TEHNICA PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION )

Tehnica PCR sau reacia n lan a polimerazei, dezvoltat la mijlocul anilor 80, a revoluionat genetica molecular, fcnd posibil studierea i analizarea genelor prin metode mult mai accesibile i foarte simple. Aceast tehnic a fost pus la punct de Kary Mullis n anul 1983, plecnd de la caracteristicile replicrii ADN i anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizeaz o caten a ADN ca matri pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin aceast tehnic se produc un numr enorm de copii a unor secvene de ADN (gene) fr a se apela la clonare (Vlaic A. i colab., 1997). Tehnica PCR exploateaz unele caracteristici ale replicrii ADN, unde pentru amplificarea secvenei de ADN dorite se utilizeaz o secven de oligonucleotide numit primer sau amors. Primerii sunt secvene scurte de 15 35 nucleotide, complementare capetelor 3 ale secvenei de ADN ce se dorete a fi amplificat; ei sunt specifici fiecrei gene i sunt sintetizai cu ajutorul unor sintetizatoare automate de ADN. Pentru amplificarea secvenelor specifice de ADN, prin tehnica PCR, se folosete o soluie tampon (PCR buffer) n care se introduce ADN ce conine gena de interes, primerii sintetizai, Taqpolimeraza i cele patru tipuri de deoxinucleotid-trifosfai (dATP, dGTP, dCTP i dTTP). Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, ntr-un aparat n care realizarea ciclurilor termice este controlat automat de Termocycler: 1. Denaturarea ADN, presupune nclzirea soluiei n care se afl ADN la 940C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea legturilor de hidrogen i separarea celor dou catene. 2. Ataarea primerilor se realizeaz prin rcirea la 40 600C a soluiei n care se afl secvena de amplificat. Primerii se leag la capetele 3 a celor dou catene de ADN ale genei pe care dorim s o amplificm. De obicei, este nevoie de doi primeri numii sens i antisens, dar amplificarea se poate realiza i cu un singur primer, n cazul tehnicii PCR ancorat. 3. Elongaia se produce la temperatura de circa 720C, temperatur la care Taqpolimeraza funcioneaz optim, n faza de extensie, iar ciclul se repet de 25 40 ori. Amplificarea este aproximativ exponenial, realizndu-se dup 3 cicluri 2 copii, dup 10 cicluri 256 copii, iar dup 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenei supuse amplificrii. (Vlaic A. i colab.,1997). Dup amplificare, gena de interes se vizualizeaz n lumin ultraviolet, la nivelul gelului de agaroz n care fragmentele au fost colorate cu bromur de etidiu. Dac amplificarea s-a produs, n gel se vor observa una sau mai multe benzi, corespunztoare secvenei specifice de ADN. n tehnica PCR, alegerea primerilor este primordial i putnd fi utilizai dou tipuri de primeri: primeri specifici - sunt dirijai spre un situs foarte precis al ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene cunoscute. Prin primer specific se nelege o secven cunoscut de ADN utilizat pentru nceperea sintezei unei anumite gene, cu structur cel puin parial cunoscut. Primeri specifici pot fi dirijai i spre regiunile situate n amonte sau aval de secvenele unice, la nivelul secvenelor minisatelit (Edwards A., i colab., 1991) sau microsatelit (Hubert R., i colab.,1989). Secvenele de tip satelit, specifice fiecrui individ sunt astfel amplificate. Evidenierea acestor polimorfisme se utilizeaz n momentul de fa n medicina criminalistic pentru identificarea suspecilor, pornind de la diferite mostre de esut (snge, sperm, bulbi de pr etc.), pentru marcarea crnii, sau altfel spus, urmrirea ei pe parcursul filierei de distribuie i consum. (Fabrice D., i colab.,2002). primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (10 20 perechi baze, n medie). Alegerea secvenelor care constituie aceti primeri este complet arbitrara.