1

RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ

RAPORTUL ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC (RST)

ETAPA DE EXECUȚIE NR. 4

Elaborarea unui ghid metodologic de autentificare pentru certificarea branzeturilor

traditionale in vederea valorificarii pe piata unica. Testarea componentelor integrate,

validarea functionala a platformei web si a exploatarii in mediul real

Proiect PCCA nr. 153/2014

Director proiect: Conf. dr. Dan Sorin Daniel

2

CUPRINS

1. Obiectivele fazei de execuţie .......................................................................................... 3

2. Rezumatul fazei .............................................................................................................. 3

3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică ...................................................................................... 4

3.1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit ....... 4

3.2. Construirea hărţii izotopice a brânzeturilor autentice din zona Transilvaniei ............ 9

3.3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web

si a exploatarii in mediul real ........................................................................................... 11

3.3.1. Modificari in baza de date .................................................................................. 11

3.3.2. Introducerea valorilor masurate ......................................................................... 13

3.3.3. Modificari de functionalitate .............................................................................. 14

3.3.4. Prezentarea datelor ............................................................................................. 16

3.4.5. Testarea functionarii Portalului .......................................................................... 19

3.4. Ghid metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale ................................ 20

3.5. Diseminarea rezultatelor ........................................................................................... 20

4. Concluzii ...................................................................................................................... 20

3

1. Obiectivele fazei de execuţie

1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit.

2. Construirea hartii izotopice a branzeturilor autentice din zona Transilvaniei

3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web

si a exploatarii in mediul real

4. Elaborarea ghidului metodologic de autentificare a produselor traditionale

5. Diseminarea rezultatelor

2. Rezumatul fazei

În vederea identificării originii brânzeturilor tradiţionale, folosind metode moleculare

de analiză s-au prelevat 44 probe recoltate în intervalul februarie-iulie 2017 de la exploataţiile

de taurine şi ovine luate în studiu. Frecvenţa de apariţie a falsurilor la producătorii de brânzeturi

declarate din lapte de oaie a fost foarte ridicatǎ (67%), 16 din probele de produse lactate pozitive

la ADN de vacă şi achiziţionate de pe piaţǎ fiind în concentraţii mai crescute de 10%, cea mai

crescută falsificare fiind înregistrată în cazul brânzei telemea produsă de către producătorii din

zona de şes. Acest procent este îngrijorǎtor, având în vedere faptul cǎ diversitatea şi numǎrul

producǎtorilor este mult mai scăzut decat în cazul produselor lactate de vacă.

Diferentierea probelor de branza (telemea si cas) in functie de originea geografica (zona

de provenienta - cele 3 zone: Zona A – montană, Zona B – deal, zona C - şes) are ca cei mai

buni markeri: Rb, K, Li, δ13C cazeina, Mg, W si Sr. Cei mai buni markeri in acest caz au fost:

Li, δ13C cazeina, Ti, K, Tl, Rb, Cu, B, Mg, Na, As, Er, Sm, W, Dy si Sn. Diferentierea probelor

de telemea in functie de producator a relevant că cei mai buni predictori obtinuti au fost: Be,

Co, Sr, P, As, Mn, Eu, Dy, Ag, K, Tb, Te, Sm, Ca, Ru si Cd. Valoarea izotopica 13C din probele

“bulk” de lapte de vaca si oaie a fost mai scazuta decat cea din cazeina, ca si consencinta a

fractionarii izotopice aparute in timpul sintezei lipidelor in plante si animale, cazeina

necontinand lipide In general, s-au obtinut diferente izotopice mai mari intre probele de telemea

si cazeina extrasa din aceste probe, fata de cele de cas si cazeina aferenta. Aceste diferente ar

putea fi explicate prin continutul diferit de grasimi pe cale le contin aceste produse lactate, casul

avand un continut mai ridicat de grasime decat telemeaua.

Prin platforma web, realizata in cadrul proiectului, s-a realizat culegerea datelor

necesare identificarii originii produselor obtinute in cele trei zone de analiza (documente

asociate prelevarii probelor din zonele de analizat, buletine de analiza cu rezultatele masurate,

matrice de parametri, etc). De asemenea, platforma web realizeaza vizualizarea datelor in

diferite moduri: tabelar, grafice, diagrame sau harti cu distributia geografica a parametrilor si

demontreaza totodata posibilitatea trasabilitatii parcursului si a responsabilitatilor pentru

actiunile asociate cu probele prelevate, analizate si publicate.

4

3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică

3.1. Dezvoltarea, testarea protocolului PCR pentru autentificarea produsului finit

S-au prelevat 36 probe în intervalul februarie-iulie 2017 de la exploataţiile de taurine şi

ovine luate în studiu (zona montană A: 4 probe telemea vacă; 4 probe caş vacă, 4 probe caş

oaie; 4 probe telemea oaie; zona deal B: 4 probe caş vacă; 4 probe telemea vacă; zona şes C: 4

probe telemea vacă; 4 probe caş vacă; 4 probe telemea oaie; 4 probe caş oaie). În vederea

identificării speciei furnizoare de lapte şi implicit a fraudelor în cazul produselor finite, au fost

supuse testării toate probele de caş şi telemea de oaie şi doar o parte din probele de brânză

provenite de la taurine. În vederea interpretării corecte a rezultatelor s-au utilizat probe de

referinţă de brânză de vacă şi oaie.

Protocolul de autentificare a speciei în cadrul produselor lactate dezvoltat şi optimizat

cu succes în etapă 3-a, a făcut posibilă cuantificarea ADN-ului de amestec pe baza etalonului

creat şi a tehnicii de amplificare descrise în cele ce urmează: extracţia ADN-ului s-a realizat cu

ajutorul unui kit de extracţie Genomic Isolate II (Bioline), special creat pentru extracţia din

ţesuturi. Nefiind specific pentru produsele alimentare, iar brânzeturile fiind o categorie aparte

datorită temperaturilor ridicate din timpul procesării, acesta a fost testat în premieră şi pe acest

tip de produse. Prima etapă a constat în cântărirea a 0,025g din fiecare probă şi plasarea în

tuburi individuale Eppendorff de 1,5ml; Proteinaza K s-a reconstituit mai apoi după

instrucţiunile din kit-ul ISOLATE II Genomic DNA Kit: 180μl soluţie Buffer + 25μl proteinaza

K pentru fiecare proba. S-a adăugat proteinaza K reconstituită în tuburile cu probe, s-a vortexat

şi s-a incubat la termobloc la 56°C timp de 2 ore până la liza completă a probelor. La scoaterea

probelor din termobloc s-a mai vortexat o dată. Pentru determinarea corespunzǎtoare s-a

reconstituit soluţia de lizǎ (Lysis Buffer G3) prin omogenizarea a douǎ soluţii: soluţia

concentratǎ de lizǎ (G2) existentǎ în kit cu soluţia apoasǎ (G1) pentru a stabili concentraţia

optimǎ necesarǎ. Din aceastǎ soluţie reconstituitǎ s-au adăugat câte 200μl la fiecare probă şi s-

a vortexat. După ce s-a efectuat acest pas, probele au fost menţinute la termostat la o

temperaturǎ de 70°C timp de 10 minute, iar dupǎ ce timpul a expirat acestea au fost din nou

vortexate. Peste probele realizate până la acest moment s-a mai adăugat 210μl etanol (conc. 96-

100%) pentru fiecare probǎ, iar mai apoi s-a vortexat energic pentru omogenizarea probei cu

etanolul adǎugat. Aceastǎ etapǎ trebuie respectatǎ cu stricteţe având în vedere faptul cǎ etanolul

are rolul de a spǎla ADN-ul şi practic inhibitorii de reacţie vor fi înlǎturați prin diluţie. Dupǎ

spǎlarea ADN-ului se vor introduce colonițele de ADN (Genomic DNA Spin Column) se

introduce în tuburi de 2 ml, peste care se introduce proba şi se centrifughează la 11.000 rpm

timp de 60 de secunde. După centrifugare se îndepărtează lichidul, iar tuburile se folosesc în

continuare. La fiecare probǎ s-au adăugat 500μl Wash Buffer GW1, s-a centrifugat la 11.000

rpm timp de 60 de secunde, după care s-a îndepărtat din nou lichidul iar tuburile s-au reutilizat.

La fiecare probǎ s-au adǎugat 600μl Wash Buffer GW2, se centrifughează la 11.000 rpm timp

de 60 de secunde, se îndepărtează lichidul iar tuburile s-au reutilizat din nou. Mai apoi s-a

centrifugat la 11.000 rpm timp de 60 de secunde pentru a îndepǎrta eventualele reziduuri de

etanol, s-au aruncat tuburile de 2ml iar tuburile (Genomic DNA Spin Column) s-au pus în tuburi

sterile de 1,5ml. Peste fiecare tub s-au adǎugat câte 100μl Elution Buffer pentru fiecare proba,

încălzit în prealabil la 70°C, în centrul membranei tuburilor (Genomic DNA Spin Column), şi

s-au incubat la temperatura camerei timp de un minut. Pentru a capta ADN-ul, pasul final a fost

centrifugarea la 11.000 rpm timp de 60 de secunde. Dupǎ ce protocolul a fost finalizat, probele

5

de ADN au fost cuantificate la spectrofotometrul Nanodrop ND 1000 pentru a verifica dacǎ

acestea sunt corespunzǎtoare pentru realizarea tehnicii PCR.

Tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului de vacă din probele analizate

Pentru a putea evidenţia cu ajutorul tehnicii PCR, prezenţa ADN bovin în produsele

lactate de oaie s-au preluat primeri specifici ambelor specii (tab. 1). În cadrul acestei cercetǎri

setul de primeri specifici s-a obţinut în aşa manierǎ încât primerul Forward sǎ fie comun

ambelor specii (bovin și ovin). Aceşti primeri ar trebui sǎ producǎ un amplicon de mǎrimea a

126 pb la ADN de vacǎ și de 332 la ADN de caprǎ, respectiv 430 la ADN de oaie. Prezenţa

ADN de vacǎ în amestecuri de lapte şi brânzeturi s -a realizat prin amplificarea secvenţei ţintǎ

a ADNmt cu primerii specifici de vacǎ (Primeri 1 şi 2) descriși ȋn tabelul nr.1.

Tabel nr. 1.

Secvențele de primeri utilizați ȋn cadrul aplicǎrii tehnicii PCR simplex și multiplex

Secvența (5’- 3’) Lungime Temperature de

topire

Specificitate

specie

Primer 1

ACTAGATCACGAGCTTGA

TCACCATGC

27 pb 60.2 comun

Primer 2

ATGCCTCCTAAAATTCATT

AATATGCG

27 pb 60.1 vacǎ

Primer 3

GCTACAGGGCATAGATTT

CGATGCATGACT

27 pb 60.1 oaie

Ȋn paralele s-au efectuat determinǎri PCR de control, cu primeri specifici de oaie

(Primeri 1 şi 3) care au fost utilizaţi pentru a identifica diferitele concentraţii de lapte în amestec.

Toate amplificǎrile PCR s-au realizat într-un volum final de reacţie de 25 µl. Pentru a evita

orice amplificare nespecificǎ s-a realizat un protocol iniţial de amplificare în gradient pornind

de la o temperaturǎ de aliniere a primerilor de 60ºC, gradual redusǎ cu 1ºC pânǎ la atingerea

temperaturii de 54ºC. La 54ºC, s-au realizat 35 de cicluri. În fiecare ciclu temperatura de aliniere

a fost urmatǎ de un pas de elongaţie la 72ºC timp de 30 de secunde. Extensia finalǎ s-a realizat

la 72ºC timp de 10 min. PCR duplex s-a realizat prin coamplificarea atât a segmentului ţintǎ

din cadrul ADN de vacǎ cât şi a celui de caprǎ/oaie.

Protocolul PCR a urmǎrit urmǎtorii pași:

Etapa I: Pregătirea probelor pentru PCR simplex: s-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate

200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl primer Forward; 1µl primer Reverse, 4 µl

ADN şi 6,5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final: 25µl.

Etapa II: Pregătirea probelor pentru PCR duplex: s-au pregătit tuburi Eppendorff de capacitate

200µl în care sau adǎugat: 12 ,5 µl MasterMix, 1µl primer Forward; 1µl primer Reverse Vacǎ,

1µl primer Reverse Bivol, 4 µl ADN şi 5,5 µl apǎ purǎ PCR. Volumul final: 25µl.

Etapa III: Amplificarea probelor: amplificarea probelor s-a realizat cu ajutorul unui

termocycler (G-STORM).Aceastǎ etapǎ presupune supunerea probelor la diferite temperaturi

pentru a reconstitui fragmentul de ADN amplificat. În cadrul programului de amplificare s-a

urmărit pentru realizarea PCR simplex protocolul următor: Denaturarea: 1x95°C→5 minute;

Alinierea primerilor în mai multe stadii: 35x95°C→1 minut, 35x54°C→1 minut (primeri de

vacǎ), 35x62°C→1 minut (primeri de caprǎ/oaie), 40x72°C→1 minut; Elongaţia finală: 1x72°C

→10 minute. În cadrul programului de amplificare s-a urmărit pentru realizarea PCR multiplex

protocolul următor: Denaturarea: 1x95°C→5 minute; Alinierea primerilor în mai multe stadii:

6

35x95°C→1 minut, 35x58,5°C→1 minut, 40x72°C→1 minut; Elongaţia finală: 1x72°C →10

minute.

Etapa IV: Obţinerea profilelor electroforetice: s-a realizat prin migrarea probelor de ADN

amplificat într-un gel de agaroză de concentraţie 1,2%, iar pentru colorarea şi vizualizarea

produşilor s-a folosit RedSafe (1,7µl – 35 ml/gel; 7µl – 140 ml/gel). Gelul de agaroză a fost

introdus într-o cuvă de electroforeză iar citirea şi interpretarea reacţiei s-a realizat cu ajutorul

unui transiluminator BioRad.

Rezultatele obținute la aplicarea tehnicii PCR simplex

Ȋn vederea testǎrii probelor lactate de oaie s-a testat același protocol PCR simplex doar

cǎ primerii desigur utilizați au fost specifici pentru oaie și pentru vacǎ. Dupǎ cum se poate

observa și din figura 5.2. la amplificarea cu primeri specifici de oaie, aceștia au fost foarte

specifici neamplificȃndu-se și produși secundari de reacție.

Figura 1. Rezultatele obținute la amplificarea probelor prin PCR simplex și testarea

primerilor de oaie și de vacǎ ; M: marker de ADN (100 de perechi de baze) ; 1 – proba martor

pozitiv pentru ADN de oaie (436 pb) ; 2 – 6 – probe pozitive la amplificarea cu primeri

specifici de oaie; 7- proba martor pozitiv ADN de vacǎ ; 8 – probǎ negativǎ pentru ADN de

vacǎ ; 9 – probǎ pozitivǎ la ADN de vacǎ

Așa cum se poate observa din figura 1, ȋn cazul probelor de oaie, testarea s-a realizat

inițial ca și ȋn cazul celor de caprǎ prin tehnica PCR simplex. Ȋn cazul brânzeturilor din lapte de

oaie s-a constatat o prevalențǎ mai scǎzutǎ a adaosului de lapte de vacǎ. Astfel, majoritatea

probelor au fost pozitive la ADN de oaie și negative la ADN de vacǎ (fig. 1). Pentru a putea

aproxima concentrațiile posibile de ADN de vacǎ din amestecul ȋn produsele lactate studiate,

am realizat diluții de ADN de vacǎ/oaie, dupǎ care probele s-au amplificat. Aceastǎ testare a

concentrațiilor se realizeazǎ direct din ADN-ul extras pur de vacǎ dupa care probele sunt

amplificat iar interpretarea se realizeazǎ dupǎ intensitatea benzilor amplificate. Deși nu este o

tehnicǎ recunoscutǎ ca fiind sigurǎ ȋn estimarea concentrațiilor totale de ADN din amestec, ea

a mai fost testatǎ si de cǎtre alți cercetǎtori ce susțin acuratețea ei. Am dorit sa testǎm acest

lucru prin prisma faptului cǎ ADN-ul de vacǎ este acceptat ȋn produsele lactate de altǎ origine

ȋn concentrație de sub 0.1%. Urmele de ADN de vacǎ sunt acceptate datoritǎ faptului cǎ acest

lucru poate sǎ se ȋntȃmple mai ales ȋn unitǎțile mari de producție datoritǎ contaminǎrii

ȋncrucisate sau utilizǎrii acelorași echipamente ȋn procesarea laptelui. Chiar dacǎ se utilizeazǎ

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

M

436 126 pb

7

dezinfectanți și se igienizeazǎ desigur utilajele, ȋn mod curent nu folosesc și soluții de

decontaminare ADN.

Figura 2. Amplificarea probelor amestec de concentrații cunoscute: 1- ADN vacǎ <0.1%; 2

– ADN vacǎ <0.5%; ADN vacǎ – 10%; ADN vacǎ >10%.

Prin urmare am constituit patru probe martor de concentrație <0.1% ADN, ADN <

0.5%, ADN - 10% și ADN >10%. Așa cum se poate observa din figura 2, la amplificare am

constatat cǎ proba 1 de concentrație <0.1% avea o vizibilitate mai scǎzutǎ ȋn gel, proba 2 de

<0.5% o bandǎ la fel de vizibilǎ, proba de concentrație 10% și peste 10% prezenta o bandǎ

vizibilǎ, strǎlucitoare. Dupǎ realizarea acestui etalon al ADN-ului de vacǎ ȋn amestecuri de

concentrații diferite s-a interpretat intensitatea benzii obținute.

Figura 3. Estimarea concentrațiilor de ADN amestec de vacǎ ȋn probele lactate de oaie

Așa cum se poate observa din figura 5.5. ȋn cazul probelor lactate de oaie la care s-a

relavat benzi pozitive, majoritatea au relevat benzi de intensitate redusǎ ceea ce semnificǎ ca

probabilul amestec s-a realizat ȋn concentrație redusǎ (<0.1%; 0.5%). Probele 19,20,21,31,32

au relevat intensitǎți mai crescute ale benzilor ceea ce semnficǎ o concentrație mai ridicatǎ de

ADN de vacǎ (>10%).

Rezultatele obţinute la aplicare tehnicii PCR multiplex

La aplicarea tehnicii PCR multiplex s-a relevat compatibilitatea primerilor din punct de

vedere al temperaturii. Astfel, în figura 4 se poate observa amplificarea în aceaşi reacţie atât a

primerilor ADN-ului de oaie cât şi a ADN-ului de vacă. După aplicarea tehnicii PCR simplex,

doar probele relevate pozitive au fost confirmate prin această tehnică.

M 1 2 3 4

8

Figura 4. Rezultatele obţinute la aplicarea tehnicii PCR multiplex în probele lactate de oaie

Aşa cum se poate observa din figura 4, brânzeturile declarate din lapte de oaie regăsite pozitive

la ADN-ul de vacă prin tehnica PCR simplex au fost confirmate şi prin tehnica multiplex. După

cum se poate observa din figura 4, ADN-ul de oaie (436 pb) s-a amplificat mult mai evident,

banda fiind de intensitate mai crescută, iar în cazul ADN-ului de vacă, benzile din nou prezintă

intensităţi diferite simbolizând un adaos variat.

Fig. 5. Concentraţia de ADN bovin în brânzeturi declarate din lapte de oaie

Această metodă, aplicată în cadrul acestui studiu, se bazează pe amplificarea unor

regiuni ţintă din ADN-ul mitocondrial, cu o limită de detecţie de 0.1% adaos posibil. Acest

lucru este susţinut de asemenea şi de alte cercetări efectuate în produsele lactate de capră şi oaie

(Piknov şi col. (2002). Metoda de referinţă Europeană de identificare a falsurilor de amestec

din produsele lactate este cea de focalizare izoelectrică a proteinelor, ce prezintă o limita de

1%. Cozzolino şi col. (2001) consideră ca detecţia limită de 5% este suficientă pentru

demonstrarea adaosului nedeclarat. Acesta a mai susţinut faptul că orice amestec de sub 5%

adaos nu produce un efect economic eficient de aceea nici nu se prea practică în cantităţi atât

de reduse. Frecvenţa de apariţie a falsurilor la producătorii de brânzeturi declarate din lapte de

oaie a fost foarte ridicatǎ (67%), 16 din probele de produse lactate pozitive la ADN de vacă şi

achiziţionate de pe piaţǎ fiind în concentraţii mai crescute de 10% (fig. 5), cea mai crescută

falsificare fiind înregistrată în cazul brânzei telemea produsă de către producătorii din zona de

şes. Acest procent este îngrijorǎtor, având în vedere faptul cǎ diversitatea şi numǎrul

producǎtorilor este mult mai scăzut decat în cazul produselor lactate de vacă.

67%

33%

<10%

>10%

126 pb

436

9

3.2. Construirea hărţii izotopice a brânzeturilor autentice din zona Transilvaniei

Pe baza datelor furnizate de către partenerul INCDTIM Cluj-Napoca, privind rapoartele

izotopice analizate din probele de brânzeturi, s-au generat hărţile izotopice cu ajutorului platformei Web

TradFood 2014, care este alcătuită dintr-un Portal Web TradFood-2014 si din bazele de date aferente

acestuia.

Figura 6. Afisarea unor harti de ansamblu si de detaliu

Pentru implementarea acestei platforme Web au fost folosite tehnologii de la firma Microsoft

care includ: mediul de dezvoltare Visual Studio 2010, limbajul C#, mediile de lucru .NET 4.0 si

ASP.NET 4.0, sistemul de gestiune al bazelor de date SQL Server 2008 R2 Express, componentele din

ADO.NET, precum si unele pachete si biblioteci de functii si pachete de componente suplimentare, care

vor fi mentionate acolo unde este cazul (aspecte descrise în manual de utilizare v1.2 TradFood 2014).

10

Figura 7. Afisarea valorii masurate prin plasarea cursorului “mouse”-ului pe un marcher secundar

Figura 8. Afisarea unei harti de detaliu cu rapoarte izotopice

Pentru a obtine o astfel de reprezentare sub forma unei harti trebuie selectata pagina ‘Caract.’

care permite lucrul cu valorile masurate ale parametrilor, cu alte cuvinte cu caracteristicile ale unitatilor

de productie. Dupa selectarea valorilor masurate pentru Rapoartele izotopice de interes si afisarea hartii

principale (in stinga Fig. 6), se poate obtine harta de detaliu (in dreapta Fig. 6) cu un clic pe marcherul

principal, evidentiat. Din harta de detaliu se pot obtine informatii in privinta unitatii de productie, a

elementului analizat (matrice), a tipului de analiza efectuata si a parametrului masurat (Fig. 6), cu un

clic pe marcherul principal. Apoi, cu un clic pe oricare dintre marcherele secundare din harta de detaliu

11

se obtin informatii in privinta valorii masurate, a unitatii de masura, a datei efectuarii analizei si a

buletinului de analiza care a insotit masuratoarea (Fig. 7). O data cu introducerea completa a datelor

colectate pentru proiect (documentele si valorile masurate ale paramatrilor) a fost posibila realizarea

unor reprezentari grafice care sa ilustreze una dintre cerintele initiale: realizarea unor harti cu

reprezentari grafice ale Rapoartelor izotopice (Fig. 8).

3.3. Testarea/validarea componentelor integrate. Validarea functionala a platformei web

si a exploatarii in mediul real

In etapa a 4-a (2017) Platforma Web a fost folosita, in continuare, pentru introducerea

si stocarea datelor primare si a documentelor pentru proiect. Au intervenit si citeva modificari,

in structura bazei de date si a componentelor pentru introducere, stocare si prezentare a datelor,

modificari menite sa imbunatateasca si sa extinda functionalitatea pusa la dispozitia

utilizatorilor Portalului TRADFOOD-2014.

3.3.1. Modificari in baza de date

Modificari in TFP2014DB

Pentru asigurarea mecanismului de blocare a conturilor de utilizator dupa un numar de

incercari de conectare esuate a fost extins tabelul TFP2014_Utilizatori prin crearea unuia nou,

numit TFP2014_Utilizatori_LO

a carui structura este prezentata mai jos:

TFP2014_Utilizatori_LO

UserID int Unchecked

Name nvarchar(50) Unchecked

Password nvarchar(50) Checked

Email nvarchar(100) Unchecked

LoginFailureCount smallint Checked

Locked bit Checked

Cimpurile nou introduse contorizeaza, pe de o parte, incercarile de conectare esuate, iar la

atingerea unui numar de 5 esecuri contul va fi blocat, prin setarea cimpului Locked pe valoarea 1, el

devenind inutilizabil.

Nota:

Deblocarea unui cont blocat de utilizator o poate face numai un utilizator in rol de ‘Admins’.

De asemenea a fost creat un nou tabel TFP2014_UtilizatorRoluri_LO cu structura

asemanatoare celui vechi TFP2014_UtilizatorRoluri si care este prezentat mai jos:

TFP2014_UtilizatorRoluri_LO

UserID int Unchecked

RoleID int Unchecked

12

Proceduri stocate modificate:

TFP2014_ActualizeazaUtilizator_LO

TFP2014_AdaugaUtilizator_LO

TFP2014_AdaugaUtilizatorRol_LO

TFP2014_ConectareUtilizator_LO

TFP2014_IaApartenentaRol_LO

TFP2014_IaRoluriPeUtilizator_LO

TFP2014_IaUnUtilizator_LO

TFP2014_IaUtilizator_LO

TFP2014_IaUtilizatori_LO

TFP2014_StergeUtilizator_LO

TFP2014_StergeUtilizatorRol_LO

In acelasi scop au fost modificate corespunzator componentele Portalului care asigura administrarea

rolurilor si a securitatii Portalului.

Modificari in TF2014DB

Adaugarea unor elemente analizate (matrici) noi

Pentru a putea fi introduse valorile masurate ale parametrilor in conformitate cu buletinele de

analiza primite, au fost adaugate doua elemente analizate noi: furaj concentrat (porumb si faina)

- diferit fata de furajul uscat (fin – trifoi/lucerna uscata) si cazeina.

Figura 9. Elementele analizate noi

Initial, in conformitate cu specificatiile proiectului, parametrul cazeină a fost inclusa in

rindul parametrilor masurabili in analizele de tip Fizico-chimice pentru probele de Lapte. In

2016 s-au facut analize in care Cazeina a fost folosita in postura de element analizat (matrice)

determinindu-se Raportul izotopic pentru Carbon. In aceste conditii cazeina a fost introdusa si

in tabelul cu Elemente analizate.

13

3.3.2. Introducerea valorilor masurate

Efortul principal din aceasta etapa a fost canalizat spre introducerea si stocarea datelor

pentru documentele gestionate de Portal si a valorilor masurate pentru diferitii parametri ai

elementelor analizate care au constituit probele analizate in cadrul proiectului.

Figura 10. Procese verbale (PV) in Portalul TradFood-2014

Pentru usurarea procesului de introducere a valorilor masurate, mecanismul de import

in masa din foi de calcul Excel folosit in cazul valorilor masurate pentru diferitii parametri

(caracteristicilor unitatilor de productie) a fost extins si aplicat si in cazul proceselor verbale si

a buletinelor de analiza. In cazul ambelor tipuri de documente introducerea detaliilor (DPV si

DBA) a fost posibila prin proceduri asemanatoare cu cele pentru importul datelor pentru

definirea PV si BA. Mai intii au fost introduse 201 procese verbale de prelevare probe, impreuna cu

detaliile care precizeaza tipurile de analize solicitate pentru fiecare element analizat (matrice) pentru

care s-a prelevat o proba. Apoi, au fost introduse cele 330 buletine de analiza care consemneaza

rezultatele obtinute in urma analizelor efectuate pe probele prelevate, adica valorile masurate ale

parametrilor (caracteristici ale unitatilor de productie).

Figura 11. Buletine de analiza (BA) in Portalul TradFood-2014

14

In fine, din introducerea tuturor valorilor aferente acestor documente a rezultat popularea

tabelelor cu valorile masurate ale parametrilor in numar de 3181 valori masurate ale parametrilor numite

si caracteristici ale unitatilor de productie si vizualizabile in pagina ‘Caract.’.

Figura 12. Valorile masurate ale parametrilor (caracteristici ale unitatilor de productie) in Portalul

TradFood-2014

3.3.3. Modificari de functionalitate

In vederea imbunatatirii securitatii Portalului, a fost introdus mecanismul de blocare a unui

cont atunci cind se depaseste un numar de incercari de conectare esuate. Limita maxima permisa a

incercarilor nereusite a fost fixata la 5, iar depasirea ei conduce la blocarea contului.

Nota:

Deblocarea unui cont blocat de utilizator o poate face numai un utilizator in rol de ‘Admins’.

Figura 13. Verificarea elementelor de identificare pentru contul de utilizator

15

S-au introdus conditii de valabilitate, verificate, pentru validitatea adresei de e-mail (folosindu-

se in acest scop un control ASP.NET de validare RequiredFieldValidator cu o “regular expression”)

si a parolei (minimum 6 caractere) pentru contul de utilizator!!!

Nota:

Pentru parola se solicita si confirmarea acesteia prin reintroducere intr-un cimp separat.

Acest tip de validare a datelor introduse este folosit si in cazul tuturor celorlalte machete pentru

introducerea/editarea datelor. Un exemplu tipic in acest sens este verificarea formatului seriei si

numarului cartii de identitate si a codului numeric personal utilizate pentru identificarea persoanelor de

contact din unitatile de productie si a personalului implicat in procesul de prelevare a probelor.

Figura 14 a si b – Validarea datelor introduse la adaugarea unei unitati de productie

Pentru asigurarea sigurantei stergerilor inregistrarilor din baza de date a Portalului a fost

introdus un mecanism de atentionare a utilizatorului si de solicitare a unei confirmari suplimentare

inainte de declansarea operatiunii de stergere propriu-zise. Fig. 15 ilustreaza functionarea acestui

mecanism, care se declanseaza dupa ce utilizatorul a actionat, cu clic, pe butonul de legatura ‘Sterge

aceasta inregistrare’.

Figura 15. Confirmarea stergerii unei inregistari din baza de date a Portalului

16

Actionarea butonului OK are ca efect executarea stergerii inregistrarii, in timp ce actionarea

butonului Cancel duce la abandonarea tentativei de stergere.

3.3.4. Prezentarea datelor

Una dintre functionalitatile cerute pentru Portal a fost aceea de a se putea reprezenta grafic, printr-o

diagrama sau pe o harta, valorile masurate pentru parametrii alesi.

Diagrame

In cele doua figuri care urmeaza este prezentata modalitatea de reprezentare grafica a valorilor masurate

pentru parametrul NTG obtinute in urma unor analize de tip Indicatori sanitari pentru elementul analizat

Lapte vaca. Fig. 16. ilustreaza modalitatea de selectare a valorilor masurate in pagina ‘Caract.’ a

Portalului.

Figura 16. Preselectarea valorilor masurate pentru parametrul NTG

Dupa selectarea tipului de diagrama dorit – in cazul de fata 2D linie este generata si afisata diagrama

rezultanta prin actionarea butonului Afiseaza diagrama pe care o putem vedea in Fig. 17.

17

Figura 17. Afisarea valorilor masurate pentru NTG ca o diagrama de tip linie

3.1.3.5. Raportarea erorilor

In cazul in care sunt depistate erori in functionarea Portalului, detalii asupra acestora sunt

raportate fie in cadrul paginilor Portalului (Fig. 13), fie sunt inregistrate cu ajutorul mecanismului de

Jurnalizare a erorilor (oferit de sistemul de operare Windows), fie sunt utilizate ambele posibilitati de

raportare.

Figura 18. Eroare raportata la tentativa de stergere a unei inregistrari

18

In acest scop a fost folosit mecanismul de inregistrare a erorilor in jurnalele sistemului de

operare Windows (jurnalul Application). Sunt vizate mai ales erorile care apar ca urmare a operatiilor

de la interfata dintre componentele Portalului si sistemul de gestiune a bazelor de date SQL Server 2008

R2 Express, adica in componentele DAL (Data Access Layer). Verificarea prezentei unor erori

inregistrare se face incepind cu deschiderea aplicatiei Event Viewer din Windows Administrative

Tools (in Windows 10, de exemplu), apoi se extinde nodul Windows Logs si se selecteaza jurnalul

Application.

Figura 19. Jurnalul cu erori de aplicatie din Event Viewer

In cazul unei erori detectate in componentele DAL ale Portalului sunt stocate doua inregistrari,

iar continutul cimpului Source va permite identificarea originii erorii (componenta DAL care a generat

eroarea) (Fig. 20).

Figura 20. Pereche de inregisterari stocate pentru o eroare la nivelul DAL

In prima inregistrare sunt detaliate cauzele erorii (Fig. 21), iar intr-a doua este prezintata comanda SQL

Server care a provocat eroarea (Fig. 22).

19

Figura 21. Inregistrarea care descrie eroarea detectata

Figura 22. Inregistrarea care stocheaza comanda SQL executata

3.4.5. Testarea functionarii Portalului

In cadrul acestei etape s-a continuat testarea componentelor Portalului TRADFOOD-2014 in

vederea inlaturarii defectiunilor ascunse si a imbunatatirii modului de prezentare a datelor, a

performantelor si a sigurantei in functionare.

20

3.4. Ghid metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale

Ghidul metodologic de autentificare a brânzeturilor tradiţionale este un instrument util

pentru producătorii care doresc să-şi certifice produsele lactate în vederea valorificării pe piaţa

naţională sau europeană. Acesta se adresează însă, mai ales specialiştilor din cadrul

laboratoarelor acreditate privind realizarea analizelor de laborator prin care aceste produse pot

fi autentificate, respectiv certificate.

Pe baza datelor obţinute în cadrul proiectului de cercetare am concluzionat că

următoarele metode analitice pot fi utilizate cu succes pentru autentificarea brânzeturilor

tradiţionale româneşti:

- Spectrometria de masă pentru determinarea rapoartelor izotopice ale carbonului şi

oxigenului;

- Spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) pentru analiza

elementală a substanţelor minerale (macro şi microelemente);

- Focalizarea izoelectrică a proteinelor (IEF);

- Identificare a ADN-ului de specie prin tehnica PCR

Menţionăm că aceste analize au fost dezvoltate, testate şi validate în cadrul

laboratoarelor de cercetare ale partenerilor implicaţi în consorţiul proiectului TradFood 2014,

respectiv INCDTIM, USAMV Cluj-Napoca şi UMF Cluj-Napoca. Aceste metode analitice au

fost descrise în cadrul rapoartelor ştiinţifico-tehnice, aferente etapelor 2 (2015), respectiv 3

(2016).

Metodologia de autentificare a acestor produse alimentare, presupune următoarele

etape:

1. Identificarea potenţialilor producători de brânzeturi tradiţionale, care doresc să-şi

autentifice produsele;

2. Recoltarea probelor de către reprezentanţii laboratoarelor acreditate;

3. Analizarea probelor prin metodele descrise mai sus;

4. Popularea platformei Web Tradfood 2014 cu rezultatele obţinute;

5. Analiza rezultatelor obţinute şi eliberarea buletinelor de analiză.

Pe baza acestor rezultate obţinute, producătorii vor putea iniţia procedurile oficiale de atestare

a brânzeturilor obţinute ca produse tradiţionale atât pe piaţa naţională cât şi europeană.

Obiectivele prevazute pentru etapa de executie nr 4 au fost realizate in totalitate.

3.5. Diseminarea rezultatelor

Rezultatele obţinute au fost prezentate în cadrul unor simpozioane naţionale cu

participare internaţională, fiind publicate în reviste de specialitate, după cum urmează: ISI (1

articol publicat), BDI (1 articol publicat), precum şi în cadrul unor conferinţe internaţionale (4

prezentări orale şi 1 poster). Rezultatele obținute în această etapă vor constitui materialul

necesar pentru un articol care va fi trimis spre publicare la o revistă indexată ISI.

4. Concluzii

Din totalul probelor de brânzeturi de oaie analizate prin tehnica PCR, 16 au relevat prezenţa

ADN-ului de vacă, ceea ce denotă un procent ridicat al falsurilor în cazul brânzeturilor

tradiţionale din lapte de oaie (67%), atât în cazul producătorilor din zona montană A, cât şi

din zona de șes C.

21

Tehnicile PCR simplex şi multiplex se pot utiliza cu succces pentru identificarea falsurilor

din produsele lactate tradiţionale.

Identificarea originii geografice este data de coroborarea rapoartelor izotopice ale

carbonului si oxigenului cu elementele Mn si Sr;

Diferentierea dintre laptele provenit de la cele doua specii (vaca si oaie) se face cu ajutorul

combinatiei de markeri: rapoarte izotopice ale hidrogenului si concentratia de Sr;

Diferentierea probelor de branza (telemea si cas) in functie de originea geografica (zona de

proveniente, cele 3 zone) are cei mai buni markeri: Rb, K, Li, δ13C cazeina, Mg, W, Sr;

Diferentierea probelor de cas in functie de producator s-a realizat cel mai bine cu ajutorul

rapoartelor izotopice ale carbonului din cazeina din cas si continutul elemental pentru: Li,

Ti, K, Tl, Rb, Cu, B, Mg, Na, As, Er, Sm, W, Dy, Sn;

Diferentierea intre probele de telemea in functie de producator are ca cei mai buni

predictori: Be, Co, Sr, P, As, Mn, Eu, Dy, Ag, K, Tb, Te, Sm, Ca, Ru si Cd.

Prin platforma web s-a asigurat:

culegerea datelor necesare identificarii originii produselor obtinute in cele

trei zone de analiza (documente asociate prelevarii probelor din zonele de

analizat, buletine de analiza cu rezultatele masurate, matrice de parametri,

etc);

vizualizarea datelor in diferite moduri: tabelar, grafice, diagrame sau harti

cu distributia geografica a parametrilor;

posibilitatea demonstrarii trasabilitatii parcursului si a responsabilitatilor

pentru actiunile asociate cu probele prelevate, analizate si publicate.