Metode biochimice de determinare a glicemiei folosite in diagnosticarea si monitorizarea diabetului zaharat tip IIIntroducere

Diabetul zaharat tip II (DZ II) este o afectiune cronica din ce in ce mai intalnita in societatea moderna, strans legata de modul de viata si de alimentatie. Din pacate, diagnosticul precoce este pus rar, datorita ignorarii simptomelor de catre pacient. Astfel se ajunge la complicatii ireversibile la nivel macrovascular si microvascular, precum si la scurtarea duratei de viata cu 10-15 ani.

Prevalenta mare si severitatea complicatiilor justifica efortul financiar important al majoritatii tarilor lumii, atat pentru diagnostic, cat si pentru monitorizarea acestei afectiuni.Diabetul zaharat tip II este o afectiune definita de nivelul glucozei din sange, care la randul ei este determinata de integritatea mecanismelor metabolismului glucidic.

Glucoza

Glucoza este cel cel mai important monozaharid din sange, care rezulta din digestia carbohidrantilor si din conversia hepatica a glicogenului in glucoza. Aceasta reprezinta un furnizor indispensabil de energie care sustine activitatea celulara. Nivelul glucozei din sange este reglat in mod direct prin activitatea a doi hormone cu actiune antagonica: glucagonul si insulina. Astfel, glucagonul accelereaza conversia glicogenului in glucoza si determina astfel cresterea glicemiei, pe cand insulina creste permeabilitatea membranelor celulare la glucoza in celule ,stimuleaza formarea glicogenului si reduce concentratia glucozei din sange.Alti hormoni care detin un rol important in metabolismul glucozei sunt ACTH, glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.

Degradarea glucozei se realizeaza prin procesul de glicoliza.

Metabolismul glucozei poate fi alterat prin mai multe mecanisme:

- incapacitatea celulelor pancreatice beta de a secreta insulina,

- reducerea numarului receptorilor insulinici,

- malabsorbtia intestinala a glucozei,

-incapacitatea ficatului de a metaboliza glicogenul,

- modificarea concentratiei hormonilor implicati in metabolismul glucozei.Indicatori biochimici de screening si diagnostic pentru diabetul zaharat tip II

In absenta unui marker biologic mai specific pentru a defini diabetul, determinarea glucozei plasmatice a ramas elementul de baza al criteriilor de diagnostic. Stabilirea valorilor cut-off pentru diagnosticul diabetului a fost consecinta analizei a doua seturi de informatii:

-nivelurile glucozei plasmatice asociate cu risc de complicatii microvasculare specifice, in special retinopatie;

-distributia in populatie a valorilor glucozei plasmatice.

Din 1965 Organizatia Mondiala a Sanatatii (OMS) a initiat publicarea de ghiduri pentru diagnosticul si clasificarea diabetului. Acestea au fost revizuite in 1998 si publicate sub denumirea de Ghid pentru Definitia, Diagnosticul si Clasificarea Diabetului Zaharat. Ca urmare a cresterii informatiei disponibile privind aceasta afectiune ADA (American Diabetes Association) a modificat in 2003 criteriile pentru diagnosticul hiperglicemiilor intermediare8.

Criteriile ADA (American Diabetes Association) pentru diagnosticul diabetului zaharat includ:

Simptome sugestive (poliurie, polidipsie, scadere ponderala inexplicabila), la care se adauga o valoare a glucozei random >=200 mg/dL (>=11.1 mmol/L) sau

Valoarea glicemiei bazale >=126 mg/dL (>=6.99 mmol/L) sau

Valoarea glicemiei >=200 mg/dL la 2 ore dupa administrarea a 75g glucoza (in cadrul testului de toleranta la glucoza)1.Recomandari pentru determinarea glucozei serice/plasmatice: screening-ul, diagnosticul si monitorizarea diabetului zaharat;

diagnosticul hipoglicemiei.

Se pot recolta 4 tipuri de probe:

Glucoza plasmatica/serica determinata jeun (bazala).

Glucoza serica determinata la 2 ore postprandial.

Glucoza plasmatica/serica determinata dintr-o proba de sange recoltata intr-un moment oarecare al zilei, indiferent de intervalul de la ultima masa (random).

Glucoza plasmatica/serica determinata in cadrul testului de toleranta la glucoza (la 2 ore dupa administrarea a 75 g glucoza) 1;2.In conditii fiziologice, dupa ingestia alimentara, nivelul glicemiei incepe sa creasaca in aproximativ 15 minute,atinge un maxim al concentratiei in 30-45 minute, iar in aproximativ 1-2 ore revine la nivelul bazal si ramane stabil pana la urmatoarea masa. Determinarea glicemiei din sangele capilar cu ajutorul testelor rapide(glucometre) nu este utilizata pentru stabilirea unui diagnostic (ex.diabet zaharat), ci pentru urmarirea evolutiei bolii (monitorizarea si automonitorizarea echilibrului glicemic).Prin urmare, exista doua tipuri de analize de laborator care se pot utiliza in aceasta afectiune si anume determinarea glicemiei si determinarea hemoglobinei glicozilate.

Determinarea glucozei din sangeIndiferent de momentul ales pentru prelevarea probelor de sange, determinarea nivelului de glucoza din sange presupune utilizarea acelorasi metode de lucru. Efectuarea glicemiei permite evaluarea statusului curent al metabolismului carbohidrailor la pacienii diabetici n momentul recoltrii probei de snge. Chiar daca in prezent laboratoarele de analize folosesc aparatura avansata, metodele de baza in determinare raman cele clasice. Pentru determinarea glucozei din sange in laboratorul clinic, se utilizeaza mai frecvent modele colorimetrice bazate pe reactii intre glucoza si o substanta cromogena. Substanta cromogena poate fi antrona sau o-toluidina. Aceste metode sunt rapide, iar valorile obtinute sunt mai apropiate de valoarea glucozei reale, obtinuta prin metoda enzimatica.

Recoltarea sangelui pentru determinarea glicemiei se face pe fluorura de sodiu (0.01g pentru 1ml sange recoltat) pentru preintampinarea coagularii si a fenomenului de glicoliza.DOZAREA GLUCOZEI-METODA COLORIMETRICA CU O-TOLUIDINA

Principiul metodei:

Prin conjugarea aldo- si cetohexozelor cu amine aromatice se obtin compusi colorati a caror intensitate se poate determina prin colorimetrare sau fotometrare.

Pentru dozarea glucozei, amina cea mai potrivita este o-toluidina care da cu aldohexozele un compus intens colorat in verde.

Reactivi:

-solutie de acid tricloracetic 20%

-solutie de acid tricloracetic 5%

-solutie de o-toluidina 0.75M

Preparare :

Se amesteca 80ml o-toluidina cu 920ml acid acetic glacial si se adauga 2,5g tiouree. Se conserva in sticle brune maximum o luna

-solutie standard de glucoza 100mg%

Preparare :

Se dizolva 100mg glucoza in 80ml solutie saturata de acid benzoic si dupa dizolvare se completeaza cu aceeasi solutie pana la 100ml. Solutia se poate conserva foarte bine cateva luni.

Tehnica de lucru :

Se pregatesc 2 eprubete de centrifuga, una pentru proba de analizat si una pentru proba standard :Exprimarea cantitatiiProba de analizatProba standard

Sange total, ser sau plasmaMl0.2-

Solutie standard de glucozaMl-0.2

Apa distilataMl1.51.5

Acid tricloracetic 20%Ml0.50.5

Fiecare eprubeta se agita penrtu omogenizare, se lasa in repaus 5 minute, dupa care se centrifugheaza timp de 10 minute la 3500-4000 turatii pe minut. Din supernatantul rezultat in fiecare eprubeta,se pregatesc :ExprimareacantitatiiProbaDe analizatProbastandardProba

In alb

Supernatant de la proba cu sangeMl0.5--

Supernatant de la proba standardMl-0.5-

Solutie de acid tricloracetic 5%Ml--0.5

Solutie o-toluidinaMl0.52.52.5

Se agita eprubetele si se tin timp de 8 minute in baia de apa la fierbere, dupa care se racesc la robinet. Dupa racire se masoara extinctiile probelor de analizat si proba standard in raport cu proba alb. Citirile se fac la 635nm .

Calcularea rezultatelor :

Ml glucoza/100ml sange (ser sau plasma)=PA/PS x 100

In care PA=extinctia citita la proba de analizat

PS=extinctia citita la proba standard

Observatii :

-ceto-sau aldopentozele dau coloratie cu o-toluidina dar de intensitate foarte slaba, neglijabila pentru concentratia acestor substante in sange. Galactoza poate interfera in cazurile de galactozemie.

-daca determinarea glucozei se face in mai putin de 3 ore de la recoltarea probei, atunci nu este obligatorie recoltarea pe substante anticoagulante.

DOZAREA GLUCOZEI -METODA COLORIMETRICA CU ANTRONAPrincipiul metodei:Glucoza este deshidratata cu acid sulfuric obtinandu-se hidroximetilfurfurol, care cu antrona formeaza un compus de condensare colorat in galben-rosiatic. Extinctia se citeste la 620nm.

Reactivi :

-solutie de acid tricloracetic 5%

-reactiv cu antrona

Preparare:

La 280ml apa distilata se adauga 720ml acid sulfuric concentrat. Se adauga 500 mg antrona si 10g tiouree. Se incalzeste la 80 grade C pe baia de apa pana la dizolvarea completa. Reactivul se pastreaza la +4 grade C timp de cateva saptamani.

-solutie standard de glucoza (200mg%).

Tehnica de lucru :

Se pipeteaza in 3 eprubete de centrifuga pentru proba de analizat, proba standard si proba in alb :ExprimareacantitatiiProbaDe analizatProbastandardProbaIn alb

Solutie de acid tricloracetic 5 %Ml0.90.90.9

Sange total, plasma sau serMl0.1--

Solutie standard de glucozaMl-0.1-

Apa distilataMl--0.1

Continutul fiecarei probe se amesteca prin agitare,dupa care se centrifugheaza numai eprubeta cu proba de analizat.

Din supernatantul probelor se fac urmatoarele amestecuri :Exprimarea cantitatiiProbaDe analizatProbastandardProbaIn alb

Supernatant cu proba de analizatMl0.5--

Din amestecul cu proba standardMl-0.5-

Din amestecul cu proba in albMl--0.5

Reactiv cu antronaMl5.05.05.0

Se incalzesc eprubetele timp de 15 minute pe baia de apa la fierbere. Dupa racire se fotometreaza la 620nm.

Calcularea rezultatelor :

Mg glucoza/100ml sange(ser sau plasma)=PA/PS x 100

In care PA=extinctia citita la proba de analizat

PS=extinctia citita la proba standardDOZAREA GLUCOZEI-METODA TITRIMETRICA(tehnica Haghedorn si Jensen)Principiul metodei:

Glucoza din sange, prezenta in filtratul de sange deproteinizat in prealabil prin incalzire cu un amestec de sulfat de Zn si hidroxid de Na, reduce fericianura de K la ferocianura de K. Fericianura de K in exces, elibereaza I dintr-o solutie de iodura de K, in mediu acid. I eliberat este titrat cu o solutie de tiosulfat de Na in prezenta solutiei de amidon ca indicator.

Pentru ca reactia sa fie completa, ferocianura de K si de Na se precipita cu sulfatul de Zn :

Excesul de ferocianura de K va reactiona cu iodura de K in mediu acid :

Iodul se titreaza cu solutie de tiosulfat de Na :

Reactivi :

-solutie de sulfat de Zn 0.45%. se pastreaza aproximativ 3 saptamani

-solutie de NaOH 0.1 N

-solutie de fericianura de K 0.01 N

Preparare :

-0.329g fericianura de K se dizolva in 80ml apa distilata si se completeaza apoi la 100ml. Solutia se pastreaza in sticle brune si la intuneric (solutia A).

-solutia de sulfat de Zn 7.5% in solutie de clorura de Na 25% (solutia B).

-solutie de iodura de K 7.5% in solutie de clorura de Na 25% 9solutia C)

-solutie de clorura de Na 25%

-solutie de acid acetic 3%

Preparare :

-3ml acid acetic glacial p.a.,apa distilata pana la 100ml (solutia D)

-solutie de tiosulfat de Na 0.005N

a)solutie de tiosulfat Na 0.1N : 26g Na2S2O3 . 5H2O, apa distilata pana la 1000ml, 2 picaturi NaOH 40%. Se lasa 2-3 zile sa stea in repaus la intuneric dupa care se stabileste titrul solutiei.

b) 5ml solutie de tiosulfat de Na 0.1 N se dilueaza cu apa distilata la 1000 ml.

-solutie de carbonat de Na 2.12g%

-solutie de amidon 1% in solutie saturata de NaCl.

Tehnica de lucru :

In doua eprubete se pipeteaza cate 5 ml solutie de sulfat de Zn 0.45% si 1 ml solutie de NaOH 0.1 N.Intr-o eprubeta care contine proba de analizat, se adauga 0.1 ml sange. Cele doua eprubete se tin intr-o baie de apa la fierbere timp de 3 minute,dupa care se filtreaza. Eprubetele se spala cu 3 ml apa fierbinte trecuta prin hartia de filtru. In filtrat se adauga 1 ml solutie fericianura de K 0.01 N si 1 ml solutie de carbonat de Na 2.12g%, se amesteca prin agitare si se incalzeste la fierbere pe baia de apa, timp de 15 minute. Se raceste imediat. Daca fericianura s-a decolorat, se mai adauga un ml solutie fericianura de K 0.01 N si se mai incalzeste 15 minute. Se raceste si se adauga apoi 2 ml sulfat de Zn 7.5%,1 ml iodura de K 7.5% si 2 ml acid acetic 3%. Imediat se titreaza iodul eliberat cu o solutie de tiosulfat de Na 0.005 N, folosind o microbiureta de 2 ml. Titrarea se face in prezenta de 5 picaturi din solutia de amidon 1% ca indicator pana la disparitia culorii albastre.

Calcularea rezultatelor :

Afland prin titrare volumul de tiosulfat de Na folosit, se citeste din tabel mg de glucoza la 100 ml.

Daca se folosesc 2 ml solutie de fericianura de K 0.01 N la titrare,atunci se adauga 385mg la 100 ml. Totdeauna se va folosi si o proba martor care ne ofera o masura a impuritatilor reducatoare din reactivi. Daca nu exista impuritati reducatoare, titrarea blancului se ve face cu 2 ml tiosulfat de Na 0.005 N. valoarea martorului exprimata in mg glucoza/100 ml se scade din valoarea probei.

De exemplu, daca s-a titrat proba de analizat cu 1.43 ml Na2S2O3 0.005 N si proba martor cu 1.9 ml,atunci obtinem :

La 1.43ml.101mg glucoza

La 1.9ml17mg glucoza

Deci mg glucoza/100ml=101-17=84Na2S2O30.000.010.020.030.040.050.060.070.080.09

0.0385382379376373370367364361358

0.1355352350348345343341338336333

0.2331329327325323321318316314312

0.3310308306304302300298296294292

0.4290288286284282280278276274272

0.5270268266264262260259257255253

0.6251249247245243241240238236234

0.7232230228226224222221219217215

0.8213211209208206204202200199197

0.9195193191190188186184182181179

1.0177175173172170168166164163161

1.1159157155154152150148146145143

1.2141139138136134132131129127125

1.3124122120119117115113111110108

1.4106104102101999795939290

1.588868483817977757472

1.670686665636159575654

1.752504847454341393836

1.834323129272524222019

1.9171514121087532

DOZAREA GLUCOZEI - METODA CU GLUCOZOXIDAZ

Principiul metodei:

Metoda de lucru este una enzimatica, bazata pe glucozoxidaza, o enzima ce catalizeaz oxidarea glucozei.Glucoz + O2 + H2OAcid gluconic + H2O2

Peroxidul de hidrogen format reacioneaz cu 4- amino-antipirina i fenolul, n prezena peroxidazei i formeaz chinonimina. Intensitatea culorii produsului rezultat este proporional cu concentraia de glucoz din proba de analizat

2H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina chinonimina +4H2O

Reactivi:

Reactiv 1 (tampon-fenol)

Tampon fosfat pH = 7,4100 mmol/l

Fenol ..24 mmol/l

Reactiv 2 (amestec enzime)

Glucoz-oxidaza..12.000 U/l

Peroxidaza .700 U/l

4-amino-antipirina.0,4 mmol/l

Reactiv 3 (standard glucoz)100mg%

Reactiv 4 -acid tricloracetic 5%

Proba:

ser nehemolizat

plasm (fr hemoliz):

recoltat cu heparin + fluorur de sodiu

recoltat cu heparin + acetat de iod

snge total (se aplic metoda cu deproteinizare)

Tehnica de lucru:

se pregtete reactivul enzimatic de lucru: se dizolv reactivul 2 n reactivul 1

se pipeteaz direct n trei eprubete, dup schema urmtoare:

Metoda fr deproteinizare

PROBASTANDARDMARTOR

Reactiv enzimatic de lucru1ml1ml1ml

Proba10ml--

Standard-10ml-

Sau se pipeteaz n tuburi de centrifug:

Metoda cu deproteinizarePROBASTANDARDMARTOR

Sange total, ser sau plasma50ml--

Sol. Acid tricloracetic(R4)500ml500ml-

Standard -50ml-

se agit

se centrifugheaz 5min la 3000 de rotaii/min

se pipeteaz n eprubete

PROBASTANDARDMARTOR

Supernatant proba50m--

Supernatant standard-50m-

Solutie acid tricloracetic--50m

Reactiv enzimatic de lucru1ml1ml1ml

se agit

se incubeaz 15min la 37o C

se citesc extincia probei (Ep) i extincia standardului (Es) fa de martor la 500nm (492-550 nm), n cuva de 1cm.

Calcul:

Glicemie (mg%) = (Ep/Es) x 100 (sau)

Glicemie (mmol/l = (Ep/Es) x 5,5

Valori normale:

Snge total: 70 - 105 mg%

Ser, plasm: 75 - 115 mg%Limite si interferente

Pot sa apara cresteri usoare ale glicemiei in sarcina normala, la marii fumatori, obezi si persoanele sedentare. Efortul fizic intens poate genera hipoglicemie. Cresteri ale glicemei pot sa apara dupa anestezie, interventii chirurgicale si dupa administrare i.v. de glucoza.

Scaderi ale glucozei serice se pot inregistra la pacientii cu eritrocitoza (hematocrit >55%) sau leucocitoza marcata (leucemii).Determinarea valorilor hemoglobinei glicozilateHemoglobina glicozilata este produsul glicozilarii non enzimatice a restului de Valina de la capatul N terminal al lantului beta al hemoglobinei. Concentratia ei depinde exclusiv de valoarea glucozei intraeritrocitare si creste proportional cu intoleranta la glucoza. La pacienii diabetici, creterea nivelului sanguin al glucozei va determina creterea glicozilrii hemoglobinei la nivelul globulelor roii. Deoarece durata de via a hematiilor este de 120 de zile, determinarea HbA la persoanele diabetice, reprezint un indice important al controlului glicemic, chiar i dup 2-3 luni. Dei hemoglobina glicozilat prezint mai multe fraciuni, uzual se folosete doar fraciunea A1c (Hb A1c). Determinarea se poate face cromatografic, colorimetric sau prin metode radioimunologice.In prezent, Hb A1c este folosita exclusiv pentru monitorizarea tratamentului si nu pentru diagnostic. Studii de data recenta demonstreaza in numar din ce in ce mai mare rolul Hb A1c in diagnostic, crend premisele introducerii cat mai rapide si ca test de diagnostic.

In acest sens, unele organisme recomanda deja cateva valori de cut-point pentru diagnostic. O valoare a Hb A1c 6.5 (48 mmol/l) constituie criteriu de diagnostic pentru DZ II, in timp ce pentru prediabet, valorile raman discutabile. International Expert Comitee recomanda, de exemplu, pentru prediabet valori cuprinse intre 6.0-6.4 % (42-46 mmol/mol), in timp ce American Diabetes Association recomanda un interval cuprins intre 5.7-6.4% (39-46 mmol/mol).Avantaje:- cresterea ratei de detectie (prevalentei) a DZ II si a prediabetului prin folosirea Hb A1c

- posibilitatea introducerii ca test de rutina , efectuat in orice moment al zilei, fara pregatiri speciale. Valorile Hb A1c nu sunt influentate de stress si nu necesita recoltarea pe nemancate.

- valorile Hb A1c incorporeaza atat contributia glucozei a jeune, cat si pe cea post prandiala, ceea ce le face importante si pentru diagnosticul intolerantei la glucoza, deci a prediabetului- corelatia valorilor Hb A1c cu riscul de complicatii micro si macrovasculare

Dezavantajele sunt legate de unele interferente fiziologice sau asociate unor stari patologice.

- False cresteri se coreleaza cu cresterea duratei de viata a hematiilor si alterarea producerii de reticulocite. Hemoglobina din eritrocitele imbatranite este expusa un timp mai indelungat la glucoza din mediul exterior, ducand la cresterea valorilor Hb A1c. Aceste situatii se intalnesc in statusul uremic si hipertrigliceridemie.

- False scaderi apar in cazul scaderii duratei de viata a hematiilor (cresterea turnoverului hemoglobinei) sau in cazul accelerarii ritmului de producere a reticulocitelor si scaderea varstei medii a eritrocitelor. Eritrocitele tinere sunt expuse un timp mai redus glucozei din mediul exterior. Cauzele frecvente sunt: hemoragii recente, siclemie, talasemie, deficit de glucozo 6 fosfat dehidrogenaza, anemie hemolitica, aplastica, splenectomie.

- Sarcina poate determina cresterea sau scaderea valorilor Hb A1c, deci nu este indicata in diagnosticul diabetului zaharat gestational (pentru care unele studii recomanda fructozamina).

- Tratamentul cu vitamina C si E si deficitul de fier interfera in determinarea Hb A1c.

- Varsta si etnia (populatia afro-caraibiana prezinta valori cu 0.4-0.7% fata de populatia caucaziana)METODE DE DOZARE A HbA1

Metoda de referinta standardizata (IFCC) este cromatografia lichida de inalta presiune cuplata cu electroforeza capilara (HPLC-CE) sau cu spectrometria de masa (HPLC-MS). Aceasta metoda a fost aprobata in 2001 si publicata in 2002, ulterior stabilindu-se corespondenta intre aceasta metoda si standardele existente anterior (NGSP), conform relatiei:NGSP(%)=(0.915xIFCC)+2.15 (mmol/mol)

Alte metode de dozare folosite sunt electroforeza, cromatografia de afinitate, cromatografia cu schimb de ioni si diverse tehnici de imunoanaliza. Indiferent de tehnica folosita, problema principala o constituie exactitatea dozarii si standardizarea rezultatelor diverselor tehnici. Rezultatele variaza in functie de metoda de analiza, varsta, varietatea biologica a pacientilor. Valorile normale de referinta sunt 20-40 mmol/mol, sau 4%-5,9%.

METODA ELECTROFOREZEI CAPILARE EC

Firma SEBIA Franta a lansat n premier mondial o linie completa dedicat determinrii Hb A1c prin electroforez capilar. Aceasta conine trei sisteme automate de electroforez dedicate tututor tipurilor de laboaratoare: Minicap Flex Piercing pentru laboratoarele de mici dimensiuni i Capillarys 2 Flex Piercing pentru laboratoarele medii i mari. Lansat n prima jumtate a acestui an, Capillarys 3 Tera este cel mai nou dintre sisteme destinat, de asemenea, tot laboratoarelor mari. Toate cele 3 aparate sunt disponibile si n Romania. n egal msur, toate sistemele de electroforez SEBIA utilizate n determinarea Hb A1c sunt certificate NGSP i particip la monitorizarea bianual a Colegiului Patologilor Americani de pe lng NGSP (CAP proficiency survey). De asemenea, n premier, se poate lucra pe toate tipurile de tuburi de recolt (normale i pediatrice), dar i pe capilare din sticl.Principiul metodei

Electroforeza capilara n sistem SEBIA determina exclusiv HbA1c (fractiunea de Hb ce a legat non-enzimatic glucoza la resturile de valina N-terminale ale lanturilor ) sub forma unui peak total separat de celelalte hemoglobine glicate Hb A1a si Hb A1b. In electroforeza capilara n solutie libera, hemoglobinele se separa n capilare de silica, pe baza mobilitatii electroforetice si a fluxului electroosmotic, la voltaj mare si n tampon alcalin. Separarea HbA1c se face la 9400 V, fraciunile fiind detectate si cuantificate prin densitometrare la 415 nm, n urmtoarea ordine: Hb A2/ C, E, S, D, F, A0, A1 minor glicozilate, Hb A1c. n paralel cu densitometrarea se realizeaz i un calcul automat al raportului

Hb A1c/ (Hb A1c + Hb A0)

cu exprimarea rezultatelor att n uniti IFCC(mmol/ mol Hb), ct i n unitti NGSP (%), n acord cu noile recomandri ale American Diabetes Association i OMS. De asemenea, n acord cu recomandrile IFCC, se utilizeaza calibratori ce contin un amestec de Hb A1c si Hb A0 nalt purificate.

Tiparul electroforetic normal relev prezena a 3 fraciuni: Hb A0, Hb A1c si Hb A2. n egal msur se pot separa i alte variante ale Hb A1 (cum ar fi cea legat de vrst), Hb A1c oxidat sau fraciunile minor glicozilate Hb A1a+b (cele obinute prin legarea hemoglobinei de fructozo 1,6- bi fosfat, glucozo 6 fosfat sau piruvat).METODA ELECTROFOREZEI IN GEL

Separarea electroforetica a Hb A1c se face in gel de agaroza, la pH acid 5.9 si depinde de afinitatea diverselor hemoglobine pentru gel si de sarcina lor. Dupa uscare, electroforegramele sunt densitometrate fara colorare, la 420 nm, lungimea de unda la care absoarbe hemoglobina. Metoda de determinare electroforetica prezinta unele avantaje, cum ar fi:

-valoarea Hb A1c nu depinde de concentratia totala de hemoglobina

-metodele electroforetice permit separarea Hb F si a celor cu punct izoelectric scazut, hemoglobine ce pot interfera cu glicohemoglobinele in alte metode- tehnica de determinare electroforetica a Hb A1c ofera informatii si asupra eventualelor hemoglobinopatiiProfilul electroforetic normal evidentiaza, de la anod la catod, urmatoarele fractiuni:

- Hb A0, fractiunea majoritara, ce corespunde Hb A0 si Hb A2 Hb A1 a+b+c (fractiunile neglicolizate ale Hb A adulte).

- Hb A1, fractiune minoritara, ce corespunde fractiunii glicolizate a Hb A.

Variatii patologice

Profilul electroforetic evidentiaza in cazul prezentei hemoglobinelor anormale urmatoarele fractiuni, de la anod la catod:

- Hb C - migreaza lent si se gaseste in spatele liniei de start.

- Hb S - ramane in linia de start.

- Hb D, E, A - migreaza grupat

- Hb F si A - migreaza grupatMETODA IMUNOTURBIDIMETRICA PENTRU DETERMINAREA HbA1Specimen recoltat - snge venos.

Prelucrare necesar dup recoltare: sngele total se hemolizeaz, folosind reactivul hemolizant. Hemolizatul proaspt este supus imediat testrii; eventual, el poate fi pstrat la 2-8o C. Sngele total, de asemenea, poate fi pstrat la 2-8o C.

Stabilitate prob - 7 zile la 2-8o C ; hemolizatul este stabil 24 ore la 2-8o C si 6 luni la -20o C.Valorile hemoglobinei glicozilate pot fi convertite in unitati de glicemie, conform tabelului de mai jos:

Glicemie medie(g/l)HbA1c (%)

1,26

1,57

1,88

Pentru fiecare cretere de 0,3 este o cretere de 1

Obiectivele terapeutice i de follow up pentru diabetici n funcie de

valoarea HbA1c sunt :

HbA1c < 6,5 % : obiectiv optimal

HbA1c ntre 6,5 % i 8 % la dou controale succesive : nseamn unechilibru glicemic acceptabil , cu o posibil modificare terapeutic dar dup evaluarea raportului avantaje/dezavantje.

HbA1c > 8 % la dou controale succesive: nseamn un echilibru

glicemic prost, se recomand o modificare terapeutic .

Bibliografie

1. Biochimie clinica- Metode de laborator editia a III-a, Drnisa Mihele, Editura Medicala, 2007 2. Diabetul zaharat tip 2. Ghid de practica pentru medicii de familie. Editura Infomedica, 2005.3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog4. (Report of Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus- Diabetes Care 1997; 20:1183-97)5. (Scroggie DA et al- The effect of glucosamine-chondroitin supplementation on glycosylated hemoglobin levels in patients with type 2 diabetes mellitus : a placebo-controlled double-blinded, randomized clinical trial- Arch Intern Med, 2003 Jul 14;163(13):1587-90)

6. *** www.descopera.ro/dnews7. www.dornamedical.ro/docum/detaliianalize/Glicemie.pdf

1