA

3.2.1 Radioterapia convenional

Tratamentul standard dup rezecia total sau parial a tumorilor de grad III sau IV este

radioterapia extern fracionat. Recomandrile actuale sunt administrarea unor doze totale de

50-60 Gy, n fraciuni de 1.8-2.0 Gy pe zi, cinci zile pe sptmn, timp de 6 sau 7 sptmni

(Laperriere et al. 2002).

11

3.2.2 Radioterapia streotactic

Avantajele radioterapiei stereotactice sunt reprezentate de faptul c dozele de radiaii sunt

mai mici decat cele utilizate n radioterapia fracionat, datorit direcionrii mai precise a

radiaiilor pe direcia masei tumorale. Metoda are eficacitate crescut, iar riscul lezrii esutului

normal adiacent este mai scazut. Dou din metodele de tratament ale radioterapiei stereotactice

sunt Gamma knife i Cyberknife.

3.2.3 Alte modaliti de radioterapie

BNCT (boron neutron capture therapy) este o metod de tratament promitoare n terapia

glioblastomului, dar deocamdat este nca la nivel experimental (Joensuu et al 2003). BNCT se

bazeaz pe capacitatea particulelor de 10B de a capta neutroni termici i de a determina

dezintegrarea acestora n particule i nuclei de litiu.

Radioterapia hiperfracionat ce utilizeaz mai multe doze mici de radiaie pe parcursul

unei zile i creterea dozei totale pn la 70 Gy, nu a mbuntit supravieuirea pacienilor cu

glioame maligne (Prados et al 2001).

3.3 CHIMIOTERAPIA

Trialurile clinice ce au comparat radioterapia versus radioterapie plus chimioterapie au

aratat o cretere a duratei medii de supravieuire n cazul folosirii radioterapiei i chimioterapiei

adjuvante (Stewart et al 2002). Cea mai utilizat combinaie medicamentoas este numit PCV i

este format din procarbazin, lomustin i vincristin (Stupp et al 2005).

Inhibarea genei MGMT asociat cu rezistena la ageni alchilani s-a dovedit a fi un factor

important n cretererea ratei de supravieuire. (Heigi et al 2004).

4. RECEPTORII TIROZIN-KINAZICI I LIGANZII LOR

4.1 Familia IGF. Liganzii i receptorii IGF

Factorul de cretere insulinic de tip 1 (IGF-1) este o protein codificat de gena IGF1

aflat pe cromozomul 12. IGF-1 este sintetizat n principal n ficat i producerea sa este

stimulat de hormonul de cretere (GH). IGF-1 i receptorul su specific IGF-1R sunt implicai

n stimularea creterii celulare, proliferare i inhibarea apoptozei. IGF-1R deine un rol important

n meninerea fenotipului malign, supraexpresia sa fiind exprimat n mai multe tipuri de

cancere.

12

4.2 FAMILIA EGF. Liganzii i receptorii EGF

EGFR (receptorul factorului de cretere epidermal) este un receptor tirozinkinazic,

implicat n stimularea diviziunii celulare, proliferare i invazie. Gena EGF prezint amplificri i

supraexpresie n aproximativ 40% din cazurile de glioblastom, majoritatea primar (Ekstrand

et.al. 1992).

Cea mai comun mutaie a EGFR este EGFRvIII, mutaie ce const n deleia exonilor 2

7, rezultnd o variant de receptor fr domeniul de legare ligand-specific funcional.

4.3 FAMILIA PDGF. Liganzii i receptorii PDGF

Liganzii factorului de cretere derivat din plachete: PDGF-A, -B, -C,-D, sunt recunoscui

de dou tipuri de receptori PDGFR- (specifici celulelor tumorale) i PDGFR- (specifici

vaselor tumorale) localizai pe membrana celulara. Supraexpresia PDGFR- apare frecvent n

glioamele cu grad sczut de malignitate i este implicat n progresia acestora ctre

glioblastomul secundar. Supraexpresia PDGFR- este frecvent nsotit i de LOH 17p i deleia

genei TP53.

4.4 FAMILIA VEGF. Liganzii si receptorii VEGF

Liganzii familiei VEGF (VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D) influenteaz

rspunsul celular prin legarea de receptorii specifici VEGFR 1, VEGFR 2, VEGFR 3, sunt

activai prin transfosforilare. n procesul angiogenezei, cea mai important izoform este VEGF

A, ce are rol n stimularea migrrii i mitozei celulelor endoteliale, n formarea lumenului

vaselor de neoformaie i stimularea migrrii monocitelor i macrofagelor. VEGF B are rol in

angiogeneza embrionar, iar VEGF C SI VEGF D au rol n angiogeneza vaselor limfatice.

Niveluri crescute de VEGF au fost detectate n zonele necrotice cu hipoxie accentuat la

pacienii cu glioblastom. De asemeni, nivelurile crescute de VEGF au fost asociate cu o

progresie rapid tumoral i un prognostic rezervat.

13

PARTEA SPECIAL (STUDIUL EXPERIMENTAL)

5. OBIECTIVE

OBIECTIVUL NR. 1 - Evaluarea numrului de CEP circulante la pacienii cu

glioblastom, comparativ cu pacienii diagnosticai cu tumori cerebrale de grad mic;

Motivaia studiului: n procesul de neoangiogenez, proces important n creterea i

invazia glioblastomului, un rol important l joac eliberarea i mobilizarea celulelor progenitorii

endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogen. Un nou concept aprut recent ar fi

c celulele tumorale pot produce diverse semnale moleculare ce pot elibera i mobiliza CEP

circulante la locul tumorii, unde au ca scop stimularea neoangiogenezei. n plus, markerii de

suprafaa ai celulelor stem canceroase au fost identificai n numeroase tipuri de cancere,

evideniindu-se importana pe care o au n diagnosticarea cancerului

OBIECTIVUL NR. 2 - Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571

asupra celulelor de glioblastom in vitro;

Motivaia studiului: inte terapeutice specifice n esuturile maligne sunt reprezentate i

de receptorii tirozinkinazici i receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste

proteine au o expresie nalt la nivelul esutului malign. Exist la aceast or diferite modaliti

de inactivare a receptorilor tirozinkinazici cum ar fi: anticorpi monoclonali, inhibitori cu

molecul mic, peptide sintetice, siRNA etc. Un inhibitor cu molecul mic, utilizat la aceasta

or ca tratament n diferite forme de cancer, este STI571 (Imatinib mesylate). STI571 se

folosete n tratamentul leucemiei limfoblastice acute, dar i alte tipuri de cancere cum ar fi

tumorilor stromale gastrointestinale sau cancerul pancreatic. Nu este ns foarte bine elucidat

rolul su n tratamentul glioblastomului.

OBIECTIVUL NR. 3 - Evaluarea efectului citotoxic al agentului de metilare SAM

asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) i a interferenei cu

expresia IGF-1R in vitro.

Motivaia studiului: Studii anterioare au artat ca S-adenozil-metionina (SAM),

principalul donor de grupri metil n numeroase procese biologice, induce moartea celulelor

canceroase prin modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii tiintifice sugereaz, c

SAM inhib efectul mitogen al factorilor de cretere n celulele canceroase. De asemenea,

studiile anterioare demonstreaz importana IGF-1R n supravieuirea i proliferarea celulelor de

glioblastom.

14

6. MATERIAL I METOD

6.1 Materiale

Materialele utilizate n studiu au avut urmatoarele proveniene: reactivii utilizai pentru

tratarea culturilor celulare -: Invitrogen/Life Technologies, Inc.(Rockville, MD, SUA), Bovine

serum albumin (BSA) - Sigma (St. Louis, MO, USA), STI571 - Novartis Pharmaceuticals Corp.

(Basel, Switzerland). IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF i FGF-2 - R&D Systems

(Abington, UK). Kitul MTT - Roche Diagnostics Gmbh (Mannheim, Germany),

SAdenosylmethyonina (SAM) - New England Bio-labs.

6.2 Celule i culturi celulare

Linia celular BT1GB a fost etablat din segment tumoral colectat de la pacient cu

glioblastom n concordan cu procedurile standard. Culturile celulare primare 18 i 38 au fost

etablate din tumori cerebrale cu grad nalt de malignitate (HGG), la Spitalul Universitii

Uppsala, n concordan cu procedurile standard.

Toate liniile celulare au fost cultivate n mediu Minimum Essential Modified (MEM) ce

conine 10% ser fetal bovin (FBS), 2mM glutamin i antibiotic (100UI/ml penicilin i

100UI/ml streptomicin). Celulele au fost cultivate n recipiente de culturi de celule de diferite

dimensiuni, n role Petri, avnd diametrul de 35mm, 60mm i 150mm sau n plcue cu 96 de

godeuri (n funcie de tipul fiecrui experiment), i au fost meninute n incubator umidifiat la

37C , 95%O2 i 5%CO2.

6.3 Tratarea celulelor

Celulele de glioblastom BT1GB au fost cultivate n MEM ce conine 10% ser fetal bovin

(FBS) suplimentat cu 2mM glutamin i antibiotic (100UI/ml penicilin i 100UI/ml

streptomicin). Celulele au fost cultivate n sticle de culturi celulare de 200ml. Dup atingerea

confluenei, celulele au fost tripsinizate apoi au fost transferate n plcue cu 96 de godeuri (n

funcie de designul fiecrui experiment) i meninute n incubator umidifiat la 37C, 95%O2 i

5%CO2. Pentru determinarea dozei-rspuns, celulele au fost cultivate n condiii standard de

cultur (mediu complet cu 10% FBS i suplimente) i tratate cu STI571 0.3125M, 0.625M,

1.25M, 2.5M, 5M, 10M, 20M, 40M, 60M sau 80M, la interval de 24 de ore, timp de

3 zile. STI571 a fost diluat n ap. S-a folosit o soluie stoc de 100 mM care a fost pstrat la -

20C. Controlul a constat din celule netratate, cultivate n condiii standard de cultur.

Viabilitatea celular a fost apoi analizat dup 72h. Pentru determinarea rolul factorilor de

15

cretere asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571, celulele au fost splate de dou ori

cu fosfat cu soluie tampon salin i incubate cu mediu cu 1% ser cu sau fr adaos de 50ng/ml

IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF i FGF-2 i tratate cu 1.25M, 2.5M, 5M sau 10M

STI551 la interval de 24 de ore, timp de 3 zile. Factorii de cretere au fost diluai n ap. S-a

folosit o soluie stoc de 1g/ml care a fost pstrat la 20C. Controlul a constat din celule

netratate, cultivate n condiii standard de cultur. Dup 72h a fost analizat viabilitatea celular.

Un numr de 15x103celule/godeu/200l mediu de cultur au fost cultivate pe plcue cu 96 de

godeuri, incubate timp de 8h i tratate cu diferite concentraii de STI571 i/sau factori de

cretere.

Liniile celulare de HGG, 18 i 38, au fost cultivate n MEM ce conine 10% ser fetal

bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamin i antibiotic (100UI/ml penicilin i 100UI/ml

streptomicin). Celulele au fost cultivate n sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost

transferate n placue cu 96 de godeuri (4x103 celule/godeu) n 0.2 ml de mediu MEM standard

cu diferite concentraii de SAM (0.1 M, 1 M, 10 M, 25 M, 50 M, 75 M, 100 M, 150

M sau 200 M) i incubate pe un interval de 7 zile, dupa care a fost analizat viabilitatea

celular. Viabilitatea celulara a fost determinat i prin numararea zilnic a celulelor n arii

marcate n prealabil, timp de 7 zile de la tratarea celulelor.

n toate experimentele efectuate n studiu au fost introduse grupuri de control, n care

celulele au fost tratate numai cu substanele folosite pentru diluie.

6.4.Determinarea viabilitatii celulare

Viabilitatea celular a fost determinat i prin numararea zilnica a celulelor. n acest

scop, celulele au fost cultivate n sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost transferate n

role Petri, avnd diametrul de 35mm. Pe partea exterioar a fundului rolelor Petri au fost n

prealabil marcate anumite zone, n care apoi au fost numrate celulele la intervale de timp

precizate anterior. Procentul de celule care au supravieuit la intervalele de timp indicate n

experiment a fost apoi calculat prin raportare la numarul iniial de celule.

6.5 Determinarea timpului de dublare a celulelor (T2)

Liniile celulare de HGG 18 i 38, au fost cultivate n MEM ce conine 10% ser fetal

bovin (FBS) suplimentat cu 2mM glutamin i antibiotic (100UI/ml penicilin i 100UI/ml

streptomicin). Celulele au fost cultivate n sticle de culturi celulare de 200ml apoi au fost

16

transferate transferate n role Petri, avnd diametrul de 35mm, la o densitate de 1000cel/ml.

Celulele au fost cultivate n condiii standard timp de 7 zile, apoi au fost numrate zilnic, iar T2

a fost calculat prin metoda regresiei liniare, utiliznd mai multe puncte de timp. La sfritul

experimentului, T2 a fost calculate prin utilizarea a dou puncte de timp, cu aplicarea formulei:

T2 = txln2/ln(N/N0 + 1) Unde: t = durata experimentului

N0 = numrul iniial de celule

N = este creterea numarului de celule pe durata experimentului

6.6. Western Blotting

Separarea i detecia proteinelor a fost determinat prin metoda Western Blot, desfurat

n trei etape distincte.

Prima etap este reprezentat de separarea amestecului de proteine prin electroforez pe

un gel poliacrilamidic (PAGE). Cu ajutorul unui cmp electric, proteinele sunt apoi transferate

pe o membran de nitroceluloz.

n urmtoarea etap are loc tratarea proteinelor din membran cu o soluie care conine

anticorpii primari, specifici pentru proteinele studiate. Proteinele sunt apoi blocate cu anticorpul

secundar, care se leag de anticorpul primar formnd astfel un complex de molecule de anticorp.

Ultima etap este reprezentat de detecie, care consta n amplificarea semnalului prin

metoda chemiluminiscenei.

n cazul experimentelor efectuate pentru actualul studiu, celulele au fost lizate n soluia

de lizare. Lizatul a fost centrifugat pentru ndeprtarea componentelor insolubile. Proteinele au

fost cuantificate cu ajutorul kit-ului Bio-Rad Dc. Cantiti egale de protein au fost separate pe

geluri SDS-PAGE 10% i ulterior transferate pe membrane Immobilion-P PVDF (Millipore).

Membranele au fost blocate cu lapte praf degresat 5% dizolvat n soluie salin Tris ce conine

0,1% Tween 20 (TBST), apoi au fost incubate cu anticorp primar diluat n lapte praf degresat 1%

diluat n TBST, incubate apoi cu anticorp secundar legat de peroxidaz diluat la rndul su n

lapte praf degresat 1% diluat n TBST. Ulterior a fost folosit sistemul de detecie ECL pentru

determinarea Western Blot a anticorpului n conformitate cu instruciunile productorului.

6.7. Citometrie de flux

Pentru identificarea i cuantificarea celule progenitorii endoteliale (CPE), celulele n

suspensie au fost marcate fluorescent i apoi au fost analizate prin citometrie de flux. Pentru

17

cuantificarea CPE circulante prin FACS (sortare celular activat fluorescent), sangele periferic

este incubat cu anticorpi conjugai fluorescent mpotriva CD45, CD34, CD31, CD133 sau

VEGFR2. Pentru fiecare procedur de izolare vor fi folosii markeri de control corespunztori.

Dupa filtrare, numrul de celule CD45-/CD31+/ CD34+ i CD45-/ CD31-/CD34-/

CD133+/VEGFR2+ au fost cuantificate i exprimate ca celule/ml de snge, folosind CyFlow SL

flow cytomoter i sotware-ul FlowMax. Pentru fiecare msurare au fost nregistrate 100.000

evenimente.

6.8.Analiza statistic

Toate datele reprezit media deviaia standard. Datele au fost analizate folosind testul t

ANOVA . Valorile p< 0.05 au fost considerate semnificative statistic.

7.REZULTATE

7.1 Numarul de CEP circulante este semnificativ mai mare la pacientii cu

glioblastom comparativ cu pacientii diagnosticati cu tumori cerebrale de grad mic.

n studiu au fost evaluate valorile CEP n sngele periferic colectat de la 12 pacieni: 4

pacieni cu glioblastom (grad IV WHO) i 8 pacieni cu tumori cerebrale cu grad mic de

malignitate (grad I, II WHO).

Dintre acetia, 1 pacient a fost diagnosticat cu meningiom meningotelial, 1 pacient cu

meningiom tranziional, 2 pacieni cu meningiom microchistic, 1 pacient cu meningiom cu celule

clare, 2 pacieni cu meningiom i 1 pacient cu meningiom psamomatos.

Pacienii inclui n studiu au fost operai la Clinica de Neurochirurgie a Spitalului

Bagdasar Arseni Bucuresti i au avut confirmat diagnosticul histopatologic.

Determinarea valorilor celule endoteliale progenitorii (CEP) circulante din sngele

periferic, colectat de la pacieni cu tumori cerebrale, a fost fcut folosind anticorpi monoclonali

mpotriva CD45 (pentru excluderea celulelor hematopoietice) i markeri endoteliali CD31,

CD34, CD133 i VEGF R2, conjugai direct cu fluorocromii Pacific-Blue, FITC, PE, PercPsi

APC. CEP circulante (definite ca celule CD45-/CD31+/CD34+/CD133+/VEGF R2+ ) au fost

cuantificate i exprimate ca numr de celule/mL de snge, folosind five-colour flow cytometry.

Analizarea datelor a nceput dup achiziia a 100.000 de evenimente. Din totalul de celule

a fost izolat populaia limfocitar (Fig.3.segmentul I), apoi populaia CD45- (Fig.3 segm..II) a

fost selectat pentru marcarea cu CD31 i CD34 (Fig.3. segm. III). n final, n Fig.3

18

segmentul.IV, a fost selectat populaia celular prezentnd coexpresia CD133+ VEGFR2+.

Etapele parcurse au fost aceleai, indiferent de tipul de tumora cerebrala, iar pentru exemplificare

a fost selectat doar experimentul ce a folosit meningiomul meningotelial.

Figura 3. .Numarul de CEP circulante pentru pacientul cu meningiom meningotelial

Rezultatele noastre au artat c nivelurile de CEP au fost semnificativ (p

19

7.2 Determinarea efectului produs de tratamentul cu STI571 asupra celulelelor de

glioblastom n vitro

n celulele aparinnd liniei BT1GB, citotoxicitatea produs de tratamentul cu STI571 a

fost dependent de doza utilizat. Supravieuirea celulelor a fost determinat la 3 zile dup

tratament.

n primul set de experimente, a fost evaluat doza raspuns dup tratamentul cu STI571 (Figura

5). Celulele BT1GB au avut o rat de supravieuire ce a sczut constant de la 98% dup

tratamentul cu 0.3125M, pn la 8.8% dup tratamentul cu 40M M STI571. Peste aceast

concentraie, rata de supravieuire a sczut foarte puin, pn la 7% n cazul concentraiei 80M

M STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control.

0

20

40

60

80

100

120

0 mM

0.31

25 m

M

0.62

5 mM

1.25

mM

2.5

mM

5 mM

10 m

M

20 m

M

40 m

M

60 m

M

80 m

M

Pro

cent din

contr

ol

STI571

Figura 5. Doza-rspuns dup tratamentul cu STI571. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele

reprezint medie +/- deviaie standard a dou experimente independente.

Apoi, a fost determinat efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom

cultivate n condiii standard sau fr nutrieni (Figura 6). Din grafic, se observ c procentele de

supravieuire ale celulelor meninute n condiii standard au sczut constant odat cu creterea

concentraiei de STI571, dar valorile obinute au fost mai mari dect cele obinute n cazul

celulelor tratate cu STI571 si cultivate n mediu cu 1% FBS. Pentru exemplificare, dup

tratamentul cu 10M STI571, celulele BT1GB cultivate n mediu cu 1% FBS au supravieuit n

procent de 32,2%, iar cele cultivate n condiii standard au supravieuit n procent de 59,2%.

Datele reprezint medie +/- deviaie standard a dou experimente independente. Toate rezultatele

obinute au fost semnificative statistic (p 0,005).

20

Figura 6. Efectul tratamentului cu STI571 asupra celulelor de glioblastom cultivate n condiii standard sau fr

nutrieni. Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezint medie +/- deviatie standard a dou

experimente independente.

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 in conditii standard (p 0,005

n urmtorul set de experimente, am observat efectul stimulativ al factorilor de cretere

IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra celulelor de glioblastom (Figura 7).

Creterea celular a celulelor BT1GB cultivate n mediu cu 10% FBS a fost de 0,98 ori mai mare

dect a celulelor cultivate n mediu cu 1% FBS. Adugarea factorilor de cretere a indus o

cretere a proliferrii celulare, comparativ cu cea celulelor cultivate n mediu cu 1% FBS, dar

mult mai mic dect n cazul celulelor BT1GB cultivate n mediu cu 10% FBS.

Figura 7. Efectul stimulrii cu IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 asupra creterii celulelor

de glioblastom . Rezultatele sunt prezentate ca procent din control. Datele reprezint medie +/- deviatie standard a

dou experimente independente.

Rezultatele semnificative statistic comparative cu controlul (p 0,005)

Este cunoscut faptul c activarea IGF-1R de ctre ligandul su, IGF-1, duce la activarea

receptorului, care la rndul su produce un efect anti-apoptotic n celulele maligne.

0

20

40

60

80

100

120

Control 2.5 uM 5 uM 10 uM

Pro

cent din

contr

ol

1%S

10%S

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1%S

10%

S

1%S+

IFG1

1%S+

PDGF-

BB

1%S+

VEG

F-B

1%S+

SCF

1%S+

EGF

1%S+

FGF-

2

Fold

21

Supraexpresia sau creterea activitii IGF-1R a fost observat n multe tipuri de cancere,

incluznd: cancer de sn (Almeida et al, 1994; Dricu et al.1999), cancer pulmonar (Cosaceanu et

al. 2007; Kiaris et al. 1999), cancer de colon (Xiao et al. 2007), cancer de prostat (Figueroa et

al. 1995), melanom (Xie et al. 1999) i tumori gliale (Chakravarti et al. 2002). n glioblastom,

IGF-1R a fost identificat ca potenial marker genetic (Hui et al. 2001) i de asemeni este implicat

n rezistena la radio i chimioterapie (Chakravarti et al. 2002; Carapancea et al. 2009;

Carapancea et al. 2007).

Pentru a verifica dac efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea IGF-1R, am

studiat efectul stimulrii cu IGF-1 asupra citotoxicitaii induse de tratamentului cu STI571 n

liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu IGF-1 i tratate cu diferite

concentraii de STI51: 2.5 M STI571 (Figura 8a), 5 M STI571 (Figura 8b), i 10 M STI571

(Figura 8c).

a b c

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

Pro

ce

nt

din

co

ntr

ol

Componente 1 2 3 4 5

10%S +

1%S + + + +

IGF-1 + +

STI571 + +

Figura 8. Rolul stimulrii cu IGF-1 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571

Rezultatele semnificative statistic fata de tratamentul cu STI571 si 1% ser (p 0,005)

Pentru a verifica dac efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea PDGFR, am

studiat efectul stimulrii cu PDGF-BB asupra citotoxicitaii induse de tratamentului cu STI571 n

liniile de glioblastom. Astfel, celulele au fost stimulate cu PDGF-BB i tratate cu diferite

concentraii de STI51: 2.5 M (Figura 9a), 5 M (Figura 9b), i 10 M (Figura 9c).

22

a b c


10%S +

1%S + + + +

PDGF-BB + +

STI571 + +

Figura 9. Rolul stimulrii cu PDGF-BB asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571


Este, de asemenea, cunoscut faptul c activarea VEGFR de ctre liganzii VEGF,

activeaz receptorii, producnd un efect mitogen. Pentru a verifica dac efectul citotoxic al

STI571 este mediat de inhibarea VEGFR, am studiat efectul stimulrii cu VEGF-B asupra

citotoxicitaii induse de STI571 n liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu VEGF-B i tratate

cu diferite concentraii de STI51: 2.5M (Fig. 10a), 5M (Fig. 10b), i 10M (Fig. 10c).

a b c


10%S +

1%S + + + +

VEGF + +

STI571 + +

Figura 10. Rolul stimulrii cu VEGF-B asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571


23

Ligandul SCF se leag de receptorul c-Kit i are ca efect activarea proteinei. Pentru a

verifica dac efectul citotoxic al STI571 este mediat de inhibarea c-Kit, am studiat efectul

stimulrii cu SCF asupra citotoxicitaii induse de tratamentul cu STI571 n liniile de glioblastom.

Astfel, celulele au fost stimulate cu SCF i tratate cu diferite concentraii de STI51: 2.5 M

(Figura 11a), 5 M (Figura 11b), i 10 M (Figura 11c).

a b c


10%S +

1%S + + + +

SCF + +

STI571 + +

Figura 11. Rolul stimulrii cu SCF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571


Legarea ligandului EGF de l receptorul sau, EGFR, activeaz acest protein

membranar , producnd un efect mitogen. Pentru a verifica dac efectul citotoxic al STI571 este

mediat de inhibarea EGFR, am studiat efectul stimulrii cu EGF asupra citotoxicitaii induse de

STI571 n liniile de GB. Celulele au fost stimulate cu EGF i tratate cu diferite concentraii de

STI51: 2.5 M (Figura 12a), 5 M (Figura 12b), i 10 M (Figura 12c).

a b c

24


10%S +

1%S + + + +

EGF + +

STI571 + +

Figura 12. Rolul stimulrii cu EGF asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571


Efectul mitogen al factorului FGF este mediat de receptorul su FGFR. Pentru a verifica

dac efectul citotoxic al STI571 produce inhibarea FGFR, am studiat efectul stimulrii cu FGF

asupra citotoxicitaii induse de tratamentul cu STI571 n liniile de glioblastom. Celulele au fost

stimulate cu FGF i tratate cu diferite concentraii de STI51: 2.5 M (Figura 13a), 5 M (Figura

13b), i 10 M (Figura 13c).

a b c


10%S +

1%S + + + +

FGF + +

STI571 + +

Figura 13. Rolul stimulrii cu FGF-2 asupra efectului citotoxic al tratamentului cu STI571


Analiznd rezultatele obinute, s-a observat c adugarea factorilor de cretere n mediu a

dus la o cretere semnificativ a proliferrii celulare de la aprox. 50% n condiii 1%S pn la

aprox. 70% n condiii 1%S+IGF-1, fiind uor diminuat la adugarea agentului inhibitor STI51

pn la aprox. 60%. Comparativ cu o rat a proliferrii de aprox. 50% n condiii de 1%S,

adugarea de STI51 a condus la o scdere a proliferrii pn la aprox. 25%.

25

7.3. SAM induce citotoxicitate n celulele de GB printr-un mecanism independent de

IGF-1R

Studii anterioare au artat c S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor de grupri

metil n numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin modificarea

profilului de metilare ADN. Alte studii tiintifice sugereaz c SAM inhib efectul mitogen al

factorilor de cretere n celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare

demonstreaz importana IGF-1R n supravieuirea i proliferarea celulelor de GB.

n acest studiu, a fost investigat efectul citotoxic indus de SAM n doua linii celulare de

GB (18 i 38). Celulele n cultur au fost expuse timp de 7 zile la diferite concentraii de SAM,

iar viabilitatea celular a fost analizat prin numrarea celulelor viabile n arii marcate.

Un parametru important n determinarea dinamicii creterii celulare este parametrul

numit Timpul de dublare celular (T2). T2 arat care este timpul necesar unei diviziuni

celulare complete.

n cazul bolilor maligne, valoarea T2 este o indicaie importana n prognosticul bolii i

permite s se evalueze eficienei medicamentelor utilizate n radio i / sau chimioterapie. De

aceea, am determinat T2 pentru cele dou linii celulare HGG (18, 38) luate n studiu., T2 a fost

determinat prin metoda regresiei liniare, utiliznd mai multe puncte de timp i prin utilizarea a

dou puncte de timp. Rezultatele obinute prin metoda regresiei liniare, arat c T2 are valoarea

79,55,54 pentru linia celular 18 i 75,256,02 pentru linia 38. Valorile T2 obinute prin

metoda care ia in calcul doua puncte de timp, nu difera semnificativ de cele obtinute prin metoda

regresiei liniare, astfel: valoarea T2 pentru linia celular 18 este 66,57,778, iar valoarea T2

pentru linia celular 38 este 59,56,3634 (Figura 14).

y = 0,262x + 6,875R = 0,961

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 20 40 60 80 100 120 140 160

cell

nu

mb

er

time (h)

18 HGG

y = 0,895x + 10,41R = 0,877

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 20 40 60 80 100 120 140 160

cell

nu

mb

er

Time (h)

38 HGG

Figura 14. Valoarea T2 pentru liniile celulare 18 HGG i 38 HGG

26

Efectul citotoxic indus de SAM in doua linii celulare de GB (18 si 38), a fost apoi investigat.

In urma tratamentului cu 0,1 M SAM, linia celulara 18 prezinta o usoara crestere a

viabilitatii celulare in primele 4 zile de la inceperea tratamentului, proliferarea celulara crescand

cu 7% 17 % si 5% in a doua, a treia si respectiv a patra zi de tratament. Tratamentul cu 0,1

M SAM produce inhibarea proliferarii celulare si o nesemnificativa moarte celulara a celulelor

apartinand liniei celulara 18, la 5 zile dupa tratament, acest efect persistand pana la sfarsitul

perioadei de tratament, astfel, aprox. 97% din celule au supravietuit la sfarsitul perioadei de 7

zile de tratament (Fig 33). In linia celulara 38, efectul citotoxic al tratamentului cu 0,1 M

SAM apare abia dupa 7 zile. In primele 6 zile de tratament, viabilitatea celulara creste cu 12% in

a doua zi, 19% in a treia zi, 24% in a patra zi, 27% in a cincea zi su cu 8% in a sasea zi.

Tratamentul cu 200 M SAM a produs un efect citotoxic mult mai mare in cele doua linii

celulare luate in studiu. Celulele apartinand liniei celulare 18 au supravieuit n procent de 91%

in a doaua zi, 77% in a treia zi, 59% in a patra zi, 52% in a cincea zi, 43% in a sasea zi, iar in

utima zi a tratamentului s-a inregistrat o scadere a viabilitatii celulare cu 32%. Tratamentul cu

200 M SAM are efect citotoxic si asupra celulelor apartinand liniei celulare 38, astfel,celulele

au supravieuit n procent de 93% in a doua zi, 85% in a treia zi, 77% in a patra zi, 70% in a

cincea zi, 59% in a sasea zi, iar numai 45% in a saptea si de tratament (Fig. 15).

TAM 0,1M

0

20

40

60

80

100

120

140

1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d

Time (days)

% o

f C

on

tro

l

18

38

TAM 200 M

0

20

40

60

80

100

120

1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d

Time (days)

% C

on

tro

l

18

38

Figura 15. Efectul tratamentului cu SAM asupra viabilitii celulelor de glioblastom la concentraiile extreme TAM

IGF-1R este un receptor tirozin kinazic, codat de ctre oncogena igf-1r, localizat pe

cromozomul 15q25-q26, promovnd transformarea oncogenica, creterea i supravieuirea

celulelor canceroase (Yu et al. 2000). Pentru explicarea citotoxicitii observate n urma

tratamentelor cu diferite doze de SAM, s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de

SAM s fie cauzat de hipermetilarea oncogenei igf-1r i inhibarea expresiei proteinei IGF-

27

1R.Rezultatele obtinute dupa tratamentul cu SAM au aratat, insa, ca aceata substanta nu are efect

asupra expresiei membranare a IGF-1R, in concentratia cea mai mare utilizata in studiu (200

M), sugerand faptul ca efectul citotoxic indus de SAM nu este relationat cu modificarea

profilului de metilare ADN al genei igf-1r (Figura 16),

Figura 16. Efectul SAM asupra expresiei IGF-1R in liniile celulare 18 i 38 Proteina -actina a fost

utilizata drept control.

28

8. DISCUII

Studiul 1. Glioblastoamele sunt tumori cerebrale heterogene, caracterizate prin

celularitate intens, activitate mitotic, necroz i proliferri microvasculare. Datorit acestor

proliferri microvasculare accentuate ce nu apar n glioamele de grad mic, fiind specifice

glioamelor maligne i n special glioblastomului, s-a concluzionat c procesele de angiogenez i

neoangiogenez joac un rol esenial n creterea i invazia glioblastomului. n procesul de

neoangiogenez un rol important l joac eliberarea i mobilizarea celulelor progenitorii

endoteliale (CEP) circulante derivate din maduva hematogen. Recent, CEP circulante izolate

din sngele periferic au atras atenia ca posibile inte terapeutice. Date din diverse studii

experimentale i clinice au artat c utilizarea inhibitorilor angiogenezei reduce vascularizaia i

progresia tumoral. Conceptul aprut recent ar fi c celulele tumorale pot produce diverse

semnale moleculare ce pot elibera i mobiliza CEP circulante produse de maduva hematogen la

locul tumorii unde au ca scop stimularea neoangiogenezei.

CEP circulante au fost studiate n diverse tipuri de cancere: pulmonar, mamar, gastric,

ovarian, iar valorile acestora au fost depistate semnificativ crescute n sngele periferic fa de

normal. De asemeni i n cazul glioblastomului, studiile au artat o cretere important a CEP

circulante fa de indivizii normali.

n cadrul experimentelor realizate am ncercat s determin i s compar nivelurile de CEP

circulante din sngele periferic la pacieni cu tumori cerebrale de grade diferite. Numrul de CEP

circulante a fost semnificativ mai mare la pacienii cu tumori cerebrale nalt maligne

(glioblastom) comparativ cu pacienii diagnosticai cu tumori cerebrale de grad mic, sugernd c

CEP circulante pot deveni un potenial biomarker n glioblastom, dar i o int terapeutic pentru

viitoarele noi tratamente ale glioblastomului

Studiul 2. inte terapeutice specifice n esuturile maligne sunt reprezentate i de

receptorii tirozinkinazici i receptorii tirozinkinazici constitutiv activi, deoarece aceste proteine

au o expresie nalt la nivelul esutului malign. Multiple studii tiinifice au evideniat faptul c

glioblastoamele supraexprim numeroi receptori tirozinkinazici precum EGFR, PDGFR,

VEGFR, SCFR i FGFR. Pornind de la acest concept, se poate spune c receptorii tirozinkinazici

sunt considerai inte terapeutice specifice n tratamentul glioblastomului.

STI571 (Imatinib mesylate) este un inhibitor cu molecul mic, utilizat la aceasta or ca

tratament n diferite forme de cancer. Mai multe studii de specialitate care au evaluat efectul

29

citotoxic al STI571 asupra celulelor tumorale n vitro, au demonstrat c acest inhibitor este mai

activ n absena nutrienilor.

Datele obinute n studiul actual sunt n concordan cu cele publicate de alte studii.

Rezultatele noastre arat c citotoxicitatea indus de STI571 n celulele BT1GB a fost

dependent de doza folosit. Concentraia la care se obine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M.

Efectul citotoxic indus de tratamentul cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare n celulele

cultivate n mediu cu 1% FBS comparativ cu celulele de glioblastom cultivate n mediu cu 10%

FBS, putndu-se observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraii de STI571.

Se presupune c aciunea antitumoral a STI571 este dat de inhibarea oncoproteinei

Bcr-Abl i a receptorilor tirozinkinazici PDGF i cKit, mecanismul de aciune al acestei

molecule nu este ns complet cunoscut pn n prezent. Studii clinice i experimentale din

ultimii ani au artat efectul citotoxic al STI571 poate fi influenat de nivelul factorilor de

cretere. Este deja cunoscut faptul c tumorile cerebrale secret o mare varietate de factori de

cretere care stimuleaz proliferarea, supravieuirea, migrarea i angiogeneza tumoral, printr-un

sistem de aciune autocrin sau paracrin. Mai mult, cercetri recente au artat ca potenialul

citotoxic al STI571 este afectat de prezena unor factori de cretere. n conformitate cu

rezultatele publicate de alte grupuri de cercetare, rezultatele noastre arat c stimularea cu

factorii de cretere IGF-1, PDGF-BB, VEGF-B, SCF, EGF sau FGF-2 a crescut proliferarea

celulele de glioblastom de aproximativ 0.5 ori .

Inhibitorul cu molecul mic STI571, s-a dovedit a fi mai eficient n tratamentul

glioblastomului n absena nutrienilor. Concentraia STI571 care determin un efect citotoxic de

50% la celulele fr nutrieni este de 4 ori mai mic (aprox. 2.5 M STI571) dect cea la care se

atinge efect citotoxic de 50% n condiii standard (aprox 12,5 M STI571).

Prezena factorilor de cretere n mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al

tratamentului cu STI571, acesta observndu-se chiar de la cele mai mici concentraii de STI571

de 2.5 M astfel: stimularea cu IGF1 a fost redus cu 7.4%, cea cu PDGF-BB a fost redus cu

8.8%, stimularea cu VEGF-B a fost redus cu 6.9%, stimularea cu SCF a fost redus cu 12.8%,

stimularea cu EGF aa fost redus cu 7.1%, iar stimularea cu FGF-2 a fost redus cu 7.5%.

Studiul 3. Studii anterioare au artat ca S-adenozil-metionina (SAM), principalul donor

de grupri metil n numeroase procese biologice, ar induce moartea celulelor canceroase prin

modificarea profilului de metilare ADN. Alte studii tiintifice sugereaz, c SAM inhib efectul

30

mitogen al factorilor de cretere n celulele canceroase. De asemenea, studiile noastre anterioare

demonstreaz importana IGF-1R n supravietuirea i proliferarea celulelor de GB.

n ultima parte a studiului, am analizat efectul SAM asupra celulelor de glioblastom.

Astfel, efectul indus de SAM fost investigat n dou linii celulare de GB (18 i 38), iar rezultatele

obinute au art c tratamentul cu SAM este citototxic pentru ambele linii celulare investigate.

De asemenea, SAM n concentraia cea mai mare utilizat n studiu (200 M), nu are efect

asupra expresiei membranare a IGF-1R.

Pentru explicarea citotoxicitii observate n urma tratamentelor cu diferite doze de SAM,

s-a analizat posibilitatea ca efectul citotoxic indus de SAM s fie cauzat de inhibarea expresiei

proteinei IGF-1R, ca urmare a efectului de hipermetilare a genei igf-1r . Rezultatele obinute

dup tratamentul cu SAM au artat c aceast substan nu are efect asupra expresiei

membranare a IGF-1R, n concentraia cea mai mare utilizat n studiu (200 M), sugernd

faptul c efectul citotoxic indus de SAM nu este relaionat cu modificarea profilului de metilare

ADN al genei igf-1r, care ar fi trebuit s se reflecte n inhibaraea trancripiei genei i n final, n

diminuarea cantitii de receptor IGF-1R produs de celul.

31

9. CONCLUZII

Studiul 1: 1. n cazul primului experiment realizat am ncercat s determinm i s

comparm nivelurile de CEP circulante din sngele periferic la pacieni cu tumori

cerebrale de grade diferite. Rezultatele obinute conduc la concluzia c numrul de

CEP circulante este semnificativ mai mare la pacienii cu tumori cerebrale nalt

maligne (glioblastom) comparativ cu pacienii diagnosticai cu tumori cerebrale de

grad mic. Totui nu au fost observate diferene semnificative ntre grupurile cu tumori

de grad mic. Aceste rezultate sugereaz c CEP circulante pot deveni un potenial

biomarker n glioblastom, de asemeni CEP pot reprezenta o inta terapeutic pentru

viitoarele noi tratamente ale glioblastomului.

Studiul 2: 2. n urma investigrii potenialului rol al inhibitorului STI571 n

tratamentul glioblastomului, am obinut rezultate care arat c citotoxicitatea indus

de STI571 n celulele BT1GB a fost dependent de doza folosit. Concentraia la care

se obine CI50 a fost de aproximativ 12,5 M. Efectul citotoxic indus de tratamentul

cu 1.25M STI571 a fost cu 35% mai mare n celulele cultivate n mediu cu 1% FBS

comparativ cu celulele de glioblastom cultivate n mediu cu 10% FBS, putndu-se

observa deci efectul chiar de la cele mai mici concentraii de STI571. nhibitorul cu

molecul mic STI571, s-a dovedit a fi mai eficient n tratamentul glioblastomului n

absena nutrienilor.

3. Analiznd rezultatele obinute din experimentul n care s-a efectuat

stimularea viabilitii celulare cu diferii factori de cretere (IGF1, PDGF-BB, VEGF-

B, SCF, EGF, FGF-2), am ajuns la concluzia c prezena factorilor de cretere n

mediu are ca efect reducerea efectului citotoxic al tratamentului cu STI571.

Studiul 3: 4. n ultimul studiu n care am evaluat efectul agentului de metilare SAM

asupra tumorilor cerebrale de grad inalt (high grade glioma, HGG) i a interferenei

cu expresia IGF-1R in vitro, am ajuns la concluzia c SAM induce citotoxicitate, dar

nu afecteaz expresia membranar a IGF-1R, sugernd faptul c efectul citotoxic

indus de SAM nu este relaionat cu modificarea profilului de metilare ADN al genei

igf-1r.

32

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

BeierD, HauP, Proescholdt M, Lohmeier A, Wischhusen J, Oefner PJ, Aigner L,

Brawanski A, Bogdahn U, Beier CP. (2007) CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived

cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res.

67(9):4010-5.

Carapancea M, Alexandru O, Fetea AS, Dragutescu L, Castro J, Georgescu A, Popa-

Wagner A, Bcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2009) Growth factor receptors signaling n

glioblastoma cells: therapeutic implications. J Neurooncol. 92(2):137-47. Epub 2008 Nov 30.

Carapancea M, Cosaceanu D, Budiu R, Kwiecinska A, Tataranu L, Ciubotaru

V, Alexandru O, Banita M, Pisoschi C, Bcklund ML, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Dual

targeting of IGF-1R and PDGFR inhibits proliferation n high-grade gliomas cells and induces

radiosensitivity n JNK-1 expressing cells. J Neurooncol. 85(3):245-54. Epub 2007 Jun 14.

Cosaceanu D, Carapancea M, Alexandru O, Budiu R, Martinsson HS, Starborg

M, Vrabete M, Kanter L, Lewensohn R, Dricu A. (2007) Comparison of three approaches for

inhibiting insulin-like growth factor I receptor and their effects on NSCLC cell lines in vitro.

Growth Factors. 25(1):1-8.

Chakravarti A, Loeffler JS, Dyson NJ. (2002) Insulin-like growth factor receptor I

mediates resistance to anti-epidermal growth factor receptor therapy n primary human

glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3-kinase signaling. Cancer

Res. 62(1):200-7.

Dricu A, Kanter L, Wang M, Nilsson G, Hjertman M, Wejde J, Larsson O. (1999)

Expression of the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) n breast cancer cells: evidence

for a regulatory role of dolichyl phosphate n the transition from an intracellular to an

extracellular IGF-1 pathway. Glycobiology. 9(6):571-9

Ekstrand AJ, James CD, Cavenee WK, Seliger B, Pettersson RF, Collins VP. (1991)

Genes for epidermal growth factor receptor, transforming growth factor alpha, and epidermal

growth factor and their expression n human gliomas in vivo. Cancer Res. 51(8):2164-72.

33

Figueroa JA, Lee AV, Jackson JG, Yee D. (1995) Proliferation of cultured human

prostate cancer cells is inhibited by insulin-like growth factor (IGF) binding protein-1: evidence

for an IGF-II autocrine growth loop. J Clin Endocrinol Metab. 80(12):3476-82.

HegiME, Diserens AC, Godard S, Dietrich PY, Regli L, Ostermann S, Otten P, Van

MelleG, de TriboletN, Stupp R.(2004) Clinical trial substantiates the predictive value of O-6-

methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation n glioblastoma patients treated

with temozolomide. Clin Cancer Res. 10(6):1871-4

Iacob G, Constantinescu AI Conceptii actuale de tratament n tumorile cerebrale

maligne. Conferinta nationala de neurooncologie, martie 2004.

JoensuuH, Kankaanranta L, Seppl T, Auterinen I, Kallio M, Kulvik M, Laakso

J, Vhtalo J, Kortesniemi M, Kotiluoto P, Sern T, Karila J, Brander A, Jrviluoma

E, Ryynnen P, Paetau A, Ruokonen I, Minn H, Tenhunen M, Jskelinen J, Frkkil

M, Savolainen S. (2003) Boron neutron capture therapy of brain tumors: clinical trials at the

finnish facility using boronophenylalanine. J Neurooncol 62(1-2):123-34

Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Gordon R, Tepper O, Gravereaux E, Pieczek

A, Iwaguro H, Hayashi SI, Isner JM, Asahara T. (2000) Vascular endothelial growth factor(165)

gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells n human subjects. Circ

Res. 86(12):1198-202.

Kiaris H, Schally AV, Varga JL, Groot K, Armatis P. (1999) Growth hormone-releasing

hormone: an autocrine growth factor for small cell lung carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S

A. 96(26):14894-8.

LaperriereN, Zuraw L, Cairncross G; Cancer Care Ontario Practice Guidelines Initiative

Neuro-Oncology Disease Site Group. (2002) Radiotherapy for newly diagnosed malignant

glioma n adults: a systematic review. Radiother Oncol 64(3):259-73.

Lnn S, Klaeboe L, Hall P, Mathiesen T, Auvinen A, Christensen HC, Johansen

C, Salminen T, Tynes T, Feychting M. (2004) Incidence trends of adult primary intracerebral

tumors n four Nordic countries. Int J Cancer. 108(3):450-5.

Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer

BW, Kleihues P. (2007) The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system.

Acta Neuropathol. 114(2):97-109.

34

Louis DN, von DeimlingA. (1995) Hereditary tumor syndromes of the nervous system:

overview and rare syndromes. Brain Pathol. 5(2):145-51.

OhgakiH, Kleihues P. (2005) Epidemiology and etiology of gliomas.

ActaNeuropathol. 109(1):93-108.

OhgakiH, Kleihues P. (2007) Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma.

Am J Pathol. 170(5): 1445-53.

Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z, Lane WJ, Williams M, Oz MC, Hicklin

DJ, Witte L, Moore MA, Rafii S. (2000) Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating

human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors.

Blood. 95(3):952-8.

PradosMD, Wara WM, Sneed PK, McDermott M, Chang SM, Rabbitt J, Page M, Malec

M, Davis RL, Gutin PH, Lamborn K, Wilson CB, Phillips TL, Larson DA. (2001) Phase III trial

of accelerated hyperfractionation with or without difluromethylornithine (DFMO) versus

standard fractionated radiotherapy with or without DFMO for newly diagnosed patients with

glioblastoma multiforme. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 49(1):71-7.

Schulenburg A, Ulrich- PurH, Thurnher D, Erovic B, Florian S, Sperr WR, Kalhs P,

Marian B, WrbaF, Zielinski CC, Valent P. (2006) Neoplastic stem cells: a novel therapeutic

target n clinical oncology. Cancer. 107(10):2512-20.

Shinkaruk S, Bayle M, Lan G, Dlris G. (2003) Vascular endothelial cell growth factor

(VEGF), an emerging target for cancer chemotherapy. Curr Med Chem Anticancer Agents; 3(2):

95-117

Stewart LA. (2002)Chemotherapy n adult high-grade glioma: a systematic review and

meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet. 359(9311):1011-8.

StuppR, Pavlidis N, Jelic S. (2005) ESMO Minimum Clinical Recommendations for

diagnosis, treatment and follow-up of malignant glioma. Ann Oncol 16Suppl 1:i64-5

Xiao XY, Zhou XY, Yan G, Sun MH, Du X. (2007) Chromosomal alteration n Chinese

sporadic colorectal carcinomas detected by comparative genomic hybridization. Diagn Mol

Pathol. 16(2):96-103.

35

Xie Y, Skytting B, Nilsson G, Brodin B, Larsson O. (1999) Expression of insulin-like

growth factor-1 receptor n synovial sarcoma: association with an aggressive phenotype. Cancer

Res. 59(15):3588-91

Yu H, Rohan T. (2000) Role of the insulin-like growth factor family n cancer

development and progression. J Natl Cancer Inst. 92(18):1472-89.

rolul celulelor stem progenitoare circulante si al receptorilor factorilor de crestere in...

Documents