variabilitatea serologicĂ Şi molecularĂ a unor … · 5.2. rezultate privind caracterizarea...

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ, CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

Ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN

VARIABILITATEA SEROLOGICĂ ŞI

MOLECULARĂ A UNOR IZOLATE ALE

VIRUSULUI PLUM POX DIN BAZINUL CENTRAL

POMICOL AL TRANSILVANIEI (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conducător ştiinţific: Prof. univ.dr. Doru Pamfil

CLUJ-NAPOCA 2010

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat teză de doctorat

CUPRINS

INTRODUCERE.............................................................................................................................6 CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7 DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN ................................................ 7

1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni .......................................................................... 7 1.2 Pătarea inelară la prun .......................................................................................................... 8 1.3 Mozaicul în benzi al prunilor (marmor lineopticum, prunus virus 9 christ) ......................... 8 1.4 Crăparea scoarţei prunului .................................................................................................... 9 1.5 Mozaicul linear (plum pseudo pox) ...................................................................................... 9

CAPITOLUL II……………………………………………………………………………………9 ORIGINEA ŞI RĂSPÂNDIREA VIRUSULUI..............................................................................9 CAPITOLUL III ............................................................................................................................ 11 PRINCIPALELE TRĂSĂTURI ALE PLUM POX-ULUI ........................................................... 11

3.1 Gazde naturale ale virusului ................................................................................................ 11 3.2 Patologia virusului Plum pox .............................................................................................. 12 3.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox ....................................................................... 12

CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 13 SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA ............................. 13

4.1 Scopul cercetării .................................................................................................................. 13 4.2 Obiectivele urmărite în cercetările aferente tezei de doctorat ............................................. 13 4.3 Materialul biologic .............................................................................................................. 14 4.4 Tehnici şi metode de cercetare ............................................................................................ 14

4.4.1 Extracţia ARN-ului total .............................................................................................. 14 4.4.2 Reacţia de revers transcriere şi amplificare .................................................................. 14 4.4.3 Protocolul de amplificare ............................................................................................. 15 4.4.4 Migrarea electroforetică a produşilor de amplificare în gel de agaroză ...................... 16

4.4.4.1 Prepararea gelului de agaroză ............................................................................... 16 4.4.4.2 Pregătirea produşilor de amplificare în vederea migrării în gel de agaroză .......... 16 4.4.4.3 Colorarea gelurilor de agaroză şi preluarea imaginilor ......................................... 16

4.4.5 Diferenţierea tulpinilor virale pe baza profilului PCR-RFLP ...................................... 17 4.4.5.1 Prepararea amestecului de reacţie pentru digestia enzimatică .............................. 17 4.4.5.2 Pregătirea gelului de poliacrilamidă şi separarea fragmentelor de digestie .......... 17 4.4.5.3 Colorarea gelurilor de poliacrilamidă ................................................................... 18

4.4.6 Principiul tehnicii DASI-ELISA pentru detectarea prezenţei virusului în probe, cât şi pentru diferenţierea tulpinilor virale ..................................................................................... 18

CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 19 REZULTATE ŞI DISCUŢII ......................................................................................................... 19

5.1 Rezultate privind caracterizarea moleculară prin RT-PCR a izolatelor recoltate de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa ......................................................... 19

5.1.1 Diagnosticarea moleculară ........................................................................................... 19 5.1.2 Diferenţierea moleculară a tulpinilor PPV-D şi PPV-M cu primeri specifici .............. 20 5.1.3 Detecţia tulpinii recombinate PPV-Rec ................................................................... 21 5.1.4 Analizarea regiunii genomice CI .................................................................................. 22

5.2. Rezultate privind caracterizarea moleculară prin PCR-RFLP a izolatelor recoltate de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa .............................................. 23

5.2.1. Diferenţierea moleculară a tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M prin digestia enzimatică cu enzima Rsa I ................................................................................................... 23 5.2.2. Identificarea eventualelor mutaţii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de restricţie al regiunii genei care codifică proteina capsidală .................................................. 24

I


II

5.3 Rezultate privind diagnosticarea şi diferenţierea serologică a izolatelor cu provenienţa de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa .......................................... 24

CAPITOLUL VI ........................................................................................................................... 28 CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI .............................................................................................. 28 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ .................................................................................................... 29 SUMMARY……………………………………………………………………………………...32


TABLE OF CONTENTS INTRODUCTION……………………………………………………………………………….6 CHAPTER I……………………………………………………………………………………..7 DESCRIPTION OF MAJOR VIROTIC DISEASES IN PLUM TREE……………………7

1.1 The prune dwarf virus……………………………………………………………………...7 1.2 Plum ring spot……………………………………………………………………………..8 1.3 Plums mosaic in bands……………………………………………………………………..8 1.4 Plum bark split……………………………………………………………………………...9 1.5 Linear mosaic (plum pseudo pox)………………………………………………………….9

CHAPTER II…………………………………………………………………………………….9 THE ORIGIN AND SPREAD OF THE VIRUS……………………………………………..9 CHAPTER III…………………………………………………………………………………..11 THE MAIN FEATURES OF PLUM POX…………………………………………………..11

3.1 Natural hosts of the virus………………………………………………………………....11 3.2 The pathology of Plum pox………………………………………………………………12 3.3 Symptoms caused by Plum pox virus……………………………………………………..12

CHAPTER IV…………………………………………………………………………………..13 RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD………….13

4.1 Research purpose………………………………………………………………………….13 4.2 Objectives pursued in the PhD Thesis research work…………………………………….13 4.3 Biological material………………………………………………………………………..14 4.4 Research techniques and methods………………………………………………………...14

4.4.1 Extraction of total RNA………………………………………………………………14 4.4.2 Revers-transcription and amplification reaction……………………………………...14 4.4.3 Amplification protocol………………………………………………………………..15 4.4.4 Agarose gel electrophoretic migration of amplification products……………………16

4.4.4.1 Preparation of agarose gel………………………………………………………..16 4.4.4.2 Preparation of PCR amplification products for agarose gel migration…………..16 4.4.4.3 Agarose gel staining and image acquisition…………………………………….16

4.4.5 Differentiation of virus strains based on PCR-RFLP profile…………………………17 4.4.5.1 Mixture preparation for enzymatic digestion…………………………………….17 4.4.5.2 Polyacrylamide gel preparation and the separation of digestion fragments……..17 4.4.5.3 Polyacrylamide gel staining……………………………………………………...18

4.4.6 Dasi-ELISA technique for the virus detection in samples and for viral strain differentiation………………………………………………………………………………18

CHAPTER V…………………………………………………………………………………...19 RESULTS AND DISCUSSION………………………………………………………………19

5.1 Results regarding the molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj, Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistriţa by using RT-PCR………………………….19

5.1.1 Molecular diagnostics………………………………………………………………...19 5.1.2 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M strains using specific primers……20 5.1.3 Detection of PPV-Rec recombinant strain………………………………………...21 5.1.4 Analysis of CI genomic region……………………………………………………….22

5.2 Results regarding molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj, Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistriţa by PCR-RFLP……………………………..23

5.2.1 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M viral strains by enzymatic digestion using Rsa I enzyme…………………………………………………………………………23

III


IV

5.2.2 The identification of viral strains possible mutations located at the restriction-site level of the capsid protein encoding gene………………………………………………….24

5.3 Results regarding the serological differentation and diagnostics of isolates provided by SCDP Cluj, Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistriţa………………………………...24

CHAPTER VI…………………………………………………………………………………..28 CONCLUSIONS AND RECCOMANDATIONS…………………………………………..28 SELECTIVE BIBLIOGRAPHY……………………………………………………………...29 THESIS RESUME………………………………………………………………………………32


INTRODUCERE

Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole sâmburoase. Acest fapt se datorează scăderii calităţii fructelor şi pierderilor cauzate de căderile premature ale acestora (Nemeth, 1994).

În România, acest virus este răspândit în toate arealele de cultură ale prunului şi provoacă pierderi masive de producţie (Minoiu, 1997, Zagrai şi colab., 2006).

Motivaţia alegerii acestei teme s-a datorat faptului că în ţara noastră la momentul începerii cerecetărilor nu era cunoscută distribuţia tulpinilor virusului Plum pox în România, ţara noastră fiind printre puţinele ţări europene care nu avea o strategie de eradicare sau limitare a impactului acestui virus. O astfel de strategie nu poate fi realizată fără a cunoaşte gradul de răspândire a PPV-ului şi distribuţia tulpinilor acestuia.

Teza de doctorat are ca obiectiv principal studierea variabilităţii serologice şi moleculare a unor izolate ale virusului Plum pox din trei regiuni pomicole situate în Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei: Cluj, Mureş şi Bistriţa.

Primele cercetări din România privind identificarea şi diferenţierea tulpinilor virusului Plum pox, prin tehnici moleculare şi serologice au fost realizate la Staţiunea de Cercetare-Dezvoltare Pomicolă Bistriţa (SCDP Bistriţa) (Zagrai şi colab., 2005a).

În perioada 2006-2008 SCDP Bistriţa în colaborare cu SCDP Vâlcea şi departamentele de biologie moleculară din cadrul Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară (USAMV) şi Universităţii Babeş-Bolyai din Cluj Napoca, au iniţiat un proiect ce a avut ca şi obiective: dezvoltarea virusologiei pomicole din ţara noastră, aplicarea de tehnici moleculare şi serologice pentru diferenţierea tulpinilor virale ale virusului Plum pox şi realizarea unei hărţi cu distribuţia pe regiuni ale acestor tulpini. Rezultatele au arătat o situaţie dramatică şi necontrolabilă în ceea ce priveşte infecţiile masive cu Plum pox din ţara noastră (http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm).

Caracterizările serologice şi moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de către cercetătorii din Europa Occidentală au permis stabilirea apartenenţei acestora la diferite tulpini virale dar şi la identificatea unor forme recombinate.

Până în prezent au fost identificate şi caracterizate serologic şi molecular şapte tulpini de PPV: Suşa D (dideron) izolată pentru prima dată la cais în sud-estul Franţei; Suşa M (marcus) identificată la piersic în nordul Greciei (Kerlan şi Dunez, 1979; Myrta şi colab., 1998); Suşa Ea (el amar) descrisă în Egipt la cais (Wetzel şi colab., 1991a); Suşa SoC (sour cherry) detectată în Republica Moldova (Kalashyan şi colab., 1993); Suşa SwC (sweet cherry) identificată în Italia (Crescenzi şi colab., 1996); Suşa PPV-Rec rezultată din recombinarea celor două tulpini majore (M şi D), fiind descoperită în Albania, Bulgaria, Cehia, Germania şi Slovacia (Glasa şi colab., 2004).Suşa PPV-W(Winona) a fost identificată în Canada (James şi Varga, 2004a). Recombinarea joacă un rol important în evoluţia ribovirusurilor, determinând apariţia unor suşe noi cu efecte nepredictibile asupra patogenităţii (Worobey şi Holmes,1999). Recombinarea naturală dintre tulpinile PPV-D şi PPV-M a constituit apariţia unei noi tulpini virale, numită PPV-Rec, ce a fost raportată prima dată de Glasa şi colab. (2002 ).

Recentele studii din Turcia efectuate pe 16 izolate au condus la identificarea unei noi tulpini virale. Secvenţierea acestora a condus la observarea unui punct de recombinare în regiunea virală HC-Pro, la poziţia 1566 din genomul viral. Astfel că cercetătorii turci propun ca această nouă tulpină recombinată să se numească PPV-T (Turcia). Urmând ca studiile ulterioare să stabilească distribuţia geografică în Turcia şi posibil în alte ţări (Serce şi colab., 2009).

Primul raport privind infecţia naturală a prunilor cu tulpina recombinată PPV-Rec în România a fost făcut în anul 2006. Toate izolatele identificate iniţial ca fiind tulpina PPV-M s-au dovedit aparţinând suşei PPV-Rec, în urma analizelor moleculare. În urma secvenţierii

6


produşilor PCR (Polymerase Chain Reaction) corespunzători regiunilor (Cter)CP şi (Cter) Nib – (Nter) CP s-a dovedit faptul că aliniamentele nucleotidice corespund cu cele din Gene Bank, raportate de Glasa et al., în 2002 şi 2004 (Zagrai şi colab., 2006). Similaritatea genetică cu alte tulpini PPV-Rec sugerează o origine evoluţionară comună. (Zagrai şi colab., 2006, 2008a).

Cercetările din cadrul tezei de doctorat au presupus utilizarea de tehnici moleculare şi serologice, fără de care nu se puteau identifica şi diferenţia tulpinile virale ale virusului Plum pox. Analizele izolatelor PPV luate în studiu s-au realizat cu ajutorul tehnicilor Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), Restriction Endonuclease Length Polymorfism (RFLP) şi DASI-ELISA (Double antibody sandwich Indirect- Enzyme- linked immunosorbent assay).

CAPITOLUL I DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN

1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni

Pomii atacaţi de acest virus au habitusul redus, înregistrează pierderi de 50-82%, iar la

soiurile sensibile se constată sterilitatea florilor. Simptome. Virusul afectează frunzele, lăstarii şi florile. Frunzele infectate se alungesc, se îngustează

şi prezintă un luciu sticlos. Lăstarii se dezvoltă în rozete şi prezintă internodii scurte. Florile atacate avortează , iar pomul rămâne cu fructe puţine.

Virusul afectează următoarele specii de Prunus: P.davidiana, P.fructicosa, P. tomentosa, P. virginiana, P. tenella, P. triloba, P. spinosa, P. spinosa.

Cele mai sensibile soiuri de prun sunt: Vânăt de Italia, Renclod Althan, Lombard, Standard, Emilia, Tragedy, President. Tolerante sunt următoarele soiuri: Victoria, Renclod Doree, Stanley, Vânăt romanesc.

Transmiterea la prun se face prin altoire, seminţe de mirobolan, portaltoi vegetativi infectaţi. Pentru testare biologică se folosesc ca şi plante indicator soiurile Vânăt de Italia, Krikon, puieţii de piersic GF 305.

Combatere Selecţia materialului de înmulţire liber de piticirea prunului se face cu ajutorul plantelor

test ierboase şi a indicatorilor lemnoşi. La plantele de castraveţi infectate cotiledoanele manifestă leziuni locale şi mozaic pe frunze.

La indicatorii lemnoşi virusul se transmite prin grefare de muguri sau scoarţă de la pomul de testat. Virusul prune dwarf produce necroze în scoarţă şi în lemn la P. effusa, soiul Krassa severă şi Malus halliana.

Metode de combatere utilizate: -înfiinţarea de plantaţii mamă producătoare de ramuri altoi, butaşi, marcote şi seminţe libere de prune dwarf -aplicarea de tratamente de fitoprotecţie la acoperire pe toată perioada de vegetaţie în pepinieră şi plantaţii mamă -defrişarea pomilor infectaţi în cazul în care aceştia sunt infectaţi -cultivarea de soiuri tolerante la virusul prune dwarf

7


1.2 Pătarea inelară la prun

Boala este produsă de virusul PNRSV, ce reprezintă virusul cel mai păgubitor după virusul PPV şi este prezent aproape peste tot unde sunt cultivate sâmburoasele. Prima dată a fost descris, izolat şi caracterizat de pe pomii de prun şi piersic iar ulterior la cireş şi vişin.

Boala este răspândită în întrega lume, fiind produsă de virusuri izometrice labile ILAR (izometric labil ring spot).Virusul este reprezentat de numeroase tulpini, dar cele mai frecvente produc pătarea inelară (Plum ring spot) şi declinul (Plum decline). Produce pagube importante atât în pepinierele pomicole cât şi în plantaţiile comerciale.

Simptome La prun simptomele se manifestă pe frunze sub forma unor pete rotunde, gălbui-clorotice

şi sub formă de inele cu centrul clorotic. Deoarece ţesuturile necrozate cad, frunzele rămân ciuruite. Simptome evidente apar în anul următor infectării, apoi infecţia rămâne în stare latentă. Simptome de ciuruire virotică pe frunze prezintă următoarele soiuri: Tuleu gras, Vânat românesc, Florentina, Santa Rosa, Renclod Oullins, Cambridge Cage.

Combatere

-testarea materialului destinat înmulţirii se efectuează cu ajutorul testului serologic ELISA -ca plante indicator sunt folosiţi puieţii de piersic GF 305, puieţi de cireş franc, Prunus serrulata var. Shirofugen -plantaţiile tinere de pomi fructiferi vor fi tratate la avertizare pentru a preveni infecţiile spontane, prin vectori -înainte de înfiinţarea unor plantaţii mamă de ramuri altoi, butaşi, marcote şi seminţe, terenurile se vor dezinfecta cu nematocide, iar tratamentele împotriva vectorilor se vor face cu insecticide sistemice la acoperire

1.3 Mozaicul în benzi al prunilor (marmor lineopticum, prunus virus 9 christ)

Soiurile infectate prezintă o reducere a producţiei de până la 40%, în funcţie de

sensibilitatea soiurilor. Virusul se transmite prin înmulţire vegetativă: altoire, marcote, butaşi şi mai puţin prin sămânţă şi polen. Mozaicul în benzi este întâlnit la prun, piersic, migdal, microbolan, cais, cireş. Producţia de fructe la pomii infectaţi este mai redusă, până la 40%, în funcţie de sensibilitatea soiurilor.

Simptome La prun simptomele apar pe frunze şi se manifestă prin desene sub forma frunzei de

stejar, inele şi îngălbeniri pe frunze. Simptomele sunt evidente primăvara, iar vara adeseori lipsesc. Soiurile ce prezintă astfel de simptome sunt: Victoria, Ontario, Cambridge Gage, Emma Leppermann, Vânăt de Italia, Renclod, Lombard.

Combatere

-testarea plantaţiilor mamă cu indicatori lemnoşi: Tuleu dulce, Emma Leppemann, puieţi de piersic şi cireş F 12/1; plante test ierboase, precum sunt: Nicotiana Megalosiphon, Vigna cylindrica, Physalis floridana

-producerea materialului săditor pomicol liber de viroze în unităţi specializate

8


1.4 Crăparea scoarţei prunului

Virusul se transmite prin înmulţire vegetativă a pomilor infectaţi: altoire, marcote şi butaşi. Producţia de fructe la soiurile sensibile este mai redusă cu până la 40-60%.

Simptome În pepinieră pomii prezintă la nivelul scoarţei crăpături superficiale, ce apoi se adâncesc,

necroza putând ajunge până la cambiu. La soiurile sensibile din plantaţiile de prun se constată crăpături adânci pe tulpină şi ramuri, ajungându-se la intrarea timpurie în declin.Soiurile ce prezintă sensibilitate sunt: Tuleu dulce, Renclod d’Althan, Stanley, Cambridge Gage, Renclod Oullins. Tolerante la acest virus sunt următoarele soiuri: Renclod Doree, Early Laxton, Anna Spath şi Upal.

Combatere

-depistarea virusului în materialul destinat înmulţirii cu ajutorul testului serologic ELISA

- testarea materialului săditor pomicol cu indicatori lemnoşi şi ierboşi

1.5 Mozaicul linear (plum pseudo pox)

Virusul este acelaşi ca şi la crăparea scoarţei, dar o altă tulpină care serologic este înrudită cu prima. Pentru prima dată a fost descris de Christoff, în 1934.

Simptome Pe frunze apare un mozaic linear verde gălbui şi uneori şi pete clorotice, evidente mai

ales primăvara. Pe fructe simptomele se manifestă sub forma unor pete uşor adâncite, asemănătoare cu cele produse de Plum pox, dar mai superficiale. Aceste fructe se maturizează mai devreme şi cad în masă. Cele mai sensibile soiuri din cultură sunt: Timpurii de Aiud, Timpurii Albach, Diana, Superb.

Tulpina virală care produce crăparea scoarţei induce la Tuleu dulce simptome foliare şi nu provoacă sinptome pe Malus pumilla R 12740-7 A. Tulpina de mozaic linear produce simptome de crăpare a scoarţei pe Tuleu dulce, iar pe R 12740 7 A determină simptome foliare tipice virusului Apple chlorotic leaf spot. Ambele virusuri provoacă simptome pe frunze la specia Malus platycarpa.

Combatere -testarea soiurilor şi portaltoilor de prun destinaţi înmulţirii şi înfiinţării de plantaţii

mamă prin dubla inoculare pe puieţi de mirobolan cu Tuleu dulce sau pe puieţi de Malus platycarpa şi testare pe Chenopodium quinoa. Cea mai indicată metodă serologică pentru depistarea virusului este testul ELISA.

CAPITOLUL II ORIGINEA ŞI RĂSPÂNDIREA VIRUSULUI

Virusul Plum pox Potyvirus (PPV), face parte din familia Potyviridae fiind

considerat pentru mult timp ca singurul virus din această familie care infectează speciile pomicole sâmburoase. Acest virus a fost identificat pentru prima dată în livezile de prun din Bulgaria în anul 1918 şi menţionat de către cercetătorul Atanasoff (1932). Virusul

9


distruge în asemenea măsură fructele pomilor infectaţi, încât acestea nu pot fi folosite nici în consumul curent, nici în industria prelucrării fructelor.

În anul 1994, Levy şi Hadidi au descoperit la soiurile de piersic şi prun importate în SUA din Asia de Est un nou virus denumit potyvirusul asiatic latent. Virusul Plum pox este cel mai distuctiv agent patogen viral al speciilor pomicole sâmburoase, producând grave pierderi de producţie mai ales soiurilor sensibile, care pot fi calamitate în proporţie de 100%.

Denumită şi Sharka, simptomele bolii au fost pentru prima dată evidenţiate în Bulgaria între anii 1915-1918, la sfârşitul Primului Război Mondial (Atanasoff,1932). Însă au existat unele rapoarte ce indicau prezenţa simptomelor bolii în Macedonia, în anul 1910.

Primul document care descrie virusul ce provoacă boala nu a aparut decât în 1932, când virologul Atanosoff l-a numit “Sarka po slivite”, însemnând “Pox of Plum”. Sharka reprezintă o mare problemă în mod particular în arealele cultivate cu sâmburoase din Europa Centrală şi de Est.

În ultimii 10 ani virusul s-a răspândit în ţările mediteranene, cum ar fi: Spania (Llacer şi colab., 1985), Portugalia (Lourno şi Monte Corvo, 1986) şi Egipt (Wetzel şi colab., 1991a). De asemenea prezenţa virusului a fost raportată în India (Thakur şi colab., 1994), Chile (Roy şi Smith, 1994), SUA (Levy şi colab, 2000) şi Canada (James şi colab, 2003). Christoff (1934) a observat prezenţa virusului în livezile de caişi din Bulgaria în 1933 şi a durat până în 1960 când a fost depistat în Ungaria.

Între anii 1932-1960 boala s-a mutat la nord şi est de Bulgaria ajungând în Iugoslavia, Ungaria, România, Albania, Cehoslovacia, Rusia. Până în 1960 virusul a infestat doar livezile de prun şi cais, niciodată cele de piersic din Bulgaria, până în 1980, când s-au importat pomi din Bulgaria.

După cel de-al Doilea Război Mondial Sharka a progresat spre vestul Europei, ajungând în Germania şi Austria în anul 1950. La mijlocul anilor’60 prezenţa virusului a fost semnalată în Olanda, Elveţia, Grecia, Anglia şi Turcia; mijlocul anilor’70 în Franţa, Italia şi Belgia; mijlocul anilor’80 în Spania şi Portugalia; sfârşitul anilor’80 în Egipt, Siria, Cipru. Levy şi colab (2000) ne prezintă un tablou al răspândirii plum pox-ului ce arată astfel:

-răspândire limitată: Albania, Austria, Cipru, Cehia, Franţa, Luxembourg, Italia, Moldova, Norvegia, Slovenia, Spania, Turcia, Ucraina, Anglia, SUA.

-răspândire largă: Germania, Grecia, Bulgaria, Ungaria, Polonia, România, Slovacia, ex- Iugoslavia

-prezent, probabil eradicat: Suedia, Olanda, Belgia -prezent, dar neextins: Lituania, India, Egipt, Bosnia-Herţegovina -statutul recent necunoscut: Danemarca şi Chile Cele mai noi date globale în ceea ce priveşte diferenţirea şi distrubuţia izolatelor din

România (regiunile Transilvania, Moldova şi Muntenia) arată o răspândire foarte largă a tulpinii PPV-D, cu o rată medie de 74% pe cele trei regiuni. Cu o frecvenţă medie sunt tulpinile PPV-REC (12,6%), urmată de infecţiile mixte (PPV-D+ rec), cu 13,3%. (http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm).

Datorită recentului progres şi severităţii acestei boli a dus la apariţia Grupului Internaţional de Lucru în anul 1970 şi care împreună cu Organizaţia Europeană şi Mediteraneană Pentru Protecţia Plantelor (OEPP/EPPO) coordonează cercetarea şi schimbul de informaţii între ţări.

Încă din anul 1975, virusul Plum pox este consiserat un patogen de carantină pe deplin justificat, întrucât el reprezintă o ameninţare gravă chiar şi pentru regiunile unde nu este încă răspândit. Este considerat un patogen de carantină şi de către Consiliul Fitosanitar

10

http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm


Inter-African şi de către Organizaţia Nord-Americană Pentru Protecţia Plantelor (Cree, 1999).

Plum pox este o problemă serioasă la nivel mondial, cu un impact sever asupra productivităţii şi calităţii fructelor din specia Prunus (PPV), un virus împotriva căruia nu este disponibil nici un fel de tratament curativ chimic sau biologic. Soluţia actuală pe termen scurt este de eradicare a pomilor infectaţi şi plantarea de material liber de viroze.

SharCo este un proiect FP 7 ce se derulează între anii 2007-2013 şi este cofinanţat de U.E în cadrul acordului de finanţare cu nr. 204429. Din acest proiect fac parte 17 institute de cercetare şi universităţi din 12 ţări europene.

Staţiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Pomicultură Bistriţa SCDP Bistriţa este una dintre cele mai importante staţiuni de cercetare implicate în investigarea virusului Plum pox în România. Activitatea la SCDP Bistriţa se concretizează pe impactul PPV asupra productivităţii şi calităţii fructelor, caracterizarea tulpinilor şi epidemiologie. Misiunea globală a parteneriatului între SCDP Bistriţa şi SharCo este de a obţine informaţii suplimentare despre epidemiologia PPV în România şi dezvoltarea unor noi modalităţi de limitare a răspândirii PPV.

CAPITOLUL III PRINCIPALELE TRĂSĂTURI ALE PLUM POX-ULUI

3.1 Gazde naturale ale virusului Speciile afectate de acest virus sunt cele din genul Prunus, cum ar fi: caisul

(P.armeniaca), piersicul (P.persica), prunul (P. Domestica şi P. Salicina). Migdalul şi ciresul pot fi infectate cu acest virus, dar simptomele nu sunt foarte evidente (Festic, 1978; Kalashyan şi colab, 1994).

Virusul a fost transmis artificial şi la cireşi şi vişini, dar infecţiile au rămas locale, neexistând dovezi că s-ar fi răspândit (Dosba şi colab, 1987). Infecţii naturale la specia P. Cerasus au fost raportate de Kalashyan şi colab. (1994), dar infecţia cu PPV a cireşelor este considerată extrem de neobişnuită, fiind practic neintâlnită în cea mai mare parte a Europei.

Specii sălbatice şi ornamentale aparţinând genului Prunus pot servi ca a doua gazdă a PPV şi pot avea impact asupra epidemiologiei şi controlului acestui virus (Polak, 1997). Astfel că multe din speciile sălbatice ale genului Prunus sunt susceptibile: P.bessey, P.cerasifera, P.insititia, P.tomentosa, P.spinosa, P.mahaleb, P.pumila, P.davidana, P.nigra, P.maritime, P.americana .

Rezultatele obţinute în Iugoslavia infirmă faptul că speciile menţionate mai sus ar fi gazde naturale ale virusului, dar s-a descoperit alt virus, virusul necrotic ring spot (Rankovic şi Dulic-Markovic,1992).

Practic toate speciile din genul Prunus cultivate în scop comercial în Europa sunt afectate mai mult sau mai puţin de acest virus. Multe specii ce nu aparţin genului Prunus, ce fac parte din noua familie de plante au fost infectate artificial cu una sau mai multe tulpini ale virusului sau în unele cazuri s-au găsit plante infectate în mod natural. Multe dintre acestea sunt plante ierboase anuale, câteva fiind perene sau lemnoase şi pot servi ca şi gazdă: Campanula rapunculoides, Chenopodium quinoa, C. Species, Lamium album, L. Amplexicaule, L. Purpureum, Lupinus albus, Lycium barbarum, L.Halimifolium, Medicago lupulina, Trifolium dulcamara, T. pratense, T. repens, Zinnia elegans.

11


3.2 Patologia virusului Plum pox Vărsatul prunului este produs de Prunus virus 7 Christoff şi aparţine grupei

potyvirus, având ca şi reprezentant virusul Y al cartofului. Criptograma virusului a fost stabilită de Kerlan şi Dunez (1976) şi se prezintă astfel: R/1; 3,5/5,2; E/E; S/Ap. Din descifrarea criptogramei rezultă că genomul viral este alcătuit din acid ribonucleic cu o singură spirală de nucleotide. Dimensiunea genomului este de 10 kb iar la capătul 3` se află o regiune poly(A). În capătul 5` se leagă cu legătură covalentă o proteină specifică.

Proteina răspunzătoare pentru proprietăţile serologice este proteina CP (Coat protein), ce este implicată şi în răspândirea virusului prin afide.

Greutatea moleculară a acidului nucleic este de 3,5 x 106 daltoni şi constituie 5,2% din particula virală. Particulele virale se prezintă sub formă alungită , cu lungime de 750nm şi diametru 15nm. Temperatura de inactivare a virusului este de 550C, diluţia limită este de 10-3, iar longevitatea în suc de 35 de ore la temperatura de 200C şi de 5-7 zile la temperatura de 40C.

Perioada de incubaţie în livadă durează 9-10 luni la plantele lemnoase şi 1-2 luni în seră la puieţi, iar la plantele ierboase 1-3 săptămâni. Viteza de răspândire în ţesuturi depinde de vârsta pomilor, sensibilitatea ţesuturilor şi viteza de propagare în întreg pomul. La soiul Vânăt de Italia în vârstă de 4 ani prin inoculare cu muguri infectaţi, virusul a cuprins întreg pomul după 4-5 ani, iar la soiul Bistriţa în 1-2 ani.

Viteza de răspândire a virusului în livadă depinde de marimea sursei de infecţie şi de prezenţa sa în interiorul său în afara plantaţiei.

3.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox Plum pox este o boală foarte gravă deoarece produce simptome severe pe fructe,

frunze, sâmburi, uneori pe trunchi şi pe ramurile de schelet (Minoiu, 1997). Simptomele de PPV sunt foarte evidente pe frunzele de primăvară ce se manifestă sub forma unor decolorări de culoare verde deschis, pete clorotice, cercuri concentrice, deformări ale frunzelor. În unele cazuri se constată o cădere prematură a fructelor bolnave.

Prezenţa sau intensitatea simptomelor variază în funcţie de specie şi soi, tulpina virală, starea fitosanitară a gazdei cu privire la alţi viruşi, sezon şi locaţie. PPV influenţează într-o mică măsură vigoarea şi longevitatea longevitatea şi pomilor infectaţi.

Nemeth (1986) descrie simptomele la unele soiuri de prun, chiar şi moartea unor pomi, dar nu s-a putut confirma că simptomele au fost induse de PPV. Atanassoff (1932, 1935) a descris simptomele plum pox-ului la diferite specii ale genului Prunus.

OEPP/EPPO (1983), Nemeth (1986) au descris simptomele PPV la prunul european, cais şi piersic. Llacer şi colab (1985), Llacer şi Cambra (1986) descriu simptomele PPV la prunul japonez. Simptomele virusului prezent la vişin şi cireş au fost descrise de Crescenzi şi colab (1997), Nemchinov şi colab (1998).

Infectarea cu acest virus poate duce la pierderi considerabile. Aproximativ 100 de milioane de pomi aparţinând speciilor sâmburoase din Europa sunt infectate , la unele soiuri sensibile pierderile pot fi de 80-100% (Kegler, 1998). În estul şi centrul Europei soiurile sensibile de prune pot prezenta căderi premature ale fructelor şi fisuri pe suprafaţa lor. Nemchinov şi colab (1998) descriu simptomele la cireş şi le prezintă astfel: pete circulare de natură clorotică sau necrotică, căderi premature ale fructelor.

12


CAPITOLUL IV SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA

4.1 Scopul cercetării

Cercetările au fost axate pe testele moleculare şi serologice pentru toate cele 90 de probe provenite din cele trei regiuni pomicole situate în Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei (Cluj, Bistriţa şi Reghin).

Cercetările s-au axat, în prealabil, pe identificarea unor focare de infecţie în regiunile menţionate. Identificarea focarelor de infecţie şi selecţia pomilor infectaţi au fost efectuate pe baza simptomelor tipice de PPV iar, ulterior, probe de frunze cu simptome evidente vor fi prelevate din diferite părţi ale coroanelor pomilor cu infecţie generalizată şi supuse diagnosticului serologic şi molecular.

Diagnosticul molecular s-a realizat prin tehnica RT-PCR folosind perechea de amorse polivalente P1/P2 care amplifică un fragment de 243 bp corespunzător regiunii C-terminus a proteinei capsidale (Wetzel şi colab., 1991 b).

Diferenţierea moleculară a fost realizată tot prin RT-PCR folosind amorse specifice regiunilor genomice (Cter)CP (gena pentru proteina capsidală), (C-ter)NIb (gena pentru replicaza virală)/ (N-ter)CP şi CI (gena pentru helicază). Evidenţierea produşilor amplificaţi a fost realizată prin electroforeză în gel de agaroză, benzile colorate cu bromură de etidiu au fost vizualizate sub lumină ultravioletă.

Produşii PCR corespunzători regiunii (Cter)CP au fost ulterior diferenţiati prin RFLP, folosind enzimele de restricţie Rsa I şi Alu I. Produşii fragmentaţi s-au evidenţiat prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Prin tehnica RT-PCR s-a avut în vedere şi identificarea unor potenţiale recombinări genetice care pot conduce la apariţia unor tulpini virale noi cu efecte nepredictibile: virulenţă şi agresivitate diferită.

Diagnosticarea şi diferenţierea serologică a izolatelor PPV a fost realizată prin intermediul tehnicii imonoenzimatice DASI-ELISA folosind antiseruri monoclonale pentru cele două serogrupuri majore - PPV-D (tulpina clorotică) şi PPV-M (tulpina necrotică) şi protocolul de lucru recomandat de Cambra şi colab., 2004.

4.2 Obiectivele urmărite în cercetările aferente tezei de doctorat

Cercetările propuse sunt relevante pentru horticultură deoarece sunt abordate aspecte de mare actualitate ce asigură acumularea de cunoştinţe avansate şi rezultate ştiinţifice într-un domeniu de mare importanţă ştiinţifică şi economică.

Tulpinile virale pot crea atât probleme de identificare cât şi de importanţă practică. Tulpinile unui virus pot induce simptome diferite şi se pot adapta diferit la noile soiuri de plante făcând astfel dificilă diferenţierea lor.

Diferenţierea simptomatologică a celor două tulpini (D si M) este dificilă de realizat. În cazul ambelor tulpini simptomele se manifestă prin pete clorotice şi mozaicuri pe frunze, pete inelare pe suprafaţa fructelor care, ulterior, devin necrozate şi se adâncesc în pulpă. Tulpina PPV-D provoacă, în general, simptome mai puţin severe comparativ cu PPV- M (Damsteeg şi colab., 1997).

Pentru caracterizarea moleculară si serologică ale izolatelor PPV recoltate, s-au avut în vedere următoarele obiective:

• Identificarea focarelor de infecţie şi recoltarea de izolate PPV de la pruni care exteriorizau simptome tipice cu acest virus

• Extracţia ARN-lui din frunze de prun simptomatice

13


• Efectuarea diagnosticului molecular pentru stabilirea prezenţei virusului cu primeri polivalenţi

• Diferenţierea tulpinilor virale cu primeri specifici • Diferenţierea tulpinilor virale prin analize PCR-RFLP • Efectuarea diagnosticului serologic pentru stabilirea prezenţei virusului prin

DASI-ELISA • Diferenţierea tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M prin DASI-ELISA

4.3 Materialul biologic

În cadrul cercetărilor am efectuat o documentare cu privire la identificarea focarelor de

infecţie, diagnosticul molecular, diferenţierea şi optimizarea protocolului de extracţie în vederea izolarii şi purificării ARN-ului .

Cercetările au fost axate, în prealabil, pe identificarea unor focare de infecţie din trei zone pomicole situate în bazinul central pomicol al Transilvaniei, şi anume: Staţiunea de Cerecetare-Dezvoltare Pomicolă Cluj (SCDP Cluj-30 de izolate), Staţiunea de Cerecetare-Dezvoltare Pomicolă Bistriţa (SCDP Bistriţa-30 de izolate) şi zona Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10-30 de izolate).

Identificarea focarelor de infecţie şi selecţia pomilor infectaţi au fost efectuate pe baza simptomelor tipice de PPV. Ulterior probe de frunze cu simptome evidente au fost prelevate în luna iunie a anului 2007, din diferite părţi ale coroanelor pomilor cu infecţie (rata de infecţie cu PPV de peste 20%) şi supuse diagnosticului molecular.

Menţionez că pentru fiecare izolat au fost recoltate 10 frunze, ce au fost aşezate în pungi de polietilenă. După numerotare, în ceea ce priveşte parcela, rândul şi pomul din care s-a recoltat izolatul pungile au fost depozitate într-o ladă frigorifică şi apoi stocate în congelator la -80 0C până în momentul în care am început analizele de laborator. Simptomele pe frunze constau în pete, benzi, inele de culoare gălbuie până la verde măsliniu (uneori roşiatice).

4.4 Tehnici şi metode de cercetare 4.4.1 Extracţia ARN-ului total Pentru izolarea ARN-ului total, s-a recurs la procedura standard, şi anume deshidratarea

ţesuturilor şi zdrobirea lor sub azot lichid, până la obţinerea unei pudre fine şi resuspendarea ţesutului mojarat într-o soluţie tampon care protejează ARN-ul eliberat din celule.

Extracţia ARN-ului total din frunzele de prun, s-a realizat cu ajutorul kit-ului de extracţie Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen).

Protocolul de lucru folosit a fost cel recomandat de producător şi a presupus parcurgerea a zece paşi.

4.4.2 Reacţia de revers transcriere şi amplificare

ARN-ul total extras din frunzele de prun virozate, a fost utilizat pentru RT-PCR, cu ajutorul kitului Qiagen One-Step RT-PCR kit”, într-un singur pas. Acest kit, permite efectuarea revers transcrierii (RT) şi a amplificării (PCR) într-o singură reacţie.

Pentru diagnostic viral s-a folosit perechea de amorse polivalente P1/P2, care au rolul de a amplifica un fragment de 243 bp corespunzător regiunii C-terminus a proteinei capsidale.

Diferenţierea moleculară a izolatelor pe tulpini, respectiv evidenţierea eventualelor suşe recombinate s-a realizat folosind amorse specifici regiunilor genomice CP (gena pentru proteina capsidală) cu P1-PD şi P1-PM (Olmos şi colab., 1997), regiunea CI (gena pentru helicază) cu

14


CIF-CID şi CIF-CIM (Glasa şi colab., 2002) şi regiunea NIb (gena pentru replicaza virală) cu mD5 şi mM3 (Subr şi colab., 2004) (fig.1).

Fig.1 Secţiunile genomice ale PPV-ului vizate pentru caracterizare moleculară.

(Zagrai şi colab., 2006)

PPV's targeted genomic sections for molecular characterization

Secvenţa amorselor utilizate în vederea diagnosticarea şi diferenţierii tulpinilor virale a

fost următoarea:

P1: 5`-3` ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC P2: 5`-3` CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA PD: 5`-3` CTT CAA CGA CAC CCG TAC GC PM: 5`-3` CTT CAA CAA CGC CTG TGC GT CIF: 5` - GCAAAGTAAYGAAGTTGCAC-3` sense CID: 5` - TCGTGTATCGAACGAGACGA – 3`antisense CIM: 5` - TCGTATAACGAACAAGTCGG – 3` antisense mD5: 5` - TAT GTC ACA TAA AGG CGT TCT C-3` mM3: 5` - CAT TTC CAT AAA CTC CAA AAG AC-3` Metoda de lucru: Amestecul (master-mix) dintre componentele s-a realizat într-un tub Eppendorf de 1,5

ml, enzima adăugându-se ultima. Amestecul de reacţie PCR a fost preparat în hota sterilă pentru a evita contaminarea cu ARN străin.

După adăugarea enzimei (revers transcriptaza şi polimeraza) se vortexează tubul uşor timp de câteva secunde, pentru evitarea separării gravimetrice a componentelor. Într-un set de microtuburi de 0.2 ml (Eppendorf) se introduc câte 20 μl/tub din amestec, peste care se adaugă 5 μl ARN din fiecare probă. Se introduce setul de microtuburi în termocycler şi se iniţiază ciclu de revers transcriere şi amplificare

4.4.3 Protocolul de amplificare

Ciclurile termice necesare reverstranscrierii ARN-ului şi amplificării fragmentelor de ADN s-au realizat în aparatul thermocycler (Corbett Research), optimizat după cum urmează:

1. Reverstranscriere: 50°C ................40 minute; 2. Activarea polimerazei: 95°C ................15 minute;

15


3. Fixarea amorselor: • Denaturare: 94°C................1 minut;

X 35 de cicluri • Ataşarea amorselor: 61°C............... .1 minut; • Extensie: 72°C.................1 minut;

4. Extensie finală: 72°C................10 minute;

5. Răcire: 4°C

Temperatura de ataşare a amorselor în cazul amorselor CIF-CID/CIM a fost de 60oC, iar în cazul amorselor mD5-mM3 de 470C.

4.4.4 Migrarea electroforetică a produşilor de amplificare în gel de agaroză

Metoda electroforetică se bazează pe separarea diferitelor specii de particule încărcate

electric, prin migrarea diferenţiată sub influenţa unui câmp electric. Astfel că într-un câmp electroforetic ce se formează între 2 electrozi, particulele încărcate electric se deplasează spre electrodul de sarcină opusă. Pentru ca migrarea să fie corectă, este necesar ca tensiunea şi intensitatea curentului electric să fie constante pe întreaga durată de migrare.

4.4.4.1 Prepararea gelului de agaroză

Preparerea gelurilor de agaroză s-a realizat prin topirea agarozei 1,4% în cuptorul cu

microunde, în 100 ml tampon de electroforeză TAE până la obţinerea unei soluţii clare, transparente. Această soluţie a fost turnată în matriţa în care au fost fixaţi pieptenii pentru formarea godeurilor. După răcirea şi întărirea gelului, pieptenii au fost scoşi iar gelul a fost aşezat în cuva de electroforeză orizontală, cuvă în care anterior s-a turnat tampon de electroforeză TAE.

Soluţia tampon, utilizată în electroforeză, a fost Tris-acetatul (TAE 1x). Pentru obţinerea acestei soluţii se prepară mai întâi o soluţie stoc cu concentraţia de 50X, care are următoarea compoziţie: 242 g Tris HCl, 57, 1 ml acid acetic glacial şi 100 ml EDTA 0,5M (pH 8.0). Soluţia de lucru TAE 1X se obţine prin măsurarea a 20 ml soluţie stoc de 50X la care se adaugă 980 ml apă distilată astfel încât soluţia de lucru (1X) să aibă concentraţia de 0,004M Tris acetat şi 0,001M EDTA.

Produşii de amplificare au fost migraţi în cuvă de electroforeză orizontală, într-un câmp electric ce se formează între doi electrozi, particulele încarcate electric deplasându-se spre electrodul de sarcină opusă. Se ştie deja că particulele de mărimi mai mici se deplaseză mai repede decât cele de mărimi mari.

4.4.4.2 Pregătirea produşilor de amplificare în vederea migrării în gel de agaroză Din produsul de amplificare, în alveolele gelului a fost încărcat un amestec de 10 µl

produs PCR, la care s-au adăugat 2 µl de colorant (loading dye). În primul godeu (alveolă) au fost încărcaţi 4 µl de marker ADN standard (100pb DNA Step Ladder, Promega).

Pentru ca migrarea să fie corectă a fost necesar ca tensiunea şi intensitatea curentului electric să fie constante pe întreaga durată a migrării. Sursa de putere a fost programată la tensiunea de 80V, respectiv 59 mA, iar durata de migrare a fost de 1 oră şi 30 de minute.

4.4.4.3 Colorarea gelurilor de agaroză şi preluarea imaginilor

Pentru a nu contamina cuva de electroforeză cu bromură de etidiu, gelurile au fost

colorate după migrare. După încheierea migrării, acestea au fost puse la colorat în aproximativ

16


150 ml de apă distilată, timp de circa 15 minute pe o platformă agitatoare. În cei 150 ml de apă distilată, s-a adăugat 10 µl de soluţie de bromură de etidiu, cu concentraţia finală de 0,5 µg/ml. Aceasta are rolul de a se intercala între bazele azotate putând fi vizualizată în lumina UV.

Deoarece bromura de etidiu îşi pierde repede fluorescenţa în lumina UV, gelurile trebuie examinate imediat după colorare. Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat în lumina UV, iar imaginea gelurilor a fost achiziţionată cu o camera video Alpha Innotech a aparatului BioSpectrum AC Imaging Sistem. Preluarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului VisionWorksLS.

4.4.5 Diferenţierea tulpinilor virale pe baza profilului PCR-RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism) sau Polimorfismele Lungimii

Fragmentelor de Restricţie, este o metodă moleculară care detectează polimorfismele apărute datorită mutaţiilor punctiforme, inserţiilor şi deleţiilor, toate acestea determinând modificarea situsurilor de restricţie ale endonucleazelor.

Metoda se bazează pe digestia enzimatică a fragmentelor de ADN (produs PCR în cazul de faţă), cu ajutorul enzimelor de restricţie, separarea electroforetică a fragmentelor de restricţie şi detectarea polimorfismului dintre lungimile fragmentelor astfel obţinute. Enzimele de restricţie sunt endonucleaze specifice care recunosc situsuri formate din 4, 6, 8 pb şi taie în acel loc după o anumită simetrie.

Cu ajutorul tehnicii RFLP au fost diferenţiate tulpinile virale de Plum pox, folosind enzimele de restricţie Rsa I şi Alu I (Wetzel şi colab., 1991a). Enzima de restricţie Rsa I are rolul de a diferenţia diferite tulpini de Plum pox Virus, de a „tăia” situsul specific recunoscut, iar enzima de restricţie Alu I, are rolul de a determina eventualele mutaţii ale acestora.

Metodologia de lucru a presupus parcurgerea următoarelor etape de lucru: 1. obţinerea prdusului PCR prin reverstranscriere cu ajutorul amorselor P1 şi P2 2. digestia enzimatică a produsului PCR obţinut folosind enzimele de restricţie Rsa I şi

Alu I 3. separarea fragmentelor de digestie în gelul de polacrilamidă 4. vizualizarea fragmentelor obţinute în lumină UV prin colorarea gelurilor cu bromură

de etidiu 4.4.5.1 Prepararea amestecului de reacţie pentru digestia enzimatică

Amestecul de reacţie a fost centrifugat pentru câteva secunde, cu scopul de a trece toţi

produşii reacţiei spre vârful tubului şi imediat probele s-au aşezat în incubator, la temperatura de 37°C timp de 2 ore. De menţionat că atât enzima Rsa I cât şi Alu I, sunt ultimele care s-au adăugat în amestec, imediat înainte de incubarea probelor.

4.4.5.2 Pregătirea gelului de poliacrilamidă şi separarea fragmentelor de digestie

Gelul de poliacrilamidă se obţine prin copolimerizarea acrilamidei şi bisacrilamidei. Polimerizarea este iniţiată de persulfatul de amoniu, iar procesul este accelerat de tetrametilenamida (TEMED).

Metoda de lucru : Plăcile de sticlă între care s-a preparat gelul, au fost foarte bine spălate cu alcool etilic

70% şi apoi cu apă distilată, pentru îndepărtarea urmelor de la gelurile anterioare sau a altor impurităţi. Între ele, lateral, au fost dispuse două distanţiere (0,25 mm) şi au fost fixate într-un suport special (cu ajutorul căruia se fixează în interiorul aparatului după realizarea gelului).

17


Pentru prepararea a 10 ml de gel de poliacrilamidă s-au adăugat următorii compuşi: Apă bidistilată steril- 7,726 ml; Tris-acetatul (TAE 50x) -200 µl; Acrylamida/bis-Acrylamida- 2 ml; Persulfat de amoniu (PSA)- 70 µl; TEMED -4 µl.

Componentele enumerate au fost introduse, în ordinea indicată, într-un pahar Berzelius de 50 ml. Cu ajutorul unui magnet şi pe plita electrică, se amestecă conţinutul paharului, iar cu ajutorul unei seringi, se introduce amestecul între plăcile de sticlă în aşa fel încât să se obţină o linie continuă de curgere a lichidului între acestea.

După umplerea spaţiului dintre plăcile de sticlă cu amestec, acestea sunt dispuse orizontal, şi se introduce între plăci, în partea superioară, un dispozitiv (pieptene) cu „dinţi”, pentru a forma alveolele (godeurile). Se lasă minimum o oră pentru întărirea gelului.

După expirarea timpului şi întărirea gelului, peste plăcile cu gel şi în cuva electroforezei verticale s-a adăugat soluţie de TAE 1x.

La probele digerate (10 µl), înainte de a le „încărca” în gel, s-a adăugat 2 µl Loading Dye care are rolul de a „transporta” moleculele de ADN în godeuri. Cei 12 µl de produs, au fost „încărcaţi” în fiecare alveolă (godeu), începând cu alveola numarul doi, deoarece în prima alveolă s-a încărcat 4 µl Leadder-ul: pUC18 DNA MspI Digest (Sigma).

Sursa de putere pentru migrarea gelurilor de poliacrilamidă a fost programată la o tensiune de 60 V, durata de migrare fiind de 1oră şi 30 de minute. 4.4.5.3 Colorarea gelurilor de poliacrilamidă

După ce fragmentele de ADN digerate au fost separate, gelul de poliacrilamidă a fost trecut de pe suportul acestuia (imersat) în circa 100 ml apă distilată, la care s-a adăugat 5 µl de soluţie de bromură de etidiu.

Pentru colorare, gelul a fost menţinut în această soluţie pe o platformă agitatoare, timp de 5 de minute, iar pentru decolorarea (clătirea) lui s-a trecut într-un recipient cu apă bidistilată timp de 5 minute.

Vizualizarea fragmentelor, obţinute prin digestia produsului PCR, s-a realizat în lumină UV, imaginea gelurilor fiind achiziţionată cu o cameră video Alpha Innotech. Preluarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului VisionWorksLS.

4.4.6 Principiul tehnicii DASI-ELISA pentru detectarea prezenţei virusului în probe, cât

şi pentru diferenţierea tulpinilor virale

Principiul testului ELISA presupune ca din reacţia dintre antigen-anticorp conjugat-enzima specifică hidrolizează substratul, astfel culoarea acestuia se schimbă. Această reacţie de culoare indicând prezenţa virusului în probe. Intensitatea culorii se poate determina fotometric, iar concentraţia virală este măsurată prin citirea densităţii optice (OD).

Parcurgerea etapelor de lucru, prepararea diluţiilor tampoanelor anticorpilor, substratului, controalele pozitive şi negative, precum şi păstrarea lor s-a făcut în conformitate cu instrucţiunile firmei furnizoare.

Înainte de începerea efectuării testelor s-a realizat o schemă care să indice poziţia fiecărei probe şi a martorilor în plăci. De asemenea s-a calculat volumul diluţiilor reactivilor în funcţie de numărul de probe ce urmează să fie testate.

Metoda de lucru: • Căptuşirea godeurilor cu IgGPPV

S-au pregătit plăcile, în care s-au încărcat câte 200 µl din diluţia de 1: 100 de IgG PPV şi tampon de căptuşire.

Plăcile s-au pus la incubat în etuvă la temperatura de 370C timp de 4 ore, pentru ca godeurile să fie căptuşite cu IgG (gama imunoglobulină).

18


-Spălarea plăcilor: Plăcile au fost spălate de trei ori cu o soluţie de PBS + Twen (tampon fosfat de potasiu) pentru îndepărtarea excesului de reziduri şi antigene. Operaţiunea s-a efectuat automat, cu aparatul Tecan, care cu ajutorul unui soft efectuează trei operaţiuni :

-încărcarea godeurilor cu soluţia de spălare - agitarea plăcilor - aspiraţia lichidului

• Adăugarea în godeuri a extractelor vegetale În fiecare godeu s-a încărcat 200 µl de extract vegetal obţinut prin mojararea cu un

omogenizator manual a aproximativ 250 mg de frunze de prun cu simptome de PPV în 5 ml tampon de extracţie (10x) pentru fiecare probă în parte (extracţia s-a făcut în pungi “Universal 12x14 “cm de la Bioreba, ce prezentau în interior o membrană filtrantă) . Pentru cele 90 de probe am avut nevoie de 450 ml de E.B (10x).

Concentraţia de lucru este de 1x şi a fost calculată astfel: 45 ml E.B de 10x + 405 ml de H2O bidistilată. După încărcarea fiecarei probe în godeu, plăcile s-au pus la 4oC timp de 16 ore. În fiecare placă s-au pus câte două controale pozitive şi negative.

-Spălarea plăcilor: urmează trei spălări cu PBS + Twen. • Adăugarea anticorpilor monoclonali specifici

Se prepară o diluţie de 1: 1000 din IgG PPV-D, IgG PPV-M (anticorpi monoclonali specifici fiecărei tulpini virale) şi PBS + 0.5% B.S.A (bovinum serum albuminum). În fiecare godeu se încarcă 200 µl şi se incubează 2 ore la 37 oC.

-Spălarea plăcilor: plăcile se spală de trei ori cu PBS + Twen. • Adăugarea conjugatului imunoenzimatic

Se prepară o diluţie de 1 : 1000 de IgG conjugat (ce conţine enzima fosfataza alkalină) în PBS. Se adaugă câte 200 µl în fiecare godeu şi se ţine 2 ore la 37 oC.

-Spălarea plăcilor: se spală de trei ori cu PBS + Twen. • Adăugarea substratului

Se prepară o soluţie de 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfatul în tampon de substrat 1X, reacţia producând o schimbare a culorii ce poate fi apreciată vizual şi cu un fotometru. Se încarcă câte 200 µl şi se ţin la temperatura camerei timp de 1h-1h30 de minute. Astfel că probele care se colorează în galben înseamnă că sunt pozitive, adică aparţin fie lui PPV-D, PPV-M sau sunt infecţii mixte (D+M).

• Citirea şi interpretarea rezultatelor Un izolat analizat este considerat pozitiv sau negativ în funcţie de valoare extincţiei

(Do=405nm) raportată la pragul de detecţie. Pragul de detecţie este ca valoare 2x media aritmetică a citirilor celor două repetiţii a controlului negativ. Astfel că o probă este considerată pozitivă dacă valoare extincţiei (media citirilor celor două repetiţii) este egală sau mai mare cu pragul de detecţie.

CAPITOLUL V REZULTATE ŞI DISCUŢII

5.1 Rezultate privind caracterizarea moleculară prin RT-PCR a izolatelor recoltate

de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa 5.1.1 Diagnosticarea moleculară

Diagnosticarea moleculară s-a efectuat folosind amorsele specifice P1 şi P2. Aceste

amorse confirmă prezenţa virusului în frunzele cu simptome evidente de PPV. Perechea de amorse P1 şi P2 amplifică un fragment de 243 pb, corespunzător regiunii C-terminus a proteinei capsidale (CP).

19


Această pereche de amorse s-a dovedit a fi foarte eficientă în diagnosticarea moleculară atât la noi în ţară (Zagrai şi colab., 2006, 2008a), cât şi în străinătate (Wetzel şi colab., 1991b; Matic şi colab., 2006; Kajic şi colab., 2008).

1000pb 1000pb 1000pb

500pb 500pb 500pb

a b c

243 pb

Fig. 2 a, b,c Analizarea migrării produşilor PCR în gel de agaroză pentru identificarea prezenţei virusului PPV la probele (izolatele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9); L-Ladder,

C- control negativ, C+ control pozitiv

În cadrul acestor profile electroforetice L reprezintă markerul care ne indică greutatea

moleculară a produşilor de amplificare. Controlul pozitiv este reprezentat de un izolat, a cărei infecţie cu PPV a fost confirmată prin studii serologice şi moleculare de către dr. ing., Zagrai Ioan, cercetător la SCDP Bistriţa. Pentru controlul negativ am folosit un izolat sănătos, adică neinfectat cu virusul PPV.

În Fig. 2 a, b,c sunt prezentate spre exemlificare imaginile gelurilor obţinute în urma migrării produşilor PCR de la probele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9. În imaginea gelurilor se observă prezenţa benzii la dimensiunea de 243 pb, ceea ce indică infectarea acestor izolate cu virusul Plum pox.

Existenţa benzii la toate cele 90 de izolate denotă faptul că toate izolatele au fost infectate cu virusul Plum pox, deci simptomele prezente pe frunzele recoltate au fost cele de PPV. Faptul că virusul este prezent în toate izolatele, ne indică o infecţie masivă cu PPV în livezile de unde au fost recoltate probele.

5.1.2 Diferenţierea moleculară a tulpinilor PPV-D şi PPV-M cu primeri specifici Diferenţierea celor două tulpini virale PPV-D şi respectiv PPV-M, s-a realizat cu ajutorul

tehnicii RT-PCR, folosind amorsa P1(sens) pentru ambele tulpini şi câte o amorsă specifică pentru fiecare tulpină în parte, respectiv PD(PPV-D) şi PM(PPV-M) ce amplifică un fragment de 198 pb, corespunzător genei proteinei capsidale.

Fiecare probă a fost amplificată cu ambele seturi de amorse, atât în scopul diferenţierii celor două tulpini virale cât şi pentru determinarea infecţiilor mixte. Aceasta a reprezentat doar o diferenţiere preliminară deoarece tuplpina PPV-M nu se diferenţiază de tulpina PPV-Rec în regiunea C-ter corespunzătoare proteinei capsidale.

a b c

Caracterizarea moleculară a izolatelor PPV recoltate de

la SCDP Cluj

67%3%

30%

PPV-D PPV-M PPV-D+M

Caracterizarea moleculară a izolatelor PPV din zona

Reghin

80%

13% 7%

PPV-D PPV-M PPV-D+M

Caracterizarea moleculară a izolatelor de la SCDP Bistriţa

prin tehnica RT-PCR

27%

13%60%

PPV-D PPV-M PPV-D+M

20

Fig.3a, b,c Diferenţierea moleculară a tulpinilor D şi M prin RT-PCR la izolatele din cele trei regiuni luate în studiu


În urma analizelor efectuate se poate observa că, din toate cele 30 de izolate recoltate de la SCDP Cluj, un număr de 20 (67%) aparţin tulpinii PPV-D, 9 (30%) izolate sunt infecţii mixte, aparţinând atât tulpinii D cât şi tulpinii M (D+M), iar un izolat aparţine tulpinii PPV-M ( 3%) conform figurii 3a.

În cazul diferenţierii moleculare a izolatelor de la Reghin rezultatele obţinute au fost sintetizate şi prezentate în tabelul 2. Astfel se poate observa că, din toate cele 30 de izolate, un număr de 2 (7%) de izolate au fost identificate ca fiind infecţii mixte (D+M) ,4 (13%) izolate aparţin tulpinii PPV-M, iar restul de 24 (80%) sunt D-uri (fig.3 b).

Rezultatele obţinute cu probele recoltate de la SCDP Bistriţa au fost sintetizate şi prezentate în tabelul 3. În urma analizelor efectuate se poate observa că, din toate cele 30 de izolate, un număr de 8 (27%) aparţin tulpinii PPV-D, 18 (60%) izolate sunt infecţii mixte, aparţinând atât tulpinii D cât şi tulpinii M (D+M), iar 4 izolate aparţin tulpinii PPV-M ( 13%) conform figurii 3c.

5.1.3 Detecţia tulpinii recombinate PPV-Rec Prima apariţie privind recombinarea ARN-ului în PPV a fost raportată în fosta Iugoslavie

(izolatul 06) de către Cervera şi colab., (1993) şi în Slovacia (izolatul BOR-3) de către Glasa şi colab., (2001).

Analizarea secvenţelor din diferite părţi ale genomului viral la un număr mare de izolate a făcut lumină în ceea ce priveşte rolul recombinării în evoluţia PPV-ului, şi au confirmat prezenţa unui punct de recombinare între PPV-D şi PPV-M în regiunea virală Nib. (Glasa şi colab., 2002)

Primul raport privind infecţia naturală a prunilor cu tulpina recombinată PPV-Rec în România a fost făcut în anul 2006. Toate izolatele identificate iniţial ca fiind tulpina PPV-M s-au dovedit aparţinând suşei PPV-Rec, în urma analizelor moleculare. În urma secvenţierii produşilor PCR (Polymerase Chain Reaction) corespunzători regiunilor (Cter)CP şi (Cter) Nib – (Nter) CP s-a dovedit faptul că aliniamentele nucleotidice corespund cu cele din Gene Bank, raportate de Glasa et al., în 2002 şi 2004 (Zagrai şi colab., 2006).

În cazul amorselor mD5 şi mM3 se obţine produs de amplificare numai în cazul în care, tulpina virală este una recombinată, amplificând un fragment de 605 pb. Astfel că în cazul în care se obţine un produs PCR din amplificarea cu P1/PM există posibilitatea ca în urma amplificării cu amorsele mD5/mM3 să obţinem un produs PCR care ne indică faptul că un izolat identificat iniţial ca fiind tulpina M este în realitate tulpina PPV-Rec.

1000pb 605 pb 500pb

100pb

Fig. 4 Produşii de amplificare RT-PCR obţinuţi cu amorsele specifice mD5 şi mM3, la

probele Cluj 16- Cluj 26; L- Ladder; C+ control pozitiv; C- control negativ Controlul pozitiv folosit este un izolat a cărei apartenenţă la tulpina PPV-Rec a fost

stabilită în cercetările anterioare efectuate de Zagrai şi colab. (2006). Faptul că nu am obţinut bandă la C- demonstrează lipsa contaminării cu ARN străin .

21


În profilul electroforetic din figura 4 sunt prezentaţi produşii PCR obţinuţi în urma analizelor efectuate cu amorsele mD5/mM3 la 11 probe de la SCDP Cluj, respectiv Cluj 16- Cluj 26. După cum se poate observa din imaginea gelului, probele Cluj 16- Cluj 20 nu prezintă bandă la dimensiunea de 605 pb, deci aceste izolate nu aparţin tulpunii PPV-Rec. Probele Cluj 21-Cluj 26 prezintă bandă la dimensiunea de 605 pb, deci aceste izolate aparţin tulpinii PPV-Rec.

Analizând toate cele 30 de izolate din regiunea Cluj, doar probele Cluj 21-Cluj 30 au prezentat bandă la dimensiunea de 605 pb, restul neprezentând bandă, prin urmare, aceste probe au confirmat apartenenţa la tulpina PPV-Rec.

Fig. 5 Produşii de amplificare cu mD5/mM3, la probele Reghin 6, 22, 23, 26, 29, 30; L-Ladder, C- control negativ, C+ control pozitiv

În figura 5 se exemplifică detectarea tulpinii PPV-Rec prin prezenţa benzii la

dimensiunea de 605pb la probele Reghin 6, Regin 22-23, Reghin 26 şi Reghin 29-30. În urma analizelor efectuate pe cele 30 de probe de la Reghin, rezultate prezentate în

tabelul 2 sunt următoarele: probele R22-23, R26, R29 sunt PPV-Rec, iar R6, R30 sunt infecţii mixte între tulpinile PPV-D+PPV-Rec.

605pbb 500pb

1000pb

605 pb

500pb

1000pb 1500pb

100pb

Fig. 6 Analiza produşilor PCR obţinuţi prin amplificare cu mD5/mM3 pentru identificarea tulpinii PPV-Rec la probele Bistriţa 10-22; L-Ladder, C- control negativ, C+ control pozitiv

În fig. 6 se pot observa probele Bistriţa 10-Bistriţa 22 ce au fost amplificate şi migrate în gel de agaroză. În cazul probelor B10, 11, 18, 21 nu s-a obţinut produs PCR, nu este prezentă bandă, nu avem infecţie cu PPV-Rec. Probele B12-17, 19, 20, 22 au prezentat bandă de 605 pb, deci aparţin tulpinii PPV-Rec. Rezultatele au fost sintetizate în tab. 3 de unde se poate concluziona că din totalul de 30 de probe luate în studiu, 22 sunt recombinate. Probele care s-au dovedit a fi D+M în regiunea CP şi au prezentat bandă cu mD5/mM3 sunt considerate a fi infecţii mixte, adică PPV-D+PPV-Rec.

5.1.4 Analizarea regiunii genomice CI Analizarea moleculară a acestei regiuni genomice a PPV-ului s-a făcut pentru a confirma

prezenţa tulpinii PPV-Rec. Această regiune a fost analizată molecular şi de către alţi cercetători

22


în studiile lor privind caracterizarea virusului Plum pox (Glasa şi colab., 2004; Matic şi colab., 2006; Zagrai şi colab., 2006, 2008a).

Folosind amorsele specifice CIF/CID şi CIF/CIM (Glasa şi colab., 2002), corespunzătoare genei helicazei, s-a observat obţinerea de produşi PCR numai în cazul amplificării probelor cu setul de primeri CIF şi CID (cu dimensiunea de 962pb). Acest lucru confirmă faptul că izolatele identificate iniţial ca aparţinând suşei PPV-M sunt în realitate PPV-Rec. Dacă s-ar fi obţinut bandă şi cu amorsele CIF/CIM atunci am fi avut o infecţie mixtă cu tulpinile PPV-Rec şi PPV-M. În urma amplificărilor realizate pe toate cele 90 de izolate, doar la probele Cluj 2, 3, 19, 21 nu s-a obţinut bandă cu amorsele CIF/CID. Acest lucru este explicat prin posibila prezenţă a unei mutaţii la nivelul punctului de alipire a amorselor sau să existe o specificitate mai redusă a amorselor CIF/CID pentru aceste izolate.

5.2. Rezultate privind caracterizarea moleculară prin PCR-RFLP a izolatelor

recoltate de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa 5.2.1. Diferenţierea moleculară a tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M prin digestia

enzimatică cu enzima Rsa I Această tehnică moleculară a permis diferenţierea tulpinilor D şi M în multe din studiile

epidemiologice ale PPV-ului iniţiate până la această dată pe plan mondial. Prin digestia enzimatică a produşilor PCR obtinuţi în urma amplificării regiunii C-

terminus a proteinei capsidale, cu ajutorul enzimei de restricţie RsaI, cele două tulpini virale de PPV (PPV-D şi PPV-M), se diferenţiază prin prezenţa sau absenţa situsului de restricţie. În regiunea proteinei capsidale a tulpinei virale PPV-D se găseşte un situs de restricţie pentru enzima RsaI, iar în cazul tulpinii PPV-M acest situs de restricţie lipseşte pentru această enzimă. Totuşi, odată cu identificarea suşei PPV-Rec, această tehnică permite doar o diferenţiere preliminară deoarece tulpinile M şi Rec nu se diferenţiază în regiune CP.

În cazul tulpinii PPV-D, enzima de restricţie RsaI are situs de restricţie, în urma digestiei obţinându-se două fragmente mai mici, cu dimensiunea de 182 pb şi 61 pb. În cazul tulpinii PPV-M enzima RsaI nu are situs de restricţie, produsul PCR cu dimensiunea de 243pb rămâne nedigerat şi apare în gel sub forma unei singure benzi.

Câteva exemple sunt prezentate în figura 7a la probele Cluj 21-25, respectiv Cluj 27-30 unde se observă prezenţa celor trei benzi la dimensiunile de 61pb, 182pb şi 243. În concluzie aceste probe sunt infectate cu ambele tuplini virale ale virusului PPV.

În cazul probei Cluj 26 produsul PCR cu dimensiunea de 243 pb a rămas nedigerat, apărând sub forma unei singure benzi, astfel că proba aparţine tulpinii PPV-M.

În fig. 7b se poate observa că probele Reghin 7-10,21, 24, 25 în urma digestiei enzimatice cu enzima Rsa I şi a migrării în gel de poliacrilamidă, prezintă două benzi la dimensiunea de 61 pb respectiv 182 pb. Acest lucru demonstrează faptul că aceste izolate aparţin tulpinii PPV-D.

Proba Reghin 6 prezintă în urma migrării în gel trei benzi, o bandă de 243 pb nedigerată şi două benzi de dimensiuni mai mici (61 pb şi 182 pb). Aceasta demonstrează că proba Reghin 6 este mixtă, aparţinând tulpinilor PPV-D şi PPV-M. Probele Reghin 22 şi 23 aparţin tulpinii PPV-M deoarece prezintă un singur fragment nedigerat cu dimensiunea de 243 pb.

Din analiza imaginii gelului prezentat în fig. 7c se observă că probele B8, B12-B16, B19 şi B20 prezintă trei fragmente în urma digestiei enzimatice şi migrării în gel de poliacrilamidă (61, 182, 243 pb), aparţinând tulpinilor PPV-D şi PPV-M. Proba B17 prezintă o bandă de 243 pb, deci aparţine tulpinii PPV-M. Proba 18 prezintă două benzi, de 61 şi 182 pb, în consecinţă aparţine tulpinii PPV-D.

23


21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 6 7 8 9 10 21 22 23 24 25 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

353pb

67pb

243 pb

182 pb

61 pb

a b c Fig. 7 a, b, c Analiza produşilor de amplificare digeraţi cu enzima de restricţie Rsa I la

probele C21-30, R 6-10; 21-25, B8, B12-20, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest

5.2.2. Identificarea eventualelor mutaţii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de restricţie al regiunii genei care codifică proteina capsidală

Este cunoscut faptul că, în regiunea care codifică capsida virală există un situs de restricţie pentru enzima de restricţie AluI. Această enzimă se poate utiliza în scopul evidenţierii unei eventuale mutaţii suferite, de tulpinile virale în acest situs.

Dacă virusul a suferit o mutaţie, care poate afecta situsul de restricţie, enzima nu-l recunoaşte şi astfel nu va tăia catenele de ADN obţinute prin RT-PCR. În cazul în care tulpinile virale nu au suferit mutaţii, enzima recunoaşte situsul de restricţie şi taie produsul PCR, obţinându-se astfel două fragmente de dimensiuni mici. Analizele obţinute în urma digestiei enzimatice, folosind enzima AluI, la toate cele 90 de probe analizate, au demonstrat faptul că, tulpinile nu au suferit nici o mutaţie în regiunea proteinei capsidale.

5.3 Rezultate privind diagnosticarea şi diferenţierea serologică a izolatelor cu provenienţa de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila şi Ferma 10) şi SCDP Bistriţa

Diagnosticarea serologică s-a efectuat pentru a evidenţia prezenţa virusului în probe. Toate cele 90 de izolate au fost supuse analizei prin tehnica DASI-ELISA, cu anticorpul policlonal universal 5B-IVIA. În urma analizelor efectuate a reieşit faptul că toate izolatele au fost infectate cu PPV. Diferenţierea serologică s-a efectuat prin aceeaşi metodă serologică, folosind anticorpi monoclonali specifici fiecărei tulpini. Tulpina PPV-D este recunoscută de către anticorpul monoclonal 4DG5 (Cambra şi colab., 1994), iar PPV-M de către AL (Boscia şi colab., 1997).

În urma analizei serologice a celor 30 de izolate de la SCDP Cluj, un număr de 29 (97%) au fost identificate ca aparţinând tulpinii PPV-D iar un izolat (3%) a fost identificat ca aparţinând tulpinii PPV-M (fig. 8a). În figura 8b sunt prezentate procentajele obţinute în urma diferenţierii serologice la izolatele de la Reghin. Probele infectate cu tulpinile PPV-D+PPV-M reprezintă un procent de 7%, cele infectate cu tulpina PPV-M 13%, cele care predomină fiind cele infectate cu tulpina PPV-D (80%).În urma diferenţierii serologice cu anticorpii monoclonali specifici 4DG5 (PPV-D) şi AL (PPV-M) rezultatele în cazul izolatelor de la Bistriţa arată că tulpina PPV-M este dominantă 70%, iar 30% din probe aparţin tulpinii PPV-D (fig. 8c).

24


a b c Fig. 8 a, b, c, Diferenţierea serologică a izolatelor PPV recoltate din cele trei regiuni luate în studiu

Tabel 1 Rezultatele analizelor moleculare şi serologice la probele C1-30 bazate pe diferite regiuni ale PPV-ului Nr Crt

Izolatul

RT-PCR (P1/P2 şi P1/PD sau PM)

Regiunea vizată

PCR-RFLP DASI-ELISA Rsa I

PPV PPV- D

PPV- M

PPV D+M

CP Nib CI PPV D

PPV M

PPV D+M

Alu I PPV D

PPV M

PPV D+M

1 Cluj 1 + + - - D - D + - - + + - - 2 Cluj 2 + + - - D - - + - - + + - - 3 Cluj 3 + + - - D - - + - - + + - - 4 Cluj 4 + + - - D - D + - - + + - - 5 Cluj 5 + + - - D - D + - - + + - - 6 Cluj 6 + + - - D - D + - - + + - - 7 Cluj 7 + + - - D - D + - - + + - - 8 Cluj 8 + + - - D - D + - - + + - - 9 Cluj 9 + + - - D - D + - - + + - - 10 Cluj 10 + + - - D - D + - - + + - - 11 Cluj 11 + + - - D - D + - - + + - - 12 Cluj 12 + + - - D - D + - - + + - - 13 Cluj 13 + + - - D - D + - - + + - - 14 Cluj 14 + + - - D - D + - - + + - - 15 Cluj 15 + + - - D - D + - - + + - - 16 Cluj 16 + + - - D - D + - - + + - - 17 Cluj 17 + + - - D - D + - - + + - - 18 Cluj 18 + + - - D - D + - - + + - - 19 Cluj 19 + + - - D - - + - - + + - - 20 Cluj 20 + + - - D - D + - - + + - - 21 Cluj 21 + + + + D+M Rec - + + + + + - - 22 Cluj 22 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 23 Cluj 23 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 24 Cluj 24 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 25 Cluj 25 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 26 Cluj 26 + - + - M Rec D - + - + - + - 27 Cluj 27 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 28 Cluj 28 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 29 Cluj 28 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 30 Cluj 30 + + + + D+M Rec D + + + + + - - Prin analizarea rezultatelor prezentate în tabelul 1 se observă faptul că toate izolatele testate s-au dovedit a fi infectate cu PPV. Acest fapt confirmă specificitatea perechii de amorse P1-P2 şi arată o excelentă polivalenţă a anticorpului universal 5B-IVIA. Acest fapt este susţinut şi de către Zagrai şi colab. (2008a) prin excelentele rezultate obţinute în privinţa diagnosticării serologice cu acelaşi anticorp universal. Un eşec al anticorpului universal 5B-IVIA a fost

Diferenţiera tulpinilor virale ale izolatelor de la SCDP

Cluj

97%

3%

PPV-D PPV-M

Diferenţierea tulpinilor virale ale izolatelor Reghin

80%

13% 7%

PPV-D PPV-M PPV D+M

Diferenţierea tulpinilor virale ale izolatelor de la

Bistriţa

30%

70%

PPV-D PPV-M

25


raportat în urma unui studiu serologic şi molecular efectuat în Croaţia, prezenţa infecţiei neputând fi confirmată în cazul izolatului Cocanska Rodna (Kajic şi colab., 2008). Aceste probleme au fost raportate de către Matic şi colab. (2006). Din cele şaisprezece izolate analizate serologic, doar jumătate au putut fi diferenţiate (toate au fost diferenţiate molecular). Un caz similar a fost raportat şi de către cercetătorul Candresse şi colab. (1998). Acesta din urmă nu a putut diferenţia serologic 33 de izolate din cele 85 analizate. Izolatele C 21- C25, C 27- C30 s-au dovedit a fi infecţii mixte (D+M) în urma analizării regiunii CP prin RT-PCR şi RFLP. În regiunea (Cter)CP se realizează diferenţierea între tulpinile D şi M. În urma analizelor serologice aceste izolate aparţin doar tulpinii PPV-D. Tulpina PPV-M nu a putut fi detectată în respectivele izolate datorită unei concentraţii reduse a acestei tulpini.

Rezultatele analizelor noastre în ceea ce priveşte diferenţierea tulpinilor D şi M, prezintă o concordanţă a tehnicilor RT-PCR şi RFLP.

Tabel 2 Rezultatele analizelor moleculare şi serologice la probele de la Reghin bazate pe diferite regiuni ale PPV-ului Nr Crt

Izolatul


Regiunea vizată


PPV PPV D

PPV M

PPV D+M

CP Nib CI PPV D

PPV M

PPV D+M

Alu I PPV D

PPV M

PPV D+M

1 Uila 1 + + - - D - D + - - + + - - 2 Uila 2 + + - - D - D + - - + + - - 3 Uila 3 + + - - D - D + - - + + - - 4 Uila 4 + + - - D - D + - - + + - - 5 Uila 5 + + - - D - D + - - + + - - 6 Reghin 1 + + - - D - D + - - + + - - 7 Reghin 2 + + - - D - D + - - + + - - 8 Reghin 3 + + - - D - D + - - + + - - 9 Reghin 4 + + - - D - D + - - + + - - 10 Reghin 5 + + - - D - D + - - + + - - 11 Reghin 6 + + + + D+M Rec D + + + + + + + 12 Reghin 7 + + - - D - D + - - + + - - 13 Reghin 8 + + - - D - D + - - + + - - 14 Reghin 9 + + - - D - D + - - + + - - 15 Reghin 10 + + - - D - D + - - + + - - 16 Reghin 21 + + - - D - D + - - + + - - 17 Reghin 22 + - + - M Rec D - + - + - + - 18 Reghin 23 + - + - M Rec D - + - + - + - 19 Reghin 24 + + - - D - D + - - + + - - 20 Reghin 25 + + - - D - D + - - + + - - 21 Reghin 26 + - + - M Rec D - + - + - + - 22 Reghin 27 + + - - D - D + - - + + - - 23 Reghin 28 + + - - D - D + - - + + - - 24 Reghin 29 + - + - M Rec D - + - + - + - 25 Reghin 30 + + + + D+M Rec D + + + + + + + 26 Reghin 31 + + - - D - D + - - + + - - 27 Reghin 32 + + - - D - D + - - + + - - 28 Reghin 33 + + - - D - D + - - + + - - 29 Reghin 34 + + - - D - D + - - + + - - 30 Reghin 35 + + - - D - D + - - + + - -

Regiunea (Cter)CP a fost analizată cu setul de amorse P1-P2, astfel că rezultatele au fost

pozitive, prin urmare toate izolatele U1-R35 au prezentat infecţie cu Plum pox. Pentru a putea diferenţia tulpinile PPV-D şi PPV-M am analizat aceeaşi regiune CP, dar

cu amorse specifice celor două tulpini: P1-PD şi P1-PM. Rezulatele ne indică o dominare a infecţiei izolatelor cu tulpina PPV-D.

26


Cercetările efectuate de Zagrai şi colab. (2009) pe 100 de izolate, din care 17 au fost recolate din zona Reghin, demonstrează faptul că predomină tulpina PPV-D. În ceea ce priveşte diferenţierea pe tulpini a virusului se observă o predominare a tulpinii PPV-D, confirmată prin cele trei tehnici, RT-PCR, PCR-RFLP şi DASI-ELISA.

Izolatele detectate ca aparţinând tulpinii PPV-Rec prin analize moleculare sunt diferenţiate ca PPV-M în urma analizelor serologice cu anticorpul monoclonal specific.

Tabel 3 Rezultatele analizelor moleculare şi serologice la probele B1-B30 bazate pe diferite

regiuni ale PPV Nr Crt

Izolatul


Regiunea vizată


PPV

PPV- D

PPV- M

PPV D+M

CP Nib CI PPV D

PPV- M

PPV D+M

Alu I PPV D

PPV- M

PPV D+M

1 Bistriţa 1 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 2 Bistriţa 2 + - + - M Rec D - + - + - + - 3 Bistriţa 3 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 4 Bistriţa 4 + - + - M Rec D - + - + - + - 5 Bistriţa 5 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 6 Bistriţa 6 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 7 Bistriţa 7 + + - - D - D + - - + + - - 8 Bistriţa 8 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 9 Bistriţa 9 + + - - D - D + - - + + - - 10 Bistriţa 10 + + - - D - D + - - + + - - 11 Bistriţa 11 + + - - D - D + - - + + - - 12 Bistriţa 12 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 13 Bistriţa 13 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 14 Bistriţa 14 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 15 Bistriţa 15 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 16 Bistriţa 16 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 17 Bistriţa 17 + - + - M Rec D - + - + - + - 18 Bistriţa 18 + + - - D - D + - - + + - - 19 Bistriţa 19 + + + + D+M Rec D + + + + + - - 20 Bistriţa 20 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 21 Bistriţa 21 + + - - D - D + - - + + - - 22 Bistriţa 22 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 23 Bistriţa 23 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 24 Bistriţa 24 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 25 Bistriţa 25 + + - - D - D + - - + + - - 26 Bistriţa 26 + + - - D - D + - - + + - - 27 Bistriţa 27 + - + - M Rec D - + - + - + - 28 Bistriţa 28 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 29 Bistriţa 29 + + + + D+M Rec D + + + + - + - 30 Bistriţa 30 + + + + D+M Rec D + + + + - + - Diferenţierea moleculară a tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M s-a realizat prin analizarea regiunii (Cter)CP cu două perechi de amorse. Cu setul de amorse P1-PD s-au efectuat amplificări pentru a putea fi evidenţiate izolatele infectate cu tulpina D a virusului Plum pox. Aceleaşi amplificări s-au efectuat şi cu setul de amorse P1-PM pentru evidenţierea izolatelor ce aparţin tulpinii PPV-M. Rezultatele obţinute demostrează o concordanţă între tehnicile RT-PCR şi RFLP, infecţiile mixte(D+Rec) fiind cele care predomină. Izolatele B1, B3, B5-6, B8, B12-16, B20, B22-24, B28-30 s-au dovedit a fi infecţii mixte (D+M) în urma analizării regiunii CP prin RT-PCR şi RFLP. În regiunea (Cter)CP se realizează diferenţierea între tulpinile D şi M. În urma analizelor serologice aceste izolate aparţin doar tulpinii PPV-M. Tulpina PPV-D nu a putut fi detectată în respectivele izolate datorită unei

27


concentraţii reduse a acestei tulpini. Izolatul B19 a fost diagnosticat ca fiind mixt (D+M) prin analize moleculare, iar prin cele serologice s-a dovedit a fi D. Tulpina M un a putut fi detectată serologic în acest izolat din aceleaşi motive de concentraţie redusă. Acest fapt a fost raportat şi de către Zagrai şi colab. (2008), unde izolatele Dumitra 10, Mihaieşti 3 s-au dovedit a fi infectate cu tulpinile D+M prin diferenţiere moleculară şi să fie diagnosticate ca fiind M-uri prin analizele serologice.

CAPITOLUL VI CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI

• Cercetările noastre au permis obţinerea unor date privind variabilitatea serologică şi

moleculară a izolatelor virusului Plum pox în cele trei regiuni luate în studiu, respectiv Cluj, Reghin şi Bistriţa.

• Cunoaşterea variabilităţii acestui virus este o condiţie esenţială în elaborarea strategiilor de eradicare sau limitare a impactului acestuia, având în vedere pagubele uriaşe produse în culturile de prun din ţara noastră.

• Studiul variabilităţii serologice şi moleculare a virusului Plum pox s-a efectuat pe un număr de 90 de izolate PPV recoltate din 3 livezi comerciale cu infecţie mare cu PPV, din Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei.

• Infecţiile au fost confirmate în totalitate prin diagnostic serologic (5B-IVIA) şi molecular (P1/P2).

• Tehnica serologică DASI-ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect - Enzyme Linked Immunosorbent Assay) a permis diferenţierea tulpinilor D şi M pe baza antiserurilor monoclonale specifice.

• Succesul ei în cazul probelor analizate s-a bazat pe următoarele atuuri: acurateţe, specificitate, robusteţe, simplicitate şi cost redus.

• Tehnica moleculară RT-PCR a permis analizarea a trei regiuni genomice ale PPV-ului, şi anume:(i) (Cter)CP, folosind perechile de amorse P1/PD şi P1/PM care disting tulpinile PPV-D şi PPV-M; (ii) (Cter)Nib - (Nter)CP folosind perechea de amorse mD5/mM3 care detectează direct o tulpină recombinată dintre D şi M, denumită PPV-Rec; CI, folosind seturile de primeri CIf/CID sau CIf/CIM pentru a confirma prezenţa tulpinii PPV-Rec.

• Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M în regiunea (Cter)CP s-au dovedit a fi PPV-Rec în regiunea (Cter) Nib – (Nter)CP.

• Prin tehnicile RFLP şi DASI-ELISA nu s-a putut face o diferenţiere între tulpinile virale PPV-M şi PPV-Rec.

• Toate cele trei tehnici utilizate în prezentul studiu au condus la observarea unei variabilităţi între tulpinile virale din cadrul populaţiei locale a virusului Plum pox.

• Rezultatele noastre prezintă o rată a infecţiei cu PPV foarte ridicată şi o situaţie critică în care se găsesc livezile de prun din punctul de vedere al infecţiilor cu virusul Plum pox, în regiunile studiate.

• Diferenţierea şi distribuţia izolatelor arată că în regiunile Cluj şi Reghin predomină tulpina PPV-D, cu cel mai mare procentaj la Reghin (80%), iar la Bistriţa predomină infecţiile mixte (60%). Tulpina PPV-Rec este predominantă în regiunile Reghin şi Bistriţa cu acelaşi procentaj de 13%.

28


RECOMANDĂRI

Cunoaşterea distribuţiei tulpinilor virale pe regiuni pomicole va fi foarte utilă viitoarelor programe de ameliorare a rezistenţei genetice la PPV, deoarece reacţia genotipurilor la infecţiile virale este diferită de la o tulpină virală la alta.

Rezultatele obţinute pot avea un rol tehnic şi economic în viitoarele strategii de combatere a acestui virus, în cultura prunului din România.

Din punct de vedere tehnic, metodele de detecţie şi diferenţiere a izolatelor pot fi utilizate: în laboratoarele de carantină fitosanitară, garantând circulaţia materialului săditor liber de boli virotice; în pepiniere, astfel asigurându-se producerea materialului săditor pomicol liber de viroze.

Din punct de vedere economic, cunoaşterea distribuţiei tulpinilor PPV va permite elaborarea de strategii de eradicare sau limitare a virusului PPV, care vor conduce la revigorarea culturii prunului şi la creşterea competitivităţii pe plan extern.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. ATANASOFF, D., 1932, Plum pox. A new virus disease. Yearbook University of

Sofia, Faculty of Agriculture, 11, 49-69. 2. BOSCIA, D., H. ZERAMDINI, M. CAMBRA, O. POTERE, M.T. GORRIS, A.

MYRTA, 1997, Production and characterization of a monoclonal antibody specific to the M serotype of plum pox potyvirus. European Journal of Plant Pathology 103, 447-480.

3. CAMBRA, M., M. ASENSIO, M.T. GORRIS, E. PEREZ, E. CAMARASA, J.A. GARCIA, J.J. MOYA, D. LOPEZ-ABELLA, C. VELA, A. SANZ, 1994, Detection of plum pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 569-577.

4. CAMBRA, M., M.T. GORRIS, N. CAPOTE, M. ASENSIO, M.C. MARTÍNEZ, E. BERTOLINI, C. COLLADO, A. HERMOSO DE MENDOZA, E. MATAIX, A. LÓPEZ, 2004, Epidemiology of Plum pox virus in Japanese plums in Spain. Acta Horticulturae, no. 657, 195–200.

5. CERVERA, M.T., J.L. RIECHMANN, M.T. MARTIN, J.A. GARCIA, 1993, 3’-Terminal sequence of the Plum pox virus PS and o6 isolates: evidence for RNA recombination within the potyvirus group. Journal of General Virology 74, 329-340.

6. CHRISTOFF, A., 1934, Mosaikkrankheit oder Viruschlorose, bei Apfeln. Eine neue Viruskrankheit. Phytopath. Z. 7, 521-536.

7. CREE, L.A., 1999, Le potyvirus de la Sharka du prunier. Agence canadienne d’inspection des aliments, 183-190.

8. CRESCENZI, A., L. D’AQUINO, S. COMES, M. NUZZACI, P. PIAZZOLLA, A. HADIDI, 1996, Further caracterisation of sweet cherry isolate of plum pox potyvirus. Proc. Middle Eur. Meet ’96 Plum pox, Budapesta, 99-103.

9. CRESCENZI, A., M. NUZZACI, L. LEVY, P. PIAZZOLLA, A. HADIDI, 1997, Infezioni di sharka su ciliegio dolce in Italia meridionale. Informatore Agrario, 34, 73-75.

10. DAMSTEEGT, V.D., H.E. WATERWORTH, G.I. MINK, W.E. HOWELL, L. LEVY, 1997, Prunus tomentosa as a diagnostic host for the detection of plum pox virus and other Prunus viruses. Plant Disease, 81, 329-332.

11. DOSBA, F., P. MAISON, M. LANSAC, G. MASSONIE, 1987, Experimental transmission of plum pox virus (PPV) to Prunus mahaleb and Prunus avium. Journal of Phytopathology 120, 199–204.

29


12. FESTIC, H, 1978, Investigation of new sharka virus hosts. Acta Horticulturae No. 74, 233-240.

13. GLASA, M., V. MARIE-JEANNE, G. LABONNE, Z. SUBR, O. KUDELA, J.B. QUIOT, 2002, A natural population of recombinant plum pox virus is viable and competitive under field conditions. European Journal of Plant Pathology 108, 843-853.

14. GLASA, M., L. PALKOVICS, P. KOMINEK, G. LABONE, S. PITTERNOVA, O. KUDELA, T. CANDRESSE, S. SUBR, 2004, Geographically and temporally distant natural recombinant isolates of Plum pox virus (PPV) are genetically very similar and form a unique PPV subgroup. Journal of General Virology, 85, 2671 – 2681.

15. JAMES, D., A. VARGA, D. THOMSON, S. HAYES, 2003, Detection of a New and Anusual Isolate of Plum pox virus in Plum (Prunus domestica). Plant Disease, 1119 – 1124.

16. JAMES, D., A. VARGA, 2004, Preliminary Molecular Characterization of Plum pox potyvirus isolate W3174: Evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657, 177-182.

17. KAJIC, V., S. CERNI, M. KRAJACIC, I. MIKEC, D. SKORIC, 2008, Molecular typing of Plum pox virus isolates in Croatia. Journal of Plant Pathology 90 (1), 9-13.

18. KALASHYAN J.A., N.D. BILKEY, T.D. VERDEREVSKAYA, E.V. RUBINA, 1993, Detection of plum pox virus in sour cherry from Moldova. Conference sur la Sharka, Bordeaux, 39.

19. KALASHYAN, J.A., N.D. BILKEJ, T.D. VERDEREVSKAYA, E.V. RUBINA, 1994, Plum pox virus on sour cherry in Moldova. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 645–649.

20. KEGLER, H., W. HARTMAN, 1998, Present status of controlling conventional strains of plum pox virus. Plant Virus Disease Control, 616-628.

21. KERLAN C., J. DUNEZ, 1976, Some properties of plum pox virus and its nucleic acid protein components. Acta Horticulturae 67, 185-192.

22. KERLAN, C., J. DUNEZ, 1979, Diferenciation biologique et serologique des souches du virus de la Sharka. Annales de Phytopat., 11, 241-250.

23. LEVY, L., V. DAMSTEEGT, R. WELLIVER, 2000. First report of plum pox virus (Sharka Disease) in Prunus persica in the United States. Plant Diseases, 84, 202.

24. LLÁCER, G., M., CAMBRA, A. LAVIÑA, 1985, Detection of plum pox virus in Spain. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 15, 325–329.

25. LLÁCER, G., M., CAMBRA, 1986, Occurrence of plum pox virus in Spain in a new natural host: Prunus salicina Lindl (Japanese plum). Plant Disease 70 (2), 17.

26. LOURNO, D, L. MONTE CORVO, 1986, Occurrence of sharka in Portugal. Acta Horticulturae No 193, 183-187

27. MATIC, S., M. AL-RWAHNIH, A. MYRTHA, 2006, Diversity of Plum pox virus in Bosnia and Herzegovina. Journal of Plant Pathology 55, 11-17.

28. MINOIU, N., 1997, Bolile si daunatorii prunului. Prunul. Ed. Conphys, 343-374. 29. MYRTA, A., O. POTERE, D. BOSCIA, T. CANDRESSE, M. CAMBRA, V.

SAVINO, 1998, Production of a monoclonal antibody specific for El Amar strain of plum pox virus. Acta Virologica 42, 248-250.

30. NEMCHINOV, L., A. CRESCENZI, A. HADIDI, P. PIAZZOLLA, T. VERDEREVSKAYA, 1998, Present status of the new cherry subgroup of plum pox virus (PPV-C). In: Hadidi, A., Khetarpal, R.K., and H. Koganezawa. Plant Virus Disease Control. APS Press, St. Paul, 629-638.

31. NEMETH, M., 1986, Virus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Akad. Kiado, Budapest, 25-152.

32. NEMETH. M., 1994, History and importance of plum pox in stone-fruit production. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 525-536.

30


31

33. OLMOS, A., M. CAMBRA, M. A. DASI, T. CANDRESSE, O. ESTEBAN, M.T. GORRIS, M. ASENSIO, 1997, Simultaneos detection and typing of plum pox potyvirus (PPV) isolates by heminested-PCR and PCR-RFLP. Journal of Virological Methods 68, 127-137.

34. POLAK, J., I. OUKROPEC, P. KOMINEK, B. KRSKA, M. BITTOOVA, 1997, Detection and evaluation of apricot and peaches to plum pox virus- progress in the Czech Republic. Proc. Middle Eur. Meet `96 Plum Pox, Budapesta, 1996, 68.

35. RANKOVIC, M, I. DULIC-MARKOVIC, 1992, Evaluation of Prunus spinosa L as host of sharka and other viruses. Acta Horticulturae No 309, 151-156

36. ROY, A.S., I.M. SMITH, 1994 Plum pox situation in Europe. Bull. 24, 515- 523. 37. SERCE, C.U., T. CANDRESSE, L. SVANELLA-DUMAS, L. KRIZBAI, M.

GAZEL, K. CAGLAYAN, 2009, Further characterization of a new recombinant group of Plum pox virus isolates, PPV-T, found in orchards in the Ankara province of Turkey. Virus Res, 142, 121-126. 38. SUBR, Z., S. PITTNEROVA, M. GLASA, 2004, Asimplified RT-PCR- based detrection of recombinant plum pox virus isolates. Acta Virologica 48, 173-176.

39. THAKUR, P.O., S.W. BHARAWAJ, I.D. GARG, K. KHOSLA, D.R. SHARMA, 1994, Plum pox virus on stone fruits from India. A new record. Plant. Dis. 9, 100-102.

40. WETZEL T., T. CANDRESSE, M. RAVELONANDRO, R.P. DELBOS, H. HAZIAD, A.E. ABOUL-ATA, J. DUNEZ, 1991a, Nucleotide sequence of the 3’- terminal region of the RNA of the El Amar strain of plum pox potyvirus. Journal of General Virology 72, 1741-1746.

41. WETZEL, T., T. CANDRESSE, M. RAVELONANDRO, J. DUNEZ, 1991b, A polymerase chain reaction as say adapted to plum pox virus detection. Journal of Virological Methods 33, 355-365.

42. WOROBEY, M., E.C. HOLMES, 1999, Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. Journ. Gen. Virol. 80, 2535 – 2543.

43. ZAGRAI, I., A. MAXIM, ZAGRAI LUMINIŢA, GABOREANU IOANA, A. RAICA, 2005, Serological and Molecular Detection and Differentiation of Plum pox virus isolates in Bistriţa Area, Lucrările Ştiinţifice ale USAMV Iasi, Seria Horticultură, Anul XLVIII, vol. 48, ISSN 1454-7376, 1297-1302. 44. ZAGRAI, I., IOANA GABOREANU, BEATRICE FERENCZ, LUMINIŢA ZAGRAI, D. PAMFIL, O. POPECU, M. RAVELONANDRO, N. CAPOTE, KATALIN KOVACS, 2006, First detection and molecular caracterization of Plum Pox Virus recombinant stain in Romania. Buletin USAMV-CN 62, 291-298.

45. ZAGRAI, I., N. CAPOTE, M. RAVELONANDRO, M. CAMBRA, ZAGRAI LUMINIŢA, R. SCORZA, 2008, Plum pox virus Silencing Of C5 Transgenic Plums Is Stable Under Challenge Inoculation With Eterologous Viruses. Journal of Plant Pathology ,90 (1), 63-71. 46. ZAGRAI LUMINIŢA, I. ZAGRAI, BEATRICE FERENCZ, IOANA GABOREANU, KATALIN KOVACS, IOANA PETRICELE, O. POPESCU, D. PAMFIL, N. CAPOTE, 2008a, Serological and molecular typing of Plum pox virus isolates in the north of Romania. Journal of Plant Pathology 90 (1), 41-46.

47. ZAGRAI, I., LUMINIŢA ZAGRAI, LIGIA ION, 2009, The response of different Prunus genotypes to D and Ree Strains of Plum pox vurus. Bulletin USAMV, no. 66 (1-2)

48. *** http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm 49. *** OEPP/ EPPO, 1983, Data sheets on quarantine organisms. Plum pox virus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 13, 1–7.

http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE,

CLUJ-NAPOCA FACULTY OF HORTICULTURE

Eng. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN

SEROLOGICAL AND MOLECULAR

VARIABILITY OF SOME PLUM POX VIRUS

ISOLATES FROM TRANSYLVANIAN FRUIT

CENTRAL AREA (SUMMARY OF THE Ph.D. THESIS)

Scientific coordinator:

Prof. univ. dr. Doru Pamfil

CLUJ-NAPOCA

2010


SUMMARY

INTRODUCTION

Plum Pox virus (PPV) is the most destructive viral pathogen of stone species and is responsible for a serious loss of production particularly for susceptible varieties. This virus is very dangerous because it reduces the quality and causes the premature fall of fruits. Therefore, PPV is considered one of the main factors that makes the plum crop to be considered no longer profitable. The virus has gradually spread to most of Europe, around the Mediterranean basin and Middle East. Also, the virus was found in India and America (Chile, USA, Canada). In Romania, Plum pox virus is prevalent in virtually all areas of the plum crop, causing a significant loss of production particularly for some susceptible varieties. (Minoiu, 1997).

The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) - 1975 proposed two lists of quarantine viruses for fruit trees. The most important virus, which is the subject to quarantine fruit trees is Plum Pox Virus. He is also considered a highly dangerous virus by the Inter-African Plants, and by the North American Plant Protection and is the subject of some regulations in Australia and USA (Cree, 1999).

So far, seven strains were identified and characterized: D strain (Dideron) isolated for the first time from apricot in Southeastern of France, M strain (Marcus) identified for peach in northern Greece (Kerlan and Dunez, 1979, Myrtle et al ., 1998), EA (El Amar) strain described for apricot in Egypt (Wetzel et al., 1991), SOC (sour cerry) strain detected in Moldova (Kalashyan et al., 1993), SwC (sweet cerry) stain identified in Italy (Crescenzi et al., 1996). PPV-Rec (name proposed and accepted) resulted from the recombination of the two major strains(D and M), the highlight being reported recently in Albania, Bulgaria, Czech Republic, Germany, Hungary and Slovakia (Glasa et al., 2004) and Romania (Zagrai et. al., 2006, 2008, 2009). The last PPV strain described is Winona (PPV-W) from Canada (James and Varga,2004), which is genetically distinct from all other viral strains known to date (James and Varga, 2005). First report on natural infection of plum recombined strain PPV-Rec in Romania was presented in 2006. All isolates initially identified as PPV-M strains were found belonging to PPV-Rec strain following molecular analysis. Also, following sequencing of the PCR (Polymerase Chain Reaction) corresponding regions (Cter) CP and (Cter) NIB - (Nter) CP proved that nucleotide alignments correspond to those of Gene Bank, reported by Glas et al., in 2002 and 2004 (Zagrai et al., 2006). Genetic similarity with other PPV-Rec strains suggests a common evolutionary origin. (Zagros et al., 2006, 2008).

Recent studies performed on 16 isolates from Turkey led to the identification of new viral strains. Their sequencing has led to an observation point in region recombinant virus HC-Pro, at position 1566 of the viral genome. The Turkish researchers proposed that this new recombined strain to be appointed as PPV-T (Turkey) (Serce et al., 2009).

Thanks to modern methods of characterization of PPV viral isolates, it is known that two strains are most common, (PPV-D) and (PPV-M) (Bousolem et al., 1994). PPV-D, widely spread in Western Europe, is non-seed transmitted, difficult to be transmitted to experimental hosts and the vector spread was effectively reduced (Levy et al., 2000). Unlike PPV-D, PPV-M spread through the seed of necrotic strains (PPV_M) was reported by Nemeth and Koelber in 1983. Also, it can be easily transmitted through afids. (Levy et al., 2000).

Although PPV is widespread in all plum growing areas from Romania, limited information about the occurrence of PPV strains are available. A recent study performed in Transylvania revealed that PPV-D is the prevalent strain followed by PPV-Rec and the mixed infections (PPV-D + PPV-Rec) (Zagrai et. al., 2008, 2009).

33


RESEARCH OBJECTIVES

The differentiation of symptoms for the two strains (D and M) is quite difficult. The

manifested symptoms for both strains include clorotice spots on leaves and mosaics, ring spots on fruit surface, which subsequently turn into necrosis. The symptoms caused by PPV-D strain are generally less severe compared with those associated with PPV-M strain. (Damsteeg et al., 1997).

The serological and molecular characterization for the collected PPV isolates pursued the following objectives:

• Identification of the infection source and harvesting of PPV isolates from plum which have the typical symptoms of the virus

• Extraction of RNA from symptomatic plum leaves • Performing the molecular diagnostics for establishing the presence of the virus by using

polyvalent primers • Differentiation of viral strains by using specific primers • Differentiation of viral strains by using PCR-RFLP analysis • Performing the serological diagnosis to establish the presence of the virus by using

Dasi-ELISA • Differentiation of viral strains PPV-D and PPV-M by using Dasi-ELISA

MATERIALS AND METHODS

Biological material

Ninety PPV isolates were collected from three fruit-growing centers from Transylvania, namely: Fruit Research and Development Station Cluj (SCDP Cluj 30-isolates), Fruit Research and Development Station Bistrita (Bistrita-30 isolated SCDP) and the Reghin area (Farm Uila and Farm 10-30 isolated). Identification of infections and selection of infected trees has been done based on of PPV typical symptoms. Then the leaf samples with obvious symptoms were taken from different parts of the crowns of trees with generalized infection (PPV infection rate from 20%) and analyzed by using molecular and serological tests.

ARN extraction For the ARN extraction it was used the usual procedure, deshydration and tissue crushing

them under liquid nitrogen, to a fine powder and tissue resuspendation in a reaction buffer that protects the RNA which is released from cells. Extraction of total RNA from leaf plum tree was done using the kit extraction Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen). The protocol used for this procedure was the one recommended by the manufacturer and the provided for the crossing of ten steps.

Serological and molecular detection The serological diagnosis has been made by using DASI-ELISA technique and the 5B-

IVIA polyclonal antibody . For viral diagnosis primers pair P1/P2 was used, which was designed to amplify a

fragment of 243 bp region corresponding to C-terminus of the protein capsid. With Qiagen One-Step RT-PCR kit we could perform both, reverse transcription (RT) and amplification (PCR) in a single reaction. Thermal cycles required for RNA reverstranscription and amplification of DNA fragments were performed in the Corbett Research thermocycler, optimized as follows: RT- 40 min at 500C, activating polymerases- 15 min at 950C followed by 35 cycles: denaturation- 1 min at 940 C, primer annealing – 45 s at 610 C and DNA elongation – 1 min at 720 C. Amplified DNA was elongated for 10 min at 720 C. Amplified products (10 µl + 2 µl loading dye) were

34


fractionated onto 1.4% agarose gel electrophoresis in 1 x TAE buffer. Bands were visualized by ethidium-bromide staining under UV light.

Serological and molecular differentiation Serological differentiation was performed by the same serological method using speciffic

monoclonal antibodies for each strain. PPV-D strain was recognized by using the monoclonal antibody 4DG5 (Cambra et al., 1994) and PPV-M by using AL (BOSCOS et al., 1997).

Molecular strain differentiation was done by RT-PCR targeting three genomic regions : (Cter) CP- using the primers pair P1/PD and P1/PM which was useful to distinguish PPV-D and PPV-M strain; (Cter) Nib/(Nter) CP by using the primers pair mD5/mM3 that detected a natural recombination between D and M (PPV-Rec)(Glasa et al., 2004); CI, using CIF/CID and CIF/CIM primers pair to confirm the presence of PPV-Rec. Reverse-transcription and amplification was performed with Qiagen One-Step RT-PCR kit. The amplification conditions were the same as those described above, except the temperature for the primers attachment, which was 60oC for CIF-CID/CIM primers and 470C for md5-mM3 primers.

PCR products corresponding to (Cter) CP were analyzed with RFLP in order to distinguish the D and M strains based on Rsa I polymorphism located in this genomic section. Digested products were fractionated onto 8% polyacrylamide gel electrophoresis in 1 x TAE buffer and photographed under UV light.

RESULTS AND DISCUSSION Similar results were obtained for the differentiation of PPV isolates by RT-PCR using PD and PM specific primers, and by RFLP using Rsa I restriction enzyme which is laso useful to distinguish PPV-D and PPV-M strains for Plum pox virus.

From 30 isolates collected from SCDP Cluj, a total of 20 (67%) belong to PPV-D strain, 9 (30%) isolates are mixed infections belonging to D and M strain (D + M) and one isolate belongs to PPV-M strain (3%).

Concerning the molecular differentiation of isolates from Reghin, 2 (7%) isolates were identified as mixed infection (D + M), 4 (13%) isolates belonging to PPV-M strain and the rest of 24 (80%) are related to PPV-D strain.

The results obtained using samples from SCDP Bistrita are the following: from 30 isolates, a total of eight (27%) belong to PPV-D strain, 18 (60%) are mixed infections, belonging to both strain, D and M, and four isolates belong only to PPV-M strain (13%).

The serological differentiation was been made by DASI-ELISA using D and M monoclonal antibodies.

The serological analysis of the 30 isolates from SCDP Cluj show that 29 (97%) were identified as belonging to PPV-D strain and 1 isolate (3%) was identified as belonging to PPV-M strain).

The results obtained by serological differentiation of the isolates from Reghin area are: samples infected with PPV-D+PPV-M strains represent 7%, the PPV-M strain infected 13% of the samples and the predominant infection is attributed to PPV-D strain (80%).

Following serological differentiation with specific monoclonal antibodies 4DG5 (PPV-D) and AL (PPV-M), the results for isolates from Bistrita show that PPV-M strain is predominant and covers about 70% of the samples and the rest 30% of the samples are attributed to PPV-D strain infection.

All PPV isolates differentiated as PPV-M in the genomic region corresponding to (C-ter)CP, proved to be PPV recombinant (PPV-Rec) when the molecular analysis was performed in the region corresponding to NIb/CP. By using specific primers to distinguish the two strains D

35


36

and M in CI region only fragments belonging to PPV-D were detected. This infomation confirmed the presence of PPV-Rec. CONCLUSIONS

Our research allowed to obtain data concerning the serological and molecular variability of Plum pox virus isolates in the three studied regions, namely Cluj, Bistrita and Reghin.

To know the variability of this virus is essential to develop appropriate strategies to eradicate or limit its impact, given the huge plum crops losses that are a reality in our country.

The study focused on the Plum pox virus serological and molecular variability was done on a total of 90 PPV isolates collected from three commercial orchards infected with PPV that are included in the Fruit Central Basin of Transylvania.

Our results provide a very high PPV infection rate and a critical situation for the plum orchards located in the studied regions.

The differentiation and distribution of isolates indicates that the predominant strain is PPV-D for Reghin area and Cluj, with the highest percentage being found in Reghin, respectively 80%. Also, in Bistrita mixed infections are predominant with a procentage of 60 %.PPV-Rec strain has a higher percentage in Reghin and Bistrita (13%).

RECCOMANDATIONS

Knowing the distribution of viral strains according to fruit region will be very useful for future programs to improve genetic resistance to PPV, as genotype response to viral infection is different from one viral strain to another.

The detection different methods of isolates can be used in plant quarantine laboratories, ensuring the circulation of virus free seedlings; in nursery and thus ensuring the production of virus free fruit-growing seedlings.

The information obtained in this research work is essential for developing some useful strategies to eradicate or limit the spread of PPV virus. Also, it is hoped that all these strategies will lead to a revival of plum tree culture and external competitiveness.

variabilitatea serologicĂ Şi molecularĂ a unor … · 5.2. rezultate privind caracterizarea...

Documents