Rezumat ştiinţific şi tehnic în extensor

Rezumatul etapei: In cadrul acestei etape “Dezvoltarea variantelor de bauturi probiotice” s-a optimizat procesul de

microincapsulare a bacteriilor probiotice Lactobacillus plantarum şi Bifidobacterium infantis în microcapsule de alginate protejat cu chitosan. S-au dezvoltat variante de băuturi din coji de mere, sfecla, morcovi, struguri albi, struguri negrii şi pulpă de portocale. Aceste Variante au fost caracterizate din punct de vedere chimic (GC-MS, HPLC LC-MS, FTIR, UV-Vis) pentru a cuantifica compuşii bioactivi. Procesul de obţinere a variantelor a fost optimizat din punct de vedere tehnologic la scară industrială. Băuturile au fost caracterizare din punct de vedere sensorial. In urma rezultatelor obţinute s-a considerat ca fiind optimă o singură variantă care a fost în continuare optimizată şi caracterizată. Varianta experimentală optimă a fost utlizată pentru pasul următor care a fost reprezentat de administrarea produsului subiecţilor sănătoşi. In urma ingestiei si analizei microbiologice a fecalelor, se evidenţiază clar că varianta de produs aleasă împreună cu L. plantarum favorizează dezvoltarea bacteriilor probiotice cu un procent de 30% mai mare faţă de momentul martor al experimentului. Practic, fiecare activitate precizată în planul de realizare al proiectului Food-Profit a fost îndeplinită iar indicatorii minim stabiliţi au fost depăşiti prin activităţile de diseminare effectuate.

Activitate 2.1. Microincapsularea probioticelor in alginat protejat cu chitosan Pregătirea microorganismelor. Lactobacillus plantarum şi Bifidobacterium infantis au fost achiziţionate de la ATCC şi s-a utilizat la realizarea acestui studiu. Un vial de bacterii liofilizate a fost, separat, inoculat în 5 ml bulion MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (Merck, Germany) şi incubate la 37°C pentru 24h iar apoi sub-cultivate în 95 mL bulion MRS şi incubate în aceleaşi condiţii. Suspensia bacteriană obţinutã a fost centrifugată la 3000 rpm pentru 5 min la 25°C, iar peletul a fost spălat de două ori cu soluţie de peptonă sterilă 0.1% (Merck, Germany) şi re-suspendată în bulion care a fost divizat pentru fiecare bacterie, în probe a câte 30 ml, având densitatea de 109ufc/ml. Microîncapsularea bacteriilor. Pudra sterilă de alginat (AG) (Promova Biopolymer, Norway) şi chitosan (CH) (Sigma Aldrich, Germany) a fost dizolvată în apă pură-sterilă, şi respectiv 0.7% soluţie acid acetic pentru chitosan, utilizând trei concentraţii diferite de matrici AG şi CH (2%, 1.5% şi 1% w/v). Volumul de 120 mL din fiecare soluţie de AG şi CH a fost amestecat cu 30 mL suspensie bacteriană cu densitatea de 109cfu mL-1. Emulsia a fost pipetată în baia de întărire sterilă formată din soluţie de CaCl2 2% (w/v) (Sigma Aldrich, Germany) pentru AG şi baie sterilă de tripolifostat de sodiu (NaTPP 5%) (w/v) (Sigma Aldrich, Germany) pentru CH, cu ajutorul unei seringi sterile (0.2 x 6 mm). Capsulele obţinute au fost filtrate baie după 30 de minute şi spălate de două ori cu apă distilată.

Figura 1. Schematizarea procedeului de încapsulare a probioticelor în alginat

Mix de alginat cu L. plantarum/B. infantis

Microcapsule de alginat ce conțin celule

probiotice, aflate în baia de întărire (CaCl2)

Microîncapsularea probioticelor în alginate. În studiul de față s-a propus încapsularea a două probiotice și anume Lactobacillus plantarum și Bifidobacterium infantis. În acest scop combinația de biopolimeri aleasă au fost alginat și alginat cu un strat extra de chitosan. Procedeul de încapsulare este descris în figura 1.

După încapsulare s-a testa rata de supraviețuire a probioticelor după mimarea tranzitului gastro intestinal. În figura 2 este prezentată această rată de supraviețuire a probioticelor L. plantarum și respective B. infantis.

Microîncapsularea probioticelor în alginat protejat cu chitosan. Pentru o protecție sporită s-a propus adăugarea unui strat de biopolimer, chitosan. Tehnica utilizata a fost layer-by-layer. Microcapsulele de alginat obținute sunt introduse în soluția de chitosan 1% sub agitare continuă, precum este reprezent în figura 2.

Figura 2. Schematizarea procedeului de aplicare a stratului protector de chitosan.

Această activitate a fost realizată de catre USAMV in totalitat , firma BWB avand dificultari in realizarea acestei activitati conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.2. Caracterizarea GC-MS a lipidelor (omega-3, omega-6, omega-9, fitosteroli)

In vederea optimizării produsului probiotic, au fost realizate 9 varinate experimentale din proporţii diferite de materii primie ( subproduse ) care au fost caracterizate mai sus. In continuare prezint caracterizarea chimică a acestor mixuri. Mix 1- pulpă de sfeclă roşie + coji struguri albi+ pulpă portocală Mix2- coji de măr+ pulpă de morcov + coji struguri roşii Mix 3- coji de struguri roşii+ pulpă de morcov+ pulpă portocală +pulpă de sfeclă roşie Mix4- pulpă de sfeclă roşie+coji de măr+ pulpă de morcov Mix5- coji struguri albi+ pulpă de morcov+pulpă de sfeclă roşie Mix6- coji de măr+ pulpă de morcov+ pulpă portocală+ coji struguri roşii Mix 7- coji de măr+ pulpă de morcov+ pulpă portocală+ coji struguri roşii+ coji struguri albi Mix8- coji de măr+ coji struguri albi+pulpă de sfeclă roşie+ pulpă portocală Mix9- pulpă de morcov+ pulpă portocală+ coji struguri roşii +pulpă de sfeclă roşie+ lemn dulce

Caracterizarea GC-MS a acizilor graşi, s-a realiza pe sucurile (Figura 3- si mixurile prepararte din acestea (Fiurile3 e-h), împreună cu cuantificarea lipidelor totale (Tabel 1 şi Tabel 2).

Figura 3. Cromatograma Suc

pulpă Morcov

9.58 14.58 19.58 24.58 29.58 34.58 39.58 44.58 49.58Time2

100

%

11

4

321

9

856 7

10

12

13 1614 15 191817

Microparticule de alginate în soluție

de chitosan 1%

1

Tabel 1. Acizii graşi in sucurile din pulpă/coaji morcov, măr, struguri albi, struguri negri

Acizi grasi (%) Denumire probă Nr. crt. Acizi graşi Suc pulpă Morcov Suc coji Măr Suc coji Struguri albi

Suc coji Struguri negri

1 12:0 0,22 0,33 0,05 0,06 2 14:0 0,21 0,56 0,16 0,13 3 15:0 0,40 0,16 0,04 0,04 4 16:0 16,41 18,93 10,46 11,75 5 16:1n-9 0,46 0,64 0,13 0,07 6 16:1n-7 0,32 0,28 0,18 0,14 7 17:0 0,24 0,27 0,09 0,09 8 18:0 1,45 4,84 4,95 3,96 9 18:1n-9 16,92 14,74 13,56 19,86 10 18:1n-7 1,02 0,74 0,80 0,87 11 18:2n-6 54,61 43,98 60,90 56,53 12 18:3n-3 5,87 5,90 3,09 3,72 13 20:0 0,46 3,69 2,42 0,91 14 20:1n-9 0,09 0,21 0,22 0,23 15 21:0 0,15 0,29 0,18 0,08 16 22:0 0,50 2,77 1,98 1,15 17 22:1n-9 0,08 0,00 0,03 0,02 18 23:0 0,15 0,18 0,27 0,12 19 24:0 0,43 1,48 0,49 0,27 AGS 20,63 33,50 21,09 18,55 AGMN 18,89 16,62 14,92 21,20 AGPN 60,48 49,88 63,99 60,25 n-3 AGPN 5,87 5,90 3,09 3,72 n-6 AGPN 54,61 43,98 60,90 56,53 n-6/n-3 9,30 7,45 19,73 15,20 AGPN / AGS 2,93 1,49 3,03 3,25

AGS-acizi grasi saturati,AGMN- acizi grasi mononesaturat,AGPN- ac gr polinesaturati Tabel 2.Acizii graşi in sucurile mix Acizi grasi (%) Denumire probă Nr. crt. Acizi graşi Mix 1 Mix 3 Mix 5 Mix 7 1 12:0 0,14 0,08 0,14 0,11 2 14:0 0,22 0,17 0,18 0,20 3 15:0 0,13 0,12 0,21 0,10 4 16:0 11,72 13,64 13,83 13,12 5 16:1n-9 0,07 0,10 0,11 0,07 6 16:1n-7 0,37 0,21 0,16 0,28 7 17:0 0,11 0,13 0,17 0,16 8 18:0 3,72 3,38 3,72 3,99 9 18:1n-9 12,70 17,31 10,66 15,81 10 18:1n-7 1,54 1,42 0,76 1,61 11 18:2n-6 61,91 56,53 61,62 56,32 12 18:3n-3 3,76 4,09 3,94 4,26 13 20:0 1,37 0,85 1,88 1,38 14 20:1n-9 0,15 0,19 0,15 0,19

2

15 21:0 0,09 0,08 0,15 0,14 16 22:0 1,29 1,04 1,38 1,49 17 22:1n-9 0,05 0,04 0,10 0,04 18 23:0 0,18 0,19 0,28 0,16 19 24:0 0,47 0,43 0,55 0,56 AGS 19,44 20,11 22,51 21,42 AGMN 14,89 19,27 11,94 18,00 AGPN 65,67 60,63 65,56 60,58 n-3 AGPN 3,76 4,09 3,94 4,26 n-6 AGPN 61,91 56,53 61,62 56,32 n-6/n-3 16,46 13,81 15,63 13,22 AGPN / AGS 3,38 3,02 2,91 2,83 AGS-acizi grasi saturati AGMN- acizi grasi mononesaturati AGPN- ac gr polinesaturati Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a.

Activitate 2.3. Caracterizarea FTIR a pigmentilor, acizilor organici, zaharurilor, polifenolilor si lipidelor

Caracterizarea FTIR (Figura 4) a mixurilor s-a realizat pe probele de sucuri rezultate care au fost centrifugate la 1500 rot/min, timp de 10 min , filtrate si supuse analizei FTIR.Inregistrarea spectrelor de absorbţie în infraroşu s-a realizat direct prin utilizarea spectofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 cu accesoriu HATR (Horizontal Attenuated Total Reflectance) . Spectrele au fost inregistrate pe domeniul de lungimi de unda 650-4000 cm -1cu o rezoluţie de 4cm-1 şi 64 scanari, identificându-se benzile de absorbţie caracteristice tipului de legături şi grupărilor funcţionale( exprimate in cm-1).

Datele obţinute au fost prelucrate cu ajutorul programelor Ir solution SoftwareOverview (Shimadzu) şi OriginR 7SR1 Software (OriginLab Corporation, Northampton, USA). Identificarea FTIR a zonelor specifice mixurilor

Figura 4. Spectrul FT-IR al mix –ului 1 pe domeniul 750-3500 cm-1

3500 3000 2500 2000 1500 1000

0.0

6

54

3

2

1

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

Mix 1

3

Spectrele FTIR prezinta sase zone majore de absorbtie 750-920 cm-1, 950-1100 cm-1,1100-1500 cm-1,1500-1750 cm-1,2800-2950 cm-1,3300 cm-1 prezentate in tabelul de mai jos. Tabel 3. Zone specifice indentificate în mixurile de sucuri Nr. Proba (Mix)

Zona 1 (750- 920 cm-1)

Zona 2 (950-1050cm-1)

Zona 3 (1100-1500cm-1)

Zona 4 (1500-1800cm-1)

Zona 5 (2850-2900cm-1)

Zona 6 3300cm-1

1 777,817,866,914 1029,1234 1346,1406 1604,1720 2920 3300 2 777,817,866,918 1031 1251,1359,1402 1602,1730 2906,2927 3300 3 777,817,866,916 1029 1236,1346,1406 1602,1720 2910,2931 3300 4 777,817,867,921 1031 1255,1342,1408 1516,1606,1729 2926 3300 5 777,817,866,918 1031 1251,1349,1402 1508,1602,1728 2927 3300 6 775,815,864,918 1029 1240,1340,1402 1510,1604,1736 2927 3300 7 777,817,866, 918 1029 1248,1346,1406 1606,1722 2929 3300 8 - 1029 1246,1328,1402 1636 2930 3300 9 - 1029 1246,1346,1406 1633 2858,2929 3300 Pik-urile cu numerele de unda caracteristice pe zone pentru fiecare proba de suc. Tabel 4. Caracterizarea zonelor de frecvenţe

Zona de frecvente

Atribuire

Zona 1 (750-920 cm-1)

=C- H vibraţia de indoire in afara planului, benzi asociate cu structura inelului fenolic

Zona 2 (950-1100cm-1)

Zonă specifică pentru carbohidrati deoarece permite identificarea oligo şi polizaharidelor. Banda de la nr. de undă 1029,1031 cm-1 se datorează vibraţiei de intindere C-OH a oligozaharidelor (caracteristică glucozei).

Zona 3 (1200-1500cm-1)

Regiunea de la 1200 cm-1 apare datorităvibraţiilor date de grupările carboxil din gruparile pectice Regiunea 1300cm-1este atribuită vibraţiilor date de legăturile C – H din ciclurile piranozice din structura carbohidraţilor 1400 cm-1C=C (benzi de intindere aromatice)

Zona 3 (1500-1800cm-1)

Absorbţia la 1600 cm-1 specifică grupelor carboxil libere din pectine C=O din acizii organici –vibraţie de intindere la 1720-1730 cm-1

Zona 4 (2850-2900)

- Benzi CH2, CH3 de intindere

Zona 5 (3300 cm-1)

O-H prezent in moleculele hidroxilate (molecula apei)

4

Spectrele FTIR pentru toate probele de sucuri prezinta pik-uri similare. In compoziţia lor, sucurile conţin apă, cantităţi mici de aminoacizi, minerale, phenoli, zaharuri, acizi organici. Fenolii, prezintă absorbţii maxime in regiunea 750-900 cm-1. Banda IR din aceasta regiune indică prezenţa compuşilor aromatici, lipsa de absorbţie indică lipsa de caractere aromatice.Regiunea 1020 cm-1 -1030 cm-1 este legată de gruparea –COH şii este asociată cu zaharurile prezente in fructe(C-O intindere pentru glucoză la 1029-1030 cm-1).Regiunea 1200-1800 cm-1 corespunde absorbţiilor date de gruparile carbonil.Probele de suc analizate au arătat semnale la 1200 -1250 cm-1, caracteristice substanţelor pectice şi apare din cauza vibraţiilor date de grupările carboxil din structura acestora. Semnalul 1340cm-1 este atribuit vibraţiilor date de legăturile C-H din ciclurile piranozice din structura carbohidraţilor. Banda de la 1600 cm-1indică grupări carboxil libere şi esterificate (COO-) intensitatea acestei benzi este folosită pentru compararea diferitelor tipuri de pectine existente in fructe. Banda de absorbţie de la 1720-1730 cm-1 este caracteristică acizilor organici prezenţi în fructe (acid tartaric, oxalic, malic, ascorbic, fumaric). Banda de la 2850 cm-1 si 2930 cm-1 corespunde vibraţiilor de intindere -C-H din interiorul grupurilor CH3 sau CH2. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.4. Caracterizarea morfologică a microcapsulelor Într-un interval de 30 minute se consideră procesul finalizat. Capsulele sunt separate de soluția de chitosan, sălate și se verifică aderența stratului de chitosan cu ajutorul microscopiei. S-a putut remarca o creștere a dimensiunii capsulelor (Figura 6, Tabel 5).

Figura 6. Imagini microscopice a microcapsulelor de alginat (stânga) și respectiv a celor de alginat cu un înveliș de chitosan (dreapta).

Tabel 5. Dimensiunea capsulelor de alginat acoperite cu un strat de chitosan și randamentul de încapsulare

Microcapsule Dimensiunea microcapsulelor (µm) (n=10)

Randamentul încapsulării (%) (n=10)

Alginat 1,5% 1255.5±12.7 67.87±0.28 Alginat 1,5% acoperite cu chitosan 1%

1535.5±5.4 65.43±0.41

În tabelul 5 se poate remarca faptul că dimensiunea microcapsulelor se modifică ușor în urma aplicării stratului extra de chitosan. Se remarcă o crștere a dimeniunii cu aproximativ 22%. Acest fapt demonstreaza aplicarea cu succes a stratului protector de chitosan.

În urma procesului de încapsulare s-a efectuat caracterizarea microcapsulelor cu probiotice. În vederea evaluării caracteristicilor s-au determinat diverși parametrii cum ar fi dimensiunea microcapsulelor și randamentul de încapsulare (Tabelul 5). De asemenea s-a utilizat microscopia și microscopia electronica de scanare pentru evaluarea formei microcapsulelor și respective evidențierea prezenței probioticelor în matricea de alginat (Figura 7).

5

Figura 7. Imagine microscopică (x10) (stânga) și respectiv imagine obținută cu ajutorul microscopiei electronice de scanare (SEM) (dreapta) a microcapsulelor obținute

0 3 6 9 12 158

9

10

11

12

Time (hours)

Surv

ival

(log

CFU

/g)

Figura 8. Reprezentarea grafică a supraviețuirii probioticelor ( ) B. infantis și ( ) L. plantarum încapsulate după trecerea prin suc gastric și intestinal

Figura 9. Reprezentarea grafică a supraviețuirii probioticelor ( ) L. plantarum încapsulat în alginat și ( ) L. plantarum încapsulat în alginate și chitosan după trecerea prin suc gastric și intestinal b) ( ) B. infantis încapsulat în alginat și ( ) B. infantis încapsulat în alginate și chitosan după trecerea prin suc gastric și intestinal

În figura 9 se poate remarca faptul că probioticele care au fost încapsulate și acoperite cu chitosan prezintă o supravieţuire mult mai mare pe durata trecerii pe mediu gastrointestinal. Cu toate că numărul de probiotice se reduce ușor în urma procesului de încapsulare este redus se asigura, totuși o supraviețuire considerabilă până la momentul ajungerii în intestin. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.5. Testarea fluxului tehnologic si productia bauturilor functionale si achizitionarea de ambalaje personalizate

0 30 60 90 120

0

5

10

15

Time (min)a)

Surv

abili

ty (l

og)

0 30 60 90 120

6

7

8

9

10

11

Time (min)

Surv

abili

ty (l

og)

6

În cadrul acestei activităţi s-au analizat în detaliu operaţiile tehnologice din literatura din domeniu de obţinere a sucurilor cu pulpă din legume şi fructe, pentru a putea fi realizate la scară de laborator teste necesare pentru obţinerea băuturii probiotice prototip cu caracteristici asemănătoare. Respectând cerinţele igienico-sanitare în vigoare s-au achiziţionat materii prime şi aparaturi de mică capacitate specifice, s-au realizat mai multe probe de laborator ce ulterior au fost supuse diferitelor teste de control al calităţii. Din multitudinea de variante s-a constituit o selecţie de reţete cu potenţial ce au fost supuse analizei senzoriale, prezentate în detaliu în cadrul activităţii 2.7. În paralel s-au realizat modificări ale utilajelor existente în patrimoniul societăţii SC B.W.B. SRL pentru a corespunde cerinţelor de fabricaţie la nivel industrial a băuturilor prototip. Astfel s-a ajuns la un nou flux tehnologic adaptat şi prezentat în acest raport. Deoarece microcapsulele cu probiotice trebuiau să fie incluse în ambalajul produsului finit şi realizat un sistem de eliberare controlată a acestora, s-au achiziţionat ambalaje inovative speciale ce pot realiza acest lucru, rămânând în responsabilitatea societăţii de a dezvolta un model de ambalaj mai ieftin şi la fel de eficient, respectiv un dop ce poate conţine aceste microcapsule. Fluxul tehnologic standard de obţinere a sucurilor cu pulpă din legume şi fruct. Industria alimentară reprezintă un domeniu prioritar în cadrul economiei naţionale, produsele alimentare fiind de importanţă strategică. Producerea alimentelor se realizează în conformitate cu normele de igienă interne şi internaţionale şi în concordanţă cu cerinţele consumatorilor.

Pentru obţinerea de băuturi probiotice, în regim de producţie, s-a pornit de la operaţiile specifice de obţinere a sucurilor cu pulpă din legume şi fructe prezentate în Figura 9 şi detaliate în cele ce urmează, dat fiind faptul că această tehnologie este destul de apropiată de tehnologia de obţinere a sucurilor cu pulpă şi reziduurile aferente la nivel de laborator.

Figura 9. Operaţii specifice de obţinere a sucurilor cu pulpă din legume şi fructe

Dezvoltând produsul la nivel de laborator, a fost necesară realizarea întregului proces de obţinere a sucurilor şi a implicit a reziduurilor de fructe şi legume, pentru un mai bun control al materiei prime utilizate, al factorilor ce concură la obţinerea unui produs la o calitatate constantă dorită şi pentru o mai uşoară determinare a randamentului de producţie. Operaţiunile specifice pentru producţia în cadrul

7

laboratorului tehnologic (Figura 10), respectă normele de sănătate şi securitatea muncii specifice domeniului industrie alimentară. Pentru a produce probele de băutură probiotică funcţională, materialul biologic proaspăt (mere, struguri, morcovi, sfeclă de zahăr) a fost achiziționat de la un supermarket local din Bistrița (România). Înainte de prelucrare au fost presortate, curăţate, alese cele sanatoase la gradul de refractometrie, eliminate corpurile străine. După aceea au fost spălate cu apă de la robinet și uscate cu aer. Toate operaţiunile au fost efectuate manual. Ulterior probele au fost trecute individual printr-un storcător de fructe şi legume Heinner HSJ-160RD (Figura 11), Motor DC, 80 RPM cu melc şi recipient pentru pulpă, pentru a separa cojile şi pieliţele necesare. Pulpa obţinută a fost din nou presată manual, pentru o mai bună separare a sucului din fructe şi legume şi a simula presarea ce se realizează la nivel industrial. Sucul de fructe şi legume obţinut a fost cântărit pentru a se calcula randamentul.

Figura 10. Operaţii specifice la obţinerea sucurilor probiotice în laborator

În următoarea etapă resturile au fost macinate fin într-un procesor de alimente Nutribullet de 600w (figura 12). Produsele rezultate au fost folosite ca ingrediente, împreună cu apa de la robinet in diferite procente pentru a obţine băuturile probiotice. Băuturile finale au fost ambalate în sticle de 100 ml şi sigilate.

Pasteurizarea s-a realizat prin tratamentul termic la 70oC în bain-marie timp de 15 minute. Ulterior produsele au fost depozitate în diferite condiţii de frigider sau temperatura camerei pentru stabilirea termenului de valabilitate sau testate din punct de vedere calitativ. Băutura prototip dezvoltată reprezintă doar baza produsului finit cu impact asupra sănătății gastrointestinale. Aceasta va fi îmbuteliată într-o sticlă de culoare închisă pentru a evita eventualele procese de oxidare ce pot avea loc în prezenţa luminii. (Figura 13 ) Pentru a conferii stabilitate băuturii, a fost necesară dezvoltarea unui sistem inteligent de adăugare a capsulelor cu bacterii probiotice şi compuşi bioactivi. A fost achiziţionat de la Wildcaps Dosing solutions (http://wildcaps.com/) un sistem inovativ de capace (Figura 14) pentru flacoane care să permită eliberarea controlată a capsulelor în momentul consumului. Astfel se va realiza o băutură

8

http://wildcaps.com/

sănătoasă fără utilizarea chimicalelor pentru conservare. În prezent se fac cercetări pentru adaptarea acestui sistem la nivel industrial, pentru a diminua costurile de producţie.

Figura.13 Sticlă 100ml închisă Figura.14. Sistem inovativ de capace Wildcaps Figura 15. Variante experimentale de băutură

Adaptarea fluxului tehnologic pentru producţia băuturilor funcţionale la nivel industrial. În cazul producţie industriale, reziduurile de fructe şi legume se vor achiziţiona direct de la producătorii locali de sucuri de fructe şi legume sau de la procesatorii acestora. Se poate de asemenea cu o investiţia suplimentară chiar producerea şi comercializarea sucurilor de fructe şi legume în paralel cu producerea de băuturi probiotice din fructe şi legume, societatea deţinând majoritatea utilajelor în patrimoniu.

Fluxul tehnologic prezentat în Figura 16 începe cu recepţia materiei prime, receptie cantitativă şi calitativă, care se face la intrarea în incinta unităţii, ocazie cu care se verifică documentele de transport şi conformitatea cu clauzele prevăzute în contractul de achiziţie a materiei prime. Materia primă este adusă cu mijloacele proprii ale furnizorului.

Figura 16. Operaţii specifice la obţinerea băuturii funţionale din reziduuri de legume şi fructe

Resturile de fructe şi legume ambalate corespunzător în vid în lăzi din PVC sunt introduse în prima parte a secţiei de fabricaţie cu ajutorul transpaletei prevăzute în lista utilajelor. Acestea sunt amestecate cu apă de la robinet pentru diluare şi introduse în moara elicoidală, unde are loc procesul de măcinare fină si omogenizare a conţinutului. Apa folosită trebuie să îndeplinească condiţiile din STAS 1342-61, din punct de vedere organoleptic, fizico-chimic, biologic şi microbiologic.

Pasteurizarea se face printr-un şoc termic de inactivare a bacteriilor şi a enzimelor fermentative realizat într-o vană cu pereţii dublii, cu capac etanş prin menţinerea la 70oC 15 minute.

Ambalarea se face în recipiente etanse tip bag-in-box sau sticle. Pungile tip bag-in-box de 3l, 5l sau 10 litri/bucată sunt introduse în cutii de carton în vederea manipulării, stivuirii, depozitării şi

9

transportării. Când băutura probiotică se ambalează în sticle, este trimisă prin cădere la maşina de dozat cu funcţionare automată. Sticlele gata pregătite sunt aduse pe bandă la maşina de dozat, primesc băutura, apoi tot pe bandă sunt transportate la maşina de turnare automată. Acestea se închid aseptic cu capace după ce se introduc în instalaţia de pasteurizare. Astfel sucul de resturi de fructe şi legume nu mai face contact cu aerul, evitându-se astfel oxidarea.

După pasteurizare sticlele de suc sunt transportate tot pe bandă la maşina de atasare a dopurilor cu bacterii probiotice şi la cea de etichetat. Această maşină funcţionează de asemenea automat, are o capacitate orară corelată cu maşinile precedente şi aplică etichete ştanţate într-un mod ce depinde de tipul constructiv al maşinii. Lipirea etichetelor se face cu un clei pe bază de dextrină sau amidon, pregătit în prealabil. Se vor eticheta apoi se vor înfolia în grupe de 6 sau 12 bucăţi, şi trecute manual în lăzi, navete şi recepţionate pentru expediţie.

Cu utilajele prevăzute în linia tehnologică se pot ambala sucuri de fructe sau legume din materia primă semifabricată, procurată în ambalaje aseptice de 200-300 kg pe zi. Depozitarea se realizează în spaţii curate, aerisite, ferite de razele soarelui, la temperaturi între 4-20oC.

Aparatura de laborator intră în categoria investiţiilor pentru îmbunatăţirea controlului intern al calităţii materiei prime şi produsele obţinute în cadrul unităţii de procesare, ca dotări tehnologice obligatorii, indispensibile pentru desfăşurarea procesului tehnologic, ca şi utilajele tehnologice de bază.

Pentru certificarea calităţii şi conformităţii produsului societatea şi-a dotat propriul laborator cu aparatură după cum urmează: refractometru portabil, PH metru de masă, mixer magnetic, etuvă şi balanţa electronică. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.6. Caracterizarea chimică a biocompusilor din bauturile probiotice

S-a realizat extracţia compuşilor bioactivi atat din sucurile fabricate din reziduurile de mere, struguri albi, struguri roşii, morcovi, sfeclă roşie, pulpă reziduală de portocaleprecum şi din mixuri. Caracterizarea UV-Vis s-a realizat pe extractele efectuate astfel încât să fie cuantificate următoarele clase de compuşi: carotenoide, antociani, polifenolitotali, flavonoide. Pentruo evaluare mai amplă şi precisă a activităţii compuşilo rbioactivi, a fost determinată şi activitatea antioxidantă, prin metoda DPPH.

Prin metoda HPLC şi HPLC-MS/ESI+s-a determinat conţinutul în acizi organici, respectiv acizi fenolici, flavonoide, antociani şi betacyanidine din sucurile şi mixurile preparate. S-a determinat de asemenea, substanaţa uscată (Tabel 6), pentru sucurile şi mixurile obţinute. Substanţa uscată s-a determinat prin uscarea probelor la etuvă la 1050 C, timp de 4 ore.

Tabel 6. Substanţa uscată pentru sucuri şi mixuri

Nr. crt. Denumire probă S.U. (%) 1. Suc Măr 3,94 2. Suc Portocală 3,91 3. Suc Morcov 2,83 4. Suc Struguri albi 6,00 5. Suc Struguri negri 4,42 6. Suc Sfeclă roşie 1,40 7. Suc Lemn dulce 0,53 8. Mix 1 2,26 9. Mix 2 6,36 10. Mix 3 3,05 11. Mix 4 1,82 12. Mix 5 2,00 13. Mix 6 4,67 14. Mix 7 6,38 15. Mix 8 3,65

10

16. Mix 9 1,43

Carotenoidele totale s-au determinat prin metoda spectrofotometrică, s-a utilizat Spectrofotometru UV-Vis cu dublu fascicol, model JascoV530. Probele, suc din reziduri portocală, morcov şi mixuri, s-au supus extracţiei repetate cu un amestec de solvenţi acetat etil/metanol/eter petrol în proporţie de 1/1/1 (v/v/v). S-au inregistrat spectrele de absorbţie UV-Vis pe domeniul de lungimi de undă 600-300 nm (Figura 17) si s-a calculat cantitatea de carotenoide totale pe baza relaţiei de calcul : X = (A x V x 1000 x Fd)/(m x 2500 x 100) In care: X= cantitatea de carotenoide din probă (mg); A= absorbanţa probei citită la λmax = 450 nm; V= volumul final al extractului (ml); Fd=factorul de diluţie; m=masa probei (g); 2500= coeficient de absorbţie molar (E1%) pentru carotenoide.

Compuşii bioactivi din clasa carotenoidelor, prezintă un maxim de absorbţie la lungimea de unda λ = 447 nm, iar valoarea absorbanţei este proporţională cu cantitatea de carotenoide din fiecare probă.

Figura 17a. Spectru de absorbtie UV-Vis suc morcov A447 = 1,0531

Tabel 7. Carotenoide totale, exprimate in mg/100 g

Nr. crt. Denumire probă Carotenoide totale 1. Suc Portocală 0,844 2. Suc Morcov 5,024 3. Mix 1 0,250 4. Mix 2 1,003 5. Mix 3 0,632 6. Mix 4 0,318 7. Mix 5 0,588 8. Mix 6 0,784 9. Mix 7 0,401 10. Mix 8 0,188 11. Mix 9 0,515

Antocianii totali s-au determinat prin metoda spectrofotometrică,s-a utilizat Spectrofotometru

UV-Vis cu dublu fascicol, model Jasco V 530. Probele de suc din: struguri negri, sfecală rosie si mixuri, s-au supus extracţiei repetate cu metanol acidulat cu 1% HCl concentrat. S-au înregistrat spectrele de absorbţie UV-Vis pe domeniul de lungimi de undă 700-220 nm (Figura 18 a-k) şi s-a calculat cantitatea de antociani totali pe baza relaţiei de calcul :Y = (A x V x Fd)/(m x 850); In care: Y= cantitatea de antociani din probă (mg); A= absorbanţa probei citită la λmax = 535 nm; V= volumul final al extractului (ml); Fd=factorul de diluţie; m=masa probei (g); 850= coeficient de absorbţie molar (E1%) pentru antociani

Compuşii biologici activi din clasa antocianilor, prezintă un maxim de absorbţie la lungimea de undă λ = 535 nm, iar valoarea absorbanţei este proporţională cu cantitea de antociani din fiecare probă.

0

1.1

0.5

1

300 600400 500

Abs

Wavelength [nm]

11

Figura 18a. Spectru de absorbtie UV-Vis

Suc sfeclă A535 =0,1990

Tabel 8. Antociani totali, exprimaţi in mg/100 g Nr. crt. Denumire probă Antociani totali 1. Suc Sfeclă roşie 0,117 2. Suc Struguri negri 5,430 3. Mix 1 0,076 4. Mix 2 1,568 5. Mix 3 2,301 6. Mix 4 0,027 7. Mix 5 0,021 8. Mix 6 1,086 9. Mix 7 1,177 10. Mix 8 0,018 11. Mix 9 0,345

Cantitatea totală de polifenoli s-a exprimat în raport cu o curbă de etalonare cu acid galic de

diferite concentraţii:1mg/100ml; 0,5 mg/100ml; 0,25mg/100ml; 0,125mg/ml şi 0,0625mg/ml. Pentru trasarea curbei de etalonare se reprezintă grafic absorbanţele citite în funcţie de concentraţia de acid galic. Protocolul de lucru pentru plăcuţe cu 24 godeuri, cu un volum de 3ml 2,350 ml apă distilată, 0,05 ml probă, 0,150 ml reactiv Folin-Ciocîlteu şi 0,450 ml Na2CO3 au fost adăugaţi in placuţa de lucru pentru proba martor cei 0,05ml de probă au fost inlocuiţi cu 0,05 ml etanol 80%; dupa 2 ore la intuneric s-au citit absorbantele la λ = 750 nm, la spectrometrul multidetectie Biotek

Tabel 9. Polifenoli totali, exprimaţi in mg EG/100 g

Nr. crt. Denumire probă Polifenoli totali 1. Suc Măr 8,940 2. Suc Portocală 23,204 3. Suc Morcov nd 4. Suc Struguri albi 17,772 5. Suc Struguri negri 87,519 6. Suc Sfeclă roşie 5,286 7. Suc Lemn dulce 7,860 8. Mix 1 18,740 9. Mix 2 31,109 10. Mix 3 35,302 11. Mix 4 1,245 12. Mix 5 6,583 13. Mix 6 27,593

-0.1

1.1

0.5

230 700300 400 500 600

Abs

Wavelength [nm]

12

14. Mix 7 30,304 15. Mix 8 18,613 16. Mix 9 21,493

Tabel 10. Flavonoide totale, exprimate in mg EQ/100 g

Nr. crt. Denumire probă Flavonoide totale 1. Suc Măr 2,518 2. Suc Portocală nd 3. Suc Morcov nd 4. Suc Struguri albi 9,619 5. Suc Struguri negri 8,268 6. Suc Sfeclă roşie nd 7. Suc Lemn dulce nd 8. Mix 1 10,163 9. Mix 2 12,465 10. Mix 3 11,966 11. Mix 4 nd 12. Mix 5 2,240 13. Mix 6 8,108 14. Mix 7 7,187 15. Mix 8 6,374 16. Mix 9 4,696

Reacţia dintre DPPH şi antioxidanţii din extractie a fost monitorizată cu ajutorul spectrometrului

BIOTEK la 515nm. Soluţia de metanol a fost folosită ca şi blank, apoi 2,8ml DPPH şi 400µl probă au fost utilizate pentru fiecare determinare, absorbanţa fiind înregistrată la T30 (după 30minute).

Curba de calibrare a fost realizată cu Trolox, utilizând diferite diluţii (500µM, 250µM, 125µM pina la 3,95µM) şi apoi s-a înregistrat absorbanţa pentru probele aflate în studiu. Protocolul de lucru este pentru placuţe cu 24 godeuri. 80µM DPPH au fost dizolvaţi in metanol 98%.

Soluţia stoc de DPPH a fost preparată proaspat, sonicată 15 minute şi pastrată la intuneric la temperatura camerei; 250µl probă şi 1750µl soluţia DPPH au fost adăugate pe placuţa de lucru; proba martor conţine 1750µl DPPH şi 250µl metanol; după 30 minute se citeşte aborbanţa la 515nm faţă de metanol. Soluţia DPPH se decolorează de la violet la galben în prezenţa unui donor de hidrogen, stabilindu-se gradul de inhibare a radicalilor liberi (I%). Tabel 11. Activitate antioxidantă DPPH, exprimatăîn mM Trolox/100 g Nr. crt. Denumire probă Activitate antioxidantă

Figura 19a. Cromatograma standarde acizi organici: peak 1-oxalic tR=2,37; 2-tartaric tR=2,59; 3-malic tR=2,90; 4-ascorbic tR=3,17; 5-citric tR=4,12; 6-fumaric tR=5,65

1. Suc Măr 0,483 2. Suc Portocală 0,704 3. Suc Morcov nd 4. Suc Struguri albi 0,982 5. Suc Struguri negri 18,237 6. Suc Sfeclă roşie 0,618 7. Suc Lemn dulce 0,243 8. Mix 1 1,255 9. Mix 2 6,129 10. Mix 3 5,743 11. Mix 4 0,237 12. Mix 5 0,659 13. Mix 6 3,674 14. Mix 7 4,336 15. Mix 8

0,781 16. Mix 9 0,982 Conform figurilor 19 a, au fost identificaţi acizii organici şi cunatificaţi pentru fiecare suc şi mix preparat

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Abs

orba

nta

(mA

U)

Timp de retentie (min)

1

23

4

5

6

13

Tabel.12. Acizi organici în sucuri şi mixuri, exprimaţi in mg/100g Ac organic

Probă Sucuri (matrice) Mixuri

Morcov

Portocală

Măr

Struguri albi

Struguri negri

Sfecla roşie

Lemn dulce

mix1

mix 2

mix 3

mix 4

mix 5

mix 6

mix 7

mix 8

mix 9

Oxalic 9,153 54,298 6,78 9,613 14,468

13,065

2,129

10,59

10,01 13,8 11,4 14,1 16,0

11,25

13,556

15,129

Tartaric 79,213 87,002

3,19

141,08

394,26

773,85

11,59

544,6

211,6

303,9

216,1

314,6

118,8

104,9 260,3 328,6

Malic 38,372

181,657

150,

29,245

54,760 0,000

11,87

0,000

24,73

38,47

17,17

27,47

38,17

28,65 30,32 38,56

Ascorbic 2,175 42,921 1,67 2,773 4,471 0,000 1,771

5,291

3,950

3,277

3,640

4,904

8,474

4,447 6,545 7,862

Citric 24,311

166,936

10,9

12,405

16,983 0,000

8,075

0,000

57,11

96,49

50,95

99,07

112,9

59,44 87,50 101,8

Fumaric 0,119 0,618 0,00 0,232 0,066 0,000 0,011

0,000

0,004

0,149

0,006

0,167

0,159

0,047 0,084 0,137

Identificarea şi cuantificarea acizlor fenolici, flavonoidelor, antocianilor şi betacianidinelor . Pentru determinarea compusilor fenolici s-a utilizat sistemul HPLC model Agilent seria 1200 echipat cu pompa quaternara, degazor pentru solventi, autosempler, detector UV-Vis cu fotodioda (DAD) cuplat cu detector de masă (MS) singlequadrupole Agilent model 6110 (Agilent Techologies, CA, USA).Separarea compuşilor fenolici s-a efectuat pe o coloanăEclipse XDB C18, dimensiuni 4,6x 150 mm, 5 μm, Agilent Techologies, utilizând fazele mobile A ( Apa + 0,1 % Ac acetic)şi B (Acetonitril +0,1% Ac acetic ) în gradient: min 0-2 solvent B 5%, min 2-18 solvent B 40%, min18-20 solvent B 90%, min 20-24 solvent B 90%, min 24-25 solvent B 5%, timp de 30 minute, la o temperatură de 250 C, cu un debit de 0,5 ml/min.Pentru MS s-a utilizat modul ESI pozitiv de ionizare în urmatoarele condiţii de lucru: cappilary voltage 3000 V, temperatură 3000 C, debit azot 8 l/min, m/z:100-1000, full-scan.S-au inregistrat cromatogramele la 280 nm (acizi fenolici şi flavonoide) şi 520 nm (antociani şi betacyanidine) (Figurile 20 a).

Figura 20a. Cromatograma Suc Măr 280 nm

Tabel 13. Identificare compuşi fenolici în sucuri şi mixuri Peak no. Rt (min) [M-H]+ Compus 1 2.76 343, 181,163 Caffeic acid-glucoside 2 3.16 551, 389 Betanidin-5-glucoside 3 5.85 551, 389 Isobetanidin-5-glucoside 4 8.96 389 Betanidin 5 10.39 355, 181, 163 3-Caffeoylquinic acid 6 10.49 453, 291 Catechin 3-O-glucose 7 10.56 389 Isobetanidin 8 11.01 419, 287 Cyanidin 3-O-arabinoside 9 12.23 355, 181,163 Chlorogenic acid

0 5 10 15 20-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

1

9 12

15

17

20

22

14

10 12.59 493, 331 Malvidin 3-O-glucoside 11 13.42 181, 163 Caffeic acid 12 14.04 627, 465,303 Quercetin 3,4’-O-diglucoside 13 14.21 291 Epicatechin 14 15.75 463, 301 Peonidin 3-O-glucoside 15 16.24 611, 303 Rutin (Quercetin 3-O-rutinoside) 16 16.59 625, 317 Petunidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-glucoside 17 16.82 449, 303 Quercitrin (Quercetin 3-O-rhamnoside) 18 16.91 581, 273 Naringin (Naringenin 7-O-neohesperidoside) 19 17.32 639, 331 Malvidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-glucoside 20 17.43 437, 275 Phloridzin (Phloretin 2’-O-glucoside) 21 17.58 611, 303 Hesperidin (Hesperetin 7-O-rutinoside) 22 18.64 569, 437, 275 Phloretin 2’-O-xylosyl-glucoside 23 20.45 597, 287 Eriocitrin (Eriodictyol 7-O-rutinoside) 24 24.51 515, 355 3,4-Dicaffeoylquinic acid Activitate 2.7. Analiza senzoriala a produselor dezvoltate

Pentru evaluarea senzorială, a fost selectat un grup format din 60 de potențiali consumatori de prototip băutură probiotice, cu vârste cuprinse între 20 și 50 de ani (angajați, vizitatori). Deoarece abilitățile senzoriale variază în rândul consumatorilor și performanța senzorială este afectată de numeroși factori care au sau nu legătură cu produsele, precalificări au fost necesare pentru a lua parte la testele senzoriale. În scopul de a selecta testeri calificaţi pentru testul hedonic, subiecții fost supuşi unui test triunghi anterior (Stone si Sidel, 2004). Lor li s-au dat trei probe, una diferită și două la fel și au fost instruiţi pentru a gusta probele de la stânga la dreapta. Testerii au fost instruiți să identifice proba diferită și să înregistreze răspunsul lor. Cele șase combinații de ordine posibile au fost randomizate printre testeri. Cei 25 de testeri care au dat răspunsuri corecte au continuat cu testele. Ceilalți au fost respinşi.

Pentru evaluarea senzorială finală a fost utilizat o scală Hedonică în 9 puncte, utilizate pe scară largă pentru măsurarea stării de acceptabilitate a alimentelor. Membrilor comisiei au avut de evaluat următoarele atribute senzoriale: aspectul, mirosul, textura și gustul băuturilor probiotice descrise în tabelul 16. Pentru a produce probele supuse spre de evaluare, materialul biologic proaspăt (mere, struguri, morcovi, sfeclă de zahăr) a fost achiziționat de la un supermarket local din Bistrița (România). Probele au fost preparate după cum urmează: loturile au fost omogenizate, corpurile străine și a materialului vegetal a fost îndepărtat, au fost spălate cu apă de la robinet și uscate cu aer. Apoi probele au fost trecute individual printr-un storcător, pentru a separa cojile necesare și măcinate fin într-un procesor de alimente. Produsele rezultate au fost folosite ca ingrediente, împreună cu apa de la robinet în diferite procente pentru a obţine băuturile probiotice. Băuturile finale au fost ambalate în sticle de 100 ml, sigilate, pasteurizate, marcate cu un număr de cod corespunzător fiecărei rețete și dat pentru testare.

Având în vedere că nu există nici o băutură similară în piaţă, realizată din reziduuri, o probă martor (I) a fost făcută cu ajutorul sucului proaspăt de struguri neajunşi la maturitate deplină, dulci, dar ușor acizi, la care au fost adăugate coji măcinate de struguri. Această probă martor seamănă cu băuturile prototip în ceea ce privește aspectul și textura.

15

Tabel 14. Compuşii fenolici în sucuri, exprimaţi în mg/100g Peak no. Rt (min) [M-H]+ Compus Măr Portocală Morcov Struguri albi Struguri negri Sfeclă roşie 1 2.76 343, 181,163 Caffeic acid-glucoside 2.492 2 3.16 551, 389 Betanidin-5-glucoside 7.006 3 5.85 551, 389 Isobetanidin-5-glucoside 10.061 4 8.96 389 Betanidin 3.966

5 10.39 355, 181, 163 3-Caffeoylquinic acid 2.457

6 10.49 453, 291 Catechin 3-O-glucose 2.262 7 10.56 389 Isobetanidin 2.353 8 11.01 419, 287 Cyanidin 3-O-arabinoside 7.745 9 12.23 355, 181,163 Chlorogenic acid 1.270 10 12.59 493, 331 Malvidin 3-O-glucoside 13.015 11 13.42 181, 163 Caffeic acid 2.138 12 14.04 627, 465,303 Quercetin 3,4’-O-diglucoside 0.903 13 14.21 291 Epicatechin 2.368 14 15.75 463, 301 Peonidin 3-O-glucoside 2.984 15 16.24 611, 303 Rutin (Quercetin 3-O-rutinoside) 4.318

16 16.59 625, 317 Petunidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-glucoside 2.454

17 16.82 449, 303 Quercitrin (Quercetin 3-O-rhamnoside) 2.120

18 16.91 581, 273 Naringin (Naringenin 7-O-neohesperidoside) 19.897

19 17.32 639, 331 Malvidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-glucoside 7.358

20 17.43 437, 275 Phloridzin (Phloretin 2’-O-glucoside) 5.714 21

17.58

611, 303

Hesperidin (Hesperetin 7-O-rutinoside)

70.478

22 18.64 569, 437, 275 Phloretin 2’-O-xylosyl-glucoside 1.125

23 20.45 597, 287 Eriocitrin (Eriodictyol 7-O-rutinoside) 7.778 24 24.51 515, 355 3,4-Dicaffeoylquinic acid 14.146

16

Tabel 15. Compuşii fenolici în mixuri, exprimaţi în mg/100g Peak no.

Rt (min)

[M-H]+ Compus Mix 1

Mix 2

Mix 3

Mix 4

Mix 5

Mix 6

Mix 7

Mix 8

Mix 9

1 2.76 343, 181,163

Caffeic acid-glucoside 0.238 0.233 0.273

0.202 0.450

2 3.16 551, 389 Betanidin-5-glucoside 0.531 0.258 0.490 0.269 0.258 0.293 3 5.85 551, 389 Isobetanidin-5-glucoside 0.585 0.257 0.509 0.264 0.257 0.296 4 8.96 389 Betanidin 0.275 0.257 0.273 0.258 0.257 0.267 5 10.39 355, 181,

163 3-Caffeoylquinic acid

0.273 0.238 0.198 0.233

0.194 0.164 0.189

6 10.49 453, 291 Catechin 3-O-glucose 0.273 0.216 0.165 0.165 7 10.56 389 Isobetanidin 0.603 0.294 0.581 0.302 0.298 0.312 8 11.01 419, 287 Cyanidin 3-O-arabinoside 0.522 0.594 0.379 0.397 0.260 9 12.23 355,

181,163 Chlorogenic acid 0.260 0.207 0.242 0.171 0.419

10 12.59 493, 331 Malvidin 3-O-glucoside 0.638 0.884 0.472 0.463 0.275 11 13.42 181, 163 Caffeic acid 0.251 0.229 0.164 0.164 12 14.04 627,

465,303 Quercetin 3,4’-O-diglucoside 0.200 0.203

0.196 0.174 0.330

13 14.21 291 Epicatechin 0.220 0.220 0.163 0.163 14 15.75 463, 301 Peonidin 3-O-glucoside 0.293 0.337 0.267 0.275 0.257 15 16.24 611, 303 Rutin (Quercetin 3-O-rutinoside) 0.493 0.486 0.478 0.352 0.872 16 16.59 625, 317 Petunidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-

glucoside 0.278 0.319 0.264 0.267 0.257

17 16.82 449, 303 Quercitrin (Quercetin 3-O-rhamnoside) 0.344 0.326 0.341 0.181 0.467 18 16.91 581, 273 Naringin (Naringenin 7-O-

neohesperidoside) 1.455 0.719 1.432 1.455 0.794 1.573

19 17.32 639, 331 Malvidin 3-O-(6’-p-coumaroyl)-glucoside

0.488 0.561 0.407 0.413 0.275

20 17.43 437, 275 Phloridzin (Phloretin 2’-O-glucoside) 0.664 0.604 0.597 0.426 0.994 21 17.58 611, 303 Hesperidin (Hesperetin 7-O-rutinoside) 4.447 2.316 4.625 4.540 2.650 5.067 22 18.64 569, 437,

275 Phloretin 2’-O-xylosyl-glucoside 0.163 0.159 0.155 0.127 0.218

23 20.45 597, 287 Eriocitrin (Eriodictyol 7-O-rutinoside) 0.634 0.367 0.627 0.664 0.356 0.718 24 24.51 515, 355 3,4-Dicaffeoylquinic acid 1.292 1.216 0.968 1.141 1.004 0.583 0.982 Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a.

17

Table.16. Design experimental folosit pentru a obține diferite rețete pentru băutura probiotică prototip Cod probă

Coji de măr %

Coji de sfeclă de zahăr %

Coji de stuguri %

Coji de morcov %

Apă %

A 10 1 5 4 80 B 10 2 5 3 80 C 10 4 5 1 80 D 9 1 9 1 80 E 5 5 5 5 80 F 5 4 10 1 80 G 5 2 10 3 80 H 5 1 10 4 80 I Probă martor Notă. Procent din fiecare ingredient sunt prezentate per eșantion.

Gustul este caracteristica principală a acestui test senzorial. Rezultatele testelor arată că rețetele cu 10% coji de struguri și procent redus de sfeclă de zahăr (G, H), au obținut cel mai mare punctaj, similar cu proba martor de struguri (I). Cum era de așteptat, creșterea conţinutului de resturi de sfeclă de zahăr peste 2% (C, E, F) are o influență negativă asupra rezultatelor de gust, din cauza acidităţii sale. Creșterea procentului cojilor de mere la 10% (A, B, C) a dat produsului caracteristici mai dulci, dar blânde. Rezultatele privind mirosul sunt similare, datorită faptului că mirosul este o combinație de aromă, gust și senzație a gurii pentru a crea un profil complet. Cojile de struguri au cel mai bogat buchet aromat și ca un rezultat probe cu 10% de struguri obținut cele mai bune rezultate fiind depășită doar de proba din must de struguri. Pe de altă parte, morcovii au un aromă slabă, influențând negativ scorurile medii ale probelor în care a fost în procent mai mare, cu excepția probelor cu conținut mare de pieliţă de struguri.

Figura 21 Rezultatele analizei senzoriale ale băuturii probiotice prototip Scorurile medii pentru aspect au fost similare cu proba de control, cu excepția probelor C, E, F cu 4% și 5% coji de sfeclă de zahăr, care au dat băuturii o culoare nenaturală, violet foarte închis și a creat o neîncredere în rândul testerilor. Scorul general mediu din probe indică faptul că cojile de fructe și legume pot fi utilizate pentru a obține o băutură prototip cu atragere la clientii potentiali. Cele mai mari scoruri medii au fost obținute de

18

probele G și H cu pieliţa de struguri 10%, iar conținutul de 2-3% din sfeclă de zahăr și resturi de morcov 5%. O posibilă combinație între probele G și H ar putea îmbunătăți produsul final. După numeroase teste și analize făcute, o rețetă care conține raportul exact de coji de mere, sfeclă de zahăr, struguri, morcovi și apă a fost dezvoltată în scopul producerii noii băuturi probiotice în conformitate cu cerinţele subiective ale potențialilor consumatori. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.8.Evaluarea viabiliăţii probioticelor dupa trecerea prin sistemul gastrointestinal (Studiu pilot pe subiecti sănătoşi)

Evaluarea răspunsului citokinelor pro-inflamatorii (IL 17, IL 10), după administrarea probioticelor. Funcția imunomodulatoare a bacterilor probiotice asupra celulele epiteliale intestinale (IECS) depinde de specile bacteriene și tulpina, precum și de stimularea sistemului imunitar. Un răspuns pro-inflamator este necesar pentru a lupta împotriva potențialelor organisme patogene. Interleukina-17 (IL-17), aparține unei noi familii de citokine. Această familie de citokine este formata din 6 liganzi, care se leagă la 5 subtipuri de receptori și induc în aval semnalizarea. Deși receptorii sunt exprimati ubicuitar, răspunsurile celulare la liganzi variază de la familie de citokine la tesuturi. Th 17 este asociată cu diferite boli autoimune, inclusiv artrita reumatoidă, scleroza multiplă, boala inflamatorie a intestinului, astm si psoriazis în afară de a fi implicata în patogeneza cancerului. În plus, această familie are un rol în apărarea gazdei împotriva infecțiilor bacteriene și fungice. Mecanismele de semnalizare ale familiei IL-17 de citokine proinflamatorii nu sunt bine explorate. Lactobacilli pot promova producția de IL-12, care joacă un rol central în promovarea răspunsurilor Th1, esențiale pentru apărarea împotriva infecțiilor patogeni intracelulare.In afara de Th1, Th2, celulele Th17 au primit o atenție considerabilă recenta, tinand cont ca prezinta funcții distincte fata de celule Th1 și Th2. In special, celulele Th17 produc citokina IL-17 pleiotropică, care induce puternic inflamatia tesutului si este asociata cu patogeneza multor boli umane, cum ar fi IBD. Astfel, modularea celule Th17 este privită în prezent ca un rezultat farmacologic potenţial pozitiv. S-au efectuat recent studii pentru a clarifica dacă efectele antiinflamatorii ale probioticelor în afecţiunile în care este implicată Th17, poate avea ca rezultat o producţie scăzută de Il 17. In vederea demonstrării efectului probioticelor asupra profilului citokinelor proinflamatorii, şi eventualele efecte adverse, s-a folosit urmatorul protocol:

- au fost introduşi pacienţi cu vârstă peste 18 ani, din cadrul Institutului de Gastroenterologie şi Hepatologie Octavian Fodor (IRGH O Fodor) Cluj Napoca.

- lotul martor a fost reprezentat de subiecţi sănătoşi din cadrul IRGH O Fodor. Lotul martor şi cazurile introduse în acest studiu au fost adaptate în funcţie de sex, vârstă ( ±5

ani), reşedinţă. Cazurile şi lotul martor vor primi informaţii detaliate cu privire la acest studiu, fiecare în parte semnând un consimţămant detaliat. Un chestionar a fost folosit pentru a obţine informaţii cu privire la caracteristicile demografice, statutul socio-economic (ani de studii, stare civilă, ocupație), tutun şi consumul de alcool, dietă, stilul de viață, expunerile profesionale şi istoricul medical. La subiecţii sănătoşi s-au recoltat probe biologice ( IL 17), înainte şi la 3 zile de la adminstrarea băuturii probiotice. După recoltarea sângelui pentru IL 17, s-a centrifugat iar serul a fost stocat la - 80 grade, pănă la un moment dat când va fi testat prin metoda ELISA. De asemenea se urmăreşte modul în care administrarea băuturii probiotice influenţează numărul de colonii formatoare de colonii. S-a urmărit de asemenea apariţia eventualelor efecte adverse ale băuturii probiotice (constipaţie, diaree, crampe abdominale, balonări). Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a. Activitate 2.9. Monitorizarea microbiologică a bacteriilor din fecale umane

Probele de fecale recoltate de către partenrul IRGHOF, au fost stocate la -20°C în glicerol. Probele au fost analizate conform protocolului: 1 g din materialul fecal a fost diluat in 9 mL de ser fiziologic steril. Au

19

fost realizate diluţii successive şi câte 1mL din diluţiile aferente au fost inglobate in mediul specific MRS agar. Rezultatele primului lot de subiecţi investigaţi sunt prezentate în tabelul 17, de mai jos:

Tabel 17. Numărul de bacterii lactice iniţial şi final în materialul fecal (ufc/mL

Cod Subiect Numărul de bacterii lactice initial (ufc/mL)

Numărul de bacterii lactice final (ufc/mL)

LR 4x106 1,25x107 BI 3x106 3,1x107 JV 12x105 2x106 CS 10x105 1,69X109 PL

4. Prezentare orală: Conferinţa Detox 5- Probiotice- Alimente sănătoase. Vodnar Dan Cristian, 5.11.2015 International Ballroom, de la Transylvania College.

5. Prezentare orală: Alimente probiotice: O cale sănătoasă către o viaţă sănătoasă. Vodnar Dan Cristian, Conferinţa Naţională „Nutriţia – Medicina viitorului” – ediţia a V-a 27 noiembrie 2015. UMF Cluj-Napoca. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a.

Activitate 2.12. Diseminarea rezultatelor- Articole publicate

1. Dan Cristian VODNAR, Oana Lelia POP, Francisc Vasile DULF, Carmen SOCACIU. Antimicrobial Efficiency of Edible Films in Food Industry. Not Bot Horti Agrobo, 2015, 43(2):XXX-XXX. DOI: 10.15835/nbha43210048.

2. Oana L Pop, Dan C Vodnar, Ramona Suharoschi, Elena Mudura, Carmen Socaciu. L. plantarum ATCC 8014 Entrapment with Prebiotics and Lucerne Green Juice and Their Behavior in Simulated Gastrointestinal Conditions. Journal of Food Process Engineering, 2015. Doi: 10.1111/jfpe.12234

3. Andrei BORŞA, Sevastiţa MUSTE, Dan Cristian VODNAR, Liana-Claudia SALANŢĂ and Lucian CUIBUS. 2015. Sensory analysis of a new generation of probiotic drinks with functional gastrointestinal health impact. BUASVM-Food Science and Technology 72(2) 188-192. Această activitate a fost realizată in totalitate conform planului de realizare/ Etapa 2-a.

21