Curs 9 – Genetică

REGLAREA ACTIVITĂŢII GENICE

Necesitatea reglajului activităţii genelor, atât în celula procariotă cât şi în cea eucariotă , este

determinată de faptul că la un moment dat funcţionează numai o mică parte din totalitatea genelor.

Astfel, în celula bacteriană se aproximează că, în condiţii determinate de mediu, nu se sintetizează

decât cca 1 % din totalitatea proteinelor structurale şi enzimelor pentru care există informaţie genetică

în genom. Ca urmare, cantitatea de proteine şi în special de enzime sintetizate în celule nu este

constantă în timp, ci se află sub controlul unui mecanism de reglare genetică. În cazul eucariotelor

superioare, numai cca 7 – 10 % din secvenţele de ADN din genom sunt transcrise în ARN.

Mecanismele de reglare reprezintă deci un sistem de coordonare prin care se face selecţia

adecvată, în raport cu mediul, a informaţiei genetice care urmează a fi exprimată fenotipic.

Mesajul selectat reprezintă doar o parte din totalul informaţiei păstrată şi transmisă ereditar de

genom, ceea ce înseamnă că există molecule semnal care controlează rata de transcriere a unor

molecule specifice de ARNm (control transcripţional). După selecţia genelor, urmează transcrierea

informaţiei genetice purtată de acestea, în vederea sintezelor proteice după un program codificat de

gene, apoi realizarea echilibrată cantitativ a acestor sinteze şi desfăşurarea reacţiilor ce implică

activitatea catalitică a proteinelor sintetizate (control translaţional). Reglarea activităţii genelor,

intrarea lor în funcţiune după un program riguros controlat este evidentă atât la procariote cât şi la

eucariote.

La eucariote, dezvoltarea şi diferenţierea celulară este legată de transcrierea selectivă a

informaţiei genetice de la nivel celular. La aceste organisme apar diferenţieri celulare specifice ce nu

pot fi explicate decât admiţând faptul că unele gene funcţionează permanent, în timp ce altele

funcţionează diferenţiat, în anumite momente specifice ale ontogenezei.

În sinteza proteinelor există, în general, două tipuri de control:

- Controlul adaptativ – este dependent de condiţiile de mediu care determină activarea unei

anumite părţi din mesajul genetic (nefolosită până în acel moment), făcând să fie sintetizate

enzimele necesare celulei în acel moment şi să fie blocată sinteza enzimelor ce nu sunt necesare

în momentul respectiv;

- Controlul programat – este indirect influenţat de mediu, conducând la funcţionarea constantă

a genelor şi la sinteza de proteine în cantitate aproape constantă în tot timpul vieţii

organismului respectiv.

1

REGLAREA EXPRIMĂRII GENELOR LA PROCARIOTE

Mecanismele de reglare a activităţii genelor au fost cel mai bine studiate la bacterii.

Teoria reglării genetice la procariote a fost elaborată de geneticienii francezi F. Jacob şi J.

Monod, în 1961. Ei au demonstrat experimental şi teoretic că sinteza proteinelor şi respectiv a

enzimelor celulare, nu este constantă în timp ci variază în funcţie de necesităţile celulei.

În funcţie de mecanismele moleculare şi de efectele acestora, procesele de reglare a activităţii

genice pot fi grupate în două mari categorii: reglare pozitivă şi reglare negativă.

Reglarea pozitivă - reglarea genetică se realizează prin activarea unor gene în prezenţa unei

molecule efector care poate fi o proteină, o moleculă activator de mici dimensiuni sau un complex

molecular. Acest sistem , în anumite situaţii, necesită prezenţa AMPc şi a proteinei CRP (proteina

de legare, receptor, a AMPc), care iniţiază transcrierea genetică.

În sistemul de reglare negativă în celulă este prezent un inhibitor care împiedică

transcrierea. Acest inhibitor (represor) interacţionează cu o anumită regiune plasată în faţa

genelor reglate. Pentru iniţierea transcrierii este necesară prezenţa unui antagonist al inhibitorului,

numit inductor.

Reglarea operonului lactozei la Escherichia coli (operonul lac)

Cercetările privind reglarea genetică la procariote, au dus la concluzia că genele care acţionează

asupra unei căi metabolice nu au o activitate independentă ci fac parte din unităţi mai mari

denumite operoni ce funcţionează coordonat.

Un operon este o unitate funcţională alcătuită dintr-o secvenţă de nucleotide ce include:

un promotor, un operator şi una sau mai multe gene structurale care sunt transcrise într-un

ARNm policistronic (o moleculă de ARNm codifică pentru mai mult decât o proteină).

Un promotor – este o secvenţă de ADN, reprezintă situsul de recunoaştere a enzimei ARN

polimeraza care are rol în procesul de iniţiere a transcrierii. În sinteza ARN, promotorul indică

care gene ar trebui utilizate pentru sinteza ARNm, şi prin alungire (elongare), controlează ce

proteine vor fi sintetizate.

Un operator – este un segment de ADN, care reglează activitatea genelor structurale din

cadrul operonului, prin interacţiunea cu un represor sau un inductor specific.

Primul operon, descris de către F. Jacob, D. Perrin, C. Sanchez and J. Monod în 1960, a fost

operonul lac de la Escherichia coli.

La E. Coli se consideră a fi cca 200 de operoni, dintre care numai activitatea unora este mai

bine cunoscută.

2

Astfel, la E. Coli, posibilitatea utilizării lactozei din mediu şi a metabolizării ei, se realizează

cu ajutorul a 3 enzime:

- β –galactozid – permeaza (localizată în membrana celulei bacteriene asigură permeabilizarea

acesteia, facilitând trecerea lactozei în celula bacteriană) si

- β – galactozidaza (localizată în citoplasma bacteriană, clivează lactoza la glucoză şi galactoză –

fig. 1).

În cadrul metabolismului celular mai intervine tiogalactozid transacetilaza (care în mod

normal, are rol de acetilare a lactozei şi a altor β –galactozide cu ajutorul acetil- CoA).

Fig. 1. Lactoza si produsii de clivare

Sinteza acestor 3 enzime este determinată de 3 gene structurale: lac Z – codifică β-

galactozidaza , lac Y – codifică β- galactozid permeaza şi lac A- codifică tiogalactozid transacetilaza.

În absenţa lactozei din mediu, genele structurale care determină sinteza celor 3 enzime

sunt inactive.

Dacă însă se adaugă lactoză în mediu, cele 3 gene sunt rapid activate şi încep sinteza celor

3 enzime. Activitatea celor 3 gene structurale este controlată de o genă reglatoare lac I, care acţionează

asupra lor prin intermediul unui represor.

În absenţa lactozei, gena reglatoare sintetizează o proteină represoare care se cuplează cu un

segment de ADN denumit operator dispus înaintea celor 3 gene structurale, blocând astfel activitatea

genelor respective.

Operonul lac (fig. 2) este alcătuit din cele 3 gene structurale (lac Z, lac Y, lac A) şi o serie

de elemente reglatoare reprezentate de:

Represor – o proteină codificată de gena lac I –gena reglatoare, situată de regulă

separat de operonul a cărei activitate o reglează; are 2 situsuri de recunoaştere: unul

pentru lactoză şi compuşii săi şi altul pentru operonul lactozei.

3

Promotorul (p) – reprezentat de o secvenţă de nucleotide care are rol de loc de

recunoaştere pentru enzima ARN polimeraza, determinând astfel iniţierea transcrierii;

Operatorul (o) – o secvenţă de nucleotide care serveşte ca un situs de recunoaştere şi

de legare pentru represorul specific operonului.

Fig. 2. Operonul lac

Prin transcrierea operonului lac se formează o moleculă de ARNm ce copiază informaţia de pe

catena sens. Acest ARNm policistronic conţine mai multe semnale start pentru iniţierea traducerii.

Transcrierea genetică a operonului lac este controlată atât pozitiv cât şi negativ.

Inducţia, represia şi retroinhibiţia enzimatică

Cercetările privind sinteza celulară a enzimelor au dus la descoperirea fenomenelor de inducţie

şi represie enzimatică, fenomene opuse ca acţiune (antagoniste) şi care controlează cantitatea de

substanţe sintetizate.

Inducţia enzimatică este declanşată de prezenţa în mediu a substanţei ce trebuie

metabolizată (Ex. lactoza) – denumită în acest caz inductor.

În mod obişnuit, operonul lac este nefuncţional. El este indus să funcţioneze de îndată ce

bacteria este pusă pe un mediu cu lactoză. Represorul se combină cu inductorul (substanţa ce

trebuie metabolizată), devine inactiv şi pierde afinitatea pentru regiunea Operatorului. Starea

deblocată a operatorului permite accesul ARN polimerazei la genele structurale care încep să fie

transcrise sintetizându-se astfel enzimele corespunzătoare (enzime catabolice- ce catalizează

metabolizarea sau degradarea- substratului nutritiv) (Fig. 3a).

Represia enzimatică –este declanşată de absenţa substratului din mediu ( intervine în

momentul în care concentraţia substratului din mediu scade). Represorul trece din stare inactivă în

starea activă, se cuplează cu regiunea operatorului blocând-o, inhibând astfel activitatea genelor

structurale care asigură sinteza enzimelor corespunzătoare.

În mod normal, represorul este inactiv şi genele care asigură sinteza enzimelor implicate în sinteza

unor metaboliţi esenţiali funcţionează. Atunci când însă concentraţia unui metabolit esenţial depăşeşte

4

necesităţile celulei, metabolitul (substanţa sintetizată) formează cu represorul un complex activ numit

corepresor, care blochează operatorul şi genele corespunzătoare (Fig. 3b).

a) Sistem inductibil

b) Sistem represibil

Fig. 3. Reglarea operonului lactozei la Escherichia coli

De exemplu, la Salmonella typhimurium, genele din operonul his care specifică enzimele ce

intervin în sinteza histidinei, sunt funcţionale atunci când în celulă se află o concentraţie mică de

histidină. Când în celulă s-a acumulat o cantitate mare de histidină, expresia acestor gene este represată

şi sinteza histidinei încetează. Corepresorul (histidina în cazul operonului his) se cuplează cu

represorul (o proteină reglatoare) inactiv, care devine activ, blocând transcrierea operonului his.

5

Retroinhibiţia enzimatică – denumită şi inhibiţia prin feedback sau efectul Novick-

Szilard, este un alt sistem de control al sintezei proteice prin cantitatea de produs final. Astfel, în cazul

unui anumit lanţ metabolic în care intervin mai multe enzime, produsul final în cantitate mare inhibă

moleculele existente ale enzimei care controlează prima etapă a lanţului metabolic. Aceasta spre

deosebire de represia enzimatică care blochează sinteza tuturor enzimelor care intervin în lanţul

metabolic respectiv.

De exemplu, în calea metabolică a histidinei, prima enzimă este pirofosforilaza. Când concentraţia

histidinei în celulă devine prea mare, molecula de histidină se leagă la o regiune specifică acestei

enzime, schimbându-i conformaţia sa tridimensională, astfel că enzima devine nefuncţională. Când

concentraţia de histidină scade, aceasta părăseşte enzima, care refăcându-şi conformaţia spaţială

originală, redevine activă.

La E coli s-a observat că prin cultivarea pe un mediu ce conţine atât glucoză cât şi lactoză,

bacteriile utilizează preferenţial mai întâi glucoza, lactoza rămâne nemetabolizată până când în mediu

nu mai există glucoza, fenomen numit diauxie. Aceasta înseamnă că atâta timp cât există glucoză în

mediu, genele lac sunt inactivate. Acest mecanism reglator a fost denumit represie prin catabolit.

Prin urmare, pentru iniţierea transcrierii ARNm policistronic, pe lângă prezenţa inductorului mai

este necesar încă un element. Activitatea acestui element este legată de concentraţia glucozei, efectul

inhibitor al glucozei asupra exprimării genelor lac fiind indirect. Natura elementului suplimentar

necesar iniţierii transcrierii operonului lac, a fost stabilită recent, acesta fiind reprezentat de proteine

implicate în reglarea pozitivă a genelor.

De exemplu, în cazul operonului lac, când glucoza este absentă, în celulă există o cantitate mare

din molecula de reglare AMPc (adenozin-monofosfat ciclic). Acest element există şi în cazul celulelor

eucariote, mai ales la animale, unde reglează acţiunea mai multor hormoni.

Când glucoza este prezentă în mediu, nivelul AMPc este scăzut. Deasemenea, dacă în mediu se

află glicerol sau un alt compus care nu poate intra în calea metabolică a glucozei, nivelul AMPc este

ridicat.

Tulpinile de E.coli (şi multe alte specii de bacterii) sunt capabile să sintetizeze o proteină

specifică ce are rolul de receptor pentru AMPc (proteina CRP) codificată de gena crp.

Proteina CRP, împreună cu AMPc, formează un complex AMPc-CRP care se leagă la promotorul

operonului lac, la nivelul unui situs specific şi activează transcrierea (fig. 4).

Sinteza ARNm are loc doar în absenţa represorului şi în prezenţa complexului AMPc-CRP legat la

o secvenţă din regiunea promotor.

In celulele ce conţin mutaţii în genele crp sau cya nu se poate iniţia sinteza ARNm chiar dacă

respectivele celule conţin şi mutaţii lac I- (deci nu se sintetizează represor) sau mutaţii la nivelul

regiunii operator care determină sinteza constitutivă a b-galactozidazei.

6

Cu toate acestea, s-a dovedit că transcrierea genelor operonului lac se realizează şi în condiţii

bazale, cu o rată foarte scăzută dar activitatea maximă a acestuia necesită îndeplinirea condiţiilor

menţionate anterior

Controlul procesului de traducere al mesajului genetic

• Cercetările efectuate asupra operonului lac au evidenţiat faptul că există unele diferenţe în ceea

ce priveşte traducerea informaţiei purtate de ARNm policistronic, ceea ce sugerează existenţa

şi la procariote a unei reglări la nivelul procesului de tranducere.

• Astfel, s-a remarcat faptul că biosinteza celor trei enzime (b-galactozidază, permează şi

acetilază) se face în raport molar de 1:1/2:1/5, diferenţele datorându-se reglării la nivelul

traducerii. Fenomenul se poate realiza pe două căi in care gena lac Z este tradusă prima.

Se pare că, în cazul moleculelor de ARNm policistronic, imediat după sinteza polipeptidului

codificat de prima genă are loc separarea de ribosomi,

urmând să se formeze un nou complex de iniţiere la nivelul codonului AUG al celei de-a doua

gene.

7

Frecvenţa cu care se realizează acest proces este corelată cu probabilitatea reiniţierii la fiecare

codon AUG următor.

Astfel, se formează un gradient în cantitatea de polipeptide sintetizate de la capătul 5’ spre cel 3’ al

ARNm.

Aceste efect, numit polaritate, se realizează în cazul majorităţii moleculelor de ARNm

policistronic. Toate moleculele de ARNm sunt degradate la nucleotide după câteva runde de

traducere.

• Degradarea este înceată dar uneori începe imediat după primul eveniment de traducere.

• Degradarea ARNm policistronic începe, cel mai frecvent, la nivelul genei lac A, apoi continuă

cu gena lac Y şi, abia la sfârşit, cu gena lac Z.

• Consecinţa acestui fenomen este că, la un moment dat, sunt mai multe copii ale genei lac Z

decât lac Y şi, evident, cu mult mai multe decât lac A.

8