Lucrarea nr. 4

Extractia si analiza prin cromatografie pe strat subtire a pigmentilor din plante verzi si colorantilor alimentari

1. Notiuni privind cromatografia Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri, care se bazeaza

pe interactiunea diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu doua faze cromatografice: faza mobila si faza stationara.

Cromatografia a fost initiata n 1901 de botanistul rus vet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere n limba greaca).

Principiul de baza al separarii cromatografice consta n distributia inegala a componentelor unui amestec ntre faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila. Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de capacitatea diferita de a difuza n acestea.

Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc n momentul initial ametecate, ntr-un volum restrns, vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila n faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute n aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va nregistra o ramnere n urma a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc n timpul deplasarii n coloana, deci este in proces dinamic.

In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie, coloana este inlocuita cu un strat adsorbant (silicagel, alumina, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe placuta prin actiune capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite.

2. Extractia si analiza cromatografica a pigmentilor naturali din frunzele verzi

Clorofila (din greac chloros-verde si phylos-frunza) este un pigment de culoare verde, esenial n procesul de

fotosintez, prin intermediul acesteia avnd loc transformarea energiei luminoase n energie. Clorofila a fost izolata

pentru prima dat de Joseph Bienaim Caventou i Pierre Joseph Pelletier in 1817.

Clorofila este un pigment cu structura clorinica, similar din punct de vedere structural cu alte produse de tip

porfirinic, cum ar fi hemul. In centrul inelului clorinic se gaseste un ion de magneziu. Inelul clorinic poate avea ca

substituenti mai multe lanuri de diferite lungimi si de obicei, un lan lung de tip fitol. Exist cteva forme diferite care

apar n mod natural, dar tipurile cel mai des intalnite n plantele terestre sunt clorofila a si clorofila b. Structura general

a clorofilei a fost elucidat de ctre Hans Fischer n 1940, iar n 1960, cnd cea mai mare parte astereochimiei

clorofilei a fost cunoscut, Robert Burns Woodward a publicat o sintez total a moleculei. n 1967, ultima elucidare

rmas privind stereochimia a fost completat de Ian Fleming, i n 1990 Woodward a publicat o sinteza actualizat.

Clorofila a Clorofila b

In frunzele plantelor pe langa pigmentii clorofilieni totodeauna se intalnesc si alti pigmenti naturali cum ar fi

carotenii si diverse xantofile toti acesti compusi avand un rol activ in procesul de fotosinteza.

-caroten

Xantofile (criptoxantina)

Mod de lucru

1. Extractia clorofilei din frunzele verzi.

a. Se cantaresc circa 3g frunze verzi. Se maruntesc bine si se introduc intr-un pahar Berzelius de 50ml.

b. Se adauga in pahar 15 ml etanol si paharul se acopera cu o sticla de ceas.

c. Se mentine circa 1.5 ore agitand ocazional cu o bagheta de sticla pentru maruntirea frunzelor.

d. Extractul obtinut se transvazeaza intr-o eprubeta curata si uscata.

2. Analiza amestecului extras prin cromatografie pe strat subtire.

Pentru cromatografie se utilizeaza placute de cromatografie cu strat de oxid de aluminiu.

Eluentul este o solutie de eter de petrol, hexan, acetat de etil, acetona si metanol in raport 6:1.6:1:1:0.4 (volum) gata preparat pe care il gasiti in balonul cotat de pe masa-Eluent I.

a. Intr-un pahar Berzelius curat si uscat se adauga circa 10 ml eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o

placuta Petri.

b. Se ia o placuta de cromatografie si cu ajutorul unui creion se trage o linie subtire la circa 1 cm de baza

placutei.

c. Cu ajutorul unei capilare se aplica in centrul placutei pe linia desenata anterior un spot cu diametrul de circa

5mm. Se lasa solventul sa se evapore, dupa care se repeta operatia de 3- 4 ori pentru a obtine o proba mai

concentrata, avand grija sa se mentina aceasi marime a spotului si lasand sa se usuce dupa fiecare aplicare.

d. Placuta se introduce in paharul cu eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.

e. Se elueaza proba pana la aproximativ 1 cm fata de capatul superior al placutei, cand aceasta se scoate din

pahar.

f. Cu ajutorul creionului se macheaza rapid linia finala a frontului de eluent, precum si spoturile ce se pot

identifica pe placuta.

g. Determinati valorile Rf pentru toate spoturile. Masurati distanta de la linia de start pana la linia frontului de

eluent. Apoi masurati distanta de la linia de start pana la linia fiecarui spot.

Rf=

Valorile Rf mai mari corespund compusilor mai putin polari. In literatura, valorile Rf pentru fiecare component sunt:

Rf = 0.16 pentru xantofile, Rf = 0.32 pentru clorofila b, Rf = 0.44 pentru clorofila a, si Rf = 0.95 pentru caroten. Completati urmatoarele date:

1. Cantitatea de frunze: ____ g

2. Completati tabelul:

Spot Culoare Rf Identitate probabila

3. Extractia si analiza cromatografica a colorantilor alimentari

Preparatele alimentare sunt adesea colorate cu diversi coloranti naturali sau sintetici pentru a le face mai atractive

pentru consumatori. Colorantii utilizati pentru colorarea alimentelor sunt compusi aprobati pentru utilizare de catre

organisme internationale si inainte de a fi inclusi pe lista compusilor utilizabili sunt supusi unei testari amanuntite

privind efectele nocive asupra organismului uman. Toti aditivii aprobati pentru a fi utilizati in industria alimentara sunt

codificati prin indicele E urmat de un numar intre 100 si 1000. Colorantii alimentari sunt codificati cu valori situate intre

E100 si E200. Utilitatea acestor aditivi alimentari este ca ei mentin calitatea si siguranta produselor o perioada mai

mare de timp, mentin sau imbunatatesc gustul produselor, asigura controlul aciditatii si alcalinitatii produselor, mentin

consistenta produselor, de asemenea mai mentin aroma sau culoarea produselor alimentare. In absenta acestora,

populatia nu ar mai cumpara cu placere foarte multe produse uzuale: bauturi racoritoare, produse de patisserie si

cofetarie, bomboane de tot felul, gemuri, marmelade, mezeluri, multe preparate culinare realizate in unitatile de

alimentatie publica.

Un exemplu de produs care contine o serie de coloranti alimentari sintetici sunt bomboanele Skittles care au coaja

colorata in diverse culori. Aditivii colorati utilizati sunt E100, E120, E132, E160e.

Culoarea poate fi realizata prin utilizarea unui singur colorant sau a unui amestec de coloranti. O metoda simpla de

punere in evidenta prezentei acestor coloranti si de identificare a lor poate fi realizata prin cromatografie in strat

subtire.

E100 (Curcumina)-galben E120 (Acid carminic)-rosu

E132 (Indigo Carmin)-albastru E160e (Caroten)-portocaliu

Mod de lucru

1. Se extrage colorantul dintr-o pastila de Skittles prin introducerea acesteia intr-o eprubeta, adaos de solutie

etanol:apa 1:1 pana pastila este acoperita si incalzire pe baie de apa pana la disparitia culorii exterioare. Solutia

obtinuta se trece intr-o eprubeta curata. Se fac 3 astfel de extracte de culori diferite (proba 1, proba 2, proba 3).

2. Analiza amestecului extras prin cromatografie pe strat subtire.

Pentru cromatografie se utilizeaza placute de cromatografie cu strat de oxid de aluminiu.

Eluentul este Eluent II.

Se ia o placuta de cromatografie si cu ajutorul unui creion se trage o linie subtire la circa 1 cm de baza placutei.

Se marcheaza trei puncte corespunzatoare celor trei extracte obtinute anterior.

Cu ajutorul unei capilare se aplica in centrul fiecarui punct marcat anterior pe placuta un spot cu diametrul de circa

5mm din fiecare extract colorat. Se lasa solventul sa se evapore, dupa care se repeta operatia de 3- 4 ori pentru a

obtine probe mai concentrate, avand grija sa se mentina aceasi marime a spotului si lasand sa se usuce dupa

fiecare aplicare.

Placuta se introduce in paharul cu eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.

Se elueaza proba pana la aproximativ 1 cm fata de capatul superior al placutei, cand aceasta se scoate din pahar.

Cu ajutorul creionului se macheaza rapid linia finala a frontului de eluent, precum si spoturile ce se pot identifica pe

placuta.

Se determina valorile Rf pentru toate spoturile.

3. Analiza unui amestec de coloranti.

Cele trei extracte se amesteca, obtinand proba 4.

Se pregateste o noua placuta cromatografica, de data aceasta spotul de proba fiind realizat cu proba 4.

Placuta se introduce in paharul cu eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.

Se elueaza proba pana la aproximativ 1 cm fata de capatul superior al placutei, cand aceasta se scoate din pahar.

Cu ajutorul creionului se macheaza rapid linia finala a frontului de eluent, precum si spoturile ce se pot identifica pe

placuta.

Se determina valorile Rf pentru toate spoturile si se compara cu valorile obtinute la punctul 2.

Se completeaza tabelul:

Spot Culoare Rf

Proba 1

Proba 2

Proba 3

Proba 4

Intrebari

1. Explicati principiul pe care se bazeaza separarea compusilor organici prin cromatografie pe strat subtire.

2. Care compus din cei separati in lucrarea de laborator este mai polar? Dar care mai putin polar? De unde va

puteti da seama?

3. De ce nu se poate utiliza un stilou cu cerneala sau un pix in locul creionului?

4. Lucrati ca inginer in industria produselor alimentare. In urma analizei cromatografice a unui produs alimentar

descoperiti ca la colorarea sa a fost utilizat un colorant care nu se afla pe lista aditivilor alimentari aprobati. Ce

masuri considerati ca ar trebui sa luati?