patogenitate si virulenta

29.11.2010

Relaţii microorganism - gazdă

Patogenitate şi virulenţă

Relaţii microorganism-gazdă


• Primele interrelaţii şi mecanisme

• Flora microbiană normală

• Principalele relaţii stabilite

• Definiţii

• Mecanisme

• Factori de patogenitate bacterieni

• Bariere protective

Relaţii microorganism-gazdă• intra-uterin

• post-natal

• mecanisme utile

– interferenţă (nutrienţi)

– tropism (receptori)

– bacteriocine

– diferiţi metaboliţi (ex. AG)

– stimulare RI (MHC II) etc

ATENŢIE LA ANTIBIOTICE !

MAI ALES AB CU SPECTRU LARG !!!



– la nivelul tegumentar

– la nivel nazal

– la nivel bucal şi faringian




stafilo alb, difteroizi aerobi, coliformi, stafilo auriu

– la nivel nazal






– la nivel nazal

stafilo, streptococi, corynebacterii, pneumococi






– la nivel nazal

stafilo, streptococi, corynebacterii, pneumococi


coci şi bacili gram-pozitivi şi gram-negativi, aerobi şi

anaerobi (ex. 1 ml salivă = 100.000.000 bacterii)



– la nivelul tractului digestiv

ex. colon adult (enterobacterii / anaerobi : 1 / 100)

– la nivel vaginal



– la nivelul tractului digestiv

ex. colon adult (enterobacterii / anaerobi : 1 / 100)

– la nivel vaginal

lactobacili, coci g+ g-, clostridii


• Principalele inter-relaţii

– simbioză

– comensalism

– parazitism

Relaţii microorganism-gazdă• Principalele inter-relaţii

– simbiozăex. coliformi intestinali / lactobacili la nivel vaginal

– comensalism

echilibru instabil / microorganisme condiţionat patogene

– parazitism• obligatoriu (Mycobacterium leprae, Treponema

pallidum, Rickettsia spp.)

• facultativ (Clostridium spp., Salmonella spp.)


• definiţia patogenităţii

• definiţia virulenţei

– variabilitate ... ex. BCG

– cuantificare ... Ex. DL50


• Mecanisme

– multiplicare şi invazivitate

– multiplicare şi elaborare de toxine

– combinaţia acestor mecanisme

Patogenitate şi virulenţăMultiplicare şi invazivitate

• Factori SOMATICI care permit M & I

– adezine (pili, lectine, liganzi, glicocalix etc)

Ulterior sunt implicate şi alte forţe

• covalente

• de hidrogen

• ionice

• hidrofobe

Distanţa faţă de

suprafaţă

Potenţialul

energetic

(+)

(-)

Minim secundar

Minim primar

Aderenţă

NOTA BENE

• Incizia şi drenajul REZOLVĂ

• atât problema MS

• cât şi problema MP

Aderenţa ar putea fi BLOCATĂ prin

• exces de receptori izolaţi

• tratament chimic / enzimatic specific

• anticorpi anti-receptor / anti-adezine

Odată aderat, microorganismul îşi

modifică caracterele de suprafaţă

• poate opri sinteza de adezine

• poate acoperi adezinele cu o “capsulă”

care va masca structurile antigenice şi

cele activatoare ale C'

• poate adsorbi proteine ale gazdei,

mascând determinanţii Ag şi structurile

activatoare ale C'

Pentru unele bacterii ataşarea reprezintă destinaţia

finală

• Vibrio cholerae

• unele tulpini de E. coli

• Bordetella pertussis etc

Pentru alte bacterii, ataşarea reprezintă doar o etapă,

urmând penetrarea tisulară şi / sau diseminarea

• Salmonella typhi

• Shigella dysenteriae

• Yersinia pestis etc



– capsula (proprietăţi anti-fagocitare + aderenţă)

• Klebsiella pneumoniae

• Streptococcus pneumoniae

• Bacillus anthracis etc

– antigenele de tip K



– Componente ale peretelui bacterian

• antigenul O la bacteriile gram negative

• antigenul Vi (ex. la Salmonella typhi)

• proteina M

• polizaharidul A etc


• Factori SOLUBILI care permit M & I

• coagulaza liberă / legată

• leucocidina

• substanţe care cresc AMPc

• factori care cresc rezistenţa la enzimele lizozomale



– Producerea de enzime litice• colagenaza, hialuronidaza, fibrinolizina

• lecitinaza

• proteaze ... etc

• hemolizine



– Producerea unor substanţe care inhibă răspunsul

imun• IgA proteaza

• proteina A

• endotoxina etc

Patogenitate şi virulenţăMultiplicare şi toxinogeneză

• multiplicare la poarta de intrare

• alterări celulare şi distrucţii tisulare la distanţă

Exotoxinele

• elaborate în general de microbi gram-pozitivi

lizogenizaţi (ex. b. difteric, streptococ β HL de grup A)

• sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus

anthracis)

• dar şi de bacili gram-negativi

– prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella

pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau

– sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli)

Exotoxinele• structură proteică

• formate dintr-un domeniu B (bind) + o porţiune

enzimatică A (active)

• secretate în timpul vieţii germenilor

• difuzibile la distanţă

• toxicitate foarte mare

Anti-toxinele• toxinele au structură proteică

• sunt imunogene

• determină apariţia de anticorpi specifici (antitoxine)

• antitoxinele pot neutraliza in vitro sau in vivo

activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina

• rezultă seruri imune utile în seroterapia specifică

– ser antidifteric

– ser antitetanic etc

Anatoxinele• exotoxinele pot fi detoxifiate

– timp

– formol

– temperatură

• pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin anatoxine

• anatoxinele = vaccinuri– ATPA (anatoxină tetanică purificată şi adsorbită)

– ADPA (anatoxină difterică purificată şi adsorbită)

– DT (anatoxină difterică şi tetanică)

– DTP (DT + corpi de Bordetella pertussis)

Endotoxinele (Antigenul O, LPZ)• evidenţiate la germenii gram negativi

• elaborate şi apoi incluse în peretele bacterian

• se pot elibera prin distrugerea acestor microorganisme

• au structură lipopolizaharidică

– acizi graşi

– lipid A

– lanţuri de polizaharide

Endotoxinele (Antigenul O, LPZ)• toxicitate mai redusă

• antigenicitate şi imunogenicitate mai redusă

• pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia

– Febrei

– Leucopeniei

– hiperpermeabilităţii vasculare

– hipotensiunii arteriale până la colaps etc

• şocul endotoxic ...

Apărarea organismului faţă de infecţii

• bariera anatomică cutaneo-mucoasă

• barierele de organ, ex. BHE

• ganglionii limfatici

• sistemul fagocitar

• sistemul complement

• citokinele

Apărarea organismului faţă de infecţii

• sistemul imun (umoral şi celular)

• alţi factori

• complexul major de histocompatibilitate (MHC)

• imunitatea de specie (naturală)

• factorii nutriţionali (vitamine, fier etc)

• factorii endocrini

• sistemul nervos central

1. Opinia despre cursuri

2. Opinia despre lucrările practice

3. Propuneri de îmbunătăţire

http://www.medicinist.com/2007/10/16/microbiologie/



Ce este rezistenţa la antibiotice ?

Definiţie EUCAST

Clasificare

clinicăSensibil Sensibil Intermediar Rezistent

Total Border - line

Nr. tulpini

CMI Jos Înalt Înalt Înalt

Sensibil Rezistent Rezistent Rezistent

Clasificare

microbiologică

Sensibil Nivel jos Nivel

intermediar

Nivel înalt

TSA – proces dinamic

• Noi antibiotice

• Noi tipuri de rezistenţă

• Noi metode de investigare

• Noi criterii de interpretare, în cadrul aceleiaşi metode

Element

QIC

NCCLS CA-SFM

Tip placă / nr

discuri AB

Rotundă Ø 100mm / 5

Rotundă Ø 150mm / 12

Pătrată / 16

Condiţii de

incubare

35o C

16 – 18 h

35 - 37o C

18 - 24 h

Standard NCCLS sau CA-SFM?

Tehnica de lucru

Utilizarea “dispenserelor”

• Convenabil, practic

• Cresc repetabilitatea

• Dar:

– Risc de contaminare

– Antibioticele rare

trebuie puse la

frigider cu capac,

după utilizare

– Nu încurajează

gândirea critică

Materiale necesare

• Cultura bacteriană (18-24 ore), pe mediu solid neselectiv

• Tulpina de referinţă pentru verificarea condiţiilor de lucru

• Plăci cu mediu Mueller-Hinton

• Tuburi cu 5 ml soluţie salină fiziologică

• Etalon McFarland 0,5

• Card Wickerham

• Tampoane pentru însămânţarea suspensiei bacteriene

• Riglă pentru măsurarea diametrelor de inhibiţie

• Discuri de antibiotice conform indicaţiei standardului

• Tabele de interpretare a diametrelor de inhibiţie

• Fişa de înregistrare a rezultatelor

Obţinerea suspensiei de lucru

• Utilizăm cultura de 18-24 ore (mediu neselectiv)

• Inoculăm câteva colonii în soluţia salină fiziologică, pentru o turbiditate comparabilă cu cea a etalonului McFarland 0,5

• Comparăm tubul cu suspensia preparată cu etalonul, cu ajutorul cardului Wickerham

• Ajustăm densitatea suspensiei la cea

din etalonul 0,5 McFarland

(mai puţin densă adăugăm cultură,

mai densă adăugăm ser fiziologic)

Însămânţarea plăcilor pentru TSA

• Utilizăm plăci uscate …

• Nu întârziem însămânţarea > 15 minute de

la prepararea inoculului

• Înmuiem un tampon în suspensia etalonată şi

îl presăm bine pe pereţii tubului

• Însămânţăm plăcile Petri prin tehnica rotaţiei

plăcii …

Metoda de însămânţare

• Rotim de 3 ori cu cate 60o

placa, astfel încât nici o

porţiune din mediu să nu

rămână neînsămânţată.

Aplicarea discurilor cu antibiotice

• Notăm pe placă datele de identificare

• Nu întârziem aplicarea discurilor > 15 minute de la

însămânţare

• Aplicăm pe suprafaţa plăcii însămânţate discurile cu

antibiotic, cu ajutorul unei pense sterile

• Discurile trebuie scoase din congelator cu

aproximativ 2 h înaintea aplicării pe placă

• Nu aplicăm > 5 antibiotice / placă …

• Presăm uşor discurile pe suprafaţa mediului

Ex. Aşezarea discurilor pentru E. coli

4 53

6

1 2

20 mm

7 8

12

11

9

10

1= AML

2=CF

3=CTX

4=AMC

5=CAZ

Incubarea• Incubăm peste noapte la 35-37o C, cu mediul dispus

superior

• Nu > 3 plăci suprapuse

Citirea

Măsurăm diametrele de inhibiţie pe partea exterioară a plăcii,

fără să deschidem capacul, preferabil pe fond întunecat:

-iniţial pentru tulpina de referinţă

-comparăm cu diametrele admise

-ulterior pentru tulpina de testat

-comparăm diametrele cu datele din tabel şi notăm

în fişă rezultatele (S, I sau R)

TSA conform standardului NCCLS

• Puncte critice:

– Mediul de cultură: Mueller-Hinton

– Discurile utilizate şi modul de utilizare

– Mărimea inoculului

– Condiţiile de incubare

– Controlul cu tulpini de referinţă

– Citirea zonelor de inhibiţie

– Pregătirea personalului

Controlul mediului Muller-Hinton

• Sterilitate (incubare 48-72 h a unor plăci, alese la

întâmplare, din lotul preparat în laborator)

• Capacitatea de dezvoltare în condiţii normale

• pH 7.2 - 7.4 (ex. aminoglicozide)

• Umiditate: uscarea plăcilor …

• Concentraţia în timidină / timină, (prea mare, scad

diametrele la sulfamide) - E. faecalis ATCC 29212

• Conc. în cationi bivalenţi (Mg++, Ca++: aminozide, Zn++:

peneme) – Pseudomonas aeruginosa ATCC 27.853

• Precauţii speciale în cazul mediului M-H cu sânge

Controlul mediului Muller-Hinton

• Strat prea gros zone mai mici

Mărimea inoculului

• McFarland 0.5

• Card Wickerham sau

• Fotometru (validare)

• Scala acelaşi tip de

tuburi

• Nota: preparare McFarland 0.5:- 0.5ml BaCl2 conc. 10g/l

- 99.5 ml H2SO4 1%

OD: 0.08-0.1 la 625nm

Mărimea inoculului

Inocul prea bogat

Zone mai mici

Utilizarea tulpinilor de referinţă

• Obligatoriu cel puţin o dată pe săptămână

minim următoarele 3 tulpini:

• Escherichia coli ATCC 25922

• Staphylococcus aureus ATCC 25923

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Alte tulpini, în funcţie de microorganismul

pentru care facem TSA

Citirea

• Preferabil cu şublerul– Evitarea erorii de paralaxă

• Tabele de

interpretare NCCLS

• Evitarea confuziilor

• Verificare

• Interpretare finală

Pregătirea personalului

• Verificarea cunoştinţelor teoretice (periodic, de

către şeful de departament)

• Aprecierea gândirii critice, adaptată la situaţie

• Planificarea activităţilor de pregătire

• Toţi trebuie să practice QI şi QE de calitate şi

nu întotdeauna acelaşi om

Tehnică greşită

Contaminare

Cultura mixtă … există două microorganisme

Înregistrări şi formulare

• Registru TSA

• Fişe de înregistrare pentru controlul de calitate

• Formulare de raportare

• Fişe pentru echipamente

Condiţiile unei TSA eficiente

• Alegerea metodei şi standardului (corespunzător)

• Utilizarea unei strategii de testare si raportare (conform standardului ales)

• Asigurarea calităţii intregului proces

• Interpretarea corectă a rezultatelor directe

• Raportarea corectă şi la timp a rezultatelor –“tezaur pentru sănătatea publică”

• Utilizarea rezultatelor de către cel care a comandat testarea decizie acţiune:

ghid pentru indicaţii terapeutice, politica utilizării medicamentului etc

patogenitate si virulenta

Documents