Screening-ul pentru detecția Neisseria gonorrhoeae prin

Real Time PCR, la paciente cu

sindrom inflamator pelvin

Drd. Silvia Filipiuc

Conducător științific: Prof. Univ. Dr.

Luminița Smaranda Iancu

Lotul de studiu

• În perioada februarie – martie 2011 au fost

testate 100 de paciente cu sindrom inflamator

pelvin

• Repartiția pacientelor pe grupe de vârstă:

Grupa de vârstă Număr paciente

20 – 30 37

30 – 40 29

40 – 50 19

> 50 15

Cuantificarea absolută utilizând

tehnica Real Time PCR

Diluții seriate din controlul pozitivCuantificarea absolută realizată pe baza

curbei standard

Principiul cuantificării în RT PCR

Principiul TaqMan Termocyclerul Stratagene Mx3005p

Etapele detecției N. gonorrhoeae

prin Real Time PCR

• recoltarea și transportul probelor;

• purificarea ADN / N. gonorrhoeae;

• cuantificarea absolută utilizând tehnica Real

Time PCR.

Recoltarea și transportul probelor

• Probele au fost recolatate de la nivelul endocolului cu ajutorul tampoanelor E - Swab / Copan Innovation;

• Cele 100 de probe au fost testate în 5 sesiuni diferite de lucru:– I. probele 1 – 10;

– II. probele 11 – 40;

– III. probele 41 – 50;

– IV. probele 51 – 70;

– V. probele 71 – 100.

Purificarea ADN / N. gonorrhoeae

Kitul PrimerDesign PrecisionTM Gram Negative Bacterial DNA extraction

Cuantificarea absolută utilizând

tehnica Real Time PCR

• ETAPE:

– Setarea plăcuțelor;

– Setarea profilului termic;

– Pipetarea mixurilor de reacție RT PCR;

– “Run”;

– Validarea experimentelor;

– Analiza rezultatelor obținute.

Setarea plăcuțelor RT PCR

Sesiunea V

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Setarea profilului termic

Profilul termic prezintă 1 segment cu 1 ciclu de amplificare

și un al doilea segment cu 50 de cicluri.

Curbele de amplificare obținute în

cele 5 sesiuni de lucru

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea IIISesiunea IV

Sesiunea V

Validarea experimentelor: verificarea

parametrilor curbelor standard

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea I

Sesiunea IV

Sesiunea V

Analiza rezultatelor obținute: numărul

de cópii ADN / gonococ detectate

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Sesiunea V

Numărul probelor pozitive pentru

N. gonorrhoeae:

Sesiune de

lucru

Număr probe

cu Ct ≤ 40

I 0

II 9

III 0

IV 0

V 2

TOTAL 11/ 100 probe

pozitive

Discuții

Nr.

crt

Prevalenta gonococ An publicare Tara Autor Sistemul RT PCR

utilizat

1 0,006 2011 Elvetia Sakem B Abbott Diagnostics

2 0,2 2011 Spania Corbeto EL in house

3 16,7 2010 USA Gaydos CA Abbott RealTime

CT/NG

4 1.7 2010 Anglia Hopkins MJ Roche COBAS

Taqman CT

5 17, 2008 Norvegia Hjelmevoll SO in house

6 0,84 2008 Austria Schabereiter-

Gurtner C

COBAS

AMPLICOR

7 38 2007 USA Mangold KA COBAS Amplicor

8 16 2007 Rusia Shipitsyna E Real-time nucleic

+ (NASBA)

9 30 2005 Olanda Geraats-Peters CW COBAS

AMPLICOR

10 3 2004 Australia Whiley DM TaqMan-ABI7500

11 19 2004 Australia Whiley DM in house

Concluzii

• studiul nostru utilizează pentru prima dată în ţară o metodă RT-PCR pentru detectarea infecţiilor asimptomatice de N. gonorhoeae;

• prevalenţa infecţiilor asimptomatice, diagnosticate printr-o metodă înalt sensibilă şi specifică este de 11%;

• prevalenţa de 11% se încadrează în datele din literatură, care semnlează valori cuprinse între 0.006% şi 19 %;

• detectarea infecţiilor asimptomatice prin tehnici de biologie moleculară, deşi mai scumpă, comparativ cu metodele clasice de izolare şi identificare, are o eficienţă superioară, ceea ce justifică utilizarea ei pentru femeile cu infecţie pelvină cronică, în vederea instituirii unei terapii specifice, cunoscând profilul de rezistenţă la antibiotice în zona studiată, determinată prin metode fenotipice sau/şi genotipice.

Vă mulțumesc!