LUCRRI PRACTICE

ASISTEN MEDICAL, ANUL II

2013/2014

I. MSURI DE PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

1. ORGANIZAREA ADECVAT A SPAIULUI DE LUCRU. EHIPAMENTELE LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE

Laboratorul trebuie s aib pereii, tavanul i podeaua fr asperiti sau crpturi, acoperite cu materiale netede i rezistente, pentru a putea fi splate zilnic cu soluii dezinfectante;

Se iau msuri s nu ptrund n laborator roztoare sau insecte care ar putea vehicula ageni patogeni n interiorul sau n exteriorul laboratorului;

Laboratorul trebuie dotat cu: - mobilier confecionat din materiale uor de splat i dezinfectat; - mese de lucru acoperite cu material neted, ignifug, rezistent la substanele dezinfectante, la acizi,

baze, colorani; - vase cu amestec dezinfectant pentru imersia pipetelor i lamelor de sticl folosite n timpul lucrului; - hot de siguran biologic - hot bacteriologic sau hot cu flux laminar vertical cu recircularea

complet a aerului - pentru protejarea produsului manipulat, operatorului i mediului; - lamp UV pentru sterilizarea suprafeelor de lucru i a aerului; - balan; - termostat (cu temperatur reglabil) - microscop binocular - lup de laborator - frigider - congelator (prevzut cu ncuietoare) - baie de ap cu temperatur reglabil - pH-metru sau indicator pH - bec de gaz - etuv - autoclav - anse bacteriologice - pipete automate - termometre - instalaie de distilare a apei - sticlrie specific de laborator - ceas de laborator - couri pentru pstrarea eprubetelor cu medii - recipiente pentru depozitarea vaselor contaminate; - trus de prim ajutor pentru accidente; - instalaie de gaz prevzut cu becuri de gaz; - instalaie de iluminat adecvat.

2. ECHIPAMENT DE PROTECIE INDIVIDUAL

Echipamentul de protecie este constituit din halat alb cu mneci lungi, eventual mnui de cauciuc i ochelari de protecie; se recomand ca echipamentul de protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior;

Echipamentul contaminat n timpul lucrului trebuie dezinfectat i sterilizat; n laborator trebuie s existe ap curent i spun dezinfectant; Dac se lucreaz cu lampa de ultraviolete aprins, se vor purta obligatoriu ochelari de protecie,

mnui, masc.

3. REGULI DE COMPORTAMENT N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

n laboratorul de microbiologie se lucreaz cu material infecios, toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial infectante, de aceea trebuie respectate anumite reguli de ordine interioar.

Este strict interzis accesul persoanelor strine n laboratorul de microbiologie; intrarea n laborator i participarea la lucrrile practice se va face numai dup audierea i nsuirea regulilor de protecie a muncii (dovedit prin semntur pe un proces verbal) i n prezena unui cadru didactic;

n timpul lucrului n laborator se va purta echipamentul de protecie adecvat; la terminarea lucrului se va depozita separat de hainele de strad;

Nu sunt permise alergarea sau mersul rapid prin laborator; Sunt strict interzise fumatul i consumul de alimente sau buturi n laborator; Este contraindicat ducerea minii sau a unor obiecte la gur, fa, ochi n timpul lucrului; Se vor evita vorbitul i deplasarea persoanelor n timp ce se lucreaz; Obiectele personale vor fi aezate n locuri special amenajate, astfel nct pe masa de lucru s fie

numai materialele i instrumentarul necesare desfurrii procedurii; Pipetarea cu gura este interzis, se vor folosi dispozitive de pipetare adecvate; Se vor respecta cu strictee instruciunile de folosire a aparatelor de laborator pentru a se evita

producerea de accidente; n cazul rspndirii accidentale a materialului infecios, va fi anunat cadrul didactic care conduce

lucrrile i care va indica msurile de dezinfecie; Dup terminarea lucrului minile se antiseptizeaz prin introducerea lor ntr-o substan antiseptic

(cloramin) pentru cteva minute, apoi se spal cu ap i spun; Fiecare student are obligaia de a-i supraveghea spaiul de lucru, pstrnd ordinea i curenia; La nceperea lucrului se va urmri:

- dac nu sunt scurgeri de gaz; - dac locul de lucru a fost organizat funcional, cu materialele aezate n locuri accesibile, pentru

a se evita deplasrile ulterioare; La terminarea lucrului se va verifica dac:

- locul de lucru a fost dezinfectat; - sunt nchise becurile de gaz, sunt stinse toate luminile; - sunt scoase din priz aparatele electrice; - sunt nchise robinetele.

4. METODOLOGIA DE LUCRU CU MATERIALE CONTAMINATE

N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE La nceputul i sfritul lucrului sau n caz de contaminare se va face decontaminarea mesei de lucru

cu o soluie dezinfectant pus ntr-un vas special sau cu ajutorul lmpii cu UV; n timpul manipulrii de materiale infecte (contaminate) se va evita:

contactul probelor patogene cu suprafaa de lucru, cu minile, cu aerul, cu obiectele din jur; contaminarea cu germeni din mediul nconjurtor a recipientelor i instrumentarului de lucru,

a mediilor de cultur, a culturilor pure de bacterii, a suspensiilor virale; Orice manipulare de produse se va face cu respectarea principiilor de asepsie; suprafaa de lucru

poate fi acoperit cu o bucat de hrtie de filtru umectat cu soluie dezinfectant; Recipientele deschise vor fi inute n apropierea flcrii becului de gaz, n poziie oblic, iar pipetele

ce conin materiale infectate vor fi meninute cu vrful n jos, tot n poziie oblic; se va evita deplasarea minii care poart ansa sau pipeta; dup deschiderea recipientelor gtul acestora se flambeaz, de asemenea nainte de a le nchide la loc;

Lamele i lamelele de sticl, pipetele gradate i pipetele Pasteur contaminate vor fi imersate dup lucru n vasul cu amestec dezinfectant de pe mas;

Ansa bacteriologic va fi sterilizat prin nclzire la rou nainte de fiecare folosire (iar portansa se flambeaz); dup fiecare folosire firul ansei se usuc la baza flcrii becului de gaz i se sterilizeaz prin nclzire la rou, iar portansa se flambeaz din nou;

Instrumentele metalice contaminate vor fi fierte timp de 30 minute, dup care vor fi splate, uscate i pregtite pentru o nou sterilizare;

Eprubetele, flacoanele, cupele de centrifug, cutiile Petri i alte recipiente de sticl ce conin material infectat, ca i instrumentele metalice, vor fi puse dup utilizare n recipiente speciale nchise etan (gleat de infecte) i autoclavate 30 min. la 120C, dup care vor fi splate i pregtite pentru sterilizare;

Dup terminarea experienelor, recipientele cu medii nsmnate vor fi puse la incubator la temperatura adecvat germenilor respectivi; oule embrionate inoculate vor fi incubate la clocitoare; animalele inoculate vor fi meninute n camere speciale sub supraveghere;

Oule embrionate i animalele sacrificate vor fi incinerate.

II. PRINCIPII I TEHNICI DE STERILIZARE

Sterilizarea este operaia de ndeprtare sau de distrugere a tuturor microorganismelor de pe suprafaa instrumentelor i vaselor de laborator, din interiorul recipientelor de lucru, din mediile de cultur ce urmeaz a fi inoculate.

Necesitatea sterilizrii deriv din obligaia de a lucra n studiul microorganismelor numai cu culturi pure, care conin celule ce aparin unei singure specii de microorganisme. Materialele contaminate n timpul lucrului cu microorganisme trebuie sterilizate pentru a evita contaminarea mediului i persoanelor cu respectivele microorganisme.

nainte de lucrul cu microorganisme se supun sterilizrii sticlria de laborator ce va fi

utilizat, instrumentarul care va fi folosit, mediile de cultur. Sticlria va fi splat cu ap i detergent, cltit cu ap distilat, uscat i mpachetat n hrtie, apoi sterilizat la etuv. Instrumentarul curat va fi sterilizat printr-o metod adecvat. Mediile de cultur se vor steriliza prin metode care s nu degradeze ingredientele componente.

Dup efectuarea experienelor se supun sterilizrii mediile de cultur utilizate, care conin

microorganismele cu care s-a lucrat i care nu mai sunt necesare. Se sterilizeaz i instrumentele de lucru, sticlria folosit i masa de lucru. Mediile i recipientele se pstreaz pn la sterlilizare n glei de infecte care se introduc cu totul n sterilizator. Dup sterilizare sticlria se va spla i se va pregti pentru o nou sterilizare. Ansa bacteriologic umed se usuc n zona rece a flcrii, apoi se sterilizeaz prin nclzirea la rou a firului i flambarea portansei. Masa de lucru se va dezinfecta prin tergere cu substane dezinfectante sau se va acoperi cu o pelicul fin de alcool, care se va aprinde.

Metodele de sterilizare se pot grupa n dou categorii mari, cu mai multe variante: 1. Metode fizice

sterilizarea prin cldur sterilizarea prin cldur umed

la temperaturi mai mici de 100C pasteurizarea tindalizarea

la temperatura de 100C fierberea la temperaturi mai mari de 100C autoclavarea

sterilizarea prin cldur uscat incinerarea nclzirea la rou flambarea sterilizarea la etuv (poupinel, cuptor Pasteur)

sterilizarea cu U.V. sterilizarea cu ultrasunete filtrarea ultracentrifugarea

2. Metode chimice

Dezinfecia Antisepsia

Se utilizeaz o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatori fizici

(termometru), chimici (substane care i schimb culoarea sau consistena la o anumit temperatur) sau biologici (de exemplu spori de Bacillus stearotermophilus).

1. Sterilizarea prin metode fizice A. Sterilizarea prin cldur Prin nclzire se produce o denaturare a proteinelor celulare i o inactivare a enzimelor (n

cazul cldurii umede) sau chiar o carbonizare a materialului celular (n cazul cldurii uscate). A1. Sterilizarea prin cldur umed se realizeaz mai uor, necesit temperaturi mai

sczute i are un grad mai mare de penetrare a materialului celular comparativ cu cldura uscat. Pasteurizarea este o metod utilizat n special n industria alimentar pentru sterilizarea

parial a unor lichide: lapte, smntn, sucuri de fructe, siropuri, bere. Se realizeaz n instalaii speciale, n dou variante: pasteurizare joas (la 50 60C timp de 30 minute) i pasteurizare nalt (la 85 90C timp de 2 5 minute); lichidele sunt aduse la temperatura adecvat pentru intervalul de timp corespunztor, apoi sunt rcite brusc, ambalate n recipiente ermetic nchise i depozitate la rece (la +4C).

Aceast metod distruge doar formele vegetative ale bacteriilor, dar nu distruge formele de rezisten (sporii).

Tindalizarea este o metod de sterilizare complet, care const n trei pasteurizri joase repetate la interval de 24 de ore una de cealalt, n bi de ap sau de nisip cu temperaturi constante. ntre dou pasteurizri succesive lichidele respective se menin la temperatura camerei, pentru a favoriza germinarea sporilor. Se aplic mediilor i lichidelor care sunt termolabile (ser, snge, soluii de zaharuri, de medicamente).

Fierberea este o metod de sterilizare incomplet, la temperatura de 100C, timp de 30 60 minute dup atingerea acestei temperaturi, n ap distilat (pentru a preveni precipitarea srurilor pe instrumente). S-a aplicat instrumentelor metalice, seringilor de sticl, folosind fierbtoare electrice sau nclzite la becuri de gaz. Dac n apa de fierbere se adaug 4 5g de borat sau carbonat de sodiu se evit variaia punctului de fierbere a apei cu presiunea atmosferic i crete eficiena metodei. Mediile termolabile se pot steriliza prin fierbere n baie de ap.

Autoclavarea este o metod de sterilizare complet, care se realizeaz n aparate speciale numite autoclave, cu ajutorul vaporilor de ap saturai sub presiune, produi ntr-un recipient cu pereii dubli, nchis ermetic, dup ndeprtarea aerului. Se folosete ap distilat. Autoclavul este alctuit dintr-o incint metalic, cu pereii dubli, cu un capac greu, prevzut cu o garnitur de cauciuc sau azbest, sursa de nclzire fiind reprezentat de o rezisten electric. Aparatul mai este prevzut cu un manometru, un sistem de reglare a presiunii, un sistem de indicare a nivelului apei din aparat, un robinet de evacuare a gazelor (aerului i vaporilor de ap), iar n interior prezint un stelaj pentru aezarea materialelor. Autoclavul se umple cu cantitatea adecvat de ap distilat (se urmrete tubul de nivel), se aaz materialele n interior, pregtite corespunztor, se deschide robinetul de evacuare a gazelor i se nchide etan capacul aparatului. Se pornete aparatul, iar cnd jetul de vapori de ap eliminat prin robinetul de evacuare este continuu, se nchide acest robinet. Se regleaz presiunea la nivelul dorit, iar cnd acest nivel este atins i presiunea rmne constant, se ncepe msurarea timpului de sterilizare. La ncheierea sterilizrii, se ntrerupe funcionarea aparatului, se ateapt scderea presiunii la zero, se deschide robinetul de evacuare i apoi se poate deschide capacul aparatului.

Vasele de sticl scoase din aparat nu se vor pune pe suprafee reci. Se evit deschiderea prea trzie a aparatului, deoarece obiectele din cauciuc sterilizate devin casante, iar dopurile de vat ale flacoanelor i eprubetelor se umezesc la condensarea vaporilor. Se pot steriliza prin autoclavare materiale care nu se degradeaz la temperaturi de 115 150C: ap distilat, ser fiziologic, soluii tampon de lucru, medii de cultur solide sau lichide (i nainte de lucru i dup ce au fost contaminate), obiecte din cauciuc sau cu garnituri din cauciuc, obiecte din sticl, instrumente metalice, filtre bacteriologice, vat, tifon. ntre temperatura i presiunea vaporilor de ap din autoclav exist o relaie direct:

- la 0,5 atm - 115C - la 1 atm 120 (121)C - la 1,5 atm - 129C - la 2 atm - 134C - la 2,5 atm - 140C - la 3 atm - 144C

A2. Sterilizarea prin cldur uscat Incinerarea reprezint arderea materialelor contaminate i nerecuperabile, n crematorii

(incineratoare) la temperaturi de 300 - 500C. Se aplic pentru materiale de unic folosin contaminate (seringi, cutii Petri, mnui chirurgicale), materiale contaminate nerecuperabile (vat, tifon), cadavre ale animalelor de laborator infectate.

nclzirea la rou reprezint meninerea n flacra becului de gaz a firului ansei bacteriologice sau a spatulelor foarte subiri pn devin incandescente. Ansa uscat se sterilizeaz prin nclzirea la rou a firului n zona fiebinte a flcrii (care atinge temperaturi de 700C) i flambarea portansei. Ansa umed se introduce n flacr n zona rece (n partea inferioar a flcrii) pentru a se usca, apoi se nclzete la rou n zona fierbinte pentru a fi sterilizat, urmat de flambarea portansei.

Flambarea const n trecerea de cteva ori prin flacra becului de gaz, n zona fierbinte, a obiectelor de sticl sau metal cu suprafa neted (lame de sticl, gura eprubetelor i a flacoanelor, portansa).

Sterilizarea la etuv se aplic n special pentru obiectele de sticlrie i porelan, perfect uscate, mpachetate corespunztor n hrtie alb. Se realizeaz la temperatura de 180C, timp de 60 minute din momentul atingerii acestei temperaturi. Etuva este un aparat cu pereii dubli, cu un nveli termoizolator, prevzut cu o rezisten electric, un ventilator pentru uniformizarea temperaturii, un termometru, un buton de reglare a temperaturii. Materialele se introduc n aparat pregtite corespunztor, se nchide aparatul i se pornete. Din momentul atingerii temperaturii de 180C se msoar intervalul de sterilizare. Cnd sterilizarea s-a ncheiat, se ntrerupe contactul electric, se ateapt scderea temperaturii la 60C, dup care se poate deschide aparatul. Vasele sterilizate scoase din aparat nu se pun pe suprafee reci.

B. Sterilizarea cu ultraviolete Radiaiile ultraviolete cu lungimea de und 250 280nm au efect bactericid. Efectul

antimicrobian maxim este la lungimea de und de 260nm, datorat aciunii asupra acizilor nucleici (n special ADN) i la lungimea de und de 280nm, datorat aciunii asupra proteinelor. Se folosesc pentru sterilizarea ncperilor (laboratoare, sli de spital), a apei potabile, a alimentelor, a plcilor Petri de plastic, a seringilor de unic folosin. Sunt produse de lmpi cu ultraviolete, numite germicide. Se evit contactul direct cu ultravioletele, deoarece determin iritaii corneene severe, care se manifest instantaneu.

C. Sterilizarea cu ultrasunete

Ultrasunetele, produse de aparate numite ultrasonatoare, determin ruperea nveliurilor celulare i eliberarea la exterior a coninutului celular. Ele se folosesc pentru sterilizarea alimentelor, sucurilor de fructe, laptelui.

D. Sterilizarea prin filtrare Filtrarea reprezint trecerea unui lichid printr-o substan poroas sau printr-o membran, pentru a separa particulele din lichidul respectiv. Filtrarea prin filtre bacteriologice separ microorganismele din suspensiile n care se gsesc, filtratul rezultat fiind steril. Prin filtrare se poate realiza i separarea a dou categorii de microorganisme, cu celule de dimensiuni diferite, dintr-un amestec. Aceast metod se aplic pentru produse termolabile (medii de cultur, soluii de zaharuri, vitamine, aminoacizi, preparate enzimatice).

A. Sterilizarea prin centrifugare Este o tehnic de separare a microorganismelor din lichidele n care se gsesc prin

centrifugare la viteze mari. Viteza de sedimentare a particulelor depinde de: mrimea i greutatea particulelor, fora centrifug, vscozitatea lichidului i diferena de densitate ntre particule i mediu.

2. Sterilizarea prin metode chimice

O substan chimic poate avea asupra microorganismelor dou tipuri de efecte: bacteriostatic (reversibil, ducnd la inhibarea proceselor de multiplicare bacterian) i bactericid (ireversibil, ducnd la omorrea bacteriilor). O substan are n general efect bacteriostatic sau efect bactericid n funcie de concentraia substanei i de timpul de aciune asupra microorganismelor. O substan este considerat bacteriostatic dac efectul su rmne ca atare i la concentraii mari, iar viteza de omorre a bacteriilor la concentraii mari este mic. O substan este considerat bactericid dac la concentraii mici determin omorrea bacteriilor cu vitez mare. Antisepticele sunt substane chimice care se aplic pe esuturi vii, au toxicitate relativ mic i sunt n general bacteriostatice. Dezinfectantele sunt substane chimice cu toxicitate relativ mare, care se pot aplica pe obiecte neanimate i au n general efect bactericid. Att antisepticele ct i dezinfectantele sunt substane chimice cu aciune antimicrobian neselectiv, alternd structuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare.

Antibioticele i chimioterapicele reprezint un grup de substane chimice cu efect bacteriostatic sau bactericid, a cror aciune antimicrobian este specific i selectiv, iar n doze terapeutice nu lezeaz celulele organismului gazd.

Ca s fie considerat un bun dezinfectant, o substan chimic trebuie s ndeplineasc mai multe condiii:

s omoare germenii la concentraii joase i ntr-un timp scurt, s aib un spectru de aciune larg (s acioneze asupra unui numr mare de categorii de

microorganisme), s nu degradeze i s nu coloreze substratul, s fie ct mai puin toxic pentru om i animale, s fie solubil i stabil n ap sau ali solveni, fr ca prin aceasta s i piard puterea

bactericid, s fie uor de manevrat, neexplozibil, neinflamabil i ieftin.

III. MEDII DE CULTUR FOLOSITE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

A. Pregtire i sterilizare

Mediul de cultur este un amestec de substane nutritive lichide sau solide, de la cele mai simple (substane anorganice) pn la cele mai complexe (din categoria factorilor de cretere), destinat creterii i multiplicrii bacteriilor, precum i studiului microorganismelor n laborator. Mediile de cultur permit urmtoarele:

izolarea unui microorganism din mediul natural (ap, sol, lapte, diferite produse patologice);

obinerea microorganismelor n cultur pur, separat de ali germeni; identificarea unui microorganism izolat n laborator, n funcie de:

caracterele de cultur; caracterele biochimice; caracterele morfologice.

Eficiena unui mediu de cultur const n asigurarea: substanelor nutritive necesare creterii i dezvoltrii germenilor; substratului energetic necesar desfurrii optime a tuturor proceselor metabolice ale celulelor.

Condiiile obligatorii ale unui mediu de cultur: s conin substane nutritive specifice microorganismului respectiv, corespunztoare att

calitativ, ct i cantitativ, ntr-o form asimilabil microorganismului: o o surs de energie necesar reaciilor de sintez, cretere, mobilitate ; o o surs de azot necesar sintezei proteinelor i acizilor nucleici; o ap i sruri minerale necesare pentru pstrarea echilibrului ionic; o ioni necesari metabolismului bacteriilor; o vitamine, care sunt factori de cretere a microorganismelor, necesare pentru sinteza

metaboliilor eseniali ; s asigure condiiile optime de aerare pentru microorganismele aerobe i respectiv condiiile de

anaerobioz pentru microorganismele anaerobe; s prezinte un pH adecvat; n general, bacteriile necesit un pH optim ntre 7 i 8 ; unele

bacterii sunt acidofile (pH = 4,5), drojdiile i mucegaiurile necesit un pH acid (2 5); s fie clar, limpede, pentru a permite studiul caracterelor de cultur a microorganismelor; s fie steril; s se asigure meninerea sterilitii i protecia fa de lumin.

Etapele preparrii unui mediu nutritiv

Diferitele medii de cultur se prepar dup o metodologie care conserv componentele nutritive ntr-o form asimilabil microorganismelor cultivate. Multe substane nutritive devin inhibitori ai creterii bacteriilor sau pot avea efect toxic pe msur ce cantitatea lor crete n mediul de cultur (zaharurile, srurile de acizi grai, fosfatul anorganic). Etapele obligatorii parcurse n prepararea mediului nutritiv sunt: stabilirea compoziiei chimice a mediului n funcie de scopul urmrit; cntrirea i apoi dizolvarea substanelor respective n ap distilat la cald; de obicei, dizolvarea

se face n jumtate din cantitatea de ap necesar, n ordinea indicat de reet; dup dizolvarea complet a substanelor se adaug restul de ap distilat, conform reetei;

se controleaz pH-ul cu hrtie de pH sau cu ajutorul unui pH-metru; dac pH-ul nu e cel dorit, se ajusteaz fie cu NaOH sol. 10%, fie cu HCl sol. 10% ;

se trece la repartizarea mediului n recipiente sterile: eprubete, baloane Erlenmeyer; vasele se nchid apoi cu dop de vat i tifon, eventual cu capion de staniol; mediul nu va ocupa mai mult de 2/3 din volumul recipientului;

sterilizarea mediului se face prin metode alese n funcie de natura substanelor care intr n compoziia lui; n general se realizeaz prin autoclavare la 121C timp de 30 minute (n cazul substanelor nepretenioase); prin fierbere n baia de ap; tyndalizare; filtrare.

Dup orice autoclavare a mediului, pH-ul scade cu 0,3 uniti. Srurile care conin Ca2+ i Fe2+ se recomand s se sterilizeze separat i s se adauge apoi aseptic n mediul rcit. Mediile care conin zaharuri se sterilizeaz la o temperatur ce nu va depi 110C, dar mai bine se sterilizeaz prin filtrare.

Mediile sterile se pot pstra cteva sptmni la temperatura de +4C (frigider sau camere frigorifice). nainte de folosire se face controlul sterilitii mediului respectiv prin punerea lui la termostat la 37C timp de 18 ore, pentru a vedea dac se dezvolt sau nu bacterii. Orice mediu de cultur care intr n lucru nu se utilizeaz la temperatura de pstrare, ci n prealabil se aduce la temperatura camerei sau la 37C.

B. Categorii de medii de cultur

Criterii de clasificare:

1. Proveniena:

a) Medii naturale, reprezentate de fragmente de organe ori de esuturi animale sau vegetale, sucuri de fructe, infuzii de plante

Ex.: cartof glicerinat (pentru Mycobacterium tuberculosis), mediu cu morcov pentru izolarea i cultivarea mucegaiurilor

b) Medii artificiale, care sunt soluii de substane organice i anorganice n concentraii bine cunoscute, confom formulei.

2. Consistena:

a) Medii lichide: ex. bulion nutritiv, b) Medii semisolide: au concentraie de agar pe jumtate fa de cele solide, c) Medii solide: ex. geloz nutritiv, d) Medii deshidratate: au valabilitate mai mare, ocup un volum mai mic, necesit

hidratare.

3. Scopul utilizrii:

a) Medii simple, uzuale - permit dezvoltarea majoritii microorganismelor, mai ales a bacteriilor:

a1) lichide: ex. bulionul nutritiv (pepton, extract de carne (BEEF EXTRACT), NaCl, ap distilat); a2) semisolide: ex. bulion nutritiv + agar 0,5% (la 100 ml bulion 0,5 g agar); a3) solide: ex. geloza simpl (bulion nutritiv + agar 1% 2 3% - se numete i bulion agarizat).

b) Medii complexe - se obin din mediile uzuale, la care se adaug diferite lichide biologice: snge, ser, lichid de ascit, care conin o serie de factori de cretere i de substane organice complexe, necesare pentru dezvoltarea microorganismelor pretenioase.

Ex.: geloz - snge i bulion - snge pentru cultivarea streptococului hemolitic; bulion sau geloz cu lichid de ascit pentru cultivarea meningococului (Neisseria meningitidis).

c) Medii speciale - asigur creterea preferenial a anumitor specii de bacterii sau evidenierea unor caractere metabolice specifice anumitor microorganisme. Ele conin, n general: un indicator de pH, un zahr fermentescibil (glucoz, lactoz, zaharoz), antibiotice selective, antiseptice. Pot fi:

c1) medii selective, care includ unul sau mai muli ageni inhibitori, ce restrng multiplicarea diferitelor specii de microorganisme dintr-o populaie heterogen, permind ns creterea doar a anumitor specii. Ex.: Mediul cu cristal violet - pentru bacterii Gram (-); sunt inhibate bacteriile Gram (+);

c2) medii de mbogire, care nu conin substane bacteriostatice; sunt destinate cultivrii bacteriilor cu necesiti nutritive particulare, care sunt stimulate s creasc rapid. Ex.: Bulion cu selenit, mediul Mller Kauffmann pentru Salmonella; Mediul Lowenstein pentru bacilul Koch. c3) medii elective, care nu conin inhibitori de cretere, satisfac doar necesitile minime ale unei specii date. Ex.: mediul BG 11 pentru cultivarea bacteriilor fixatoare de azot molecular, nu conine azot. c4) medii difereniale, care se folosesc pentru diagnosticul diferenial, evideniaz prin compoziia lor anumite particulariti metabolice ale unor specii date. Pot evidenia un singur caracter (medii difereniale simple) sau mai multe (medii difereniale politrope). Ex. medii difereniale simple:

o Geloz snge permite diferenierea streptococilor hemolitici (care produc hemolizine ce distrug hematiile) de celelalte specii de streptococi, nehemolitice;

o Mediul AABTL - pentru evidenierea bacteriilor care fermenteaz lactoza. Ex. medii difereniale politrope:

o Mediul TSI agar tripluzaharat sulfat feros (triple sugar iron); o Mediul MIU (Mobilitate Indol Uree)

c5) medii de meninere, care se folosesc pentru pstrarea culturilor de microorganisme n colecii de laborator; asigur viabilitatea ndelungat a celulelor.

4. Prezena sau absena oxigenului:

a) Medii pentru culturi aerobe b) Medii pentru microorganisme anaerobe: la medii de cultur obinuite se adaug substane

cu efect reductor (acid ascorbic, cistein) sau fragmente proaspete de organe vegetale ori animale cu aciune reductoare (ficat, splin, boabe de orez n curs de germinare); mediile lichide se fierb nainte de nsmnare, iar dup nsmnare se adaug un strat de ulei de parafin steril la suprafaa lor; mediile solide se repartizeaz n coloan nalt pentru a nu permite difuzia oxigenului; se pot menine n exsicator sau n incinte speciale n care se gsesc substane cu efect reductor.

IV. RECOLTAREA PRODUSELOR BIOLOGICE I PATOLOGICE N BOLILE INFECIOASE

Scopul recoltrii probelor biologice sau patologice:

- izolarea i identificarea agentului etiologic al bolii; - stabilirea distribuiei anumitor ageni infecioi n diferite colectiviti i a perspectivelor

epidemiologice prin supravegherea sero-epidemiologic a colectivitilor respective (dinamica anticorpilor specifici);

- stabilirea profilului imunologic al unei populaii, ca urmare a aciunilor de imunizare ce au fost efectuate;

- recunoaterea naturii virale sau bacteriene a unor maladii nc neelucidate; - identificarea agenilor infecioi din mediul extern (ap, aer, sol, alimente); - controlul unor preparate biologice umane (snge i derivate) pentru evitarea rspndirii unor

virusuri. Un diagnostic microbiologic corect depinde de calitatea recoltrii, prelucrrii i transportului probelor la laborator. n cazul recoltrii probelor patologice trebuie respectate cteva reguli: se utilizeaz recipiente, instrumente i materiale sterile; materialele necesare recoltrii trebuie

sterilizate prin procedee fizice, pentru a nu exista urme de substane chimice de la sterilizarea prin metode chimice, care s inactiveze agentul patogen din prob sau s inhibe dezvoltarea agentului bacterian pe mediul de cultur;

alegerea materialelor trebuie s corespund scopului; n unele situaii tamponul de vat este total contraindicat (de exemplu n cazul Bordetella pertussis), deoarece bacteriile i leucocitele pot s rmn n cantitate mare imobilizate pe tampon;

recoltarea probelor se face n condiii riguroase de asepsie, pentru evitarea contaminrii produsului recoltat, pentru evitarea contaminrii persoanei care recolteaz produsul i pentru prevenirea supra-infectrii pacientului;

dac se urmrete izolarea agentului microbian, recoltarea se face naintea nceperii oricrui tratament local sau general cu antibiotice, deoarece acestea pot inhiba multiplicarea microorganismelor i reuita examenului bacteriologic este compromis; dac a fost necesar imperios instituirea unui tratament cu antibiotice nainte de recoltarea produsului patologic, se recomand:

o dac este posibil, oprirea tratamentului cu 24 - 48 de ore nainte de recoltarea produsului;

o recoltarea produsului imediat nainte de administrarea urmtoarei doze de antibiotic; o n cazul n care au fost administrate tetracicline, se poate contracara efectul acestora

adugnd n mediul de cultur pentru bacterii sulfat de magneziu; o diluarea inoculului n mediul de cultur fr antibiotic;

produsele recoltate trebuie s fie caracteristice pentru patogenul respectiv i n cantitate optim; se aleg poriunile cele mai reprezentative, de exemplu n cazul bolilor diareice zonele suspecte ale materiilor fecale, cu aspect mucos, sangvinolent;

recoltarea produselor trebuie s se realizeze ct mai aproape de debutul bolii, alegnd cel mai potrivit moment, n care agentul patogen s se regseasc n produsul recoltat, n funcie de evoluia i de specificul fiziopatologic al bolii; periodicitatea recoltrii produsului patologic poate juca i ea un rol important n aprecierea diagnosticului: 2-3 probe de snge n 24 de ore pentru hemocultur, n cazul unei septicemii; cte o prob de scaun timp de trei zile consecutiv pentru coprocultur n bolile diareice acute; cte o prob de sput timp de trei zile consecutiv pentru diagnosticul tuberculozei.

La recoltarea probelor se ine cont de; modul potrivit de recoltare, timpul potrivit de recoltare, locul potrivit de recoltare.

a) Locul de recoltare depinde de patogeneza bolii respective: Calea de ptrundere a agentului patogen n organism:

respiratorie, cutanat, digestiv, genital;

Calea de diseminare a acestuia n organism: o sangvin bacteriemie (infecie generalizat cu bacterii), viremie (infecie generalizat cu virusuri), o limfatic, o pe calea filetelor nervoase (septinevrit);

Localizarea agentului patogen n organism: digestiv, respiratorie (de exemplu sputa n cazul infeciilor cu Mycobacterium

tuberculosis sau la nivelul cavitii nazale), n coarnele anterioare ale mduvei spinrii, tegumentar;

Calea de eliminare a agentului patogen din organism: prin urin, prin materiile fecale, prin picturile Pfluge.

b) Timpul optim de recoltare a probelor biologice i patologice n cazul maladiilor bacteriene i virale este ct mai curnd dup debutul maladiei; virusul este prezent la un titru maxim n perioada de debut i n cea de stare a bolii, disprnd apoi n cteva zile. Trebuie s se in cont de etapele bolii.

Perioada bolii

Decelarea virusului sau a antigenelor virale n produsele prelevate

Decelarea anticorpilor

specifici n ser Incubaia Rar Nu Debutul bolii Perioada de stare

De cele mai multe ori De obicei

Perioada de recuperare Uneori De obicei Perioada de convalescen Nu sau foarte rar Da

Probele se eticheteaz corect i cite, pentru a nu exista posibilitatea unei confuzii; pe etichet i pe formularul trimis la laborator se scriu:

o numele i prenumele bolnavului, vrsta acestuia, o data i locul recoltrii, o natura probei biologice/patologice, o analiza solicitat i eventual diagnosticul clinic, data debutului bolii, tratamentul

antimicrobian administrat (antibioticul, doze, durat, data nceperii tratamentului).

Transportul produselor biologice i patologice

Transportul la laborator al probelor recoltate se face n cel mai scurt timp posibil, deoarece se urmrete:

meninerea condiiei iniiale a produsului recoltat; diferite microorganisme au temperaturi optime diferite, sunt diferit sensibile la UV, pH, deshidratare,

concentraie de oxigen; microorganismele din microbiota asociat se pot multiplica mai rapid dect cele patogene; utilizarea mediilor de transport poate duce la modificarea aspectului produsului patologic;

prevenirea contaminrii probei recoltate, a personalului medical implicat, a mediului extern; cnd rezistena microorganismului la aciunea mediului extern este extrem de redus, se recomand prelucrarea probei la patul bolnavului sau recoltarea probei direct n laborator, cu prelucrare rapid;

Majoritatea probelor recoltate suport un transport de 1-2 ore pn la laborator, iar dac acesta dureaz mai mult se apeleaz la metode de conservare a probei:

- meninerea la temperatur sczut (container cu ghea, meninere la frigider); - utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart); - recoltarea produsului patologic ntr-o sering steril, eliminarea bulelor de aer i nchiderea

seringii cu un dop de cauciuc steril. Transportul la laborator se efectueaz de ctre un curier instruit special, n recipiente etane

marcate cu risc microbiologic.

1. Recoltarea secreiilor nazo-faringiene Se pot izola - bacterii cu poart de intrare sau localizare respiratorie - streptococi (Streptococcus sp.) - stafilococi (Staphylococcus sp.) - bacili difterici (Corynebacterium dyphtheriae) - meningococi (Neisseria meningitidis) - virusuri - cu poart de intrare i multiplicare respiratorie (v. gripal) - microorganisme cu poart de intrare respiratorie, n primele faze de la infectare - microorganisme cu cale de eliminare prin nazo-faringe (v. rujeolos) Se utilizeaz - tampoane - nazale - faringiene - nazo-faringiene - spltura nazo-faringian. a) Tampoanele nazo-faringiene sunt alctuite dintr-o baghet cu un tampon de vat bine nfurat la vrf ntr-un tub steril. a1) pentru izolarea virusurilor - se introduc n eprubet, n mod steril, 2-3 ml mediu de conservare pentru virusuri, fr a se umezi tamponul de vat; se adaug n mediu penicilin, streptomicin i un antifungic (nistatin, stamicin) pentru mpiedicarea multiplicrii bacteriilor i ciupercilor eventual prezente; - pentru virusurile respiratorii se folosesc cel puin dou tampoane, unul pentru raclare din cavitatea nazal, al doilea pentru badijonare de pe suprafaa faringelui; - dup recoltarea probei se introduce bagheta n mediul de conservare, care se va centrifuga pentru ndeprtarea resturilor celulare, supernatantul folosindu-se ca inocul. a2) pentru izolarea bacteriilor - se folosesc tampoane sterile uscate, cu care se preleveaz proba; - se traseaz striuri cu tamponul pe mediu de cultur solid n cutii Petri (de ex: m. Chapmann pentru stafilococ, geloz-snge pentru streptococul hemolitic); a3) se pot preleva celule exfoliate din cavitatea nazal sau faringe cu ajutorul unor baghete de sticl sterile, care au un capt cu asperiti; se introduce bagheta n cavitatea nazal i se rotete, colectndu-se astfel celule care se pun n mediu conservant sau n tampon fosfat ntr-o eprubet steril; lichidul se concentreaz prin centrifugare. b) Spltura nazo-faringian - cu o sering steril de 10-20 ml, la care este ataat un tub de cauciuc steril, se aspir ser fiziologic sau tampon fosfat steril; - bolnavul este aezat pe scaun, cu capul pe spate; serul se injecteaz n cavitatea nazal i se elimin prin cavitatea bucal ntr-o cutie Petri steril, prin aplecarea capului n fa; - lichidul de spltur se folosete ca inocul, eventual dup centrigugare pentru concentrrare.

2. Prelevarea sputei Diagnosticul de laborator n cazul infeciilor cu M. tuberculosis var. hominis este n esen

bacteriologic, dar poate avea i elemente serologice sau imunobiologice. Recoltarea i transportul produsului patologic la laborator presupune recoltarea de sput, lichid de spltur bronic, LCR, urin, lichid peritoneal, pleural, pericardic, puroi, n funcie de forma clinic a bolii.

Sputa se recolteaz n cutii Petri sterile; uneori este necesar centrifugarea produsului patologic, alteori sputa trebuie decontaminat (de exemplu prin tratare cu NaOH 4%) i neutralizat pentru cultivare. Se utilizeaz pentru efectuarea de preparate microscopice care se coloreaz special sau pentru inoculare pe medii de cultur speciale (Lwestein - Jensen).

3. Prelevarea din leziuni cutanate sau mucoase

Sunt frecvente ca leziuni cutanate sau mucoase: veziculele, pustulele i crustele produse de virusurile Pox , Herpes i de bacterii (streptococi, stafilococi, bacil piocianic).

- pentru izolarea virusurilor se aspir lichidul din veziculele respective cu o pipet Pasteur steril cu vrful efilat;

- pentru izolarea bacteriilor se poate preleva puroi (exsudat cu limfocite alterate, fibrin i bacterii); puroiul poate forma: furuncul, flegmon sau ran deschis;

- se aseptizeaz zona prin badijonare cu tinctur de iod; - se recolteaz puroi cu o sering steril cu ac, o spatul, o ans, o pipet Pasteur steril, prin puncie i aspirare sau, dac nu exist alt variant, cu un tampon de vat steril. n cazul recoltrii de bacterii anaerobe se utilizeaz msuri speciale. 4. Prelevarea secreiei conjunctivale - se preleveaz cu ansa bacteriologic de unic folosin sau cu un tampon de tip faringian, prin raclarea zonei de secreie; - produsul recoltat se pune ntr-o pictur de tampon fosfat i se folosete ca inocul; - se poate realiza imediat o reacie de imunofluorescen pe lam. 5. Prelevarea probelor de snge Sngele se preleveaz cu o sering steril, prin puncie venoas. - n cazul bolilor virale se pune un diagnostic serologic urmrind prezena i dinamica titrului anticorpilor fa de un anumit virus: - se preleveaz dou sau trei probe de snge: 1) proba de ser precoce, la debutul bolii (n primele 3-4 zile); 2) proba de ser tardiv, serul de convalescent (la 15 zile de la debut); 3) n unele viroze (cauzate de v. paragripale, v. respirator sinciial) se recolteaz i a treia prob, la 30-40 zile de la debutul bolii, mai ales dac primele dou probe au dat rezultate negative; - se prelucreaz n acelai timp cele trei probe de ser; creterea semnificativ a titrului anticorpilor n probele 2 sau 3 fa de proba 1 (minim de 4 ori) demonstreaz o infecie viral recent cu agentul cauzal investigat; se poate lucra cu o baterie de antigene dac nu se bnuiete cauza. - pentru izolarea bacteriilor (streptococi, meningococi) se realizeaz o hemocultur, trecnd proba pe mediu de cultur steril i asigurnd condiii de cultivare adecvate; la prelevarea sngelui pentru hemocultur se folosete un antiseptic la nivelul punciei venoase, pentru a se evita introducerea unui stafilococ de pe tegumente. 6. Prelevarea probelor de urin

In infeciile tractului urinar (ITU) se pot recolta urin, snge (ex.. n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. La recoltarea probelor de urin se respect recomandrile: - n cazul n care nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat pentru recoltare

3-4 ore dup miciune; - recoltarea se realizeaz dup splarea cu ap i spun a organelor genitale i a perineului; exist

recomandri specifice pentru sexul feminin i masculin i respectiv pentru copilul mic; - este preferabil ca recoltarea s aib loc ntr-un spaiu corespunztor, n apropiere de laborator,

iar personalul medical trebuie s explice i eventual s asiste recoltarea; - este contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare, iar prelungirea

timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor); dup recoltare, n cazul n care urina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult 30 de minute dup recoltare, cu examinare

bacteriologic n cel mult 2 ore), ea trebuie meninut la temperatura frigiderului, iar transportul trebuie realizat la +4C (temperatur la care condiia microbiologic a probei rmne nemodificat maximum 24 ore);

- de regul se recolteaz urina din mijlocul jetului"; dup splarea organelor genitale i a perineului; prin miciune se elimin circa 100 ml urin (ndeprtnd astfel o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) i abia apoi se recolteaz 20-50 ml (preferabil 50ml) urin n recipientul steril, dup care miciunea continu;

- exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare uretral, cu riscurile respective);

- de la copilul mic urina se recolteaz n pungi sterile speciale. Cu toate c, indiferent de grija cu care va fi recoltat, urina va fi contaminat, se poate

preciza dac pacientul are sau nu infecie urinar prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti formatoare de colonii (UFC/ml) n urina proaspt recoltat, din mijlocul jetului". Mai multe studii au artat c atunci cnd se demonstreaz prezena a 105 bacterii/ml, aceasta indic o infecie a tractului urinar (ITU) n aproximativ 80% dintre cazuri, n timp ce o valoare de 104 bacterii/ml indic ITU n mai puin de 30% dintre cazuri. Datorit acestor rezultate, n practica medical se consider c este infecie urinar atunci cnd numrul de bacterii/ml urin este > 105/ml.

7. Prelevarea probelor de scaun Sindromul de boal diareic acut este determinat de o varietate de microorganisme i de

aceea se impune cunoaterea metodelor de identificare a fiecrei categorii n parte. Se consider c o persoan prezint diaree acut dac a avut cel puin 3 scaune moi n

ultimele 24 de ore, cu sau fr deshidratare (pot fi ntre 3 i 40 scaune, cu pierderi lichidiene de pn la 20 litri n 24 de ore). Scaunele pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sangvinolent) i pot fi nsoite de simptome digestive (dureri abdominale, grea, vrsturi, balonare, flatulen) sau generale (febr, stare general alterat).

Ca ageni etiologici ai bolii diareice pot fi amintii: - Vibrio cholerae serogrup OI, biovar El Tor sau clasic holer; - Salmonella (altele dect typhi i paratyphi) - salmonelloze; - Shigella dyzenteriae grupa A, B, C, D shigelloze (dizenteria bacilar); - Escherichia coli EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, DAEC, Klebsiella sp., Campylobacter jejuni,

Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus infecii intestinale bacteriene;

- Candida albicans (la pacieni imunocompromii) infecii intestinale fungice; - Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis,

Entamoeba hystolitica i Entamoeba coli infecii intestinale datorate protozoarelor; - rotavirusuri, alte virusuri enterale infecii virale intestinale.

n ceea ce privete recoltarea produsului biologic pentru investigaii de laborator, exist cteva particulariti: pentru bolile intestinale virale recoltarea probei se face la maxim 48 de ore de la debut; stocarea

probelor se face la -20C sau -70C; pentru bolile bacteriene recoltarea se face la maxim 4 zile de la debut, probele fiind pstrate la

rece cel mult 24 ore; multe probe se pot pstra la temperatura camerei dac se prelucreaz n maxim 24 de ore, n special dac se urmrete izolarea unor bacterii sensibile la frig (Vibrio, caz n care se recomand prelucrarea imediat);

pentru bolile intestinale parazitare se recomand transportul probelor dup omogenizare cu formaldehid 10%, n proporie de 3:1 = prob:conservant; se va efectua examen coproparazitologic.

Recoltarea probei de materii fecale se face n raport cu agentul cauzal suspectat i cu perioada de boal, convalescen sau stare de purttor, n recipiente sterile numite coprocultoare:

din scaunul emis spontan (sau dup administrarea de purgativ salin): prelucrarea imediat n laborator permite un examen macroscopic, cu prelevri din poriunile reprezentative (mucopurulente, fibrinoase, sangvinolente, lichide). Cnd nu este posibil prelucrarea imediat, este necesar conservarea probei n containere speciale ntr-un mediu de conservare, la rece (la +4C), urmat de transportul la laborator; Proba prelevat astfel const n 2 - 3 g materii fecale. Mediul de conservare poate fi lichid

(tampon fosfat salin adiionat cu glicerin, care permite supravieuirea germenilor timp de 2-3 zile) sau semisolid (Cary - Blair i Stuart, care permit supravieuirea germenilor timp de 7 zile) i va inhiba microbiota saprofit, favoriznd dezvoltarea celei patogene.

cu ajutorul unui tampon sau al unei sonde Nelaton, direct din rect: tamponul se introduce 2 - 3 mm n rect i se rotete pentru a recolta scaun de pe suprafaa plicilor mucoasei rectale. Sonda Nelaton se introduce n rect pe o distan de aproximativ 15 cm la adult i 5 - 7 cm la copilul mic. Tamponul sau sonda se descarc prin agitare ntr-un tub steril cu 1 - 3 ml bulion steril sau soluie salin fiziologic steril, rezultnd o suspensie ce va fi utilizat ca inocul. Dac prelucrarea probei nu se face imediat, tubul se nchide ermetic cu dop steril de cauciuc i se pstreaz la +4C.

direct de pe scutecul sterilizat n prealabil, la sugari; cu tampon steril, n timpul examenului rectoscopic, de la nivelul ulceraiilor, la pacienii

cu rectocolit ulceroas sau cu dizenterie (subacut sau cronic). Materialul prelevat trebuie transportat la laborator n condiii de refrigerare i examinat ct mai curnd dup recoltare.

8. Prelevarea secreiilor de la nivelul aparatului genital Diagnosticul bacteriologic n cazul sifilisului presupune urmtoarele etape ale

diagnosticului clasic: - recoltarea probelor patologice (pentru efectuarea de preparate microscopice) reprezentate de:

o lichidul clar din leziunile primare sau secundare, dup ndeprtarea cu grij a crustei; o lichid de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n cazul sifilisului congenital

timpuriu, o prob recoltat din ganglionii limfatici regionali.

Recoltarea se face ct mai repede dup debutul bolii i nainte de nceperea tratamentului cu antibiotice. Probele se preleveaz cu ansa steril sau pipet Pasteur, ori aplicnd direct lama steril peste leziunea umed i acoperind apoi cu lamela de sticl, dup care se apas uor pentru ndeprtarea bulelor de aer.

- transportul probelor patologice, n maxim 20 de minute de la prelevare, ceea ce presupune recoltarea probei n imediata vecintate a laboratorului; - examinarea preparatului microscopic se poate face cu ajutorul microscopului cu fond ntunecat sau se poate aplica reacia de imunofluorescen direct.

V. TEHNICI DE CULTIVARE A BACTERIILOR, RICKETTSIILOR, CHLAMIDIILOR, VIRUSURILOR

1. TEHNICI DE CULTIVARE A BACTERIILOR

nsmnarea microorganismelor (din cultur preexistent sau din prob natural ori

patologic) reprezint depunerea unei cantiti de cultur bacterian sau prob de analizat pe suprafaa sau n profunzimea unui mediu nutritiv solid sau lichid.

Scopul nsmnrii: - pentru studiul caracterelor de cultur - pentru diagnosticarea bolilor infecioase - pentru prepararea de vaccinuri bacteriene - pentru obinerea unor produse biologice sintetizate de bacterii (antibiotice, aminoacizi,

vitamine) - pentru conservarea i pstrarea microorganismelor n colecii de culturi pure n laborator.

Cerine obligatorii ale operaiei de nsmnare: a) nsmnarea s se realizeze steril pentru a nu permite introducerea n mediul nutritiv a altor

germeni din mediul nconjurtor, pentru evitarea diseminrii microorganismelor n mediul nconjurtor, mai ales dac acestea sunt sau pot deveni patogene; nsmnarea se face n apropierea flcrii becului de gaz, care ofer posibilitatea sterilizrii instrumentelor cu care se lucreaz prin flambare sau nclzire la rou;

b) nsmnarea se face ntr-un interval de timp ct mai scurt, pentru a micora posibilitatea contactului materialelor cu aerul nesteril;

c) n timpul lucrului, ct timp recipientele cu medii de cultur sterile sau cu bacterii trebuie meninute deschise, se vor ine n poziie oblic, aproape orizontal, n imediata apropiere a flcrii becului de gaz.

Variante de nsmnare a microorganismelor: 1. dup natura produsului din care se face nsmnarea:

a) dintr-o cultur bacterian pur n mediul nutritiv steril, b) dintr-o prob: - natural (ap, buturi, sol, alimente),

- patologic, prelevat de la bolnav. Probele naturale pot conine asociaii heterogene de germeni, de aceea se va face nti

izolarea diferiilor germeni, apoi purificarea fiecrui germen n parte. c) nsmnarea mixt a dou tipuri diferite de microorganisme, obligatorie pentru cele care nu

se dezvolt singure, d) nsmnarea asociat a dou sau mai multe specii de microorganisme (n special pentru

studii de ecologie fiziologic: antagonism etc.), 2. dup consistena mediului nutritiv n care se nsmneaz i a mediului din care se preia

inoculul (solid, lichid): a) inoculare n medii nutritive lichide:

- cu germeni crescui n mediu lichid, - cu germeni de pe mediu solid,

b) inoculare pe medii nutritive solide: - cu germeni crescui n mediu lichid, - cu germeni de pe mediu solid,

3. dup disponibilitatea substanelor nutritive din mediu: a) cultivare continu, n care se rennoiete permanent mediul de cretere cu o anumit rat

reglabil, suspensia de celule fiind scoas din camera de cretere cu aceeai rat, b) cultivare discontinu, n care mediul nutritiv inoculat nu este rennoit; creterea numeric

a microorganismelor este limitat n timp de disponibilitatea limitat a nutrienilor; se produce inhibarea creterii celulare prin epuizarea rezervelor nutritive sau prin acumularea produilor de catabolism.

nsmnarea reprezint pasarea unei culturi pure pe un mediu nutritiv. Inocularea reprezint trecerea pe un mediu nutritiv a unei probe naturale sau patologice n

scopul izolrii germenilor. Cultivarea se refer la condiiile de cretere a culturii bacteriene dup nsmnare sau

inoculare: temperatur, aerare, agitare, pH, substane nutritive.

A. INOCULARE N MEDII NUTRITIVE LICHIDE Materiale necesare: - mediu lichid steril, - cultur bacterian n mediu lichid sau pe mediu solid, - bec de gaz, - pipet Pasteur / ans de platin, - vas cu amestec sulfo-cromic. Mod de lucru: - se agit uor tubul cu germeni, se deschide, se flambeaz; dac proba se gsete pe mediu

solid n cutii Petri se deschide cutia; - se introduce pipeta steril n tub, se ia o cantitate de inocul, se scoate pipeta; dac proba are

o concentraie mare de germeni n mediu lichid sau se gsete pe mediu solid, se folosete ansa sterilizat n prealabil, care trebuie rcit pe partea interioar a tubului sau a capacului cutiei (recoltarea se face prin raclarea uoar a culturii de pe mediul solid);

- se flambeaz tubul i se nchide; dac se folosete cutia Petri, se flambeaz capacul i se nchide cutia;

- se deschide tubul cu mediu steril, se flambeaz; - se introduce pipeta (sau ansa) cu inocul n tub, se nsmneaz,se scoate pipeta; inoculul de

pe ans prelevat de pe mediu solid se dilueaz n mediul lichid, prelund cu ansa cte o pictur pe peretele tubului;

- se flambeaz tubul i se nchide; - pipeta se pune n vasul cu amestec sulfo-cromic; ansa se usuc i se sterilizeaz prin

nclzire la rou.

B. INOCULARE PE MEDII NUTRITIVE SOLIDE a) inocularea n tuburi cu geloz n coloan dreapt (L S)

Materiale necesare: - mediu de cultur steril n coloan dreapt n tub, - cultur bacterian n mediu lichid, - bec de gaz, - ans de platin fir. Mod de lucru: - se sterilizeaz ansa prin nclzire la rou; - se deschide tubul cu germeni, se flambeaz; - se rcete ansa pe peretele interior al tubului; - se preia o cantitate de inocul; - se flambeaz tubul, se nchide; - se deschide eprubeta cu mediu steril, se flambeaz; - se depune inoculul n mediu prin nepare; - se flambeaz tubul, se nchide; - se sterilizeaz ansa prin nclzire la rou dup uscare.

b) inocularea n tuburi pe geloz nclinat Materiale necesare: - mediu de cultur steril solidificat nclinat n tuburi, - cultur bacterian n mediu lichid sau pe mediu solid: n Petri, n tub nclinat, - bec de gaz, - ans de platin.

Mod de lucru: - se sterilizeaz ansa prin nclzire la rou; - se deschide eprubeta cu germeni, se flambeaz; - se rcete ansa pe peretele interior al tubului sau pe faa intern a capacului cutiei; - se preia o cantitate de inocul; - se flambeaz eprubeta sau capacul cutiei Petri, se nchide; - se deschide tubul cu mediul steril solidificat nclinat, se flambeaz; - se introduce ansa n inoculul pn n captul eprubetei, n lichidul de condensare, unde se

descarc inoculul i se omogenizeaz; - se descrie pe suprafaa mediului nclinat, cu bucla ansei, un traseu n zig-zag, pe care

rmne inoculul bacterian; - se flambeaz tubul, se nchide; - se sterilizeaz ansa prin nclzire la rou dup uscare.

c) inocularea pe mediu solidificat n cutie Petri c1) cu ajutorul ansei Materiale necesare: - mediu de cultur solidificat n plci steril, - cultur bacterian n mediu lichid sau pe mediu solid: n plci Petri, n plan nclinat n

tuburi, - bec de gaz, - ans de plantin. Mod de lucru: - se sterilizeaz ansa prin nclzire la rou; - se deschide tubul cu germeni, se flambeaz sau se deschide cutia Petri n apropierea flcrii

becului de gaz, fie innd-o ntredeschis n mna stng, fie lsnd-o pe mas i ridicndu-i capacul;

- se rcete ansa pe peretele interior al tubului sau pe partea interioar a capacului cutiei ori pe o poriune necultivat de mediu;

- se preia o cantitate de inocul (de pe mediu solid prin raclarea fin a culturii bacteriene sau a unei colonii);

- se flambeaz tubul, se nchide sau se nchide cutia Petri, eventual dup o prealabil flambare a capacului;

- se deschide cutia Petri cu mediul steril i se traseaz pe suprafaa mediului, n funcie de scopul urmrit, striuri paralele sau n unghi drept;

- se nchide cutia Petri; - se sterilizeaz ansa, dup uscare, prin nclzire la rou. c2) cu ajutorul pipetei (inoculare prin inundare) Materiale necesare: - mediu de cultur steril solidificat n plci, - cultur bacterian n mediu lichid, - bec de gaz, pipete sterile. Mod de lucru: - se scoate pipeta steril din ambalajud de hrtie; - se deschide tubul cu germeni, se flambeaz, se agit; - se preia o cantitate de inocul n pipet; se flambeaz tubul, se nchide; - se deschide cutia Petri cu mediu solid; - se distribuie inoculul pe suprafaa mediului solidificat, uniform; dac inoculul este prea

bogat, excesul se poate prelua cu pipeta prin nclinarea cutiei; dac este n cantitate mic, se pot folosi baghete sterile de sticl, cu o form special, pentru distribuire uniform;

- se nchide cutia Petri dup o eventual flambare a capacului; - se pun n amestecul dezinfectant pipeta folosit i bagheta.

La nsmnarea pe mediu solid tehnica este aleas n funcie de scopul dorit: nsmnarea n striuri se practic pentru studiul fenomenului de antibioz dintre microorganisme; nsmnarea prin inundare (n pnz) este utilizat pentru antibiograme, studiul particularitilor biochimice sau pentru obinerea unor cantiti superioare de celule; nsmnarea prin ncorporare se practic pentru cultivarea unor microorganisme ce necesit o presiune parial a oxigenului mai sczut dect cea atmosferic. Dac suspensia bacterian este suficient de diluat, se vor putea obine colonii izolate.

Toate tipurile de nsmnri sunt urmate de notarea datei, a numrului probei i a altor elemente de identificare, apoi de termostatare timp de 24 48 h a tuburilor sau cutiilor Petri, de obicei la 37C (n funcie de tipul de germeni). Cutiile Petri se vor pune la termostat cu capacul n jos.

Pentru izolarea microorganismelor n culturi pure este necesar s se obin colonii fizic independente pe mediu solid. Colonia bacterian reprezint rezultatul multiplicrii ntr-un spaiu limitat a unei singure celule bacteriene; celulele din aceeai colonie fiind identice ntre ele din punct de vedere genetic, colonia reprezint ea nsi o cultur pur.

Pentru obinerea de colonii izolate se depun pe suprafaa mediului solid celulele bacteriene n aa fel nct ele s ajung izolate fizic ntre ele, iar n urma multiplicrii lor s se formeze colonii izolate. Coloniile rezultate se vor distinge prin morfologie, dimensiuni, aspect, pigmentaie.

Prin preluarea separat a acestora cu ansa steril i trecerea lor pe un alt mediu de cultur, se vor obine culturi pure n urma termostatrii. Culturile pure obinute se pot studia din punct de vedere morfologic, biochimic, serologic etc.

Obinerea culturilor pure este necesar pentru studiul microorganismelor n laborator (morfologic, citologic, genetic, biochimic), pentru utilizarea culturilor n scop industrial n vederea obinerii de substane bioactive (aminoacizi, antibiotice, enzime) i pentru obinerea de vaccinuri.

FI DE LUCRU

Tehnica epuizrii ansei

Principiul tehnicii: Bucla ansei, n care se recolteaz o cantitate mic de inocul, descrie un traseu lung pe suprafaa mediului solidificat, lsnd n fiecare sector al plcii un numr din ce n ce mai mic de celule, astfel nct, n ultimul sector, ansa de a depune celule izolate spaial este mai mare. Prin incubarea ulterioar a plcilor la termostat, la 37C, timp de 24 - 48 ore, prin multiplicarea celulelor izolate, vor rezulta colonii izolate. Materiale necesare: - proba de cercetat n mediu lichid; dac proba este pe mediu solid, se obine din aceasta o

suspensie celular n tampon fosfat salin (TFS) steril, soluie de lucru (1x); dac suspensia este concentrat, se face o diluie n TFS steril;

- mediul nutritiv solid distribuit n cutii Petri; - ans; bec de gaz.

Tehnica de lucru: Variante: 1) Tehnica epuizrii ansei pe sectoare, n striuri paralele

- se traseaz pe cutia Petri, cu markerul, dou linii perpendiculare una pe cealalt, pentru a mpri cutia n 4 sectoare;

- se preleveaz inoculul cu ansa steril, pelicula din bucla ansei se las pe partea intern a peretelui eprubetei;

- se descriu striuri paralele n cele patru sectoare ale plcii, succesiv, de la stnga la dreapta (n sens orar) i de la marginea plcii ctre centru;

- plcile se noteaz i se pun la termostat, cu capacul n jos, la 37C, timp de 24 - 48 ore; - dac nu se obin colonii izolate, operaia se repet cu o suspensie diluat.

2) Tehnica epuizrii ansei prin fracionarea striurilor - se recolteaz inoculul cu ansa steril; - se traseaz striuri paralele n primul sector al plcii; - ansa se usuc i se sterilizeaz, apoi se rcete pe partea interioar a capacului; - se traseaz n al doilea sector striuri paralele ntre ele, perpendiculare pe cele din primul sector,

pornind din captul terminal al striurilor din primul sector; - ansa se usuc i se sterilizeaz; - operaia se repet pn la ultimul sector; - plcile se noteaz i se pun la termostat, cu capacul n jos, la 37C, timp de 24 - 48 ore.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160500002531

http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm

http://www.oxoid.com/UK/blue/press/press.asp?art=Y&arch=Y&pRef=PR0288&c=UK&lang=EN&yr=2004

http://www.popsci.com/science/article/2011-11/bacteria-swap-gene-information-through-global-network http://www.abpischools.org.uk/page/modules/infectiousdiseases_medicines/medicines3.cfm

FI DE LUCRU

Tehnica diseminrii inoculului diluat

pe suprafaa mediului solid cu ajutorul baghetei de sticl Principiul tehnicii:

Este o tehnic de obinere a coloniilor izolate (n scopul obinerii de culturi pure) n cazul probelor puternic contaminate. Inoculul diluat este distribuit omogen pe suprafaa mediului cu ajutorul baghetei sterile. Materiale necesare: - proba de cercetat n mediu lichid; dac proba este pe mediu solid, se obine din aceasta o

suspensie n tampon fosfat salin (TFS) steril, soluie de lucru (1x); dac suspensia este prea concentrat, se face o diluie a acesteia n TFS steril;

- eprubete sterile; pipete gradate sterile; - soluie TFS de lucru steril; mediul nutritiv solid distribuit n cutii Petri; - vas cu amestec dezinfectant; bec de gaz.

Tehnica de lucru: - se face o diluie seriat zecimal din proba de cercetat:

- n 10 eprubete se pun cte 9 ml TFS steril; - n prima eprubet se adaug 1ml din suspensia celular de cercetat; se obine diluia 1/10

sau 10-1; - se barboteaz, se trece 1 ml din prima eprubet n cea de a doua eprubet, unde se obine

diluia 1/100 sau 10-2; se barboteaz i operaia se repet pn la eprubeta a zecea (n care va fi diluia 10-10);

- din ultimele diluii se depune cte un inocul pe suprafaa mediului solid din cutiile Petri; - se distribuie uniform inoculul din cutie cu ajutorul baghetei de sticl sterile; - bagheta se pune n vasul cu amestec dezinfectant; - cutiile se noteaz i se in pe masa de lucru sau la termostat n poziie normal pentru adsorbia

suspensiei n mediu, apoi se intorc cu capacul n jos, dup care se termostateaz la 37C, timp de 24 - 48 ore.

FI DE LUCRU

Tehnica inoculrii prin ncorporarea inoculului Materiale necesare:

- mediu de cultur steril solid n tub n coloan dreapt - cutii Petri sterile goale; cultur bacterian n mediu lichid; - bec de gaz; vas cu amestec oxidant; baie de ap; pipete Pasteur sau gradate sterile

Mod de lucru: - se pun n baie de ap la lichefiat tuburile cu mediul steril solidificat; dup lichefierea

complet se las s se rceasc la 45 - 48C; - se agit uor tubul cu germeni, se deschide, se flambeaz; - se preia cu o pipet steril o cantitate de inocul; - se flambeaz tubul, se nchide; - inoculul se depune n centrul cutiei Petri goale sterile; pipeta se depune n amestecul

oxidant; peste inocul se toarn mediul lichefiat i rcit la 45 - 48C, rotindu-se uor cutia pentru omogenizare;

- se las pe plan neted s se solidifice; - dup solidificare cutia se noteaz i se pune la termostat cu capacul n jos; se termostateaz

la 37C, timp de 24 - 48 ore.

Inocularea diluiilor zecimale prin ncorporare n mediu solid,

pentru determinri cantitative

2. TEHNICI DE CULTIVARE A RICKETTSIILOR, CHLAMIDIILOR, VIRUSURILOR

Virusurile sunt entiti infecioase acelulare, care nu se pot replica dect n celule vii. Cultivarea lor se face pe medii celulare, de tipul oulor embrionate, animalelor de laborator, culturilor de celule.

Rickettssiile i chlamidiile sunt bacterii de dimensiuni mici, cu structur celular de tip procariot, care produc mbolnviri la om i animale. Datorit parazitismului lor obligatoriu intracelular, dei au metabolism propriu i propriul echipament enzimatic, bacteriile de tipul rickettssiilor i chlamidiilor se cultiv pe medii celulare, asemntor virusurilor.

FI DE LUCRU

Cultivarea virusurilor pe ou embrionate

A. STRUCTURA OULUI EMBRIONAT DE GIN

La unul dintre poli, oul prezint o camer cu aer, mrginit de o membran proprie a

oului. Embrionul este nconjurat de o membran amniotic ce delimiteaz o cavitate amniotic, plin cu aproximativ 5 ml. de lichid amniotic incolor. n faa embrionului se gsete sacul vitelin de culoare galben, continuat cu sacul albuminic. Coaja oului i restul embrionului sunt nvelite de membrana corioalantoidian, ce delimiteaz o cavitate alantoidian, plin cu un lichid alantoidian de culoare glbuie.

Structura oului embrionat (http://www.virology.ws/2009/12/10/influenza-virus-growth-in-eggs/)

B. INOCULAREA VIRUSURILOR PE OUL EMBRIONAT DE GIN nainte de orice tip de inoculare se noteaz sub control la ovoscop locul camerei cu aer i

locul unde embrionul este mai aproape de coaj, se badijoneaz cu iod zonele n care urmeaz a fi practicate orificii i se lucreaz n manier aseptic.

1. Inocularea n cavitatea alantoidian (intraalantoidian) Este calea de inoculare pentru virusul urlian i pentru virusul gripal (dup ce a fost cultivat

n prealabil, pentru adaptare, n cavitatea amniotic). Se folosesc ou embrionate n vrst de 9 - 10 zile, examinate la ovoscop pentru controlul viabilitii embrionilor. a)- se aaz oul n poziie orizontal, cu partea notat n sus; se execut cte un orificiu (cu un perforator) n coaja oului n zona notat i n zona camerei cu aer; - prin orificiul lateral se introduce acul seringii 3 - 4 mm i se injecteaz aproximativ 0,1 - 0,2 ml de suspensie viral; orificiile executate se parafineaz. b)- se aaz oul n poziie vertical, cu camera de aer n sus; se practic un orificiu punctiform cu ajutorul perforatorului; - se introduce prin acest orificiu acul seringii, orientndu-l spre zona unde embrionul este mai aproape de coaj; se inoculeaz n cavitatea alantoidian 0,1 - 0,2 ml suspensie viral; orificiul executat se parafineaz dup inoculare. Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 370C.

2. Inocularea pe membrana corioalantoidian Este calea de inoculare pentru izolarea virusurilor pox (smallpox, cowpox), a virusului

herpetic, a virusului sarcomului Rous. a) metoda Burnet - se aaz oul n poziie orizontal, cu partea notat n sus i se practic un orificiu punctiform la nivelul camerei cu aer; - se delimiteaz n dreptul embrionului o fereastr triunghiular cu laturile de 0,5 - 0,8 cm i se decupeaz coaja oului cu o foarfec steril; se perforeaz membrana proprie a oului la acest nivel; - cu ajutorul unei pompe mici de cauciuc se aspir aerul din dreptul camerei cu aer; se creeaz astfel o camer cu aer artificial, n partea lateral a oului, prin ndeprtarea membranei corioalantoidiene de membrana proprie a oului; - prin orificiul triunghiular se ndeprteaz membrana proprie a oului, descoperindu-se membrana corioalantoidian la acest nivel i se pun cteva picturi din suspensia viral direct pe membrana corioalantoidian; - dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o lamel de sticl steril nclzit; se parafineaz i orificiul punctiform de la nivelul camerei cu aer.

Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 370C. b) metoda Tanaka - se aaz oul n poziie vertical, cu camera de aer n sus i se practic o fereastr triunghiular la acest nivel; se ndeprteaz coaja oului i membrana proprie a oului; - se pun cteva picturi din suspensia viral direct pe membrana corioalantoidian; - dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o lamel de sticl steril nclzit prrrin flllammmbare. Oule inoculate se pun la incubator n poziie vertical, la 35 - 370C.

3. Inocularea intraamniotic Este calea de inoculare pentru izolarea virusurilor urlian i gripal din produsele patologice.

a)- oul se aeaz la ovoscop n poziie vertical i se practic un orificiu punctiform la nivelul camerei cu aer; - se introduce acul seringii prin camera cu aer spre embrion, oprindu-se naintarea acului atunci cnd embrionul este atins i se mic puin; - se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml inocul viral n cavitatea amniotic, iar orificiul executat se parafineaz. a1)- oul se aeaz la ovoscop i se practic un orificiu punctiform la nivelul prii laterale notate; - se introduce acul seringii prin orificiul creat, oprindu-se naintarea acului atunci cnd embrionul este atins i se mic puin; - se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml inocul viral n cavitatea amniotic, iar orificiul executat se parafineaz.

b) metoda Taylor - Chialvo - se practic o fereastr triunghiular la nivelul camerei cu aer i se ndeprteaz coaja oului; - cu o pens steril se ndeprteaz membrana proprie a oului, se prinde sacul amniotic i se ridic puin; - se inoculeaz suspensia viral direct n cavitatea amniotic i se las napoi n ou sacul amniotic; - dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o lamel de sticl steril nclzit. Oule inoculate se pun la incubator n poziie vertical, la 35 - 370C.

4. Inocularea intravitelin Este calea de inoculare pentru izolarea i cultivarea rickettsiilor i chlamidiilor. Se folosesc

ou embrionate de 5 - 7 zile. - se aaz oul n poziie vertical i se practic un orificiu punctiform la nivelul camerei cu aer; - se introduce acul seringii prin orificiul creat, orientndu-l spre partea lateral opus celei notate; - se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml de suspensie viral, iar orificiul executat se parafineaz. Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 370C. Oule inoculate se incubeaz la temperatura adecvat un interval de timp corespunztor tipului de virus inoculat: pentru virusul gripal 48 ore; pentru virusul urlian 6 -7 zile; pentru rickettsii 5 zile.

C. RECOLTAREA PRODUSELOR CARE CONIN VIRUSUL

Se face nti sacrificarea oului, care const n meninerea lui dou ore la -300C sau 24 de ore la 40C, pentru a se evita spargerea vaselor de snge din membrana corioalantoidian i adsorbia virusurilor pe hematii, virusuri ce nu s-ar mai regsi n produsul recoltat. Se aaz oul n poziie vertical i se aseptizeaz coaja la nivelul camerei cu aer; cu o foarfec steril se ndeprteaz calota oului. Recoltarea diferitelor produse ce conin virusul se face n funcie de tipul de inoculare care a fost folosit.

1. Recoltarea lichidului alantoidian

- se ndeprteaz membrana proprie a oului cu o pens steril, iar cu vrful pensei se ndeprteaz embrionul de coaja oului; e perforeaz membrana corioalantoidian; - se recolteaz cu pipeta Pasteur orientat oblic spre partea lateral notat 6 - 7 ml de lichid alantoidian de culoare glbuie, care se distribuie n eprubete sterile.

2. Recoltarea lichidului amniotic

- cu o pens steril se ndeprteaz membrana proprie a oului i se prinde embrionul, care se scoate uor n afar; - cu o pipet Pasteur steril se recolteaz din sacul amniotic 2 - 3 ml lichid amniotic incolor, clar, care se repartizeaz n eprubete sterile.

3. Recoltarea membranei viteline

- se vars coninutul oului ntr-o cutie Petri steril - se recolteaz cu o pens membrana sacului vitelin, care se spal ntr-un vas steril cu TFS; - membrana se mojareaz i se centrifugheaz la 4000 rpm; supernatantul reprezint suspensia de virusuri, de rickettsii sau de chlamidii i se preia din cupa de centrifug n eprubete sterile.

FI DE LUCRU

Cultivarea virusurilor pe animale de laborator

Alegerea animalelor de laborator pentru inocularea de virusuri se face n funcie de sensibilitatea fa de virusul inoculat. Inocularea trebuie fcut pe calea cea mai eficient. Se pot utiliza: oareci aduli sau nou - nscui, cobai, obolani, iepuri, maimue, cocoi. nainte de inoculare animalele se in aproximativ 12 zile n carantin, pentru a se nltura cele bolnave.

TEHNICI DE INOCULARE

1. Inocularea intraperitoneal - animalul se prinde de coad cu mna dreapt i se pune pe sita metalic a borcanului, care se afl lng acesta; el se prinde cu lbuele de sit, astfel nct poate fi prins de pielea cefei cu policele i indexul minii stngi i poate fi imobilizat: cu degetul mic se imobilizeaz coada i cu inelarul membrul inferior stng, corpul fiind sprijinit n podul palmei; - animalul se ine cu capul n jos, pentru ca ansele intestinale s se deplaseze spre diafragm; - inocularea se face cu ajutorul acului unei seringi, dup aseptizarea pielii cu iod, paramedian stnga, la jumtatea distanei dintre apendicele xifoid i pubis; cantitatea de inocul nu depete 1 ml.

2. Inocularea subcutanat

- animalul se prinde de pielea cefei cu o pens Kocher, care se aga ntr-un cui al mesei de lucru; cu mna stng se prind coada animalului i membrele posterioare, iar cu mna dreapt se aseptizeaz pielea cu iod n regiunea dorsal; - se inoculeaz n regiunea aseptizat, sub piele, cantitatea dorit de inocul.

3. Inocularea intramuscular

- animalul se prinde de pielea cefei cu o pens Kocher, care se aga ntr-un cui al mesei de lucru; cu mna stng se prind coada animalului i membrele posterioare, iar cu mna dreapt se aseptizeaz pielea cu iod n regiunea coapsei; - se inoculeaz n muchii coapsei cantitatea dorit de inocul.

4. Inocularea intravenoas

- se pune oarecele sub o plnie de sticl, a crei margine realizeaz o uoar staz la baza cozii, devenind astfel vizibile cele dou vene caudale; staza se va ntrerupe dup introducerea acului n ven; se aseptizeaz pielea la baza cozii; - coada se prinde cu mna stng, iar cu dreapta se realizeaz inocularea intravenoas.

5. Inocularea intracaudal

- se pune oarecele sub o plnie de sticl, a crei margine realizeaz o uoar staz la baza cozii, devenind astfel vizibile cele dou vene caudale; se aseptizeaz pielea la baza cozii; - coada se prinde cu mna stng, iar cu dreapta se realizeaz inocularea intracaudal.

6. Inocularea intranazal

- se introduce oarecele sub o plnie de sticl cu captul acoperit cu un dop de vat, sub care se introduce i un dop de vat mbibat cu eter; - cnd animalul este bine anesteziat (ca s nu strnute) este prins cu mna stng i inut n poziie vertical; cu o pipet Pasteur se pune cte o pictur de inocul n fiecare nar; animalul respir profund i aspir inocului.

7. Inocularea intracerebral - se imobilizeaz animalul cu indexul i policele minii stngi prin apsarea pe zona occipital, napoia urechilor, iar cu podul palmei se acoper corpul animalului; - inocularea se practic paramedian deasupra arcadei, folosindu-se ace speciale de 1,5 mm lungime; la oarece acul se introduce direct n cavitatea cranian; la iepure, obolan sau alte animale se practic nti o trepanaie, deoarece craniul este foarte dur.

Dup inoculare animalele sunt supravegheate o perioad de timp de 3 - 4 sptmni. De la animalul inoculat se preleveaz apoi diferite organe, n funcie de calea de inoculare folosit: pulmonul - pentru virusurile gripale; creierul - pentru virusurile neurotrope; snge; exsudat peritoneal.

Nr. crt.

Virusul inoculat

Specia de animal

inoculat

Calea de inoculare Efectele inoculrii

1. Arbovirusuri oarece oarece sugar

intracerebral, intraperitoneal intracerebral

encefalit

2. Virusul febrei galbene

maimu intraperitoneal necroz hepatic

3. Virusul herpetic

iepure oarece sugar

intraconjunctival intracerebral, intraperitoneal

cheratoconjunctivit, encefalit encefalit, necroz hepatic

4. Virusul rabic oarece oarece nou-nscut

intracerebral convulsii moarte encefalit moarte

5. Virus citomegalic

oarece cobai

intracerebral intraperitoneal

encefalit moarte pneumonie, infiltrat hepatic

6. Virus gripal oarece dihor

intranazal intranazal

pneumonie moarte pneumonie

7. Virus urlian maimu intraparotidian parotidit epidemic

FI DE LUCRU Cultivarea virusurilor n culturi de celule

Culturile de esut sau celulare reprezint explante in vitro ale unor fragmente de organe, de esuturi sau celule dispersate obinute din esuturi, introduse ntr-un mediu nutritiv capabil s le asigure supravieuirea i proliferarea.

Culturile celulare sunt mediile cel mai frecvent utilizate pentru cultivarea virusurilor. Exist mai multe tehnici de culturi de esuturi i celule: culturi iniiate cu fragmente de esut fragmente de esut cultivate in vitro n suspensie sau

nglobate ntr-un substrat cu dublu rol (de fixare mecanic i de furnizare a elementelor nutritive); culturi de fragmente de organe fragmentele de organe se manipuleaz astfel nct s se menin

arhitectura original a esutului o perioad mai lung de timp; se realizeaz culturi de epiteliu respirator ciliat (pentru virusuri respiratorii) sau culturi de epiteliu intestinal (pentru enterovirusuri);

culturi de celule dispersate se pot realiza pe suport solid sau n suspensie n mediu lichid; materialul iniial este reprezentat de celule libere, obinute ca atare din organism (limfocite din sngele periferic) sau prin tripsinizare din esuturi prelevate anterior.

1.Celulele din care se iniiaz cultura - celule adulte - cultiv mai greu in vitro, au cretere mai nceat i o perioad de laten de 6-8 zile; se prefer organisme adulte tinere, de la care se folosesc organe parenchimatoase (exemplu rinichi); se obin frecvent culturi celulare de tip epitelial, cu celule poligonale care au tendina de a forma placarde; - celule embrionare - cultiv mai uor dect cele adulte, au o cretere rapid i o perioad de laten mic; necesit medii nutritive mai puin complexe; formeaz de obicei culturi celulare de tip fibroblastic, cu celule alungite, orientate paralel ntre ele; n funcie de sursa de celule folosit, culturile celulare pot fi: - culturi celulare primare, ale cror celule provin direct dintr-un esut sau organ, dup

dispersarea celulelor prin tripsinizare; majoritatea culturilor primare nu mai pot fi pasate n laborator (se cultiv o singur dat); sunt culturi n monostrat, cresc direct pe suprafaa vasului de sticl, un timp limitat in vitro; sunt culturi cu celule normale, care prezint o susceptibilitate mrit la aciunea virusurilor;

Ex. : cultur de embrion de gin - tulpini celulare, formate dintr-un singur tip de celule, n monostrat; pot fi cultivate un numr de

50 de generaii n laborator; sunt celule normale, epiteliale sau fibroblastice; Ex. : tulpini celulare embrionare umane; tulpini celulare renale de maimu. Culturile celulare primare i tulpinile celulare pot fi utilizate pentru prepararea de vaccinuri. - linii celulare, care sunt populaii de celule derivate din esuturi animale sau umane subcultivate

serial un timp nelimitat n laborator, cu numr de cromozomi modificat; sunt celule heteroploide, tumorale, obinute fie direct din esuturi tumorale prin tripsinizare, fie din tulpini celulare transformate n urma pasrilor repetate n laborator.

Ex.: HeLa celule din carcinom de col uterin Hep 1, 2, 3 - celule din carcinom de nazofaringe sau laringe Vero celule din rinichi de maimu Cercopithecus 2. Vasele de cultur adecvate, pregtite special o din sticl neutr, transparent, fr neregulariti sau din plastic, de unic folosin

flacoane paralelipipedice de 250 ml tuburi Barski, se pot pune lamele flacoane Roux

o nchise cu dopuri de cauciuc, netoxice, de culoare deschis, sau cu capac cu filet 3. Mediul nutritiv pentru culturi de celule (Eagle, IC65)

o de cretere sau de meninere substane nutritive vitamine antibiotice indicator de viabilitate celular (rou neutru) indicator de pH (rou fenol).

Cultivarea virusurilor n culturi celulare Materiale necesare:

- vase cu culturi celulare (pentru probe i martor); - suspensia viral de inoculat; mediu nutritiv de ntreinere pentru cultura de celule; - pipete sterile; - vas cu amestec oxidant.

Tehnica de lucru: - se ndeprteaz din vasul de cultur cu pnza celular mediul nutritiv de cretere; - se inoculeaz peste pnza celular 0,1 1 ml suspensie viral, n funcie de mrimea

vasului de cultur; se omogenizeaz suspensia viral peste celule i se las 20-30 min. pentru adsorbia virusului pe celule;

- se introduce n vasele de cultur mediu nutritiv de ntreinere (2 ml n eprubete sau 15 20 ml n vasele de 250 ml);

- vasele se termostateaz la 370C, examinndu-se zilnic la microscop; mediul trebuie s acopere n permanen pnza celular;

- n paralel se observ o cultur celular martor, care a fost obinut n acelai timp i n aceleai condiii ca i cultura inoculat, dar care nu va fi cultivat cu virus.

Interpretarea rezultatelor: n urma multiplicrii virusului n culturile de celule apar o serie de modificri morfologice

ale patului celular, care constituie efectul citopatic (ECP); acesta presupune: - zone de liz celular: celulele sunt distruse n urma multiplicrii virusului inoculat,

datorit eliminrii explozive din celule (de exemplu enterovirusurile); - sinciii celulare: mase celulare cu mai muli nuclei (de exemplu virusul respirator

sinciial, virusul herpetic, unele virusuri paragripale); - incluzii, mai ales la nivelul nucleului, datorit aglomerrii particulelor virale n urma

multiplicriilor (de exemplu adenovirusurile); - desprinderea de pe substrat; formarea de celule gigant; rotunjirea celulelor. Sunt i virusuri care nu dau efect citopatic (de exemplu unele virusuri paragripale). n cazul

acestora, prezena lor n culturile celulare se poate pune n eviden prin: - fenomenul de hemadsorbie: hematiile de cobai au proprietatea de a se adsorbi pe suprafaa

celulelor n care s-au multiplicat virusurile; - se ndeprteaz mediul de cultur din cultura celular infectat cu un virus care nu d efect

citopatic; - se adaug peste aceasta o suspensie 0,5% de hematii de cobai, care se distribuie pe

suprafaa pnzei celulare; se las 30 min. la 370C; - se spal pnza celular cu TFS steril, ndeprtndu-se hematiile; - cultura splat se examineaz la microscop: dac pe suprafaa celulelor din cultur au rmas

fixate stabil hematii (nu au fost ndeprtate prin splare), n acele celule s-au multiplicat virusurile; dac n urma splrii nici o celul din cultur nu are hematii pe suprafaa ei, testul este negativ (celulele nu sunt infectate cu virus).

- folosirea culturilor de celule agarizate (acoperite cu un strat subire de agar i colorate) are avantajul de a pune n eviden mai uor zonele de liz celular, sub forma unor plaje incolore de liz pe fondul culturii colorate; aceste medii se pot pstra n laborator timp ndelungat;

- virarea culorii mediului de cultur are loc n culturile celulare normale, neinoculate cu virus, datorit multiplicrii celulare, de la rou spre galben (culoarea roie a mediului se datoreaz indicatorului de pH rou fenol, care n mediu neutru este rou-orange, iar n mediu acid este galben); n culturile celulare inoculate cu virus celulele sunt distruse i nu mai modific pH-ul mediului, iar culoarea nu se schimb.

- fenomenul de interferen replicarea n prealabil n cultura celular a unui virus care nu d efect citopatic (de exemplu virusul rubeolei) poate inhiba replicarea ulterioar a unui virus care d efect citopatic (de exemplu virusul Echo 11).

VI. TESTAREA SENSIBILITII BACTERIILOR LA ANTIBIOTICE I TEHNICI DE LABORATOR PENTRU CONTROLUL ANTIBIOTICOTERAPIEI

Testarea microorganismelor la antibiotice i chimioterapice este necesar pentru stabilirea

unui tratament corect i datorit apariiei i extinderii rezistenei microorganismelor fa de aceste categorii de substane.

O tulpin bacterian este considerat sensibil dac bacteriile sunt n mod eficient afectate de antibiotic, obinndu-se n urma tratamentului efectul terapeutic dorit, cu dozele obinuite. Dac tulpina este moderat sensibil, bacteriile sunt afectate ntr-o msur mai mic, necesitnd doze terapeutice mai mari sau ci de administrare speciale pentru obinerea efectului terapeutic dorit. Dac rezultatul testrii in vitro a tulpinii bacteriene este negativ, tulpina este considerat rezistent.

Antibiograma este tehnica de testare a bacteriilor fa de aciunea antibioticelor i chimioterapicelor. Se poate realiza prin dou metode in vitro: metoda difuzimetric, ce are o valoare calitativ i metoda diluiilor, cu valoare cantitativ. Sensibilitatea bacteriilor fa de antibiotice se poate face i prin metode in vivo, n care se apreciaz eficiena terapeutic a antibioticului prin teste de laborator, determinnd concentraia de antibiotic din snge, LCR sau alte umori, ori nivelul de eficien inhibitorie (NEI) sau nivelul de eficien bactericid (NEB).

METODA DIFUZIMETRIC A ANTIBIOGRAMEI

Aceast metod sepoate realiza n mai multe variante: - antibiograma difuzimetric comun,

- antibiograma difuzimetric comparativ (metoda Stokes, Bal) care folosete pentru comparaie o tulpin de referin din aceeai specie sau dintr-o specie nrudit, - antibiograma difuzimetric standardizat (Bauer-Kirby), care permite obinerea unor rezultate comparabile ntre diferite laboratoare, - antibiograma difuzimetric rapid.

Principiul metodei Bauer-Kirby Pentru etapa calitativ a antibiogramei sunt utilizate microcomprimate impregnate cu

cantiti fixe de antibiotic, ce se depun pe suprafaa unei plci cu geloz Mueller - Hinton, nsmnat n prealabil "n pnz"cu germenele de testat. Antibioticul difuzeaz n mediu i se creeaz un gradient de concentraie invers proporional cu distana fa de disc. Eficacitatea antibioticului se apreciaz prin msurarea zonelor de inhibiie a creterii bacteriene n jurul discurilor. Pentru standardizarea metodei s-au standardizat: mrimea discului de antibiotic, mediul de cultur, tehnica de lucru, modalitatea de citire a rezultatelor. Aceast metod prezint dezavantajul c nu se poate folosi pentru germeni cu vitez lent de cretere i nici pentru bacterii anaerobe.

Materiale necesare: - plci Petri cu geloz Mueller - Hinton n strat de 4 mm grosime (25 ml mediu pentru placa de 9 cm diametru), cu pH 7,2 7,4; suprafaa mediului trebuie s fie uscat (se pstreaz la frigider, iar nainte de folosire se pot ine la termostat 20 min. sau la temperatura camerei cteva ore); - inoculul, obinut de obicei din 5 colonii izolate, reprezentat de o cultur bacterian pur tnr, de 18 - 24 ore n bulion, e reprezentat de culturi aflate n faz logaritmic de cretere, care sunt n general mai sensibile la aciunea antibioticelor i sensibilitatea lor este tipic pentru tulpina testat; turbiditatea inoculului trebuie ajustat la o concentraie de 5 9 x 107 celule/ml., corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland; - truse cu microcomprimate standardizate pentru antibiograme (de 6 mm diametru); - pense tip iris; - pipete Pasteur sterile sau tampoane sterile tip exsudat nazo-faringian; - bec de gaz, amestec sulfocromic.

Standardul McFarland Nr. 0.5, 1 i 2

Standard McFarland 0.5 1 2 3 4

1.0% clorur de bariu (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

1.0% ac id sulfuric (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6

densitatea celular aproximativ (1x108 CFU/mL)

1.5 3.0 6.0 9.0 12.0

% Transmitan la 600nm 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5

Absorban la 600nm 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669

Standardul nefelometric McFarland se obine prin amestecul unor cantiti exacte de clorur

de bariu i acid sulfuric, formndu-se un precipitat de sulfat de bariu. Standardul 0,5 McFarland se prepar din 0,05 ml clorur de bariu dihidrat 1,175% (BaCl2x2H2O) i 9,95 ml acid sulfuric 1% (H2SO4). Standardul se prepar i din particule de latex, care au stabilitate n suspensie. Standardul se compar cu suspensia bacterian n soluie salin sau n bulion nutritiv.

Tehnica de lucru: - se aduc la temperatura camerei plcile Petri cu mediu solid, care au fost pstrate la frigider maxim 7 zile; - se nsmneaz "n pnz" plcile respective cu inoculul diluat, cu ajutorul pipetei Pasteur prin inundarea plcii, urmat de aspirarea excesului sau cu ajutorul unui tampon steril; cu tamponul se traseaz striuri paralele dese n trei direcii ale plcii, cu un traseu circular pe marginea plcii la final; - plcile se introduc la termostat la 37C, 15 - 20 min. sau se in ntredeschise lng flacra becului de gaz pentru uscarea suprafeei mediului; - se depun pe suprafaa mediului de cultur microcomprimatele cu antibiotice, cu ajutorul pensei tip iris, la o distan de 15 mm de marginea plcii i de 30 mm ntre ele; - plcile se termostateaz 16 18 (maxim 24) ore la 35 - 370C, cu capacul n jos, nu mai mult de 2-3 plci suprapuse.

Citirea rezultatelor: - se msoar cu rigla diametrul zonelor de inhibiie a creterii bacteriene din jurul discurilor cu antibiotic, pe spatele cutiei Petri i se interpreteaz prin comparaie cu rezultatele puse la dispoziie de centrele de referin sau productorii de antibiotice.

Interpretarea rezultatelor: - cu ct diametrul zonelor de inhibiie este mai mare, cu att germenele este mai sensibil la antibioticul respectiv; gradul de sensibilitate (sensibil, moderat sensibil, rezistent) se citete n tabele speciale, n funcie de concentraia antibioticului per disc i valoarea diametrului zonei de inhibiie; - se apreciaz i aspectul limitei zonei de inhibiie: dac limita acestei zone este clar conturat, sensibilitatea celulelor din populaia respectiv este uniform; dac limita acestei zone nu este clar conturat, sensibilitatea celulelor din populaia respectiv nu este uniform;

- apariia unor colonii bacteriene de dimensiuni normale n zona de inhibiie denot faptul c sunt mutante rezistente la antibioticul respectiv i tulpina se consider a fi rezistent; - apariia n aceeai zon a unor colonii de dimensiuni mai mici dect cele normale ns