Virulenta

4. PROPRIETILE MICROORGANISMELOR PATOGENE: PATOGENITATEA I VIRULENA BACTERIAN

Din multitudinea de microorganisme existente n natur, un numr limitat sunt capabile s se dezvolte n asociaie cu organismele superioare, iar dintre acestea, un numr restrns (cteva sute) sunt patogene.

Bacteriile patogene au dou proprieti definitorii: patogenitatea i virulena. Cei doi termeni au semnificaie distinct.

4.1. Definiii

Patogenitatea (gr. pathos boal, suferin; om. gr.-geneia, fr. gnie nscut, produs al) este proprietatea esenial a oricrui agent patogen ce const n capacitatea acestuia de a genera un proces infecios, acelai din punct de vedere clinic, manifestat prin starea de boal, atunci cnd ptrunde n organismul sensibil pe cale natural sau pe cale experimental. Un microorganism patogen este capabil s induc leziuni tisulare la o gazd receptiv. n mod obinuit, patogenitatea este asociat, inexact, cu modul de via parazitar a microorganismelor, dar calitatea de patogen nu se asociaz totdeauna cu parazitismul. Majoritatea bacteriilor patogene sunt parazite, iar in vitro se dezvolt ca saprobionte pe medii organice, uneori cu compoziie chimic complex. Unele bacterii, dei sunt strict saprobionte, adic se dezvolt pe materia organic n mediile naturale (de exemplu, Cl. botulinum), dar nu sunt parazite, produc totui efecte patologice prin intermediul exotoxinelor pe care le secret.

Patogenitatea a aprut n cursul co-evoluiei gazd-parazit i implic existena a patru proprieti eseniale:

ptrunderea i localizarea n esuturile gazdei; multiplicarea i producerea de toxine/invadarea gazdei; inducerea unui rspuns imun i rezistena la mecanismele de aprare ale gazdei; producerea leziunilor specifice.

Patogenitatea este un caracter calitativ de specie. De exemplu, B. anthracis, C. diphteriae, S. typhi, M. tuberculosis sunt patogene sau condiionat patogene, adic determin apariia unui proces infecios numai dac sunt inoculate n doze foarte mari sau dac organismul are o rezisten general sczut. Cel mai ilustrativ exemplu de patogenitate condiionat este oferit de Ps. aeruginosa, o bacterie saprobiont n mediile naturale: organismul uman mpiedic, n condiii obinuite, colonizarea cu pseudomonade, dar la persoanele imunocompromise, n rnile provocate de arsuri sau de traumatisme sau n esutul pulmonar al pacienilor cu fibroz chistic, Ps. aeruginosa produce ntotdeauna infecii.

Alte specii (Azotobacter sp., Nitrobacter sp., Acetobacter sp. etc.) nu sunt niciodat patogene, pentru c nu au capacitatea de a stabili interaciuni cu organismele superioare.Virulena (lb. latin virulentus = otrvitor) este capacitatea relativ a unei tulpini patogene de a determina leziuni tisulare (de a coloniza, de a se multiplica i eventual de a invada celulele i esuturile gazdei i/sau de a produce toxine), determinnd o stare patologic la o gazd receptiv.

Virulena exprim cantitativ gradul de patogenitate a unei tulpini pentru o anumit gazd i este o proprietate multifactorial, dependent de paticularitile structurale i fiziologice ale agentului patogen materializate n:

infeciozitate (sau capacitatea de colonizare); agresivitate (sau invazivitate); toxigenitate.

Procesul infecios

Infecia (lb. latin inficere - otrav) este deteminat de capacitatea agentului patogen de ptrunde, de a se localiza i multiplica n organismele gazd sensibile. Infecia bacterian produce modificri de tip alterativ ale organismului gazd. Ele sunt primare (directe), datorate factorilor de patogenitate bacterian (intoxicaii, toxiinfecii, bacteriemii) i secundare, mediate de factorii umorali i celulari ai sistemului imunitar (strile de hipersensibilitate).

Factori de virulen

Virulena este corelat cu prezena unor structuri bacteriene (flageli, fimbrii),a unor proteine membranare sau cu unele particulariti fiziologice i de sintez (de exemplu sinteza exotoxinelor sau a exoenzimelor), denumii factori de virulen, care determin producerea unor leziuni n organismul gazdei.Moleculele care mediaz virulena au fost grupate n 4 clase: adezine, invazine, agresine i impedine. Adezinele sunt proteine bacteriene care mediaz interaciunea celulei bacteriene cu o varietate de celule ale gazdei, n special epitelii, ca o prim treapt de colonizare a gazdei. Invazinele sunt proteine bacteriene care permit celulei s intre n celula eucariot. Agresinele sunt molecule, de exemplu toxine i proteaze, care produc leziuni ale gazdei ori favorizeaz rspndirea infeciei. Impedinele sunt componente bacteriene care inhib aciunea mecanismelor de aprare, fr s produc leziuni.

Moleculele inductoare ale sintezei de citokine sunt, probabil, tot factori de virulen, dar nu aparin celor 4 clase enumerate mai sus. Componentele care induc sinteza citokinelor, moduleaz activitatea celulei infectate, cu consecine patologice i au fost denumite moduline.

Analiza genetic a factorilor de virulen bacterian a artat c patogenii se disting de bacteriile nepatogene, prin prezena genelor specifice de patogenitate, adeseori organizate n aa numitele insule de patogenitate aglomerri de gene care aparent au fost dobndite n evoluie, pe calea transferului orizontal al genelor (fig. 30, 31).

Fig 30.

Fig. 30. Structura unei insule de patogenitate (V1-4), gene de virulen, IS (secvene de inserie) (Barton et al., 2009)

Fig. 31. Reprezentarea evoluiei bacteriilor patogene din bacterii comensale prin dobndirea genelor de virulen prin transfer orizontal mediat de diferite elemente genice mobile. PAIs (insule de patogenitate- pathogenicity islands) (dup Ahmed et al., 2008).Bacteriile patogene conin 1-2 insule de patogenitate, dar diferite tulpini de Salmonella au pn la 5 astfel de secvene insulare de ADN. Originea comun a genelor codificatoare a factorilor de virulen explic faptul c ageni patogeni cu grad mic de nrudire poart gene de virulen strns nrudite. Afirmaia este foarte evident pentru un set de aproximativ 20 de gene, codificatoare ale unui set de proteine care definesc un mecanism de patogenitate, denumit sistem de secreie de tip III.Scopul practic al cercetrii proprietilor de virulen a unui agent patogen este obinerea unor mijloace de contracarare a exprimrii sau aciunii factorilor de virulen (vaccinuri) pentru a preveni infecia.4.2. Infeciozitatea Infeciozitatea reprezint capacitatea unui microorganism de a depi mijloacele de aprare a organismului, de a se implanta i de a coloniza esuturile sntoase, adic de a stabili o localizare i de a forma un focar primar de infecie. Colonizarea esutului de ctre un microorganism patogen este o faz iniial critic pentru evoluia procesului patologic i este un fenomen complex, care implic att implantarea, ct i utilizarea substanelor nutritive disponibile n mediul gazdei. Traversarea stratului de mucus de ctre agenii infecioi este favorizat de prezena organitelor de micare (flageli), dar i prin secreia substanelor mucolitice (de exemplu, mucinaza produs de Helicobacter pylori i Vibrio cholerae), stimularea secreiei de mucus, producerea unor toxine care inhib motilitatea ciliar.

n medii apoase motilitatea este asigurat de flageli dispui peritrih, n timp ce flagelii cu localizare polar favorizeaz traversarea rapid a mediilor cu vscozitate crescut (de exemplu, bacteriile spiralate), iar fenomenul de hiperflagelare asigur deplasarea pe suprafaa majoritii mucoaselor (de exemplu, la Proteus mirabilis expresia flagelilor este legat de exprimarea altor factori de virulen; B. bronchiseptica devine mobil atunci cnd ajunge n medii srace n substane mutritive, mobilitatea fiind implicat n persistena i cronicizarea infeciei).

Aderena la celulele gazdei este direct (prin intermediul adezinelor specifice de tipul pililor, hemaglutininei - HA) sau indirect (prin intermediul glicocalixului sau al moleculelor de matrice extracelular de tipul fibronectinei sau al opsoninelor). Adezinele bacteriene confer specificitate tisular (de exemplu, H. pylori - pentru mucoasa gastric; E. coli uropatogen - pentru mucoasa tractului urinar; Str. pneumoniae - la pacienii cu otite, ader mai eficient la celulele nozofaringelui, dect la pacienii cu septicemie sau cu meningite; Str. mutans - se leag de glicoproteine salivare), dei exist i ageni infecioi care pot coloniza diferite esuturi, n funcie de poarta de intrare n organismul gazd, producnd diferite tipuri de infecii (de exemplu, B. anthracis poate produce crbunele pulmonar, digestiv i cutanat).

4.2.1. Adezinele bacteriene

Prima etap a colonizrii unui esut este aderena celulelor bacteriene la celulele gazdei. Legarea bacteriilor patogene de celulele sensibile este etapa iniial a procesului infecios. Aderena mpiedic ndeprtarea bacteriilor prin: fluxul secreiilor, tuse, motilitatea cililor, peristaltismul intestinal.

Aderena este mediat de structuri specializate ale suprafeei bacteriene, cunoscute sub denumirea generic de adezine. Structurile bacteriene de aderen, anatomice sau moleculare sunt de cele mai multe ori adaptative. Ele dispar prin cultivarea succesiv in vitro. De aceea, tulpinile bacteriene de laborator sunt mai puin aderente la suport, comparativ cu tulpinile bacteriene izolate recent.

Aderena asigur colonizarea anumitor situsuri din organism, multiplicarea bacteriilor, sinteza toxinelor i desfurarea reaciei inflamatorii de aprare.

Bacteriile ader n special la epiteliile mucoaselor, dar i la epiteliile cheratinizate, la endotelii, la esutul osos, la smalul dentar etc. Aderena implic interaciunea situsurilor complementare de pe suprafaa celor dou tipuri de celule: epitelial i bacterian.

Aderena este condiionat de complementaritatea sarcinilor electrice ale celor dou suprafee. Cele mai multe bacterii au o sarcin net negativ a suprafeei lor, dar au i zone limitate electropozitive, precum i molecule cu caracter hidrofob.

Aderena reprezint un avantaj ecologic major pentru bacteriile patogene, cu privire la asigurarea nutrienilor, protecia fa de anticorpi i lizozim etc. Multiplicarea lor, dup aderen, are loc cu o rat net superioar fa de a celulelor neaderente.

Mecanismele aderenei bacteriene in vivo au fost studiate n special pentru bacteriile generatoare de carii dentare. Aderena celulelor bacteriene patogene la celulele sensibile implic participarea a doi factori: o adezin localizat pe suprafaa bacteriei i un receptor de pe suprafaa celulei gazd (fig. 32).

Fig. 32. Reprezentarea schematic a adererenei celulelor bacteriene la celula gazd sensibil, mediat de adezine (liganzi) i receptori specifici (http://lib.bioinfo.pl/courses/view/312, http://diverge.hunter.cuny.edu/~weigang/Images/15-01_adherence_1.jpg).

Fig. 33. Diversitatea structurilor implicate n aderena bacteriilor Gram-pozitive (Streptococcus pyogenes) la celula gazd sensibil (http://d3jonline.tripod.com/10-Bacteria/Microbial_Virulence.htm).

Adezinele bacteriene se mpart n dou categorii: a) adezine de natur proteic; b) adezine neproteice. Grupul adezinelor proteice cuprinde fimbriile, care sunt structuri filamentoase, neflagelare ale suprafeei celulare, diferite de pilii participani la conjugare. Fimbriile fac parte din categoria lectinelor i se gsesc numai la bacteriile Gram-negative. Ele se leag de receptori specifici ai membranei celulare. Fimbriile care aparin aceluiai tip sunt formate din molecule proteice identice. Diferitele variante fimbriale se deosebesc prin lungimea filamentului i prin greutatea molecular a monomerilor polipeptidici constitutivi.

n aceeai categorie sunt incluse o categorie de proteine din structura membranei externe a bacteriilor Gram-negative sau din structura peretelui celular al bacteriilor Gram-pozitive, care ndeplinesc funcia de adezine (fig. 33).

Grupul adezinelor neproteice. O serie de substane de natur glucidic, cu structuri complexe i particulare intr n structura peretelui celular al bacteriilor Gram-pozitive i Gram-negative, exercitnd un rol important n patogeneza bacterian (aderen, evitarea mecanismelor de aprare ale gazdei, meninerea unei anumite ncrcturi electrice a celulelor bacteriene). Studiul acestor glicoconjugate constituie obiectul glicomicii bacteriene (Reid i colab., 2010) (fig. 34).

Fig. 34. Diversitatea glicomului bacterian: (A) Bacterii Gram-negative (1) precursori glucidici complexai cu nucleotide; (2) peptidoglican; (3) Glicoproteine N-linkate; (4) LPS/LOS; (5) polizaharide extracelulare; (6) polizaharide capsulare; (7) proteine glicozilate O-linkate - Salmonella enterica; (8) pilin - Neisseria gonorhoeae (B) Micobacterii (9) arabinogalactan (10) acizi micolici (11) lipomannan and (12) lipoarabinomannan. (C) polizaharide capsulare, polizaharide extracelulare, PG (13) acid teichoic (14) acid lipoteichoic, IM: membrana intern; OM: membrana extern (dup Reid i colab., 2010).Cele mai comune adezine neproteice sunt polizaharidele care intr n structura unei reele de tip glicocalix, de tip capsular sau a unei structuri neorganizate de tipul stratului mucos. Exopolizaharidele formeaz structuri capsulare la multe bacterii patogene i au consisten de geluri hidratate. Ca factori de virulen, exopolizaharidele au dou roluri majore:

a) aderena de substratul tisular. Dupa Gristina i colab. (l985), att suprafaa celulei bacteriene, ct i a substratului tisular sunt polianionice. Sarcinile electrice asemntoare determin respingerea celulei bacteriene de ctre substratul tisular. Forele de respingere sunt contracarate de forele de atracie London-van der Waals. Ele permit realizarea unor interaciuni hidrofobe ntre moleculele suprafeei bacteriene i ale celulei gazd. Exopolizaharidele bacteriene intensific interaciunile dintre liganzii bacterieni i tisulari. Astfel, esutul este acoperit de un biofilm, n care agregatul de celule bacteriene, nconjurat de o matrice molecular, ader strns la substrat; b) protecia celulei bacteriene fa de sistemele de aprare a gazdei. Capsula mpiedic fagocitoza pentru c bacteriile capsulate formeaz microcolonii i nglobarea lor de ctre fagocite devine dificil. Cu ct suprafaa celulei bacteriene este mai hidrofil, cu att este mai greu fagocitat. Pe de alt parte, complementul i anticorpii nu au acces la suprafaa celulei. Unele specii bacteriene produc o capsul a crei compoziie chimic este asemntoare componentelor tisulare ale organismului gazd infectat (de exemplu, capsula de la Str. pyogenes i Pasteurella multocida conin acid hialuronic.O astfel de capsul camufleaz celula bacterian fa de sistemul imunitar).

Matricea molecular polizaharidic, cu structur fibroas favorizeaz creterea celulelor i stabilitatea biofilmului. Stabilitatea biofilmului asigur formarea continu de microcolonii, persistena i extinderea infeciei cronice. Din structura sa scap periodic celule bacteriene care trec n snge sau n lichidele tisulare adiacente, favoriznd extinderea infeciei.

Alte adezine sunt acizii lipoteichoici, caracteristici bacteriilor Gram pozitive, ancorai de glicolipidele membranare. Sunt structuri moleculare filamentoase, foarte asemntoare fimbriilor, cu rol de aderen la substrat. La Str. pyogenes, acizii lipoteichoici au efect sinergic cu proteina M.

Adezinele neproteice sunt mai puin eficiente n medierea proceselor de aderen bacterian, comparativ cu cele proteice. Polizaharidele capsulare, n anumite cazuri favorizeaz aderena, iar alteori au efect invers (de exemplu, polizaharidele mpiedic aderena celulelor de H. influenzae, N. meningitidis sau P. multocida tip A).

Receptori de adezine. Interaciunea dintre celula epitelial sensibil i adezinele bacteriene este mediat de receptorii de adezine i se bazeaz pe principiul complementaritii spaiale.Uneori, interaciunea este nespecific, ceea ce explic faptul c unele specii bacteriene (Salmonella, Yersinia) infecteaz att celulele intestinale umane, ct i liniile celulare de Drosophila. Alteori, interaciunea are un grad nalt de specificitate. De exemplu, Str. pyogenes se localizeaz la nivelul epiteliului faringian i foarte rar n tractul urinar, iar E. coli colonizeaz epiteliul intestinal i al cilor urinare, dar foarte rar pe cel respirator.

Helicobacter pylori, un patogen specific uman, ader la celulele epiteliale ale mucoasei gastrice, dar nu la celulele profunde ale mucoasei sau ale colonului. Pe celulele epiteliului, H. pylori recunoate antigenul de grup sanguin Lewis, dar probabil i alte molecule, deoarece H. pylori infecteaz i indivizi negativi pentru acest antigen. Un factor esenial pentru colonizare este ureaza, pe care H. pylori o produce n cantiti foarte mari. In vitro, celulele de H. pylori hidrolizeaz ureea, elibernd amoniul care neutralizeaz aciditatea i permite colonizarea iniial. Amoniul generat prin hidroliza ureii produce NH4OH care se disociaz i ionul OH- produce leziuni ale mucoasei.

Receptorii de adezine ai celulelor epiteliale sunt molecule din familia integrinelor, care ndeplinesc funcii fiziologice importante: leag proteine plasmatice, dar i proteine din matricea extracelular (fibronectine, fibrinogen, laminina, colagenul de tip I etc.).

Receptorii de adezine sunt molecule ale suprafeei celulei sau se gsesc la nivelul mucopolizaharidelor care tapeteaz ntotdeauna epiteliile mucoase.

Din punct de vedere chimic, receptorii de adezine sunt glicoconjugate: glicoproteine ale membranei celulare sau ale stratului mucopolizaharidic i glicolipide din structura membranei (fig. 35).

Fig. 35. Reprezentarea schematic a aderenei bacteriene la celula gazd, mediat de adezine fimbriale sau afimbriale, prin intermediul receptorilor de natur glicolipidic sau glicopeptidic (dup Nizet i Esko, 2009).

Fig. 36. Evidenierea efectului anti-infecios al manano-oligozaharidelor (MOS), analogi structurali ai receptorilor pentru fimbriile de tip I la Salmonella (dup Moran, 2009).

Glicoproteinele i glicolipidele proemin la suprafaa membranei celulare i expun la exterior catene oligozaharidice mai mult sau mai puin complexe, cu rol de receptori de adezine.

Glicoproteinele din stratul mucopolizaharidic sunt formate din catene polipeptidice legate prin puni S-S. Catena oligozaharidic este format din N-acetil-galactozamin, N-acetil-glucozamin, fucoz, galactoz i acid sialic. Glicoproteinele din mucus se gsesc i n secreii (salivar, digestive).

Glicoproteinele membranare se deosebesc de cele din mucus: N-acetil-galactozamina lipsete, locul ei fiind luat de manoza i de acizii uronici. Catenele glicoproteice ale mucopolizaharidelor i ale suprafeei celulare sunt asemntoare cu cele ce se gsesc pe suprafaa eritrocitelor i formeaz antigenele de grup sanguin. Aa se explic proprietile hemaglutinante pe care le posed anumite adezine bacteriene, dac receptorul lor celular se gsete pe hematii.

Glicoconjugatele pot avea rol de receptori pentru toxine. De exemplu, glicolipidul GM1, prin componenta sa oligozaharidic este receptor specific al toxinei holerice.

Detectarea localizrii receptorilor glicoproteici i glicolipidici pe suprafaa celulei este posibil prin utilizarea lectinelor. Lectinele sunt glicoproteine ce se leag specific cu un rest oligozaharidic. Lectinele cuplate cu un derivat fluorescent sunt utilizate pentru a studia repartiia receptorilor suprafeei celulare.

Modularea expresiei proprietilor de aderen se poate face, teoretic, pe mai multe ci:

prin blocarea receptorilor celulari cu analogi structurali ai adezinei bacteriene. De exemplu, aderena streptococilor poate fi inhibat in vitro, dac la mediul de reacie se adaug acid lipoteichoic, analogul structural al adezinelor acestor bacterii;

prin utilizarea analogilor structurali ai receptorilor celulari. D-manoza, adugat n mediul de reacie inhib aderena S. typhimurium i Sh. flexneri la eritrocitele de cobai. Bacteriile poart fimbrii de tip I, ai cror receptori celulari sunt glicoproteine cu manoz (fig. 36);

blocarea parial sau total a adezinei cu anticorpi specifici este considerat ca o modalitate eficient de protecie. Astfel, starea imunitar postvaccinal sau consecutiv unei infecii, asigur o protecie bun fa de o infecie ulterioar cu acelai agent sau cu ali ageni care au adezine comune;

utilizarea antibioticelor la doze subinhibitorii este o modalitate de a modifica expresia adezinelor. Dozele subinhibitorii blocheaz, parial sau total, biosinteza unor constitueni ai suprafeei celulare, antrennd i modificri ale anumitor proprieti, inclusiv a celor de aderen.

Receptorii celulari de adezine se modific, att cantitativ, ct i calitativ.Modificrile receptorilor celulei gazd pot favoriza aderena i invazia tisular. Un exemplu este infecia sever produs de Str. pneumoniae, care determin infecii clinice (pneumonie, otit medie, septicemie).Sensibilitatea la infecie crete foarte mult consecutiv unei infecii virale a tractului respirator. Citokinele gazdei activeaz receptorul pentru PAF (platelet activating factor), pe suprafaa celulelor epiteliului pulmonar.Pneumococii ambelor tipuri de colonii (transparente i opace) ader la suprafaa celulei pulmonare, dar cei ce produc colonii transparente invadeaz circulaia sistemic prin capilarele pulmonare ori prin vasele limfatice.Astfel se explic predispoziia pacienilor infectai cu un virus al tractului respirator la complicaiile consecutive pneumoniei cu Str. pneumoniae (meningit, septicemie).

Interaciunea unui patogen cu celula gazd nu este mediat ntotdeauna de receptori celulari. Adeseori, bacteriile patogene activeaz cile de semnalizare ale celulei, direct prin componentele celulare sau prin intermediul citokinelor inflamatorii.

4.2.2. Biofilmele microbiene

Aderena la un substrat reprezint o etap iniial a formrii biofilmului microbian.Biofilmul este o comunitate microbian sesil alctuit din celule ataate ireversibil la un substrat, la o interfa sau ntre ele, ncorporate ntr-o matrice de substane polimerice extracelulare pe care le-au produs i manifest un fenotip modificat cu privire la rata de cretere i de transcriere a genelor (Donland i Costerton, 2002). Etapele formrii unui biofilm. Pentru a forma biofilmul, bacteriile trebuie s adere la un substrat. Condiia iniial este deplasarea microorganismelor din mediu la suprafaa substratului, care se poate realiza prin trei mecanisme:

prin difuziune consecina micrii browniene a celulelor bacteriene - asigur deplasarea lent ntr-un mediu staionar, ca i n cursul procesului de sedimentare, n care poate reprezenta singurul mod de contact al microorganismelor cu diferite substraturi;

prin cureni de convecie, asociat cu circulaia lichidului n care sunt suspendate, poate asigura un transport cu cteva ordine de mrime mai rapid dect cel precedent; micarea activ, cea mai rapid, poate duce la contacte ntmpltoare sau orientate chimiotactic n cazul existenei unui gradient chimic n regiunea interfacial. n condiii naturale, orice suprafa iniial ,,curat, este acoperit n scurt timp de molecule adsorbite, n general, de natur proteic. nc din faza n care se gsesc la oarecare distan de substrat, microorganismele sunt expuse forelor generale fizico-chimice. Aderena la substrat este iniial reversibil, n sensul unei depuneri pe suprafaa suport, cu meninerea n continuare a micrii browniene i flagelare i cu posibilitatea de ndeprtare prin agitare uoar sau chiar prin propria mobilitate. Un rol important n procesul de aderen au att interaciunile London-van der Waals, care sunt de regul atractive, tensiunea superficial*, legturile covalente, ct i forele electrostatice de respingere. n mediile naturale, datorit structurilor nveliului celular, att bacteriile Gram-negative ct i cele Gram-pozitive sunt ncrcate electronegativ. Energia potenial rezultat din interaciunea lor este variabil i n funcie de concentraia electroliilor determin comportarea bacteriilor n raport cu substratul.*Tensiunea superficial se manifest la nivelul suprafeei de separare dintre un lichid i un gaz (sau dintre dou lichide nemiscibile). Suprafaa lichidului se comport ca o membran elastic, ce tinde s se contracte i s se micoreze la minimum posibil. Tensiunea superficial este o for rezultant a atraciilor din interior i exterior, exercitate asupra moleculelor din stratul de separare lichid-gaz sau lichid-lichid. Etapa de legare ireversibil sau permanent este caracterizat prin ncetarea micrii browniene i prin posibilitatea ndeprtrii bacteriilor aderente numai sub aciunea unor fore puternice de agitare. Aderena este favorizat de prezena polizaharidelor extracelulare i a glicoproteinelor preformate sau sintetizate de novo pe suprafaa celulei care ader. Fenomenul explic tendina superioar de aderen la substrat, a bacteriilor n faza exponenial de cretere, comparativ cu cele aflate n faza staionar, mbtrnite sau moarte (fig. 37).

Fig. 37. Prezentarea corelaiilor dintre densitatea bacterian, faza de cretere a unei culturi asincrone, n sistem discontinuu, i etapele formrii biofilmului microbian (dup Costerton i colab., 1999). Dup legarea ferm, bacteriile ncep s creasc i s se multiplice rapid. Celulele legate ireversibil de substrat, dar nu i ntre ele, formeaz un strat continuu monocelular care acoper toat suprafaa expus a substratului. Celulele legate att de substrat, ct i ntre ele formeaz microcolonii i biofilme. Ulterior, biofilmele rezultate din creterea pluristratificat a bacteriilor pot fi colonizate i de alte specii incapabile, per se, s colonizeze suprafee strine, care pot contribui la organizarea mai complex a biofilmului. Se adaug, uneori, cantiti importante de polimeri specifici cu structur reticulat sau fibrilar, care ancoreaz suplimentar celulele de substrat i unele de altele (fig. 38).

Fig. 38. Diagram prezentnd etapele dezvoltrii unui biofilm de Ps. aeruginosa 1. Ataarea iniial, reversibil, a celulelor la substrat. 2. Sinteza exopolizaharidelor care determin ataarea ireversibil. 3. Formarea microcoloniilor. 4. Maturarea arhitecturii biofilmului. 5. Dispersia celulelor din biofilm (Dup Caiazza i colab., 2007, http://www.dartmouth.edu/~gotoole/swarm.html).

Cnd biofilmul devine suficient de gros, straturile profunde devin anoxice i conin predominant specii anaerobe. Mai devreme sau mai trziu, cel puin celulele de la baza sistemului devin nfometate i mor. Anoxia, moartea multor celule i producerea de gaze pot destabiliza biofilmul, determinnd detaarea i desprinderea lui de suprafeele solide. Creterea poate fi reluat avnd un caracter ciclic (Zarnea, 1994).

Fig. 39. Modaliti de desprindere a celulelor din biofilm (dup Costerton i colab., 1999)

Proprietile biofilmelor

Biofilmele bacteriene sunt foarte heterogene n ceea ce privete structura, fiziologia, ecologia i parametrii fizico-chimici.

Arhitectura biofilmelor este heterogen att n spaiu ct i n timp, schimbndu-se constant datorit aciunii unor factori interni i externi. Tolker-Nielsen i colab. au studiat rolul motilitii celulare asupra arhitecturii biofilmului, examinnd interaciile dintre Ps. aeruginosa i Ps. putida prin microscopie confocal de baleiaj cu raze laser. Cocultivarea celor dou organisme ntr-un sistem de cretere continu, a avut iniial ca rezultat formarea unor mici microcolonii ale fiecrei specii, ns n timp coloniile au devenit mixte, datorit migrrii celulelor de la o microcolonie la alta. Biofilmele sunt dinamice din punct de vedere funcional i rspund la schimbarea condiiilor mediului. Celulele bacteriene pot fi diseminate din biofilm prin eliberarea celulelor rezultate din diviziune, prin dispersie datorit gradientului concentraiei nutrienilor, procesului de quorum sensing, sau prin diseminare n agregate, datorit curenilor de curgere. Agregatele celulare pstreaz sensibilitatea sczut fa de substanele antimicrobiene, caracteristic biofilmului. Biofilmele pot de asemenea, s migreze pe suprafee prin modaliti foarte variate (fig. 39, 40).

Fig. 40. Modaliti posibile de deplasare a biofilmelor: deplasare colectiv prin unduire sau rostogolire pe suprafa; prin detaare; deplasare individual prin diseminare (dup Dircks, 2003).

Expresia genic este diferit la bacteriile incluse n biofilm fa de cele planctonice. Brzel i colab. (1995, citai de Stoodley, 2002) au evaluat schimbrile expresiei genice la celulele ataate de Ps. aeruginosa i au artat c n timpul diferitelor etape ale aderenei, nivelul de expresie a peste 70 de gene s-a modificat. Sauer i colab.(2002) au artat c biofilmele mature de Ps. aeruginosa prezint un profil proteic radical diferit de acela al bacteriilor planctonice crescute n chemostat. Aproximativ 50% din proteomul detectat (peste 800 de proteine) prezint diferene de expresie de ase ori mai mari sau chiar mai mult. Dintre acestea, peste 300 de proteine au fost detectate n eantioanele de biofilm matur, dar nu la bacteriile planctonice. Printre genele exprimate la un nivel nalt n celulele biofilmelor mature sunt cele care codific proteine implicate n traducerea mesagerilor, n metabolism, n transportul membranar i/sau n secreie i reglarea genic.

Celulele biofilmului i coordoneaz comportamentul prin molecule pentru semnalizare destinate comunicrii intercelulare. Comunicarea intercelular este un aspect esenial al convieuirii ntr-o comunitate bacterian i este mediat prin semnale chimice denumite i feromoni bacterieni sau autoinductori. Exist dovezi c unele semnale chimice, produse de ctre celule i eliminate n mediul extern, pot fi interpretate nu doar de membrii aceleiai specii, ci i de alte specii microbiene i poate chiar de organisme mai complexe (comunicare inter-regn).

n populaiile planctonice, semnalele chimice produse de celule nu sunt suficient de concentrate pentru a determina schimbri n expresia genic. Totui, n biofilme, matricea care susine celulele n strns proximitate permite acumularea moleculelor de semnalizare n concentraii suficiente pentru a determina schimbri coordonate n comportamentul celular. Populaiile bacteriene i activeaz unele gene numai atunci cnd recepioneaz stimulii chimici care semnaleaz c populaia lor este destul de numeroas pentru a fi avantajos i/sau sigur s iniieze schimbarea unei activiti genice. De exemplu, unele bacterii patogene nu vor produce toxine pn la atingerea unei densiti adecvate pentru a supravieui mecanismelor de aprare a gazdei. Modalitatea de recunoatere a densitii celulare a unei populaii prin mecanisme de semnalizare chimic intercelular a fost denumit quorum sensing and response (QS).

QS este un sistem de reglare ubiquitar n lumea bacteriilor, care prezint dou componente implicate n transducia semnalului: o component proteic receptoare (senzor), cu un domeniu extracelular care recepioneaz semnalele extracelulare i un domeniu intracelular cu aciune enzimatic de histidin-kinaz, localizat membranar; o component proteic reglatoare (efector), localizat n citoplasm, cu rol activator sau represor al transcrierii genice, prin modificarea conformaiei specifice a ADN sau prin interaciune cu ARN- polimeraza.Fiecare celul dintr-o populaie bacterian produce o anumit cantitate de feromon (autoinductor) care se acumuleaz pe msura creterii densitii celulare. La atingerea strii de quorum bacterian, feromonii (denumii n acest caz factori de quorum) vor atinge concentraia prag necesar pentru a interaciona cu proteine receptoare (senzor). Sub influena feromonilor, proteina-senzor se activeaz printr-un proces de autofosforilare. Proteina efectoare activat prin fosforilarea domeniului aminoterminal va interaciona direct cu ADN bacterian, modulnd activitatea anumitor gene.

Cel mai studiat sistem de comunicare interbacterian, prin intermediul feromonilor, este sistemul homoserin-lactonelor (HL) i al derivailor lor, funcional la bacteriile Gram-negative.

Sistemele QS, la bacteriile Gram- pozitive, implic semnale chimice diferite de HL. Unele specii de Streptomyces sintetizeaz compui difuzibili similari autoinductorilor, denumii generic, butanolide, care intervin n reglarea producerii antibioticelor i a metaboliilor generai n faza staionar. Cel puin dou peptide secretate de B. subtilis sunt necesare pentru inducerea strii de competen i sporulare. La S. aureus un singur octapeptid este suficient pentru declanarea expresiei coordonate a mai multor factori de virulen. Feromonii oligopeptidici sunt necesari i pentru transferul conjugativ la Enterococcus faecalis. Sporularea la Myxococcus xanthus necesit, de asemenea, integrarea unor semnale extracelulare, dintre care cel puin unul este constituit din aminoacizi.

Primul sistem QS a fost evideniat la bacteriile luminiscente (Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium sp.) care triesc n simbioz n organele luminoase ale unor specii de peti marini de mare adncime i ale diferitelor specii de molute. Aceste bacterii produc lumin (prin activarea genelor ce codific luciferaza) numai n stare simbiotic. n stare liber, cnd densitatea bacterian este sczut, bacteriile nu produc luciferaz. Aceleai bacterii, cultivate n condiii de laborator, la atingerea unei densiti critice, i activeaz genele pentru luciferaz, consecina fiind creterea brusc de circa 100 de ori a cantitii de lumin eliberate de fiecare celul. Prin adugarea la o cultur bacterian cu densitate mic a unui supernatant de cultur bacterian cu densitate mare, celulele i-au activat genele pentru luciferaz, demonstrndu-se astfel reglarea acestui proces fiziologic prin intermediul unui factor solubil (feromon) ce se acumuleaz n mediul de cultur pe msura creterii densitii culturii bacteriene. Aceste observaii explic de ce bacteriile luminescente nu pot produce lumin atunci cnd triesc n stare liber i la densiti sczute n mediul marin. n schimb, n condiiile simbiozei cu organele luminoase ale organismelor superioare, aceleai specii bacteriene supuse unor condiii favorabile de cretere i n acelai timp, unei restricii spaiale, pot atinge densiti celulare mult mai mari, necesare induciei feromonilor bacterieni.

Rolul feromonilor nu se limiteaz numai la controlul bioluminiscenei, ci i al altor procese fiziologice extrem de variate: (i) expresia coordonat a anumitor factori de virulen de ctre bacteriile patogene sau oportuniste ca rspuns la contactul cu celulele eucariote ale gazdei sensibile, inclusiv formarea biofilmelor mature, care implic procese de difereniere a celulelor incluse n biofilm (fig. 41), (ii) inducerea competenei pentru procesul de transformare bacterian, (iii) sporularea, (iv) transferul plasmidelor conjugative, (v) procese metabolice dependente de densitatea celular, (vi) biosinteza antibioticelor, (vii) motilitatea (twitching, swarming, swirming).

Fig. 41. Ilustrarea rolului mecanismului de quorum sensing n formarea biofilmului de ctre o specie Gram-negativ. Dei celulele planctonice secret semnale chimice (HSL - homoserin lactone), concentraia sczut a moleculelor de semnalizare nu modific expresia genic. n biofilm densitatea celular este mare, astfel nct HSL secretate ating concentraii mai mari. Moleculele HSL sunt recepionate de celulele din biofilm i determin schimbri n activitatea genetic a celulei (dup Costerton i Dircks, 2004).

Deoarece unul dintre cele mai importante roluri ale mecanismelor de QS, att la bacteriile Gram-negative, ct i la cele Gram-pozitive, este reprezentat de reglarea expresiei coordonate a factorilor de virulen i evitarea mecanismelor de aprare antiinfecioase ale gazdei, n prezent aceste mecanisme reprezint inta dezvoltrii unor noi strategii anti-patogenice, bazate pe blocarea mecanismelor de semnalizare intercelular la diferite niveluri (blocarea sintezei moleculelor de semnalizare prin administrarea unor analogi ai acestora, inhibarea propagrii semnalului mediat de feromoni prin diminuarea concentraiei extracelulare a acestora, inhibarea recepionrii semnalelor prin utilizarea unor molecule competitive (cu structur asemntoare feromonilor bacterieni) sau necompetitive (cu structur chimic diferit) capabile s interfere cu legarea moleculelor de semnalizare la proteina senzor sau cu transmiterea semnalului la proteina reglatoare.Una dintre cele mai importante consecine ale formrii biofilmelor este rezistena crescut a celulelor incluse n biofilm, att la mecanismele de aprare ale gazdei ct i la dozele convenionale de antibiotice i biocizi, celulele manifestnd proprietatea de rezisten fa de substanele antimicrobiene. Mecanismul proteciei sau rezistenei la factorii antimicrobieni, pentru care termenul mai corect ar fi toleran sau rezisten fenotipic (foarte diferit de rezistena propriu-zis la antibiotice, determinat genetic) este subiectul unor dezbateri curente.

Pentru a explica mecanismele rezistenei fenotipice (comportamentale) sau a rezistenei celulelor incluse n biofilme la substane antimicrobiene, au fost emise mai multe ipoteze, care au formulat factorii determinani ai rezistenei comportamentale, diferii de factorii genetici de rezisten (fig. 42):

aderena la substrat i agregarea bacteriilor ntre ele;

exopolimerii secretai care protejeaz celulele; aceast ipotez, formulat adesea n trecut, conform creia structura mucoid ar constitui o barier de difuzie fa de moleculele antimicrobiene, este respins azi de unii autori;

enzimele degradative, fie provenind de la o singur specie i acumulate n concentraii mari, fie, provenind de la specii difertie i acionnd sinergic;

aderena celular nsi determin modificri fiziologice (intrarea n stare de laten metabolic a celulelor din straturile profunde ale biofilmului, subexprimarea porinelor, supraexprimarea pompelor de eflux) care explic fenomenul de rezisten a microorganismelor din biofilme.

Fig. 42. Mecanismele rezistenei biofilmelor la antibiotice: i) permeabilitatea redus a matricei biofilmului pentru antibiotice, care acioneaz doar la nivelul straturilor superficiale; activitate redus a antibioticelor datorit condiiilor locale (reziduuri microbiene, pH, pCO2, pO2 etc); distrugerera antibioticului de ctre enzimele inactivatoare acumulate n interiorul biofilmului; rata de cretere redus a celulelor din biofilm (populaie persister); eliminarea activ a antibioticului prin intermediul pompelor de eflux exprimate de celulele crescute n biofilm; activarea rspunsului la stres care se manifest prin supra-exprimarea unor mecanisme de rezisten la antibiotice (de exemplu, enzime inactivatoare) (dup Pozo i Patel, 2007).

Biofilmele microbiene sunt implicate n generarea infeciilor cronice, persistente, greu de tratat, consecutiv formrii biofilmelor pe esuturi (endocadita valvular, otita medie, fibroza chistic, prostatita bacterian cronic, periodontita) sau pe dispozitive medicale (valve cardiace artificiale (protetice), catetere centrale venoase, catetere urinare, lentile de contact, dispozitive intrauterine) (fig. 43).

Fig. 43. Interaciunea unui biofilm microbian cu efectorii imunitari ai gazdei. Bacteriile planctonice pot fi eliminate de anticorpi i fagocite i sunt sensibile la antibiotice. b. Celulele bacteriene aderate formeaz biofilme, preferenial pe suprafee inerte. Comunitile sesile sunt rezistente la anticorpi, fagocite i antibiotice. c. Fagocitele sunt atrase de biofilme. Biofilmul nu poate fi fagocitat, dar fagocitele i elibereaz enzimele lizosomale n mediul extracelular. d. Enzimele fagocitelor lezeaz esutul din jurul biofilmului i celulele planctonice sunt eliberate din biofilm. Eliberarea lor poate determina diseminarea i infecia acut n esutul nvecinat (dup Costerton et al., 1999).

4.3. Sideroforii factori de virulenFierul, dei este al IV-lea metal al planetei din punct de vedere cantitativ, se gsete majoritar sub forma hidroxizilor insolubili. Fe este substana mineral esenial pentru toate celulele eucariote i procariote, dar este toxic n concentraie mare. n cele mai multe habitate Fe2+ este instabil, fiind oxidat la Fe3+, fie spontan prin reacia cu O2 molecular, fie pe cale enzimatic, n reaciile metabolice. n mediile naturale, n prezena O2 i a H2O, la pH neutru i alcalin, Fe3+ formeaz oxidul feric hidratat (Fe2O3. nH2O) sau este legat de ageni chelatori (compui chimici n care un ion metalic multivalent este captat, sechestrat i legat n structura ciclic a agentului chelator). n organismul uman i animal, Fe este legat stabil de diferite proteine: hemoproteinele (hemoglobina, mioglobina) leag circa 2/3 din cantitatea total de Fe, n hem.

Multiplicarea bacteriilor n esuturile gazdei este limitat de mecanismele de aprare ale gazdei i este condiionat de capacitatea de a-i obine nutrienii. Bacteriile necesit prezena obligatorie a Fe2+ (forma accesibil metabolismului), cu excepia lactobacililor. Fe2+ se gsete n structura chimic a tuturor tipurilor de celule.

Fe este un component al moleculelor eseniale (citocromi, ribonucleotid-reductaza etc.), fiind necesar desfurrii unor variate reacii enzimatice, eseniale pentru cretere: replicarea ADN, transferul electronilor, metabolismul oxigenului, peroxidului i radicalului superoxid (SOD este o enzim cu Fe); Fe2+ este un cofactor de sine stttor sau parte a unui grup prostetic, n special de tip hem, ca un component esenial al catenei de transport al electronilor n membrana celular. Fierul poate fi defavorabil pentru metabolismul bacterian: radicalii liberi OH. generai n reaciile Haber-Weiss, catalizate de Fe, se pot acumula, consecina fiind moartea celulei. De aceea, sechestrarea, mobilizarea i depozitarea Fe ntr-o form netoxic, biodisponibil, este foarte important pentru celul. S-au identificat dou tipuri de proteine de depozit al Fe: bacterioferitina (depoziteaz Fe hemic i nehemic) i feritina (depoziteaz numai Fe nehemic).

Fe are nu numai un rol fiziologic deosebit, dar multe bacterii l utilizeaz pentru activarea unor factori de virulen: toxine, adezine, invazine.

n mediile naturale, ca i n organismul uman i animal, Fe se gsete n cantiti suficient de mari pentru a asigura creterea microorganismelor, dar este n forme inaccesibile. Astfel, concentraia normal a Fe n plasma mamiferelor (mai mic de l0 (M) este satisfctoare pentru creterea i multiplicarea bacteriilor, dar numeroi factori l fac inaccesibil microorganismelor. Practic, Fe disponibil lipsete, deoarece este chelat de proteine care-l leag cu mare afinitate sau este component al eritrocitelor. Un deficit parial al Fe are efect bacteriostatic, iar deficitul major are efecte letale, prin inhibiia sintezei proteinelor. Fe anorganic este insolubil n aerobioz la pH fiziologic. De aceea, sinteza componentelor celulare care utilizeaz Fe este controlat prin diferii parametri, care acioneaz n diferite condiii fiziologice i de mediu, n sens negativ (n condiiile excesului de Fe n mediu) sau n sens pozitiv (n condiiile limitante ale Fe). Concentraiile mari ale Fe duc la stoparea expresiei multor gene implicate n nglobare. n condiiile limitrii Fe, intr n aciune mecanismele reglatoare pozitive.

n organismul uman i animal, Fe este legat n complexe organice cu proteine intracelulare (feritina, hemosiderina, gruparea hem din hemoglobin sau din mioglobin), cu glicoproteine extracelulare (lactoferina din secreii - lapte, saliv, lacrimi), precum i cu transferina din snge i limf. *Cea mai mare parte a transferinei se sintetizeaz n ficat i este eliberat n fluidele organismului. Ea leag Fe feric la locul absorbiei i-l transport la locul utilizrii. Celulele mamaliene regleaz concentraia Fe intracelular, prin intermediul a dou proteine:

o protein de import al Fe, cu rol de receptor de transferin; o protein de depozit al Fe, reprezentat de feritina.

Transferina ptrunde n celul prin intermediul receptorului membranar specific. Dup ce celula import transferina, Fe este ncorporat n proteinele celulare (citocromi etc.), iar excesul este depozitat ca feritin. Cnd celula necesit o cantitate mai mare de Fe, crete densitatea receptorului de transferin i astfel celula preia o cantitate mai mare de Fe din mediul extracelular i reduce concentraia de feritin. Dac Fe se acumuleaz n exces n celul, scade densitatea receptorilor de transferin i crete cantitatea de feritin.

n plasm, hemoglobina (Hbg) este complexat cu alte proteine ca haptoglobina*, iar cantiti mici de hem pot fi legate de albumin sau de hemopexin. Fierul intracelular poate fi asociat cu Hbg, transferina sau cu lactoferina sau este depozitat sub forma feritinei.

*Haptoglobina este o protein din setul reactanilor de faz acut. Se sintetizeaz n ficat i are rolul de a ndeprta hemoglobina liber, rezultat prin hemoliza intravascular. Se formeaz un complex stabil, ireversibil, care este epurat rapid de hepatocite. Dup leziunea tisular, haptoglobina crete de 2-4 ori i se gsete n exudatul inflamator. Nivelul sczut de haptoglobin are semnificaie clinic dup vrsta de un an i se poate datora insuficienei hepatice, dar la majoritatea pacienilor, cauza este hemoliza intravascular i rata rapid de clearance a complexelor haptoglobin-hemoglobin. Nu exist o corelare cantitativ ntre nivelul haptoglobinei plasmatice i amploarea hemolizei, deoarece chiar o hemoliz minor diminueaz masiv cantitatea de haptoglobin. Dac pacientul este n faza acut a unui proces infecios sau inflamator de alt natur, nivelul normal al haptoglobinei nu exclude diagnosticul de hemoliz. Lactoferina face parte din familia transferinei. Este sintetizat de celulele fagocitare i de hepatocite. n stare liber se gsete n secreii (lapte, lacrimi, saliv, secreia mucoas care tapeteaz epiteliile). Neutrofilele elibereaz lactoferina n situsul inflamator. Identitatea secvenei aminoacizilor dintre lactoferin i transferin este de 60%.

Proteinele care leag Fe au afinitate nalt, au constante nalte de legare, de aproximativ 1036 i n mod normal sunt parial saturate. De exemplu, feritina leag circa 4500 atomi de Fe3+/molecul, iar transferina*, proteina major de transport a Fe n plasma sanguin, este saturat n proporie de 30%. Transferina i lactoferina conin 2 situsuri de legare a Fe/molecul. Homeostazia Fe controlat riguros, are ca rezultat o concentraie sczut a Fe biodisponibil liber n plasm, de circa 10-24M, de cteva ori mai mic dect nivelul necesar creterii normale a bacteriilor. De aceea, organismele patogene sunt strict limitate n privina dobndirii Fe.

Rolul Fe n patogeneza infecioas a fost demonstrat experimental. Dup administrarea parenteral a Fe la cobai, sensibilitatea la infecia cu K. pneumoniae a crescut dramatic, ceea ce demonstreaz rolul aprovizionrii cu Fe asupra patogenezei bacteriilor. De aceea, serul sanguin uman este bacteriostatic. n timpul evoluiei, cantitatea restrictiv de Fe disponibil a creat mecanisme specializate pentru utilizarea resurselor de Fe, prin contact direct sau indirect. Bacteriile i-au elaborat mecanisme adaptative prin care mobilizeaz Fe i l disponibilizeaz pentru activitile celulei. Bacteriile preiau Fe din transferin, lactoferin, hemoglobin i din complexele hemoglobin-haptoglobin, air cele cu localizare intracelular din rezerva celulei. L. monocytogenes produce un reductor al Fe3+ la Fe2+ i astfel Fe este eliberat din glicoproteinele chelatoare intracelulare.

Se recunosc dou mecanisme prin care bacteriile dobndesc Fe:

mecanismul prelurii indirecte prin intermediul sideroforilor;

mecanismul prelurii directe a Fe prin receptorii celulari care leag proteinele cu Fe. Sideroforii sunt ageni chelatori sintetizai i secretai de microorganismele procariote i eucariote (i chiar de plantele superioare), care intr n competiie pentru legarea Fe, cu proteinele gazdei care sechestreaz Fe. Denumirea general a agenilor chelatori bacterieni este cea de siderofori. Sideroforii sunt molecule mici (600 Da), difuzibile, secretate de multe microorganisme, n condiiile scderii concentraiei de Fe biodisponibil, care au n structura lor, grupri caracteristice de tipul catechol, fenolat sau hidroxamat. Structura molecular caracteristic, definit funcional ca o cuc molecular, are rolul de a lega Fe3+ (feric) din mediul extracelular. Sideroforii sunt secretai prin pompele de eflux ale suprafamiliei MFS (major facilitator superfamily).

Structura ferocromului, exemplul tipic al unui siderofor de tip hidroxamat. R = R = R = H; R = CH3 (Neilands, 1995).

Structura enterobactinei ferice, exemplul tipic al unui siderofor de tip catechol (cele 3 inele catechol asigur legarea coordinativ a Fe) (Neilands, 1995).

Structura aerobactinei, exemplu tipic al unui siderofor de tip citrat-hidroxamat (Neilands, 1995). Sinteza sideroforilor este catalizat de sintetaze neribosomale, un complex multienzimatic care activeaz i asambleaz un spectru larg de aminoacizi, ceea ce are ca rezultat diversitatea structural nalt a peptidelor macrociclice.

Sideroforii secretai formeaz complexe stabile cu Fe3+ extracelular. Ulterior, complexul siderofor - Fe3+ este recunoscut de un receptor situat n membrana extern, dar nu poate trece prin canalele membranei celulei bacteriene datorit dimensiunilor sale. Transferul membranar al Fe3+ mediat de receptor, este asociat cu reducerea lui la forma feroas (Fe2+), iar sideroforul rmne la nivelul receptorului (fig. 45 a, b). La bacteriile Gram pozitive, complexele Fe-siderofor sunt recunoscute selectiv de receptori membranari i transportate n celul cu consumul ATP. n celul, complexul Fe-siderofor se disociaz prin hidroliza sideroforului i/reducerea ionului feric la Fe2+ (feros), care este depozitat n bacterioferitin, utilizat ca un cofactor n cteva procese celulare vitale. Fe este legat n centrul sideroforilor cu o afinitate echivalent celei de legare cu transferina.

Fig. 44a. Mecanismul prelurii Fe de ctre siderofori (Baron, 1996).

Fig. 44b. Ilustrarea mecanismului prin care sideroforii funcioneaz ca mediatori ai cantitii de Fe disponibil (//www.chem.duke.edu/~alc/labgroup/research).

Sideroforii se gsesc nu numai la bacteriile patogene, ci constituie mecanisme eficiente de preluare a Fe n tot regnul procariotelor. n funcie de specie, ei sunt factori cu diferite grade de virulen. Sideroforii pot prelua ionii de Fe chiar din compui minerali, ca hematita. O modalitate frecvent de preluare a Fe este utilizarea xenosideroforilor, funcional la S. cerevisiae, adic microorganismele preiau Fe din sideroforii sintetizai de alte microorganisme. Fe intracelular poate fi obinut prin liza celulei gazd, mediat de citolizine sau hemolizine. Se elibereaz Fe, hemul sau Hbg. Unele bacterii folosesc Fe din celulele care degenereaz la suprafaa epiteliilor mucoase.

S-a constatat c genele pentru aerobactin la Shigella sp. sunt represate in vivo, n interiorul macrofagelor. Totui, unele bacterii intracelulare secret molecule siderofor-like capabile s penetreze vacuola, s se ncarce cu Fe din citoplasm i s se ntoarc n vacuol. Vacuolele parazitare pot fuziona cu vezicule de exocitoz sau endocitoz care conin Fe i l utilizeaz. Unii parazii (Toxoplasma) pot induce formarea porilor n membrana vacuolar, permind moleculelor gazdei (care transport Fe) s ptrund n interiorul vacuolei.Neisseria i Prevotella (Bacteroides) elimin proteaze specifice care degradeaz transferina i elibereaz Fe. Mecanismele directe de preluare a Fe constau n nglobarea surselor de Fe (lactoferina, transferina, feritina, hemul i/sau hemoproteinele). Dezavantajul este c mecanismele directe necesit existena receptorilor specifici pentru fiecare surs de Fe, iar structura chimic a surselor este diferit de la un compartiment la altul al gazdei. Mecanismul de preluare direct a Fe este propriu unor bacterii patogene care colonizeaz mucoasele (Neisseria sp., Bordetella sp., H. influenzae, M. catarrhalis, Actinobacillus pleuropneumoniae). Ele nu secret siderofori, dar preiau Fe prin contactul selectiv ntre componentele membranei externe, cu proteinele care leag Fe (transferina, lactoferina sau chiar hemoglobina). Neisseria sp. i H. influenzae utilizeaz ca surse de Fe numai transferina i lactoferina uman, ceea ce ar explica specificitatea lor pentru gazdele primate.

Receptorul pentru hemoglobin de la N. gonorrhoeae leag preferenial, dar nu exclusiv, hemoglobina uman, scoate hemul i-l transfer n spaiul periplasmic. Printr-un mecanism necunoscut, este internalizat numai hemul, iar hemoglobina rmne la exterior. n citoplasm, unele bacterii au enzime omologe oxigenazei hemice umane, care degradeaz hemul la -biliverdin, cu eliberarea Fe i CO*. *Toxicitatea CO pentru om se atribuie afinitii nalte pentru toate proteinele ce conin Fe hemic, scznd capacitatea hemoglobinei de a lega O2. CO este inhibitor al enzimelor cu Fe nehemic, inclusiv hidrogenaza i nitrogenaza. Mamiferele produc CO endogen prin degradarea hemului. Hbg discrimineaz ntre CO endogen i exogen. Fr discriminare, CO de origine endogen s-ar lega cu 20% din proteinele cu hem din organism. 4.4. Agresivitatea (Invazivitatea)

Puterea de invazie (agresivitatea sau invazivitatea) reprezint capacitatea agenilor patogeni de a depi prin mecanisme specifice, barierele epiteliale, de a ptrunde n esuturile gazdei i de a se multiplica, producnd efecte patologice. Microorganismele invazive au capacitatea de a ptrunde prin mijloace proprii n esuturile gazdei sau de a stimula funcia endocitar a substratului i de a-i pstra viabilitatea n mediul gazdei (fig. 45).

Fig. 45. Biologia celular a procesului infecios indus de bacterii extra i intracelulare. a, b. Reorganizarea citoscheletului; c. Ptrunderea n citoplasma celulei gazd prin endocitoz; d. Evitarea mecanismelor de aprare prin prezentarea antigenelor bacteriene asociate cu moleculele CMH, modificarea expresiei genelor pentru molecule proinflamatorii (de exempu, NF-kB); e. Aciunea direct a moleculelor bacteriene injectate prin mecanismul SST III asupra nucleului celulei gazd (dup Bhavsar et al., 2007). Invazia este modalitatea prin care microorganismele infecioase sparg barierele epiteliale ale gazdei. Multe bacterii patogene au capacitatea de a supravieui n interiorul celulei eucariote. Ele ptrund n celule care n mod obinuit nu sunt fagocitare (celulele mucoase, celulele endoteliale ale vaselor sanguine). Mediul intracelular ofer protecie microorganismului, care ori se multiplic ori persist.

n general, organismele invazive ader la celula gazd prin intermediul unei clase de molecule de adezine, denumite invazine, care orienteaz intrarea bacteriei n celul. Mecanismele de aderen declaneaz sau stimuleaz semnalele celulare, care direct sau indirect uureaz intrarea bacteriei. Invazia este un eveniment activ, susinut de funciile normale ale celulei. Suportul procesului de invazie i nglobare este citoscheletul celulei gazd.

Puine specii bacteriene sunt capabile s foreze intrarea direct n celula gazd, printr-o digestie enzimatic local a membranei celulei gazd, dup aderen. De exemplu, R. prowazecki secret fosfolipaze care produc degradarea localizat i controlat a membranei celulei gazd. Prin leziunile membranare, agentul patogen intr direct n citoplasm.

n categoria invazinelor intr o categorie de proteine asociate suprafeei celulare, dar i apendicele celulare evideniate la microscopul electronic (fimbrii i flageli) sau cele care constituie un strat fin, nalt organizat, pe suprafaa celulei. Invazinele uureaz rspndirea bacteriilor n organism, dup fixarea i multiplicarea lor la poarta de intrare.

Flagelii ca organite de motilitate sunt n acelai timp invazine, deoarece confer un avantaj evident celulelor bacteriene care trebuie s traverseze stratul vscos de mucus, pentru a ajunge la celulele epiteliale ale tractului digestiv sau respirator.

Fimbriile, la bacteriile patogene, au rol de adezine bacteriene, dar n aceiai msur ele constituie i un factor de agresivitate, deoarece confer un grad de protecie a celulei fa de factorii de aprare ai gazdei.

Unele invazine produc efect necrotic sau determin alte modificri care favorizeaz colonizarea tisular progresiv. De exemplu, unele bacterii produc hialuronidaza i alte enzime care hidrolizeaz polimerii din substana fundamental a esutului conjunctiv, favoriznd astfel invadarea vaselor sanguine i limfatice.

Agenii patogeni au elaborat strategii care le permit s invadeze suprafeele mucoase. Aderena selectiv de celulele M este o modalitate eficient de invazie. Bacteriile i virusurile care utilizeaz calea de transport a celulelor M, pot infecta mucoasa digestiv i se pot disemina sistemic.

Celulele M (Microfold), care acoper plcile Peyer reprezint o specializare local a epiteliului intestinal. Ele separ foliculii limfoizi asociai epiteliului, de lumenul intestinal. Plcile Peyer, formate din foliculi limfoizi agregai, sunt componenta major a sistemului imunitar al mucoaselor i au o funcionalitate precis: s exclud antigenele exogene, nainte ca ele s ptrund n mediul intern i s evite sau s minimalizeze expunerea aparatului imunitar sistemic, la antigenele moleculare sau celulare care tind s ptrund n mediul intern. n acelai timp, esutul limfoid asociat mucoaselor trebuie s rmn insensibil la microbiota normal a mucoaselor. MALT are calitatea de zon de control a organismului, la contactul cu antigenele, dar are i rol reglator asupra funcionalitii aparatului imunitar sistemic. Aa se explic faptul c administrarea oral a unui antigen la om sau animale, n esen, nu produce un rspuns imun sistemic, ci de obicei, un rspuns imun al mucoasei. Mecanismul nu este cunoscut, dar sistemul imunitar al mucoaselor mpiedic rspunsul imun amplu al aparatului imunitar sistemic, dup contactul cu un numr foarte mare de antigene intestinale, n special de origine alimentar. Antigenele complexe bacteriene sau virale pot iniia un rspuns imun complex, prin intermediul aparatului imunitar al mucoaselor. Deficienele funcionale ale MALT expun organismul i aparatul imunitar sistemic, unei permanente stri de activare, care depete limitele fiziologice, consecina fiind instalarea maladiilor autoimune.

Celulele M acoper plcile Peyer i pinociteaz material luminal sub form solubil, pe care l transfer macrofagelor subiacente. Macrofagele prelucreaz antigenele i le prezint limfocitelor adiacente. Celulele M sunt considerate ca un sistem timpuriu de avertizare a sistemului imunitar. Ele sunt acoperite cu un strat mucos subire, microvili scuri, dar sunt foarte active din punct de vedere al pinocitozei, comparativ cu celulele epiteliale columnare. Au puini lizosomi i materialele nglobate nu sunt supuse degradrii. Dei celulele M au evoluat ca un sistem protector strategic, proprietile lor funcionale le confer calitatea unor adevrate pori de intrare un clci al lui Achile al intestinului, deoarece bacteriile patogene dobndesc acces spre structurile profunde.

Celulele M transport macromolecule, particule i microorganisme, direct n mediul celular al foliculilor limfoizi ai mucoasei. Ele nu au receptori pentru imunoglobulinele polimerice, adic nu transfer IgA, ceea ce favorizeaz accesul antigenelor la suprafaa mucoasei. Prin epiteliul folicular, microorganismele dobndesc acces la structurile limfoide ale foliculului. Consecina este benefic, deoarece, astfel se iniiaz rspunsul imun protector fa de microorganismele luminale. Din acest punct de vedere, celulele M formeaz un sistem de avertizare timpurie. Celulele M ale foliculilor sunt specializate pentru transportul transepitelial. Suprafaa bazolateral a celulelor M este intruzat profund, formnd un buzunar mare, intraepitelial, n care sunt eliberate particulele i macromoleculele transportate. Celulele M au prelungiri bazale de circa 10 m, ce se extind n esutul limfoid subiacent i stabilesc contacte directe cu celulele limfoide sau cu celulele prezentatoare de antigen. Celulele din pliul membranar al celulei M sunt limfocite T CD4 cu receptor de tip , limfocite B i un numr mic de macrofage. Puine limfocite T sunt de memorie sau neangajate (naive). Pliul celulei M este situsul interaciunii celulelor T, cu celulele ce prezint antigenul (limfocite B i macrofage).

Sub celula epitelial M se gsete o populaie bogat de macrofage i celule dendritice, n raporturi spaiale strnse cu limfocitele T CD4 i cu limfocitele B. Macrofagele i celulele dendritice au probabil rolul de a ngloba agenii patogeni transportai de celulele M, de a prelucra i depozita antigenele.

Interaciunea agenilor patogeni cu celula M variaz larg, de la transportul simplu, pn la distrugerea celulelor epiteliale foliculare. Virusurile care ader de celulele M declaneaz procesul de endocitoz, iar bacteriile modific enzimatic suprafaa celulelor epiteliale M, induc semnalul declanator al internalizrii i altereaz bariera epitelial.

Ptrunderea virusurilor prin celulele M

Celulele M preiau virionii adereni i macromoleculele prin mecanismul endocitozei, pe calea veziculelor tapetate cu clatrin. Materialele neaderente sunt preluate prin endocitoz n faza fluid, n vezicule tapetate sau netapetate cu clatrin. Particulele mari aderente i bacteriile stimuleaz procesul de endocitoz, mediat de extensia prelungirilor celulare i reorganizarea filamentelor de actin ale citoscheletului. Nu este cunoscut dac celulele M particip la prelucrarea i prezentarea antigenelor.

Enterovirusurile ptrund n organism pe cale oral. Poliovirusul de tip I i tulpina Sabin atenuat ader selectiv de celulele M i se multiplic n plcile Peyer, nainte de a se disemina sistemic. Deoarece poliovirusul depete bariera intestinal prin celula M, i confer calitatea de vector al unor vaccinuri orale.

Transmiterea sexual a HIV se face pe cale vaginal sau anal. Infecia este uurat de leziunile epiteliale, dar HIV poate traversa epiteliile simple i stratificate. In vivo, celulele epiteliale ale rectului se pot infecta, dar dovezile nu sunt concludente pentru epiteliul vaginal.

n rectul uman, foliculii limfoizi sunt acoperii de celule M. Celulele M rmn o cale posibil de acces a HIV, la celulele limfoide subiacente.

Ptrunderea microorganismelor la nivelul epiteliului folicular are i consecine nefavorabile, deoarece acesta poate fi o cale de acces a microorganismelor patogene (S. typhi), la structurile submucoase.

Enterobacteriile au mecanisme proprii de invazie. Agenii patogeni enterici strpung bariera mucoasei intestinului subtire, prin motilitate flagelar, la nivelul celulelor M.

Aderena bacteriilor de celulele eucariote necesit recunoaterea oligozaharidelor specifice ale glicoproteinelor. Faptul este evideniat de rezultatele experimentale in vitro: oligozaharidele sunt cei mai puternici inhibitori ai interaciunii bacteriilor cu suprafaa celulei eucariote. Celulele bacteriene interacioneaz cu celulele M, probabil, prin intermediul glucidelor. Celulele M posed o diversitate de glicoconjugate, care moduleaz capacitatea lor de a prelua microorganismele.

E. coli nepatogen din intestin nu ader selectiv la celulele epiteliale, dar anumite tulpini patogene colonizeaz mucoasa i interacioneaz cu celulele M. Aderena la celulele epiteliului intestinal i la celulele M induce dezagregarea microvililor i respectiv a pliurilor celulelor M, odat cu formarea la situsurile de aderen a unor structuri speciale, denumite piedestale consecin a reorganizrii filamentelor de actin. V. cholerae interacioneaz strns cu zone extinse ale membranei apicale ale celulei M. Semnalul activator induce reorganizarea actinei submembranare i celula bacterian este fagocitat fr lezarea celulei M. nglobarea de ctre celulele M nu produce maladia. Agentul patogen nu supravieuiete n mucoas i nu se disemineaz sistemic.

nglobarea vibrionilor de ctre celulele M activeaz un rspuns imun protector al mucoasei: secreia de sIgA anti-toxin i anti-LPS, care pot preveni colonizarea mucoasei cu V. cholerae i implicit maladia diareic.

n intestinul subire, V. cholerae exprim un grup de adezine proteice prin intermediul crora ader de enterocite. Pilii stabilizeaz coloniile pe suprafaa mucoasei, iar toxina choleric induce secreia ionilor de clor, din celulele intestinale n lumen.

Ingestia celulelor de Salmonella induce formarea focarelor de infecie n plcile Peyer. S. typhi i S. typhimurium ader rapid i selectiv de celulele M, dar poate invada direct prin epiteliul vilozitilor. Salmonella invadeaz enterocitele prin mecanismul fagocitozei n vacuole mari, indus dup dezasamblarea microvililor i reorganizarea citoscheletului apical.

Experienele cu anse intestinale ligaturate au evideniat c dup 30 de minute de la injectare, Salmonella induce creterea volumului celulelor M, nglobarea rapid a bacteriilor, urmat de degenerarea celulelor M i accesul celulelor infecioase la structurile mucoasei.

Yersinia ptrunde n mucoasa intestinal pe calea celulelor M: ader preferenial la celulele M, este nglobat i traverseaz citoplasma prin transcitoz.

Shigella, un patogen cu localizare intracelular facultativ, induce leziuni severe ale mucoasei intestinului i colonului, nsoite de pierderea funciei de barier a epiteliului. Shigella ader de membrana plasmatic, este fagocitat i, dup ruperea membranei fagosomului, este eliberat n citoplasm, unde bacteriile se multiplic, induc asamblarea unei cozi de filamente de actin i sunt extruzate ntr-o vacuol de origine membranar, care este fagocitat ulterior de celulele nvecinate.

Experienele cu enterocite intestinale, in vitro, au evideniat c S. flexneri nu invadeaz suprafaa apical dac jonciunile epiteliale nguste sunt intacte. Invazia este posibil numai prin membrana bazolateral. In vivo, Shigella invadeaz mucoasa, n primul rnd, pe calea celulelor M, urmat de invazia celulelor epiteliale prin suprafaa bazolateral. Ulcerrile mucoasei au cea mai mare frecven n ileon i n colon, unde foliculii limfoizi i celulele M sunt mai numeroi.

4.5. Toxigenitatea

Toxigenitatea (toxigeneza) reprezint capacitatea unui agent patogen de a elabora n cursul creterii sale, una sau mai multe substane toxice. Toxigeneza este o proprietate esenial a patogenitii bacteriene.

Sub denumirea de toxin sunt cuprinse toate substanele toxice de provenien biologic (sintetizate de bacterii, fungi, celule vegetale sau animale). Termenul de toxin deriv din cuvntul grecesc toxicon, care nseamn otrav. Unele sunt secretate de celulele bacteriene n cantiti foarte mici, fiind proteine cu aciune predominant enzimatic i poart denumirea generic de exotoxine. Altele, de natur lipopolizaharidic (LPS), care nu au aciune enzimatic i sunt biologic active la concentraii mult mai mari, aparin endotoxinelor. Se cunosc circa 140 de toxine proteice, din care 2/3 sunt produse de bacteriile Gram-pozitive, dar i de unele specii de bacterii Gram-negative (de exemplu, Ps. aeruginosa, Sh. dysenteriae, V. cholerae, V. parahaemolyticus, E. coli). Unele specii bacteriene produc ntre 5 i l0 tipuri de toxine.Clasificarea toxinelor bacteriene

Pentru a-i exercita efectul, toxinele trebuie s se elibereze din celule i s se solubilizeze n umorile organismului. Dup sintez, toxinele pot rmne asociate permanent sau temporar cu celula sau sunt eliminate la exterior. Aceste diferene sunt dependente, n primul rnd de specia productoare, precum i de fazele succesive ale evoluiei unei populaii bacteriene: faza exponenial, staionar sau de declin. Chiar toxinele care n faza exponenial a culturii bacteriene sunt asociate celulei, n faza de declin se gsesc libere n mediul extracelular datorit lizei celulelor. Din aceast cauz, studiul raportului topologic ntre celul i toxin are semnificaie numai pentru faza de evoluie a culturii bacteriene. Din acest punct de vedere se disting urmtoarele categorii de toxine:

a) Toxine localizate n celul (citoplasmatice) produse de bacterii Gram-negative (Sh. dysenteriae, Y. pestis, B. pertusis, E. coli etc.) i Gram-pozitive (enterotoxina produs de Cl. perfringens, streptolizina S, pneumolizina produs de Str. pneumoniae, o toxin sintetizat de Cl. difficile). Toate sunt de natur proteic. Sunt localizate n citoplasm sau sunt asociate membranei citoplasmatice i pot fi eliberate dup ndeprtarea peretelui prin liz mecanic sau prin extracie chimic.

b) Toxinele constitutive ale peretelui celular, produse numai de bacteriile Gram-negative i care corespund endotoxinelor clasice. Sunt situate n afara membranei citoplasmatice i fac parte din structura membranei externe a peretelui celular. Din punct de vedere chimic, endotoxinele sunt complexe glicolipidice sau glicolipoproteice. Ele nu sunt niciodat eliberate n cursul fazei de cretere exponenial, ci numai prin dezagregarea peretelui celular.

c) Toxinele eliminate n mediul extern sau exotoxinele propriu-zise sunt de natur proteic i sunt produse mai frecvent de bacteriile Gram-pozitive (toxina difteric, toxinele stafilococice, toxina de B. anthracis etc.), dar i de cele Gram-negative (V. cholerae, Ps. aeruginosa). Exotoxinele ndeplinesc n mod obligatoriu, 3 condiii:

- se gsesc n mediul de cretere, independente de celula care le-a produs;

- eliberarea lor n mediul extracelular nu necesit autoliza celulei. Celula rmne viabil, continu s creasc i s se multiplice;

- nu se acumuleaz n celul. Aceste criterii se aplic celulelor n faza de cretere exponenial i staionar, deoarece n faza de declin, celulele pot prezenta fenomene de autoliz, independente de sinteza toxinei.

d) Toxinele cu localizare mixt (endocelular i exocelular), n funcie de faza de evoluie a culturii bacteriene. n faza exponenial, toxinele sunt secretate parial n mediu, dar o fracie semnificativ rmne n interiorul celulei i este eliberat prin autoliz (toxinele tetanic, botulinic).

Mult timp s-a considerat c exotoxinele sunt de natur proteic, iar endotoxinele de natur lipopolizaharidic. Aceast difereniere nu este net, deoarece unele toxine proteice aparin categoriei endotoxinelor, fiindc rmn asociate celulei productoare i invers, uneori, toxinele de natur lipopolizaharidic sunt eliminate la exterior ca exotoxine. De aceea, clasificarea toxinelor trebuie s se fac dup criteriul compoziiei chimice. Din acest punct de vedere, majoritatea exotoxinelor sunt de natur proteic, iar endotoxinele de natur lipopolizaharidic.

Raynaud i Alouf (1970) au clasificat toxinele n raport cu compoziia chimic i cu localizarea celular.

Grupa I cuprinde toxinele proteice intracitoplasmatice ale bacteriilor Gram-negative, eliberate dup ruperea mecanic, enzimatic, prin autoliza nveliurilor sau prin extracie chimic. Sunt sintetizate de B. pertussis, Sh dysenteriae (neurotoxina), Y. pestis.

Grupa a II-a cuprinde toxinele lipopolizaharidice sau glico-lipo-peptidice (endotoxine), componente structurale ale peretelui celular Gram-negativ.

Grupa a III-a cuprinde exotoxinele proteice propriu-zise, produse de V. cholerae, Cl. tetani, C. diphteriae.

Grupa a IV-a cuprinde toxinele proteice cu localizare intra- i extracelular, n cursul fazei logaritmice de cretere: toxinele produse de Cl. tetani, Cl. botulinum, Cl. oedematiens, Cl. sordelii. Din punctul de vedere exclusiv al compoziiei chimice, se disting:

1) Toxine proteice, reprezentate de exotoxinele produse de bacteriile Gram-pozitive i de toxinele proteice intracelulare ale unor bacterii Gram-negative: B. pertussis, Y. pestis, Sh. dysenteriae (neurotoxina).

2) Toxine glico-lipo-polipeptidice, corespunztoare endotoxinelor.

n raport cu tropismul lor se disting: neurotoxine, enterotoxine, cardiotoxine, cu efecte limitate la esutul respectiv, sau toxine pantrope, cu efecte asupra mai multor categorii de esuturi.Determinismul genetic al sintezei toxinelor

Sinteza toxinelor bacteriene este codificat de gena tox, a crei localizare este cromosomal, plasmidial sau fagic. La V. cholerae, subunitile toxinei holerice sunt codificate de gene cromosomale, asociate cu alte gene ce codific ali factori de virulen. Astfel de grupe de gene de virulen se numesc insule de patogenitate. Secvena lor difer mult de a altor gene cromosomale, ceea ce denot c ele sunt achiziii relativ recente n evoluie. Ar putea s aib originea prin integrarea unui element genetic exogen fagul.

La Cl. botulinum, gena tox, cu situs cromosomal, prezint mai multe alele, care codific sinteza a 7 serotipuri de toxina (notate A --- G), care nu dau reacie ncruciat semnificativ cu anticorpii obinui fa de una dintre ele.

Enterotoxinele i hemolizinele de E. coli, toxina dermo-exfoliativ stafilococic sunt codificate de gene plasmidiale.

Gena tox, codificatoare a toxinei difterice este localizat n genomul unor bacteriofagi ADN (, P, 1, W). Activitatea ei este controlat de o gen situat pe cromosomul bacterian.

Fagii purttori ai genei tox se gsesc n celulele de C. diphteriae n stare integrat (profag), de fag virulent replicativ sau sub forma de replicon autonom represat. Este cunoscut modul de funcionare a genei tox, purtat de fagul , ce se integreaz ca profag. Ea se gsete aproape de situsul de inserie a genomului fagic n cromosomul bacterian, dar are propriul su promotor i se poate exprima independent de alte gene fagice, dar poate fi represat fr s influeneze biosinteza altor proteine fagice. Aceast gen nu pare a fi esenial pentru genomul fagic. Modificarea ei mutaional nu influeneaz ciclul de multiplicare a fagului. Se consider c gena tox a acestui fag este de origine bacterian, mobilizat prin procesul de transducie fagic.

Sinteza toxinei eritrogene streptococice (scarlatinoas), precum i a toxinelor botulinice C i D este codificat de fagi temperai. La Cl. perfringens, toxigeneza este legat temporal de procesul sporulrii. Sporularea este o condiie obligatorie, dar insuficient pentru producerea toxinei. Toxina pare a fi un produs al unei gene de sporulare i este o protein de structur a tunicii sporale.

Cile secreiei proteinelor la bacteriile Gram-negative Interaciunea bacteriilor patogene cu celulele gazd este caracterizat de factori localizai pe suprafaa bacteriei sau secretai n spaiul extracelular.

Proteinele bacteriene secretate sunt numeroase, diferite structural i ndeplinesc o varietate larg de funcii: proteoliza, hemoliza, citotoxicitatea, fosforilarea i defosforilarea proteinelor. Transportul acestor proteine din citoplasm n spaiul extracelular se face pe mai multe ci.Pentru bacteriile patogene, termenul de secreie (sau export) semnific transportul activ al proteinelor din citoplasm, prin membran la exteriorul bacteriilor Gram pozitive i respectiv, n spaiul periplasmic la bacteriile Gram-negative.Termenul de translocaie semnific transferul unei molecule care rmne la suprafaa celulei bacteriene, n membrana citoplasmatic sau n stratul mureinic la bacteriile Gram-pozitive sau n membrana intern a bacteriilor Gram-negative.

Secreia proteinelor urmeaz o cale comun la bacteriile Gram-pozitive i negative, cu implicarea cii generale de secreie (calea Sec-dependent). Dup traversarea membranei citoplasmatice, proteinele translocate urmeaz ci diferite: la bacteriile Gram-pozitive, proteinele sunt fie eliberate n mediul extracelular, fie ncorporate n peretele celular;

la bacteriile Gram-negative, proteinele translocate prin membrana intern sunt eliberate n spaiul periplasmic.

La bacteriile Gram-negative s-au descris 5 ci de secreie a proteinelor (I-V) (fig. 47-48). Sistemele de secreie de tipul 1 (TOSS) sunt sec- independente, implicate n secreia hemolizinelor de E. coli, hemolizinei cu funcie adenilat ciclazic (HlyA) i a hemaglutininei filamentoase (FHA) de la B. pertussis, a proteazelor alcaline de la Ps. aeruginosa, a leucotoxinelor de la Pasteurela haemolytica, a metaloproteazei de Erwinia chrysantemum. Secreia unei molecule prin TOSS nu necesit secven semnal, ns necesit 3-4 proteine accesorii care formeaz un canal transmembranar prin care sunt transportate proteinele secretate. Genele care codific pentru proteinele accesorii au secvene apropiate de genele codificatoare pentru moleculele secretate. Moleculele accesorii sunt omologe i adesea interanjabile. Energia necesar transportului rezult prin hidroliza ATP (una dintre proteinele accesorii conine un domeniu de legare a ATP), iar regiunea C-terminal a moleculelor secretate codific informaia necesar secreiei. Secreia HlyA se face printr-un proces continuu prin membrana intern i extern. Proteinele secretate prin TOSS nu au peptidul leader cu rol de semnal, nu sunt supuse clivajului proteolitic, iar semnalul de secreie este localizat n secvena de C-terminal de 60 de aminoacizi a proteinei secretate (C. Hueck, 1998). Nu sunt prelucrate n timpul secreiei i nu formeaz intermediari periplasmici distinci. Funcionalitatea TOSS, exemplificat de -hemolizina de E. coli i de adenilil-ciclaza de B. pertussis, este conferit de 3 proteine: o protein a membranei interne din clasa ABC (ATP binding casette); o protein de fuziune membranar; o protein a membranei externe ce formeaz un por. Procesul de secreie este iniiat dup ce un semnal de secreie de la captul C-terminal al moleculei destinat secreiei interacioneaz cu proteinele transportoare ABC. Secvena semnal este recunoscut specific de transportorul ABC.

Sistemele de secreie de tipul III (TTSS) funcioneaz pentru secreia specific a factorilor de virulen a unor ageni patogeni ai omului, animalelor i plantelor: Yersinia spp. (proteina Yops), Shigella spp, Salmonella spp, E. coli EPEC, EHEC (O157: H7), Ps. aeruginosa (exoenzima S), Vibrio parahaemolyticus, Bordetella spp, Chlamydia trachomatis, pentru toxinele produse de Xanthomonas campestris, Ps. solanacearum, Ps. syringae, Erwinia amylovora.

Proteinele secretate pe cile de tip I i III traverseaz membranele intern i extern ntr-o singur etap, nu au secven leader i sunt exportate ntr-o form nemodificat. Deoarece proteinele exportate nu au secven leader, ambele ci sunt independente de sistemul sec i nu implic prelucrarea N-terminal a proteinelor secretate. Secreia proteinelor pe aceste ci este un proces continuu, fr prezena distinct a intermediarilor periplasmici.

Sistemul de tip III este specializat pentru secreia factorilor de virulen care nu pot difuza i nu pot ptrunde independent, ci sunt transferai direct n celul i acioneaz asupra factorilor intracelulari ai gazdei. n general, expunerea celulelor gazd la proteine de tip III, n absena celulei bacteriene, nu are efect sau efectul este minim. Activitatea unor sisteme de transport de tip III este dependent sau este stimulat ca rspuns la contactul bacteriei cu celula gazd. Mecanismul de transport care elibereaz factorii de virulen direct n celula gazd asigur eficiena interaciunii i utilizarea cu randament optim a proteinelor bacteriene.

Ca i TOSS, TTSS transport moleculele efectoare prin membrana intern i extern ntr-o modalitate Sec-independent, dar dependent de contactul cu substratul tisular al gazdei i are rol n secreia i translocaia* unor proteine bacteriene.

*Secreia i translocaia sunt evenimente distincte funcional. Termenul de translocaie este folosit pentru a descrie transportul proteinelor din celula bacterian, prin membrana plasmatic, n citosolul celulei int eucariote, iar secreia semnific transportul proteinelor din citoplasma bacterian, n spaiul extracelular. Trstura esenial a TTSS este injectarea proteinelor efectoare direct n celula eucariot, adic funcionarea sa este dependent de contactul agentului patogen cu membrana celulei gazd eucariote i permite eliberarea factorilor de virulen n interiorul acesteia. Moleculele secretate (efectoare) interfer cu cile de semnalizare ale celulei gazd. TTSS funcioneaz numai la bacteriile Gram-negative i transport proteinele prin membrana intern, stratul de peptidoglican, membrana extern i prin barierele celulei gazd (membrana plasmatic i chiar prin peretele celulei vegetale). TTSS sunt inductibile la contactul agentului patogen cu celula gazd i, n esen, au rolul de a transloca factorii bacterieni de virulen, direct n celula gazd n timpul infeciei.

Sistemul de secreie de tip III este un mecanism de virulen bine conservat la foarte bacterii Gram-negative patogene, dar proteinele secretate sunt foarte diferite. Dei patogenii posed i ali factori de virulen, sistemul de secreie de tip III este determinantul esenial al virulenei, deoarece multe dintre proteinele secretate astfel interacioneaz direct cu componentele celulare, alternd transducerea semnalelor, sau acioneaz n citoplasma celulei eucariote n care sunt translocate. Dintre miile de proteine bacteriene, doar cteva sunt secretate prin sistemul de secreie de tip III n spaiul extracelular sau translocate n celula gazd. Sistemul de secreie de tip III este alctuit din circa 20 de proteine, majoritatea localizate n membrana intern, asemntoare cu cele din corpusculul bazal al flagelului bacteriilor Gram-pozitive i Gram-negative. De aceea se presupune c sistemul TTSS a aprut prin duplicarea genelor celulare. Aparatul TTSS necesit o ATP-az, probabil asociat membranei. Transferul din spaiul periplasmic, prin membrana extern, este mediat de un set restrns de proteine suplimentare sau pe calea secretorie general alctuit din cel puin 12 proteine.

Semnalul de secreie este secvena de 15-20 de aminoacizi N-terminali ai proteinei secretate. Secvenele N-terminale ale proteinelor secretate pe calea sistemului de tip III nu sunt asemntoare. Unele sisteme de secreie de tip III asambleaz structuri macromoleculare la suprafaa celulei bacteriene, care pot fi implicate n translocaia moleculelor efectoare n celula eucariot (fig. 46). Cele mai proeminente sunt structurile cu form de ac, observate pe imaginile electrono-optice.

Fig. 46. Structura acicular proeminent la suprafaa unor bacterii patogene, cu rol n translocaia proteinelor efectoare n citoplasma celulei gazd. Amnunte n text (dup Coburn i col., 2007).La Salmonella, Shigella i Yersinia, structurile sunt rigide, luminale, lungi de 45-80 nm, cu rolul de a transloca proteinele n celula gazd, iar la E. coli patogen, acul se extinde cu apendice filamentoase care par s faciliteze ataarea bacteriei de celula gazd prin stratul gros de glicocalix.. Acul TTSS este aezat pe o pereche de inele concentrice incluse, unul n membrana intern, cellalt n membrana extern. Cele dou inele, asemenea inelelor corpusculului bazal al flagelului, par s formeze o cale de transport direct i continu prin membrana intern, stratul peptidoglicanic i prin membrana extern. La bacteriile fitopatogene, structura echivalent acului este asemntoare pilului (pilul Hrp). Este flexibil, luminal, cu lungimea de 2 m, adaptat s traverseze peretele gros al celulei vegetale.

Varietatea maladiilor cauzate de agenii patogeni la diferite gazde este reflectat de diversitatea proteinelor secretate pe calea sistemului de tip III: unele mediaz invazia bacteriei n esuturile gazdei, altele paralizeaz ori omoar celula gazd. Sistemul de secreie de tip III este funcional pentru biogeneza flagelului la Ps. aeruginosa, pentru secreia proteinei InvA la Salmonella, care induce un semnal n celula gazd ce determin internalizarea bacteriei. InvA este omolog cu MxiA de Shigella i cu LcrD de Yersinia, de asemenea cu rol n secreia factorilor de invazie.

Calea de secreie de tip III a fost iniial identificat la Yersinia, unde funcioneaz pentru secreia a circa 12 proteine, majoritatea cu rol n virulen (proteinele Yops - Yersinia outer proteins). Sh. flexneri posed o plasmid de virulen, pe care sunt localizate circa 15 gene care codific antigenele Ipas (invasion plasmid antigens), ce determin capacitatea de invazie a celulelor epiteliale ale mucoasei colonului, cu apariia simptomelor clinice de dizenterie. Salmonella secret proteinele Sip (Salmonella invasion proteins), omologe proteinelor Ipas, necesare invaziei celulelor. Antigenele Ipas nu conin peptidul cu rol de semnal, sunt localizate pe suprafaa extern a bacteriei, dar i n mediul extracelular i sunt transferate n celula gazd prin TTSS, ca i antigenele Sip.

Multe dintre componentele TTSS sunt omologe proteinelor de la baza flagelului. Cteva proteine de la baza flagelului folosesc energia din hidroliza ATP pentru a propulsa moleculele de flagelin prin lumen, la captul distal. Foarte probabil, TTSS folosete un mecanism asemntor, energizat de ATP, pentru propulsarea proteinelor prin canalul central al pilului n celula int. Dup ce proteina a fost eliberat, plierea poate fi completat de chaperoni citosolici ai celulei int. Sistemul de secreie de tip III s-a pstrat la bacteriile Gram-negative patogene pentru plante (E. amylovora, Ps. solanacearum, Ps. syringae i X. campestris). Interaciunea agentului patogen cu planta gazd determin procesul infecios la plantele sensibile i reacia hipersensibil* la cele rezistente. Genele codificatoare s-au denumit hrp. La unele organisme, genele aparatului de secreie de tip III sunt localizate pe plasmide specifice patogenilor, absente la speciile nepatogene. La ali patogeni (S. typhimurium, EPEC, Ps. syringae, Ps. aeruginosa, E. amylovora, Xanthomonas), genele codificatoare ale aparatului de translocaie de tip III sunt localizate pe cromosom. *Rspunsul hipersensibil al plantelor rezistente nu are nimic comun cu reacia de hipersensibilitate a mamiferelor i se caracterizeaz prin colapsul rapid i necroza esuturilor care au venit n contact cu agentul patogen, urmat de stoparea progresiei procesului infecios. Proteina inductoare a reaciei hipersensibile la plantele rezistente (harpin) nu are secvena clasic N-terminal i este asociat cu membrana extern, o situaie omolog cu a proteinelor Yops i Ipas, descrise iniial ca proteine asociate membranei, nainte de a fi secretate n mediul extracelular.

Practic, toate bacteriile Gram-negative patogene pentru plante posed secvene omologe genelor hrp, cu excepia A. tumefaciens, care produce procesul patologic printr-un mecanism unic.

Descoperirea genelor de virulen la bacteriile patogene pentru mamifere i la cele patogene pentru plante, a cror secven pstreaz un grad semnificativ de omologie, a creat o punte de legtur ntre cele dou domenii de cercetare i ridic probleme de filiaie ntre organisme ndeprtate filogenetic (Gijsegem, 1993).

Cile de secreie II i IV, dependente de sistemul general de secreie celular (Sec-dependente), traverseaz membrana extern i intern n etape distincte. La ambele sisteme, exportul prin membrana intern, n spaiul periplasmic, este mediat de sistemul proteinelor de secreie Sec dar difer prin cile pe care proteinele sunt transportate prin membrana extern. Proteinele secretate pe cile II i IV se sintetizeaz pe ribosomii citoplasmatici ca preproteine, cu o secven semnal N-terminal ce orienteaz proteina spre calea de secreie Sec a membranei interne. Trstura definitorie a exportului proteinelor prin sistemul sec dependent este prezena unei secvene semnal de circa 30 de aminoacizi hidrofobi la captul N-terminal al proteinei. Secvena semnal uureaz transportul proteinelor n spaiul periplasmic i este ulterior clivat de o peptidaz specific (signal-peptidaz). Cile de secreie sec-dependente cuprind un set de proteine localizate n membrana intern, o ATP-az asociat membranei citoplasmatice (Sec A) ce furnizeaz energia necesar exportului proteinei i o protein chaperon care are rolul de a se lega de proteina int nainte de a fi secretat.

Sistemul de secreie de tip II este varianta principal a cii secretoare generale (gsp) sec-dependent, utilizat pentru transportul moleculelor prin membrana intern n spaiul periplasmic. Proteinele accesorii (circa 14) mediaz exportul moleculelor prin membrana extern. Cel mai studiat sistem de secreie de tip II este al pululanazei la Klebsilla oxytoca, alctuit din cel puin 7 proteine localizate n membrana citoplasmatic i alte proteine din membrana extern.

Sistemul de secreie de tip II este calea principal pentru secreia enzimelor degradative extracelulare, de ctre bacteriile Gram-negative: elastaza, fosfolipaza C, exotoxina A secretat de Ps. aeruginosa, pululanaza la Klebsiella oxytoca), o lipoprotein ce hidrolizeaz amidonul i care, dup ce este secretat n mediul extern, formeaz micelii, toxina de V. cholerae, proteina pililor de tip IV de la Ps. aeruginosa.Aparatul Sec este alctuit din mai multe proteine: una dintre ele - Sec A- conine situl de legare la ATP, care prin hidroliz furnizeaz energia necesar transportului ATP-az. Alte cteva proteine sunt integrate n membrana intern; o semnal-peptidaz cliveaz o secven semnal N-terminal implicat n procesul de export al moleculelor n spaiul periplasmic. Aici, restul proteinei adopt o stare quasinativ, facilitat de chaperoni.Transportul prin membrana extern necesit alte 12-16 proteine accesorii, din clasa celor integrate, ce poart denumirea generic de secreton. Calea de secreie de tip IV (TFSS) este funcional pentru o serie de toxine bacteriene care sunt eliberate din celul printr-un mecanism de autotransport. Autotransportorii utilizeaz un sistem sec-dependent i necesit clivarea unei secvene semnal pentru translocaia prin membrana intern. Proteinele sistemului de secreie de tip IV traverseaz membrana extern i formeaz un por prin care trece proteina secretat. Proteinele secretate traverseaz membrana extern n virtutea secvenei C-terminale, care este ndeprtat enzimatic dup ce proteina este eliberat din membrana extern: astfel sunt secretate toxinele-enzime cu activitate proteazic specific ce cliveaz IgA produse de N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae, citotoxina vacuolant sintetizat de Helicobacter pylori, serin-proteaza de Serratia marcescens, o familie de proteine din membrana extern la B. pertussis, t