2.8.3. Principiul reaciei PCRReacia PCR are la baz mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului i este utilizat pentru amplificarea unei secvene int de ADN ntr-un numr mare de copii (Kubista et al., 2006), fiind considerat un fotocopiator molecular (Dalgleish, 2007) sau o metodologie de xeroxare a ADN-ului (NCHGR,1992).Pentru ca amplificarea s aib loc, sunt necesare urmtoarele componente principale: doi primer i oligonucleotidici care flancheaz secvena ADN int, nucleotide libere, o polimeraz termostabil, ioni de magneziu, o soluie tampon ce are rol de mediu de reacie. Reacia se desfoar n cadrul unui ciclu repetitiv de temperaturi.In prima etap a amplificrii PCR, temperatura nalt are rolul de a separa cateneledublului helixde ADN. Temperatura este apoi cobort pentru a facilita alipirea (hibridarea molecular) primerilor oligonucleotidici la secvena int. n ultima etap, temperatura are o valoare optim pentru activitatea polimerazei care extinde primerii prin alipirea unor noi nucleotide, n prezena ionilor de Mg. n contextu l amplificrii PCR, cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCR cycle/step). Dup fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matrie n ciclul urmtor. Principalul produs al acestei reacii exponeniale este un segment dublu catenar de ADN a crui terminaii corespund capetelor 5 ale primerilor oligonucleotidici.Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dat de distana dintre cei doi primeri.Produii ciclului iniial de amplificare sunt ns reprezentai de molecule de ADN de mrimi diferite, a Fror lungimi pot depi pe cea determinat de siturile de alipire a celor doi primeri. n ciclul doi, aceste molecule (produii primului ciclu de amplificare) genereaz catene de ADN de lungime definit care se vor acumula exponenial n continuare, formnd produii de reacie dominani. Numrul final de copii (N) ale secvenei int, rezultat n urma amplificrii poate fi exprimat prin urmtoarea relaie:N =(2n - 2n)x N0(1)unde n reprezint numrul de cicluri, 2n exprim produsul obinut dup primul ciclu i produii cu lungime nedefinit obinui dup al doilea ciclu, care pot fi neglijai, iar N0 numrul iniial de copii ale secvenei int (Somma i Querci, 2004b). Teoretic, dup 20 cicluri PCR vom avea o amplificare de 220 ori a ADN int, dac eficiena de amplificare este de 100% n fiecare ciclu.n practica ns, eficiena de amplificare variaz. Astfel, cantitatea teoretic de produs obinut se poate exprima prin ecuaia:N =(1+ E)n x N0(2)unde E reprezint eficiena de amplificare (Kubista et al., 2006).n continuare sunt descrise cele trei etape ale reaciei PCR, dup Sambrook et al. (1989) citai deSomma i Querci (2004b).n prima etap, catena dubl este denaturat dnd natere ADN-ului monocatenar.Procesul trebuie s fie complet deoarece catenele separate doar parial se vor realipi odat cu scderea temperaturii, iar primerii nu vor putea aciona (Kubista et al., 2006).Separarea catenelor complementare se face odat cu creterea temperaturii, prin ruperea legturilor de hidrogen. Pragul de temperatur maxim este de 92-96 C, nivel la care se consider c reacia este complet i ntreg ADN-ul dublu-catenar s-a denaturat. Nivelul temperaturii la care jumtate din ADN-ul dublu-catenar se gsete sub form monocatenar se numete temperatur de denaturare (melting temperature/Tm) i este un parametru utilizat la designul primerilor i al protocoalelor de amplificare. Tipul de solvent, concentraia srurilor i pH-ul influeneaz procesul de denaturare. De exemplu, n mediu de reacie cu coninut redus de sruri, pH ridicat i n prezena solvenilor organici (ex. formaldehid), Tm are valoare mai redus. Proporia C/G este un alt factor important care influeneaz Tm, aceast valoare fiind mai mare n cazul structurilor de ADN cu coninut mai mare de C/G.Temperatura ridicat corespunztoare etapei de denaturare asigur de asemenea stoparea reaciilor enzimatice (ex. cele iniiate n ciclul anterior).Alipirea (hibridarea) catenelor de ADN are loc odat cu scderea treptat a nivelului de temperatur. Acest principiu st i la baza atarii primerilor la siturile complementare care flancheaz secvena int. n aceast etap, ntre primerii prezeni n mediul de reacie i ADN-ul matri monocatenar legturile se formeaz i se rup n mod constant. Cu ct aceste legturi sunt mai stabile (ex. primerii care se potrivesc perfect pe secvena matri de ADN), cu att vor rezista mai mult, permind ADN polimerazei s i desfoare mai uor activitatea. Dup ataarea ctorva nucleotide, legturile devin foarte puternice.Temperatura necesar pentru alipirea primerilor depinde n principal de caracteristicile acestora. Teoretic, aceasta este cu cteva grade mai mic dect Tm, ceea ce asigur formarea unor structuri stabile doar ntre primeri i fragmentele int ntre care exist un grad mare de omologie (complementaritate) (Kubista et al., 2006).Ultima etap presupune extinderea primerilor de-a lungul secvenei int prin adugarea unornucleotide libere de ctre ADN polimeraz (frecvent Taq AND polimeraza), n prezena Mg2+. Bazele complementare secvenei int sunt ataate n continuarea primerului, la captul 3 al acestuia (reamintim F polimeraza adaug nucleotide n direcia 5-3, citind secvena int de la 3 la 5). Temperatura optim de funcionare a Taq ADN polimerazei este de aproximativ 72 C, acest nivel fiind utilizat n majoritatea protocoalelor PCR (Kubista et al., 2006). De asemenea, pentru majoritatea experimentelor PCR, durata de30-45 secunde a acestei etape asigur extensia complet a fragmentului de interes, fiind necesar un interval de timp mai lung n cazul n care lungimea secvenei int depHte 1000 pb.2.8.4. Instrumentele i componentele necesare reaciilor PCRDou mari inovaii au permis automatizarea procesului de amplificare PCR (Somma i Querci, 2004b): introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt inactivate la temperaturi ridicate astfel, cantitatea de ADN polimeraz repartizat iniial poate aciona de-a lungul mai multor cicluri PCR; crearea unor blocuri de temperatur a cror nivel termic poate fi crescut sau cobort rapid, n mod automatizat; un astfel de instrument poart denumirea de thermal cycler sau main PCR.Parametrii ciclurilor de temperatur i reactivii utilizai sunt factori critici pentru succesul reaciei PCR, cele mai importante elemente care trebuie avute n vedere n acest context fiind secvena int de ADN, primerii, polimeraza, soluia tampon, ionii de Mg, nucleotidele libere i numrul ciclurilor de amplificare.Secvena intTeoretic, amplificarea PCR se poate desfura dac exist cel puin o copie intact a secvenei int (Kubista et al., 2006), fiind ns necesar un numr mai mare de copii pentru ca detecia produsului de amplificare s fie posibil. Mrimea acestei secvene poate fi cuprins ntre 0,1 (sau chiar mai puin n cazul amplificrilor real-time PCR) i pn la cteva kilobaze. Cantitatea total de ADN utilizat n mod obinuit pentru PCR este de 0,05-10 g. Dei o prob nu trebuie s fie nalt purificat, cum se impune n cazul altor aplicaii (ex. secveniere), eliminarea unor contaminani, ca polizaharide, polifenoli, lipide, heparin, ageni de chelatizare ai Mg2+, formalin sau detergeni, este esenial pentru buna desfurare a procesului de amplificare.PrimeriiO component foarte important a reaciei PCR este reprezentat de primeri.Secvena acestora influeneaz poziia i lungimea produsului de amplificare, temperatura de alipire i cantitatea de produs obinut (Innis i Gelfand, 1994, n Somma i Querci, 2004b). Proiectarea necorespunztoare a primerilor determin obinerea unor cantiti reduse de produs de amplificare dorit sau chiar lipsa acestuia. Elementele importante pentru construierea primerilor sunt: lungimea, temperatura de alipire, gradul de omologie cu alte secvene dect cea pe care dorim s o amplificm, gradul de complementaritate dintre secvenelor primerilor, coninutul G/C, secvenele polipirimidinice (T, C) sau polipurinice (A, G), secvena de la captul 3 (Somma i Querci, 2004b).Lungimea primerilor este cuprins de obicei ntre 16 i 30 nucleotide, iar cu ct aceasta este mai mare, cu att alipirea (hibridarea) se realizeaz mai greu (temperatura de alipire este mai ridicat), specificitatea reaciei crete (cu ct secvena este mai lung, cu att probabilitatea existenei unor secvene similare scade), iar cantitatea de produs acumulat se reduce.Temperatura de alipire O reacie PCR necesit utilizarea unor primeri cu temperaturi de alipire (hibridare) similare. Dac cele dou temperaturi sunt foarte diferite, amplificarea nu se va desfura corespunztor deoarece primerul cu temperatur de hibridare mai ridicat se poate alipi nespecific dac nivelul de temperatur este optim pentru cellalt primer, iar acesta din urm nu va rmne alipit la temperatura specific primului primer, care este prea ridicat. n practic temperatura de alipire se determin pornind de la temperatura de denaturare (Tm) menionat anterior. Aceasta se poate calcula utiliznd diferite formule, cea mai simpl fiind cea conceput de Wallace:Tm=2(A+ T)+4(G+ C)unde: A, T, G, C reprezint numarul de baze ale primerului. Aceast formul ofer o valoare aproximativ, dar destul de precis n cazul primerilor de 18-24 baze. Relaia existent ntre temperatura de alipire i cea de denaturare reprezint una dintre aanumitele black boxes ale reaciei PCR. Regula general acceptat este utilizarea unei temperaturi iniiale de alipire cu 5 C mai mic dect temperatura de denaturare. De cele mai multe ori aceast valoare nu este ns optim, fiind necesar determinarea empiric a temperaturii optime de alipire.Secvena primerilor Primerii trebuie astfel alei nct s aib o secven complementar unic,cel puin pentru taxonul analizat, ceea ce confer specificitate reaciei. Dup cum s-a menionat anterior, specificitatea primerilor este influenat i de lungime, numrul siturilor de alipire fiind mult mai mic pentru un primer de 24 baze comparativ cu unul de 15 baze.Fiecare primer trebuie astfel proiectat nct s nu conin secvee omoloage mai lungi de tre i baze, aceastea putnd cauza apariia unor structuri dublu-catenare de tip ac de - pr ce mpiedic alipirea corect. O alt eroare de proiectare este prezena regiunilor omoloage n cadrul primerilor utilizai n aceeai reacie, rezultatul fiind sporirea primer-dimerilor.Alipirea captului 3 al primerilor este esenial deoarece aceasta este partea n care polimeraza va aduga nucleotide libere pentru sinteza noii catene. Este recomandat includerea ct mai multor baze G i C n aceast regiune, prezena lor favoriznd o hibridare mai stabil.Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar regiunile poli-T sau poli- A sunt instabile din punct de vedere al legturilor complexului primer-secven int. Cu toate acestea, trebuie evitat nlQuirea mai multor baze de acelai fel.Ideal, succesiunea nucleotidelor n cadul secvenei primerilor trebuie s fie ntmpltoare, G/C s reprezinte 50%, iar totalul bazelor s fie de aproximativ 20. n aceast situaie, Tm va fi cuprins ntre 56 i 62 C.Designul primerilor se realizeaz cu software-uri speciale, ca Primer Express, distribuit de Applied Biosystems, sau Primer3 care poate fi accesat liber (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Acestea sunt astfel concepute nct s ia n considerare toate principiile amintite anterior, referitoare la caracteristicile intrinseci ale primerului.Specificitatea poate fi apoi evaluat teoretic prin determinarea omologiei secvenelor primerilor cu secvene genomice din diverse baze de date, utiliznd software-uri de tip BLAST (basic local alignment search tool) Concentraia primerilor Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei n concentraii de 1 M,suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezena unor concentraii mai mari poate cauza amplificarea unor secvene nedorite. Dac ns concentraia primerilor n mediul de reacie este redus, eficiena reaciei PCR va scdea.ADN polimerazaMetoda conceput de Mullis utiliza o ADN polimeraz termosensibil, fiind necesar adugarea enzimei n mediul de reacie naintea fiecrei etape de extensie.Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a uurat mult metodologia de lucru, adugarea enzimei dup fiecare etap de denaturare nemaifiind necesar. Prima ADN polimeraz termostabil utilizat a fost Taq ADN polimeraza, provenit de la bacteria Thermus aquaticus care triete n izvoarele termale din Yellowstone National Park, SUA, la temperaturi de aproximativ 85 C (Saiki et al., 1988, n Somma i Querci, 2004b).Datorit mediului din care provine, Taq ADN polimeraza funcioneaz optim la o temperatur de70-80 C i este, probabil, cea mai utilizat polimeraz n aplicaiile PCR.Exist i alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN polimeraza, provenit de la Pyrococcus furiosus) i de asemenea diverse companii productoare pun la dispoziie o multitudine de versiuni ale aceleiai enzime, modificate i optimizate pentru diferite aplicaii (ex. n cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNA Polymerase i HotStar Taq DNA Polymerase de la Q iagen, Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase de la Fermentas, TaqDNA Polymerase nativ i recombinant, Platinum TaqDNA Polymerase de la Invitrogen, AmpliTaq DNA Polymerase i AmpliTaq Gold DNA Polymerase de la Applied Biosystems, GoTaq Flexi DNA Polymerase de la Promega).Nucleotidele libereNucleotidele libere reprezint elementele de baz pentru sinteza ADN-ului.Concentraia acestora trebuie s fie cuprins ntre 20 i 200 M pentru fiecare din cele patru tipuri, n proporii echivalente, pentru a reduce erorile de ncorporare n moleculele nou sintetizate (Innis et al., 1988, n Somma i Querci, 2004b). Nucleotide nalt purificate sunt furnizate i utilizate ca stocuri, de obicei n amestec.Soluia tampon i ionii de MgDei nu particip direct la desfurarea reaciei de polimerizare, prezena unei soluii tampon n mediul de amplificare este indispensabil, aceasta avnd rolul de a asigura un mediu optim, din punct de vedere chimic, pentru activitatea i stabilitatea ADN polimerazei. Compoziia soluiei tampon este optimizat pentru enzima creia i este destinat, cei doi reactivi fiind comercializai sub form de pachet. Cele mai utilizate soluii tampon conin 10 mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5-2,5 mM MgCl2. Acestor componente li se mai pot aduga i alte substane, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvani ce au rolul de a mbunWi modul n care decurge amplificarea.Prezena cationilor divaleni de Mg este de asemenea esenial pentru desfuarea amplificrii,concentraia optim determinndu-se empiric pentru fiecare protocol n parte. Acetia se regsesc sub form de sruri (de obicei MgCl2) concentraia final fiind cuprins, n general, ntre 0,5 i 5,0 mM. Ionii de Mg ndeplinesc urmtoarele roluri: formeaz un complex solubil cu nucleotidele, esenial pentru ncorporarea acestora n catena de ADN; stimuleaz activitatea polimerazei; ridic temperatura de denaturare a complexului primer-secven int, conferindu-i stabilitate.n general, o concentraie redus de Mg2+ are ca rezultat acumularea n cantiti reduse a produsului de reacie, n timp ce concentraia ridicat de Mg2+ favorizeaz acumularea produilor nespecifici. Pentru ca ionii de Mg s fie activi n timpul reaciei, trebuie evitat prezena n soluia ADN a unor cantiti ridicate de ageni de chelatizare (ex. EDTA) sau gupri ionice ncrcate negativ (ex. fosfai).Numrul ciclurilor de amplificareNumrul ciclurilor necesare pentru producerea unei cantiti detectabile de amplicon depinde n principal de concentraia iniial a secvenei de ADN int. Pentru amplificarea a 50 copii, Innis i Gelfand (1990) recomand 40-45 cicluri PCR, n timp ce doar 25-30 cicluri sunt suficiente pentru amplificarea a 3x105 molecule (Somma i Querci, 2004b). Aceast disproporionalitate se datoreaz efectului de plafonare (platou), care implic modificarea ratei de acumulare a produsului PCR n ultimele cicluri ale amplificrii. Plafonarea este cauzat de degradarea reactivilor (ex. enzime sau nucleotide), consumarea acestora (ex. primeri n cazul produilor scuri sau nucleotide n cazul produilor lungi) sau de concurena produilor nespecifici pentru reactivi. Datorit acestui fenomen, mrirea numrului de cicluri peste anumie valori nu reprezint o soluie.De aceea, n cazul n care produsul de interes nu este obinut dup 30-40 cicluri PCR se recomand efectuarea unei reamplificri, utiliznd o parte (i.e. aproximativ 1 l) din produsul de amplificare i un nou amestec de reacie.

2.8.5. Reacii PCR specializatePe lng reacia PCR tipic, descris anterior, au fost create variante destinate unor aplicaii specifice: nested PCR, touch-down PCR, real-time PCR (rt-PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), consensus PCR, PCR multiplex, colony PCR, hot-start PCR, inverse PCR, PCR RAPD, PCR AFLP etc.Unele metodologii de testare OMG calitativ sunt bazate pe protocoale nested PCR, n timp ce real-time PCR este tehnica cea mai utilizat pentru cuantificarea acizilor nucleici. Reaciile multiplex pot fi utilizate att n etapa de analiz calitativ, ct i n cea de cuantificare.n continuare sunt descrise principiile metodei nested PCR i a reaciilor multiplex.Nested PCRUn experiment de tip nested PCR presupune utilizarea unui set de primeri localizat ntre ali doi primeri pereche, de-a lungul aceluiai fragment de ADN. ntr-o prim reacie se realizeaz amplificarea cu primerii externi, urmat de amplificarea cu ceilali doi primeri (Somma i Querci, 2004b). Deoarece fragmentul mai lung, amplificat n prima etap, este utilizat ca matri n cadrul celei de-a doua reacii, metoda se caracterizeaz printr-o mare sensibilitate i specificitate (Zimmermann et al., 1998, n Angonesi Brod et al., 2007; Somma i Querci, 2004b). Sensibilitatea crete datorit reamplificrii regiunii de interes, iar sporirea specificitii se bazeaz pe probabilitatea extrem de redus ca eventualele fragmente amplificate nespecific n prima etap s fie amplificate nespecific i n cea de-a doua reacie. A doua reacie poate fi considerat o strategie de confirmare a identitii produsului PCR. Sensibilitatea Prit a acestei tehnici este ns susceptibil potenialelor contaminri care pot apare n timpul executrii protoculului. Trebuie deci acordat o atenie deosebit acestui aspect, mai ales n cazul laboratoarelor de testare.Aceast tehnic a fost foarte apreciat pentru avantajele pe care le prezint, majoritatea primerilor concepui la sfritul anilor 1990 pentru detecia OMG-urilor fiind inclui n astfel de protocoale. O mare parte dintre acetia sunt utilizai i astzi n practica testrii OMG. Singurul neajuns al acestei abordr i este reprezentat de necesitatea executrii a dou reacii de amplificare, ceea ce nseamn un consum suplimentar de timp i materiale.PCR multiplexPCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri n cadrul unei reacii, avnd ca rezultat obinerea unui singur amplicon specific. n cadrul unei reacii PCR multiplex sunt utilizate mai multe perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai multe secvee int. Acest tip de aplicaie s-a dezvoltat n ultimii ani, mai ales dup introducerea unor noi tipuri de polimeraze (Germini et al., 2004). Prezena mai multor perechi de primeri n acelai mediu de reacie determin sporirea probabilitii de apariie a hibridrilor nespecifice i a construciilor primer-dimer, amplificarea preferenial a fragmentelor de ADN mai scurte (Atlas i Bey, 1994, n Somma i Querci, 2004b), precum i reducerea limitelor de detecie (Germini et al., 2004), fcnd destul de dificil optimizarea protocoalelor de acest tip. Cu toate aceastea, metoda genereaz mult mai mult informaie, ntr-un timp mai scurt i cu costur i mai reduse dect amplificrile PCR clasice (singleplex) (Germini et al., 2004).Perechile de primeri trebuie s aib temperaturi de alipire ct mai apropiate. Este de asemenea necesar ca lungimea fragmentelor amplificate s fie similar, cele mai scurte fiind amplificate preferenial. n ceea ce privete validarea teoretic a secvenelor primerilor, aceast poate fi fcut cu ajutorul unor software-uri ca Oligos , iar efectele eficienelor diferite de amplificare pot fi compensate prin ajustarea empiric a concentraiilor primerilor. Utilizarea soluiilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele generate de prezena unui numr mai mare de primeri.2.8.6. Identificarea contaminrii, validarea i interpretarea rezultatelorReacia PCR are o larg aplicabilitate n practica tiinific, fiind utilizat ca tehnic analitic sau pregtitoare. Datorit sensibilitii metodei, contaminarea cu ADN, chiar i n cantiti foarte reduse, poate duce la obinerea unor rezultate incorecte. Acest aspect trebuie s constituie ngrijorarea principal n cadrul laboratoarelor de testare (Querci et al., 2005). Este de aceea necesar ca setarea reaciei s se desfoare ntr-un mediu lipsit de ampliconi provenii din alte reacii PCR, ADN rezultat din pregtirea probelor anterioare sau substane rezultate n urma proceselor de decontaminare . Primele dou tipuri de ageni produc contaminare de tip carry-over, determinnd apariia rezultatelor fals pozitive, iar a treia categorie constituie substane inhibitoare ce favorizeaz obinerea rezultatelor fals negative. Un alt tip de erori care trebuie evitat este contaminarea ntre probe analizate n paralel (contaminare ncruciat/cross-over contamination), care determin de asemenea apariia unor rezultate fals pozitive.Existena spaiilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat, reduce riscu l contaminrii, iar respectarea strict a normelor de decontaminare este o condiie esenial pentru reducerea ratei de apariie a rezultatelor fals pozitive. Roth et al. (1997), citai de Somma i Querci (2004b), recomand de asemenea ndeplinirea anumitor cerine de rutin referitoare la organizarea i desfurarea activitilor, menite s asigure meninerea unui mediu adecvat de lucru pentru orice sistem de analiz care are la baz reacia PCR, indiferent de numrul probelor procesate.Sursele poteniale de contaminare pot fi uor ntlnite n laborator (ex. probele analizate,personalul, instalaia de aer condiionat, echipamentele sau reactivii), motiv pentru care este necesar utilizarea probelor de control, pozitive i negative. Acestea sunt necesare pentru a evidenia prezena contaminanilor, dac acetia exist i pentru a evalua (valida) corectitudinea rezultatelor obinute. Probele de control pentru analize OMG, specifice nc din etapa de pregtirea a probelor i pn la cea de cuantificare, sunt prezentate n continuare conform SR EN ISO 24276:2006: prob de control pentru mediul de lucru (environmental control/E); utilizarea acestui tip de control este recomandat ncepnd cu etapa de pregtire (omogenizare) a probei i are rolul de a identifica prezena contaminanilor n mediul de lucru (ex. aerul din labortor); proba const dintr-un tub coninnd ap liber de acizi nucleici, care este lsat deschis n mediul de lucru pe tot parcusul procesului de analiz;prob neutr de control a extraciei (extraction blank/B); controlul are caracter obligatoriu, ncepnd cu etapa de extracie a ADN-ului; n acest tip de prob, materialul biologic este nlocuit cu ap liber de acizi nucleici, urmrindu-se evaluarea prezenei/absenei contaminrii ncruciate n timpul etapei de extracie; n fiecare serie de extracii trebuie inclus cel puin o astfel de prob de control; prob pozitiv de control a extraciei (positive extraction control/P) este de asemenea obligatorie ncepnd cu etapa de extracie; indic dac reactivii utilizai pentru extracie funcioneaz corespunztor i dac extracia a fost executat n mod corect; n acest scop se utilizeaz o prob care conine n mod sigur fragmentul de interes; aceast prob trebuie utilizat periodic, precum i la schimbarea stocului de soluii de lucru; prob pozitiv de control pentru ADN-ul int (positive DNA target control/C+); controlul este obligatoriu, ncepnd cu etapa PCR, pentru a verifica eficiena procedurii de amplificare a secvenei int; proba de control este constituit din ADN extras dintr-un MRC pentru secvena de interes sau dintr-o prob cunoscut pozitiv; acest tip de prob poate fi nlocuit sau poate nlocui proba pozitiv de contro l a extraciei (P); prob negativ de control pentru ADN-ul int (negative DNA target control/C-); acest tip de control are caracter obligatoriu ncepnd cu etapa de amplificare a ADN-ului; demonstreaz capacitatea procedurii de a nu produce rezultate fals pozitive n lipsa secvenei int, utilizarea fiind ns justificat doar n etapa de validare a metodei; proba se obine dintr-un MRC care nu conine secvena de interes sau dintr-o prob cunoscut negativ;prob de control a reactivilor (amplification reagent control/NTC); utilizarea acestei probe de control este necesar din etapa PCR; are rolul de a verifica contaminarea cu acizi nucleici a reactivilor utilizai pentru PCR; poate fi nlocuit de proba neutr de control a extraciei; proba de control include toi reactivii necesari, mai puin extractul de ADN care este nlocuit de un volum corespunztor de ap liber de acizi nucleici; prob de control a inhibiiei reaciei PCR (PCR inhibition control/I); se utilizeaz ncepnd cu etapa de amplificare, avnd rolul de a confirma absena/prezena inhibitorilor ce pot afecta eficiena amplificrii; controlul inhibiiei poate fi fcut prin analiza real-time PCR a unei diluii seriale a extractului; o alt strategie o reprezint utilizarea unui control extern, ntnlnit n literatura de specialitate sub denumireaspike; n aceast situaie, extractul analizat este amestecat cu o soluie pozitiv pentru secvena de interes, care reprezint practic controlul pozitiv extern; uneori, controlul pozitiv extern poate fi adugat naninte de extracie, caz n care este reprezentat de o matrice (ex. fin).Interpretarea rezultatelor testrii OMG calitative se face pe baza profilului obinut prin separarea electroforetic a produilor PCR. Mrimea ampliconilor separai este estimat cu ajutorul unei soluii de ADN standard (DNA marker, DNA ladder) care conine fragmente de mrimi cunoscute. n cazul n care profilul electroforetic al probei prezint o band a crei mrime este aproximativ cea ateptat, se poate concluziona c banda este cea cutat, iar proba este pozitiv. Validarea rezultatelor presupune ndeplinirea urmtoarelor condiii: proba de control pentru mediul de lucru (E), proba neutr de control a extraciei (B), proba negativ de control pentru ADN-ul int (C-) i proba de control a reactivilor (NTC) nu trebuie s prezinte banda specific corespunztoare ampliconului pe care dorim s-l detectm; pot fi prezente benzi scurte corespunztoare structurilor primeri-dimer; proba pozitiv de control a extraciei (P), proba pozitiv de control pentru ADN-ul int (C+) i proba de control a inhibiiei reaciei PCR (I) trebuie s prezinte banda corespunztoare secvenei int pe care dorim s o detectm; repetiiile corespunztoare aceleiai probe trebuie s prezinte rezultate identice.n cazul n care exist neconcordane ntre probele de control, analiza trebuie considerat neconcludent (SR EN ISO 24276:2006).Un aspect important, care reiese i din cele prezentate anterior, este faptul c o parte din probele de control, n special cele pozitive, pot fi reprezentate de materiale de referin (certificate). Utilizarea materialelor de referin constituie o parte esenial a procedurilor de control al calitii. Trebuie reinut c n scopul validrii rezultatelor nregistrate, utilizarea probelor de control i a materialelor de referin este indispensabil (el et al., 2006; Querci et al., 2005).n cazul n care specificul experimentelor impune o confirmare foarte precis a rezultatelor obinute prin electroforez, se pot aplica diferite metode, ca: analiza de restricie a produilor PCR, Southern blotting-ul, secvenierea produilor PCR cea mai sigur cale de confirmare a autenticitii acestora.