SUBIECTE MICROBIOLOGIE an II, sem I REZOLVATE 1. Celulele eucariote si procariote caracteristici comparative PROCARIOTE EUCARIOTE

Dimensiuni: medie: 1-10 microni medie: 5-20 microni

Tipuri de organisme: bacterie, archaea protiste, ciuperci, plante, animale

Tipul nucleului celular Fr nucleu individualizat.. nucleu cu membran dubl

ADN Circular, in general. Dei nu formeaz un nucleu, ADN-ul este condensat ntr-un nucleoid. Procariotele pot transporta elemente ADN extracromosomiale numite plasmide, care sunt de obicei circulare. Plasmidele activeaz funcii suplimentare, cum ar fi rezistena la antibiotice Cromozomi lineari cu proteine histone. ADN-ul eucariotei este organizat ntr-unul saumai multe molecule liniare, numite cromozomi , care sunt asociate cu proteine histone. Toate ADN-urile cromozomiale sunt stocate n nucleul celulei, separate de citoplasma printr-o membran. Unele organite eucariote, cum ar fi mitocondriile conin deasemenea ADN.

ARN-/sinteza proteinelor cuplat n citoplasm sintez de ARN n nucleu sintez de proteine n citoplasm

Ribozomi 50S+30S (S=constanta de sedimentare) 60S+40S

Structur citoplasmatic structur simpl structur complex cu membrane intracitoplasmatice i citoschelet

Perete celular serveste ca filtru de protectie - Peretele celular este format din peptidoglican la bacterii, i acioneaz ca o barier suplimentar mpotriva forelor exterioare. Acesta previne, de asemenea, celulele de la dezvoltarea exagerat i n cele din urm de spargerea (citoliza) din cauza presiunii osmotice mpotriva unui mediu hipotonic Dei cele mai multe procariote au un perete ce exist i excepii, cum ar fi Mycoplasma Membrana plasmatic se aseamana cu cea a procariotelor n funcie, cu diferene minore n configurare. Pereii celulelor pot fi sau nu prezeni.

Micarea celulelor flagel fcut din flagelin flagelar i ciliar fcut de tubulin;

Metabolism anaerob, aerob de obicei aerob

Mitocondria nu are de la una pn la cteva mii

Organite citoplasmatice lipsesc RE, ap. Golgi, centrul celular prezente.

Organizare de obicei celule izolate celule izolate, colonii, organisme evoluate multicelulare cu celule specializate

Diviziunea celulelor diviziune binar (diviziune simpl) Mitoz (pentru celul somatic) Meioz (pentru foarmarea gameilor)

2. Clasificati bacteriile dupa forma si dispunere exemple DUPA FORMA: a. rotunde (cocii), b. alungite (bacili), c. ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) d. filamentoase (actinomycetele). Cocii: bacterii rotunde (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) de 0,8 - 1; Bacilii Sunt bacterii cu form alungit de bastonas cu dimensiuni ntre 1,5 - 10. La bacili este important examinarea extremitilor, aspectul acestora avnd rol n identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta: capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), tiate drept (Bacillus anthracis - bacilul crbunos), mciucate (Corynebacterium diphteriae - bacilul difteric), n form de suveic (Fusobacterium); Cocobacilii Sunt bacterii uor alungite, fiind forme intermediare ntre coci i bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae); Vibrionii sunt bacterii ncurbate n form de virgul (Vibrio cholerae); Spirilii sunt bacterii spiralate avnd 1-2 spire rigide (Spirillum volutans); Spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil avnd: 12-20 de spire (Treponema pallidum), - foarte multe spire strnse (Leptospira) - 2-3 spire (Borrelia): Actinomicetele sunt bacterii foarte asemntoare fungilor i formeaz filamente sau hife lungi i ramificate care se rup, rezultnd forme bacilare (Actinomyces). DUPA ASEZARE: COCI: n grmezi sau asemntor unei ciorchini de struguri ca, de exemplu, germenii din genul Staphylococcus; n tetrade la genul Micrococcus; n baloturi de cte 8 coci orientai n cele 3 direcii ale spaiului la genul Sarcina; n lanuri la genul Streptococcus; n diplo, ca dou flcri de lumnare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; n diplo, ca dou boabe de cafea care se privesc fa n fa prin concavitile lor ca, de pild, la Neisseria gonorrhoeae (gonococ) i Neisseria meningitidis (meningococ); - izolai, care nu sunt de interes medical. BACILI: cel mai ades izolai i n poziii ntmpltoare unul fa de cellalt ca, de exemplu, majoritatea bacililor gram-negativi; grupai cte doi (diplobacili) sau n lanuri scurte ca, de exemplu, genul Klebsiella; dispui n lanuri ca bacilii din genul Bacillus (bacilul crbunos); dispui n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeti cum sunt bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae); n palisad, ca scndurile unui gard (bacilii difterimorfi). 3. Enumerati componentele constante si facultative ale celulei bacteriene CONSTANTE Nucleul bacterian Este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o structur primitiv n comparaie cu nucleul celulelor eucariote i reprezint 2% din greutatea uscat a bacteriei. Nucleoidul este format dintr-o molecul circular de AND care este n contact direct cu citoplasma. Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia. Citoplasma Situat ntre materialul nuclear i faa intern a membranei citoplasmatice, citoplasma este un sistem coloidal alctuit din 80% ap, n care se gsete o cantitate mare de molecule organice, ioni anorganici, enzime, ARN, vacuole i incluzii. . Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie. Membrana citoplasmatic Este o membran fin (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic ce mrginete la exterior citoplasma bacteriilor i o separ de peretele celular funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, secret numeroase enzime hidrolitice, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor ETC Mezozomii Sunt structuri membranare care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice sub form de buzunar sau n deget de mnu, prezente la bacteriile gram - pozitive i ocazional la cele gram negative.Ei particip la replicarea cromozomului bacterian i diviziunea celular, sinteza peretelui celular i formarea sporului bacterian. Peretele celular nconjoar membrana citoplasmatic, peretele celular este o structur rigid, specific bacteriilor. El este format dintr-un strat bazal, asemntor la toate bacteriile i un strat al structurilor superficiale, NEOBLIGATORII Structuri inconstante: incluziile formatiuni structurale inerte care apar in citoplasma la sfarsitul perioadei de crestere activa, pot contine polimeri anorganici, substante anorganice simple, polimeri organici, lipide etc. Vacuole formatiuni sferice care contin diferite substante in solutie apoasa, au o membrana lipoproteica numita tonoplast Capsula glicocalix, strans legat de celula bacteriana, structura polizaharidica (S pneumonae) sau polipeptidica (Anthracis), vizibila la mo Flageli confera mobilitate bacteriilor Fimbrii formatiuni scurte cu rol in adeziune Spori forma de rezistenta si conservare a speciei 4. Structura peretelui bacterian la bacteriile gram + si gram Bacteriile gram + Peptidoglicanul reprezint 50-90% din greutatea uscat a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm i conine pn la 200 de lanuri paralele de murein. Stratul structurilor speciale este redus i alctuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic i gliceroltheicoic. Acetia pot ptrunde pn la membrana citoplasmatic legndu-se covalent de aceast - acizii theicoici de membran sau numai pn la perete - acizi theicoici de perete. Ei reprezint antigenele de supafa ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular este sensibil la aciunea lizozimului care rupe legturile dintre acidul Nacetil muramic i N-acetilglucozamin i a penicilinei care nhib sinteza peptidoglicanului. Bacteriile gram Peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm, reprezentnd numai 10% din greutatea uscat a bacteriei. Stratul superficial este ns mult mai complex dect la bacteriile gram - pozitive fiind alctuit din: membran extern, lipoproteine lipopolizaharidul de perete. Membrana extern este format dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Aceste proteine, bine definite la majoritatea speciilor bacteriene, sunt denumite Omp (outer membrane proteins) sau Momp ( major outer membrane proteins). Membrana extern se leag de protoplast prin intermediul unei lipoproteine i a proteinei OmpA din membrana extern. Proteinele nespecifice ale membranei externe cu funcie de porine, cum sunt trimerii OmpF i OmpC, delimiteaz nite canale umplute cu ap prin intermediul crora pot difuza n spaiul periplasmic substane hidrosolubile. Proteinele specifice au funcii de transport pentru anumite substane, unele dintre ele fiind i receptori pentru bacteriofagi. De exemplu, proteina LamB este responsabil pentru transportul maltozei i receptor pentru fagul lambda al bacilului coli. Proteinele de suprafa pot avea la unele bacterii rol n patogenitate, ca de exemplu cele 7 proteine de suprafa al shigellelor care le asigur invazivitatea. Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afl lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. Aceasta este alctuit din: lipidul A care are o structur particular, fiind format din uniti dizaharidice de glucozamin, legate de beta-hidroxiacizi grai cu 10-16 atomi de carbon fixai direct de membrana extern, miezul sau core, numit i antigen R, comun tuturor bacteriilor gram - negative i care include 2 zaharuri caracteristice: acidul keto-deoxyoctanoic i o heptoz. uniti monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie i tip i constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative. LPZ este o toxin termolabil, care se elibereaz n mediul nconjurtor de ctre bacteriile gram-negative numai dup liza lor i foarte reactiv n organismul gazd. Astfel, lipidul A produce febr, activeaz mecanismele aprrii antiinfecioase i n exces produce ocul endotoxic cu evoluie grav, chiar fatal. Spaiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gramnegative creeaz un compartiment ce se ntinde de la membrana celular pn la membrana extern, numit spaiu periplasmic. El conine peptidoglicanul i un gel care favorizeaz nutriia bacteriei prin coninutul n enzime degradative ca, de pild, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele i cefalosporinazele. * Tipuri de coci Gram (+): genul Staphylococcus spp., genul Streptococcus spp., Enterococcus spp., * Tipuri de bacili Gram (+): Listeria spp., Bacillus spp., (B. anthracis) - Clostridium spp., (Cl. tetani) * Tipuri de coci Gram (-): Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoese, - Moraxella, Branhamella etc * Tipuri de bacili Gram (-): E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus, (Enterobacteriaceae), Haemophilus spp, Pseudomonas spp - * Bacterii Gram (+) la limita: - Corynebacterium diphteriae (prin decolorare prelungita pierde violetul de gentiana apare colorat in rosu, iar la o colorare obisnuita apare violet). 5. Rolul peretelui bacterian Peretele celular este o component celular obligatorie care nconjoar membrana citoplasmatic, peretele celular este o structur rigid, specific bacteriilor. Funciile peretelui celular bacterian: asigur forma, rezistena mecanic i osmotic a bacteriei; asigur protecia membranei citoplasmatice fa de presiunea intern a celulei bacteriene, care este foarte mare: 5-6 atm la E. coli, 20-30 atm. la S. aureus; regleaz traficul molecular de perete n ambele sensuri, deci schimbul de substane dintre bacterie i mediul nconjurtor, fiind permeabil pentru molecule cu o GM mai mic de 10.000 daltoni i cu un diametru mai mic de 1nm; stocheaz unele enzime n spaiul periplasmic la bacteriile gram-negative ce vor fi eliberate dup necesiti, spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care i elimin enzimele direct n mediul extern; prezint receptori pentru bacteriofagi; este sediul antigenelor de suprafa, fiind deci implicat n rspunsul imun al macroorganismului; este sediul unor factori de patogenitate; are rol n diviziunea bacterian i n procesul de sporulare. 6. Coloratia Gram timpi, interpretare, exemple Coloratia Gram. Este o coloratie foarte utilizata in bacteriologie, deoarece imparte bacteriile in doua categorii: bacterii Gram-pozitive si bacterii Gram-negative. Tehnica coloratiei este urmatoarea: frotiul uscat este fixat prin caldura; se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.; se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.; se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva secunde; se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30 sec. pana la 1 min; se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet; dupa uscare se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gram negative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu. 7. Protoplasti Sferoplasti Forme L Bacterii cu perete alterat sau formele L. Sunt bacterii cu stratul bazal viciat sub aciunea unor factori din mediu ca, de exemplu, lizozimul i penicilina, care lizeaz, respectiv mpiedic sinteza peptidoglicanului. Bacteriile lipsite total de perete celular se numesc protoplati i provin din rndul bacteriilor gram - pozitive, iar cele cu perete parial lezat, sferoplati din bacteriile gram-negative, care i pierd mai greu peretele. Formele L sunt foarte sensibile la variaiile osmotice, putnd supravieui numai n condiii speciale de osmolaritate, dar sunt foarte rezistente la antibioticele beta-lactamice. Dac factorii nocivi dispar din mediu, formele L se pot transforma n bacterii normale prin resinteza peretelui celular. Unele teorii mai vechi susin c formele L pot ntreine i croniciza o infecie, dar dovezile n acest sens lipsesc. Protoplastul este o sfera marginita de membrana citoplasmatica, reprezinta bacteria grampozitiva dupa indepartarea completa a peretelui, de exemplu sub actiunea lizozimului care lizeaza mureina. In medii hipotone protoplastul se lizeaza. Este o structura care nu se poate multiplica. Sferoplastul reprezinta bacteria gram negativa dupa degradarea partiala a peretelui contine o cantitate mai mica de mureina. Lizozimul poate actiona asupra peptidoglicanului numai dupa alterarea membranei externe. In medii hipotone sferoplastul se lizeaza. Spre deosebire de protoplast acesta se poate multiplica. 8. Coloratia ZIehl-Neelsen, timpi interpretare exemple -se realizeaza pentru evidentierea bacteriilor din specia Mycobacterium Tehnica:-etalarea produsului patologic -uscarea -fixarea Etape: Se acopera lama cu fuxina pura,5-10 min, Se incalzeste pana la emisia de vapori(nu se ajunge la fierbere),de 2-3 ori in interval de 10 min Se spala cu apa de la robinet Se decoloreaza cu alcool-acid -30 sec. Se spala cu apa Se recoloreaza cu albastru de metilen-2 min. Se spala frotiul cu apa si se lasa la uscat in stativ Citirea si interpretarea: Se foloseste obiectivul cu imersie Mycobacteriile (bacilul tuberculos,bacilul leprei)apar colorate in rosu pe fond albastru=bacilii acido-alcoolo rezistenti=BAAR,ceilalti germeni si elemente celulare apar colorate in albastru Proprietatea de acido-alcoolo rezistenta este caracteristica genului Mycobacterium Se datoreaza structurii particulare a peretelui celular,cantitatii mari de lipide pe care acesta le contine si in special acidului micolic 9. Structura si rolul membranei citoplasmatice Membrana citoplasmatic Este o membran fin (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic ce mrginete la exterior citoplasma bacteriilor i o separ de peretele celular. Pe seciune apare trilaminat, fiind alctuit din dou straturi fosfolipidice dispuse cu prile hidrofobe fa n fa. Printre moleculele fosfolipidice se gsesc molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele dou straturi fosfolipidice, fie le traverseaz fiind expuse la ambele fee ale membranei. Aceast structur dinamic, fluid, temporar i reversibil n funcie de factorii de mediu este o structur n mozaic, modelul ei fiind descris n 1972 de Singer i Nicholson. Funciile membranei citoplasmatice: este o membran cu permeabilitate selectiv, ndeplinind funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, n ambele sensuri cu mediul nconjurtor. Permeabilitatea selectiv a membranei citoplasmatice permite realizarea n interiorul celulei, pentru unele substane, concentraii de 105 ori mai mari dect n afara celulei, secret numeroase enzime hidrolitice ce se elibereaz n mediul nconjurtor unde scindeaz substratul nutritiv n uniti absorbabile, unele proteine legate de membrana citoplasmatic joac rolul de chemoreceptori, ndeplinete rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind sediul enzimelor lanului respirator i al fosforilrii oxidative, deci centrul energogenezei celulare, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor, este implicat n sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participnd activ la creterea i diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian, constituie o posibil int pentru aciunea unor chimioterapice ca, de pild, polimixinele. 10. Ribozomii, structura si rol Ribozomii sunt structuri sferice cu diametru de aproximativ 180nm i constanta de sedimentare de 70S. Marimea lor depinde de concentratia ionilor de MG si K, unii apar liberi in citoplasma altii legati de fata interna a membranei citoplasmatice. n absena ionilor de Mg2+ se desfac n dou subuniti cu constanta de sedimentare de 50S i 30 S. Intre cele doua subunitati se formeaza un canal prin care trec moleculele de ARNm in cursul sintezei proteice Din punct de vedere chimic sunt alctuii din 65-70% ARN i 30-35% proteine. O parte din ribozomi se asociaz formnd polizomi (mai ales n timpul sintezelor proteice), alii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataeaz mezozomilor sau membranei citoplasmatice. Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul. ARNm transporta informatia genetica de la genom la nivelul ribozomilor. Traducerea se face la nivelul ribozomilor de catre ARNt care are dubla specificitate (pentru fiecare din cei 20AA exista unul sau mai multi ARNt) 11. Mezozomi Incluziuni Vacuole (in structura celulei bacteriene) Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind n funcie de specia bacterian i condiiile de mediu. Compoziia lor chimic este diferit, ele putnd fi de glicogen sau amidon (la unii bacilii aerobi sporulai), lipide (la genul Bacillus), polimetafosfai (sau incluziile de volutin descrise mai nti la Spirillum volutans i apoi de Babe i Ernst la bacilii difterici) etc. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie. Mezozomii sunt structuri membranare care se formeaz prin invaginarea membranei

Subiecte microbiologie an II sem I pg. 1 Subiecte microbiologie an II sem I pg. 1 Subiecte microbiologie an II sem I pg. 2 citoplasmatice sub form de buzunar sau n deget de mnu, prezente la bacteriile gram - pozitive i ocazional la cele gram - negative. Ei nu formeaz n citoplasm caviti inerte, ci deschise spre spaiul periplasmic (spaiul dintre membrana citoplasmatic i peretele celular) i sunt n contact direct cu materialul nuclear. Dup morfologia lor, mezozomii sunt lamelari, veziculari i tubulari, iar dispoziia lor n celula bacterian poate fi septal, periferic i nuclear. Funciile mezozomilor: particip la replicarea cromozomului bacterian i diviziunea celular, particip la reaciile de fosforilare oxidativ i oxidoreducere, dar n msur mai mic dect membrana celular, sediul unor enzime hidrolitice care ndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote, sinteza i secreia unor exoenzime, ca de exemplu penicilinaza sau cefalosporinaza, sinteza peretelui celular i formarea sporului bacterian. Vacuolele sunt formatiun sferice care contin diferite substante in solutie apoasa. Au o membrana lipoproteica numita tonoplast. Au fost descrise in special la bacteriile acvatice. 12. Masa nucleara bacteriana structura, caracteristici vine in contact direct cu citoplasma contine ADN, nu are nucleoli are afinitate pentru coloranti bazici dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensa a citoplasmei bogata in ARN unicul cromozom bacterian este alcatuit dintr-o singura molecula de ADN dublucatenar cu aspectul unui fir lung (1000-2000 Mm) inchis intr-un inel si replicat pe el insusi - Nucleul contine informatia genetica necesara proceselor vitale de crestere si multiplicare Codonul din punct de vedere functional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaza un codon. Codonii detin informatia genetica pentru a plasa intr-o anumita secventa un anumit aminoacid Cistronul reprezinta o subunitate functionala a genei capabila sa determine independent sinteza unui lant polipeptidic Gena reprezinta o portiune a genomului, o anumita secventa de nucleotide dispuse liniar genele structurale reprezinta circa 90% din ansamblul informatiei genetice gena poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau functionale (enzime) 13. Cum este inscrisa informatia genetica in genomul celulei bacteriene Nucleul contine informatia genetica necesara proceselor vitale de crestere si multiplicare Codonul din punct de vedere functional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaza un codon. Codonii detin informatia genetica pentru a plasa intr-o anumita secventa un anumit aminoacid Cistronul reprezinta o subunitate functionala a genei capabila sa determine independent sinteza unui lant polipeptidic Gena reprezinta o portiune a genomului, o anumita secventa de nucleotide dispuse liniar genele structurale reprezinta circa 90% din ansamblul informatiei genetice gena poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau functionale (enzime) 14. Enumerati si descrieti succint etapele biosintezei proteice are loc la nivelul ribozomilor. Initial are loc transcrierea informatiei genetice pe ARNm ARNm va transporta aceasta informatie de la genom la ribozom, sub forma unei copii complementare De regula numai o catena de ADN este folosita drept matrita pentru ARNm - Transcrierea mesajului genetic este selectiva si se desfasoara intre promotor si semnalul de terminare fiind controlata de ARN polimeraza ADN dependenta - Traducerea mesajului genetic este realizata la nivelul ribozomilor de catre ARNt - ARNt are dubla specificitate (pentru fiecare din cei 20 AA exista unul sau mai multi ARNt iar enzime specifice fiecarui aminoacid controleaza legarea corecta a aminoacizilor activati pe ARNt corespunzator Fiecare ARNt poseda un triplet de nucleotide (anticodon) complementar codonului corespunzator aminoacidului Succesiunea specifica a nucleotidelor este transpusa intr-o secventa specifica de aminoacizi care intra in constitutia lantului polipeptidic din proteina in curs de formare. 15. Capsula bacteriana structura,rol, localizare Capsula bacteriana Majoritatea bacteriilor patogene i comensale sunt capabile s produc in vivo un material de nveli extracelular. Capsula este un nveli compact, intim legat de celula bacterian, cu o lime de cel puin 0,2m. Este vizibil pe preparatele uzuale sau n coloraiile negative sub forma unui halou clar ce nconjoar bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natur polizaharidic (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepia capsulei bacilului crbunos care este polipeptidic. Capsula are rol n rezistena bacteriilor fa de fagocitoz, fiind astfel un factor de virulen. Variantele necapsulate ale acelorai specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la oarecele alb de laborator o septicemie mortal, pe cnd varinata necapsulat nu este patogen. Capsula este o structur cu proprieti antigenice specifice (antigenele K) care permit diferenierea unor serotipuri n cadrul speciei. Bacteriile nu sintetizeaz material capsular in vitro pe mediile uzuale, coloniile rezultate fiind rugoase, de tip R =rough. Pe medii speciale, ns, bacteriile pot crete capsulate, coloniile fiind mucoase, de tip S =smooth. Structura descris mai sus este capsula clasic a bacteriilor, la care ne referim atunci cnd vorbim de bacterii capsulate. La unele bacterii s-au mai evideniat i alte structuri de nveli, cum sunt: Microcapsula este o structur discret cu o grosime sub 0,2m care nu se evideniaz la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulen. Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf i vscos ce nvelete bacteria. El este format din lanuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii i dextranii, cu rol major n adezivitatea bacteriilor de suprafee. Astfel, de pild, Streptococcus mutans produce cantiti mari de dextran i levan prin intermediul crora se ataeaz de suprafaa diniilor contribuind la formarea cariilor i a plcii dentare. Un alt exemplu este Pseudomonas aeruginosa, care secret un strat mucos dens care i crete rezistena la antibiotice. Funciile capsulei: este un factor de aderen i colonizare a bacteriile pe suprafee; protejeaz bacteriile de diferii ageni antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; protejeaz bacteriile de aciunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulen; reprezint sediul antigenelor capsulare, importante n identificarea acestor bacterii. 16. Flagelii bacterieni structura, rol, localizare Cilii sau flagelii bacterieni Sunt apendici filamentoi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea n citoplasma bacterian, i servesc ca organe de locomoie. Ei sunt prezeni mai ales la bacili (Enterobacteriaceae) dar i la unii coci (enterococ). Flagelii sunt formatiuni fine, alungite, flexibile cu origine la nivelul corpusculului bazal. Din punct de vedere chimic flagelul este de natura proteica (flagelina) - Roluri: In mobilitate (50Mm/s) Antigenic (structura proteica, antigenul H) In clasificarea bacteriilor o Monotriche (cu un flagel) o Lofotriche (cu un manunchi de flagel) o Peritriche (cu mai multi flageli dispusi de-a lungul suprafetei) Cilii sunt structuri helicoidale, cu dimensiunea n general mai mare dect cea a celulei bacteriene creia i aparin (2-15/2-20 nm) i se evideniaz microscopic prin coloraii speciale. Dispoziia i numrul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fr cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situai la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) i peritriche - cu cilii dispui pe ntreaga suprafa a bacteriei (Salmonella, E. Coli, Proteus etc.). Structura cililor este tubular, ei fiind formai dintr-o protein contractil, flagelina, sub form polimerizat. Cilul se ataeaz de bacterie printr-un corpuscul bazal i un crlig de articulaie aflate n citoplasma bacteriei. Corpusculul bazal se inser prin crligul de articulaie de membrana citoplasmatic i peretele celular. Mobilitatea i direcia micrii cililor pot fi influenate de concentraia unor substane din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) i de temperatur. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriilor. Cilii bacterieni nu se observ dect pe preparate colorate special. n practica de rutin nu se evideniaz flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lam i lamel n care se urmresc micrile bacteriilor, fie prin nsmnarea tulpinii pe un mediu semisolid prin neparea n profunzime a mediului. Dac bacteria crete nu numai pe traseul nsmnrii i difuzeaz n mediu, ea este mobil. 17. Fimbriile bacteriei Fimbriile Fimbriile sunt oligomeri proteici care apar ca apendici filamentoi la suprafaa celulei bacteriene. Ele sunt alctuite din subuniti proteice cu masa molecular de 17.000 Da i dintro component proteic minor. Sinteza fimbriilor este influenat de condiiile de mediu, mai ales de temperatur i de factori ce influeneaz rata de dezvoltare a culturii microbiene. Subunitile proteice ale fimbriilor pot fi supuse unei variaii antigenice care scap bacteria de rspunsul imun al gazdei. fimbriile de tip 1, sau pilii comuni, sunt prezente la multe specii de Enterobacteriaceae. Ele se leag de glicoconjugaii din membrana citoplasmatic a celulelor gazd ce conin manoz. fimbriile P sunt prezente pe tulpinile de Escherichia coli pielonefritogene. Receptorul pentru aceste fimbrii sunt glicolipidele ce conin dou molecule alturate de galactoz prezente n membrana celulelor epiteliului urinar. fimbriile S s-au evideniat la tulpinile de E.coli implicate n meningite i se ataeaz de glicoconjugaii ce conin acid sialic. fimbriile K88 i K89 se gsesc la tulpinile de E.coli enterotoxigene ce produc diaree. Receptorii celulelor sensibile conin acid sialic i lactoz. Aceeai tulpin de Escherichia coli poate conine mai multe tipuri de fimbrii codificate de anumite zone cromozomiale sau plasmidice. Aceast diversitate genetic permite adaptarea tulpinii la condiii diferite oferite de organismul gazd. fimbriile ce conin N-metilfenilalanin au fost evideniate la o serie de genuri de bacterii gram-negative, cum sunt Pseudomonas (bacilul piocianic), Neisseria (gonococ i meningococ), Bacteroides, Vibro etc. 18. Sporii bacterieni structura, rol, localizare Sporii Unele bacterii se transform n spori, care sunt forme primitive de difereniere celular, cu rezisten crescut la factorii de mediu i care apar endocelular n condiii nefavorabile de via. Sporogeneza se ntlnete numai la 3 genuri de bacterii gram-pozitive, Clostridium i Bacillus care sunt bacili i Sporosarcina care sunt coci. Sporii nu sunt forme de nmulire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativ se formeaz un singur spor, care n condiii favorabile de via va da natere unei singure celule bacteriene. Forma sporului poate fi rotund sau oval. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulai aerobi, nedepind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe cnd la genul anaerob Clostridium, sporul are un diamentrul mai mare dect bacteria, producnd deformarea acesteia. Acest caracter al sporului se numete caracter clostridial i este important n identificarea bacililor gram-pozitiv anaerobi. Poziia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi central, ca la bacilul crbunos (Bacillus anthracis), subterminal, ca la B.cereus, sau terminal, ca bacilul tetanic (Cl.tetani). n coloraiile obinuite sporul apare ca o zon incolor n corpul bacterian. El se evideniaz ns prin coloraii speciale, la cald, care permeabilizeaz nveliurile sporale pentru colorani (coloraia Mller). Pe preparatele native ntre lam i lamel efectuate din culturi, sporii apar ca nite formaiuni rotunde, refringente. Ultrastructura i compoziia chimic a sporilor asigur acestora o mare rezisten la agenii fizici i chimici, ceea ce face ca ei s fie considerai forme de rezistena ale bacteriilor. De importan deosebit pentru medicin este rezistena sporilor la cldur, de care trebuie s se in cont la sterilizare. Sporularea. Este un proces ce se declaneaz n condiii nefavorabie de via, cnd bacteriile sunt lipsite de surse nutritive. Ea presupune formarea unor structuri noi i dispariia altor structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei. Din punct de vedere morfologic, sporularea ncepe prin condensarea la un capt al celulei a materialului nuclear. Acesta va fi separat de un sept ce provine din invaginarea membranei citoplasmatice. Septul crete, se desprinde de membrana citoplasmatic i formeaz n jurul materialului nuclear o membran dubl a crei fee care se privesc sunt cele ce sintetizeaz peretele bacterian. Acesta este stadiul de prespor.Cele dou lamele ale membranei presporale vor sintetiza nveliurile sporale: peretele sporal i cortexul situate ntre cele dou lamele ale membranei presporale i o tunic proteic i exosporiumul n afara membranei presporale. Structura sporului variaz de la specie la specie, dar organizarea general se aseamn. De la interior spre exterior, sporul este format din: core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear inconjurat de membrana citoplasmatic. Aici este depozitat DNA i o substan care are rol n rezistena sporului la cldur - dipicolinatul de Ca, care nu s-a mai evideniat nicieri n natur, cortexul intern sau peretele sporal format din peptidoglican i care este peretele celular primordial, membrana extern sau cortexul sporal, care este stratul cel mai gros al sporului i care conine i el un peptidoglican, cu o structur particular, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie n transformarea sporului n forma vegetativ, tunica proteic este format din proteine chitinoase cu numeroase legturi disulfitice. Ea este impermeabil, fiind responsabil de rezistena sporilor la unele dezinfectante, exosporiumul este prezent numai la unii spori i conine lipoproteine i zaharide. Germinarea sporului. n condiii de mediu favorabile, sporul germineaz i va da natere unei bacterii vegetative identice cu aceea n care s-a format. Germinarea are loc n 3 etape: Activarea sporului. Se produce cnd acesta ntlnete condiii favorabile de via, dar i un factor care s lezeze nveliul sporal (mecanic sau chimic ca, de exemplu, lizozimul, compui cu grupri sulfhidrilice libere etc.). Iniierea este declanat de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru altele adenozina. Acesta duce la activarea unei enzime autolitice care degradeaz cortexul sporal. Are loc absorbia de ap, eliberarea dipicolinatului de calciu i degradarea unor compui sporali. Dezvoltarea sporului. Protoplastul sporal se transform n bacterie vegetativ, care trece printro perioad metabolic activ de refacere a constituenilor celulari normali i a echipamentului enzimatic complet. 19. Apa, substantele minerale si pigmentii in structura celulei bacteriene Continutul n apa al bacteriilor se situeaza n medie la 85% din masa celulara. Apa este faza n care se solubilizeaza, sunt transportati electrolitii si substantele neelectrolitice si mediul n care se petrec toate reactiile metabolice. Ea participa la multe din aceste reactii (hidroliza, reactii anabolice etc.) si formeaza mpreuna cu substantele anorganice si macormoleculele organice continute o unitate fizico-chimica si biologica. Exista apa libera (mediu de dispersie) si apa legata fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au putina apa, in special apa legata. Bacteriile sunt fiinte acvatice prin excelenta. Roluri: mediu de dispersie, reactiv in reactiile metabolice, erapa finala a unor reactii oxidative. Substante minerale 2-30% din greutatea uscata a bacteriei si variaza in functie de specie. Unele elemente intra in compozitia diferitelor strucuri (sulful in str aa) Roluri: favorizeaza schimburile cu mediul regleaza presiunea osmotica pot stimula cresterea si functia bacteriei activeaza unele sisteme enzimatice contribuie la reglarea pH-ului Pigmentii pigmentogeneza este caracteristica bacteriilor cromogene si este dependenta de conditiile de cultivare Poate reprezenta un criteriu de identificare. Dupa localizarea pigmentului bacteriile pot fi: cromofore (pigmentul este legat in citoplasma) paracromofore (pigmentul este prezent in perete sau in stratul mucos) - cromopare (pigmentul este difuzibil in mediu Roluri: protectie fata de UV antibiotic enzimatic 20. Glucidele, proteinele si lipidele in structura celulei bacteriene Glucidele in structura bacteriana se pot gasi glucide cu rol in metabolismul intermediar glucidic precum si glucide complexe, polizoide. Acestea din urma au urmatoarele roluri: participa la realizarea structurii peretelui celular fac parte din capsula unor bacterii Exista teste biochimice in care se urmareste utilizarea sau imposibilitatea utilizarii unui anumit zahar de catre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (in special in cazul enterobacterilor, etc). Testariile biochimice sunt de mare utiliate in studiul fungilor. Proteinele pot fi simple, cu rol in metabolismul intermediar pritidic si complexe, heteroproteinele: - mucoproteine cromoproteine nucleoproteine De remarcat prezenta in structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum si a aminoacizilor in forma D (adaptare biochimica a bacteriilor fata de actiunea nociva a enzimelor proteolitice) Lipidele reprezinta mai putin de 10% din greutatea uscata a bacteriilor si variaza cantitativ in functie de specie, varsta etc. Lipidele se pot gasi libere in vacuole sau combinate, facand parte din diferitele structuri ale celulei bacteriene (perete, membrana, mezozomi): acizii grasi speciali (ac mycolic la mycobacterii) cerurile (acizi grasi + alcooli monovalenti superiori) bacteriile acid-alcool rezistente fosfolipidele lipidul ubiquitar lipidul A 21. Substante cu actiune antibiotica produse de bacterii piocianina elaborata de P. Aeruginosa fata de B anthracis plasmida col codifica proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine cu efect asupra unor bacterii receptive inrudite (de exemplu colicinele elaborate de E.coli) unele bacterii din genul bacillus produc antibiotice polipeptidice (de ex B licheniformis produce bacitracina, B. Brevis gramicina, B. Plymyxa polimixina) 22. Nutritia principalelor bacterii studiate: tipuri de nutritie Nutritia bacteriana reprezinta totalitatea proceselor prin care bacteriile si procura din mediul nconjurator substantele necesare supravietuirii, cresterii si nmultirii , iar respiratia bacteriana modalitatea de a-si produce energia necesara activitatii metabolice. Sursa de energie. n functie de sursa de energie pe care o folosesc, bacteriile se mpart n: fotosintetizante, care utilizeaza energia luminoasa pentru sinteza compusilor proprii si chimiosintetizante, care si procura energia prin reactii de oxido-reducere a unor substante. Bacteriile care oxideaza substantele anorganice se numesc lithotrofe, iar cele care oxideaza substante organice chemoorganotrofe. Sursa de carbon. Dupa sursa de carbon, bacteriile se clasifica n: autotrofe, care sintetizeaza compusi organici pornind de la substante anorganice, sursa de carbon fiind CO2, mixotrofe, care folosesc ca sursa de carbon att substante organice ct si CO2, heterotrofe, care utilizeaza ca sursa de carbon numai substante organice. Sursa de azot a bacteriilor de interes medical o constituie n general aminoacizii, dar unele bacterii utilizeaza si sarurile de amoniu (Escherichia coli, Salmonella etc.). Necesarul de oxigen pentru dezvoltarea bacteriilor este variabil si va fi discutat n cadrul reactiilor de energogeneza. Necesarul de substante organice este foarte diferit de la o specie bacteriana la alta. Astfel, de pilda, Escherichia coli cultiva foarte bine pe medii care au n compozitie o singura sursa organica de carbon (glucoza, acetat sau succinat), o sursa de azot [(NH4)2SO4)], ioni esentiali dezvoltarii (K+, Mg2+ etc.) si oligoelemente (Cl-, Co, Cu, Mo, Ni, Se, Zn etc.). Cu ct necesitatile nutritive bacteriilor sunt mai mari cu att dependenta lor fata de o gazda naturala creste. Astfel, o categorie aparte n cadrul bacteriilor heterotrofe sunt bacteriile paratrofe. Ele sunt lipsite de unele enzime (genul Rickettsia) sau nu sunt capabile de energogeneza (genul Chlamydia) 23. Clasificarea bacteriilor in functie de tipul respirator (vezi tabel la sfarsitul subiectului!) La bacterii deosebim n functie de acceptorul final de hidrogen, 3 tipuri de oxidatie: respiratia, n care acceptorul final de hidrogen este oxigenul atmosferic, fermentatia, n care acceptorul final de hidrogen este o substanta organica, si respiratia anaeroba, n care acceptorul final de hidrogen este oxigenul prezent ntr-o sare anorganica (nitrat sau sulfat) care se va reduce. Din punct de vedere practic, bacteriile se mpart, dupa necesarul de oxigen, n: bacterii strict aerobe, care se dezvolta numai n prezenta oxigenului atmosferic, folosind exclusiv respiratia aeroba si deci oxigenul ca acceptor final de hidrogen. Astfel de bacterii sunt, de exemplu, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis etc. bacterii strict anaerobe, care nu se dezvolta dect n absenta oxigenului, prezenta lui fiind foarte toxica culturii chiar la o presiune de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reactie energogenetica exclusiv fermentatia, n conditii anaerobe, deci oxidatia de substrat. Daca fermentatia se produce n prezenta oxigenului, se formeaza radicali de superoxid (O2-) foarte toxici. Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt lipsite de superoxiddismutaza care transforma radicalul superoxid n apa oxigenata si catalaza care descompune apa oxigenata. Exemple de bacterii strict anaerobe sunt cele din genul Clostridium, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta att n prezenta ct si n absenta oxigenului atmosferic. Ele utilizeaza ca reactii energogenetice respiratia aeroba, fermentatia iar unele chiar si respiratia anaeroba. Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pilda, enterobacteriile). bacterii anaerobe aerotolerante folosesc numai fermentatia n prezenta aerului atmosferic, fara participarea oxigenului la reactiile energogenetice. Ele tolereaza oxigenul n mediu fie pentru ca au n echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie ca enzimele exista n mediul de cultura. Astfel, bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaza, dar pot fi cultivate n conditii de aerobioza pe medii cu snge, care suplineste catalaza. bacterii microaerofile folosesc respiratia si fermentatia, dar necesita o concentratie mai mare de bioxid de carbon dect cea din atmosfera pentru reactii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, Campylobacter, necesita concentratii de bioxid de carbon de 6-10%. Reactiile energogenetice ale bacteriilor sunt n principiu aceleasi ca si la celulele eucariote, si anume: glicoliza pe calea Embden-Mayerhoff (n conditii de aerobioza sau anaerobioza), calea pentozofosfatilor, (n care se produce NADPH2 important donor de ioni de H pentru reactiile anabolice), beta-oxidatia acizilor grasi, ciclul acizilor tricarboxilici, dezaminarea oxidativa si transaminarea aminoacizilor, oxidarea de substrat, fosforilarea oxidativa. Necesar de O2 Unde se dezvolta Reactia energogenetica Exemple

1. STRICT AEROBE in prez. O2 atmosferic Respiratie aeroba -Pseudomonas -Mycobacterium tuberculosis

2. STRICT ANAEROBE in absenta de O2 atmosferic [prezenta = toxica. Nu au: superoxiddismutaza si catalaza] Fermentatie in conditii anaerobe [fermentatia in conditii aerobe => radicali de superoxid => toxic] -Clostridium -Bacteroides -Prevotella -Fusobacterium

3. FACULTATIV ANAEROBE in prezenta + absenta O2 respiratie aeroba fermentatie respiratie anaeroba (unele din ele) -Enterobacterii [majoritatea speciilor de interes medical]

4. ANAEROBE AEROTOLERANTE tolereaza O2 Prezinta: superoxiddismutaza si catalaza sau enzimele exista in sistemele de cultura - fermentatie in conditii aerobe, fara particip. O2 -Streptococcus

5. MICROAEROFILE necesita conc. mare de CO2 fermentatie respiratie -Neisseria -Brucella -Campylobacter (6-10% conc. CO2)

24. Definiti factorii de crestere bacterieni: exemple Definitie: Factorii de crestere sunt metaboliti esentiali pe care bacteria nu ii poate sintetiza pe baza substantelor din mediu. Exemple: Factorii X si V pentru Haemophilus influenzae ! bacteriile patogene devin dependente de un astfel de factor. exemplu: Mycobacterium Leprae este cea mai pretentioasa bacterie 25. Clasificati bacteriile in functie de temperatura optima de dezvoltare: exemple In functie de temp de dezvoltare, bacteriile pot fi: a)mezofile-cu temp optima 30-37 grade(majoritatea bact studiate de microbiologia medicala); b)psichrofile- temp optima in jur d 20 grade(unele accepta si temp apropiata de 0 grade); c)termofile- temp opt de 50-60 grade(unele se multiplica si la ~95 grade:ex :thermus aquaticus).Nu sunt patogene. Temperarura optima de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. n functie de aceasta temperatura, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmultesc optim la 20C dar si sub aceasta temperatura, mezofile, cu temperatura optima cuprinsa ntre 20-40C si termofile, care se nmultesc optim la peste 45C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se nmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si bacterii homeoterme. Limitele de temperatura n care aceste bacterii pot sa creasca sunt nsa mai mari si variaza de la specie la specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta variatii mai mari de 1-2C fata de temperatura optima, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi. Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect fiind sterilizarea. Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de +4oC din frigidere, nu distrug bacteriile, dar opresc n general nmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pastreaza n aceste conditii. Totusi, exista tulpini microbiene care se nmultesc si la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmultesc la 0oC si tulpini din familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se n nmultesc la +5oC. Acest aspect trebuie luat n calcul de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germene ntr-o infectie se bazeaza pe criteriul numeric. Congelarea. Daca o suspensie bacteriana este supusa nghetului la temperaturi nu prea mici fata de 0oC, cristalizarea apei determina formarea unor spatii ce contin solutii concentrate de saruri care nu cristalizeaza dect la temperaturi mult mai joase (-20C pentru NaCl de exemplu), cnd solutiile devin saturate si pot cristaliza. Aceste concentratii ridicate de saruri minerale, la care se adauga cristalele de apa, vor leza structurile bacteriene. Prin nghetare nu vor fi omorte toate celulele unei suspensii, dar nghetul si dezghetul repetat scad foarte mult numarul de bacterii viabile. Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-10C) nu este destul de scazuta pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optima este cea realizata de CO2 (-78C) sau de azotul lichid (-180C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este favorizata de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid. Acesti agenti chimici induc o solidificare amorfa, vitroasa care nlocuieste solicificarea prin cristalizare. 26. Structua si sinteza peptidoglicanului Peptidoglicanul sau mureina este structura chimica responsabila de rigiditatea peretelui celular si care asigura forma si rezistenta mecanica a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el consta dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamina si acid N-acetil-muramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanturile vecine sunt legate intre ele prin punti polipeptidice, transversale. Sinteza: incepe prin sinteza in citoplasma a UDP-acid N-acetil muramicpentapeptid( NAM). Acesta se ataseaza de bactoprenol(lipid din mbr celulara),apoi urmeaza un lant d reactii biochim. Legarea incrucisata finala se realizeaza printr-o reactie de transpeptidare in care terminatiile amino libere ale pentaglicinei inlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul invecinat.Reactia e catalizat de transpeptidaze, un set d enzime aka PBPs(penicillin binding proteins), cu activitate atat de trans cat si de carboxipetidaze, dar controleaza si gradul de legare a peptidoglicanului.(lucru important in diviziunea celulara).La nivelul lor se leaga penicilinele si alte beta lactamice. Orice compus care inhiba o etapa in sinteza peptidoglicanului la o bacterie in crestere va produce liza bacteriana. 27. Definiti notiunea de cultivare a bacteriilor; enumerati pe ce substraturi se realizeaza Cultivarea se realiz prin insamantarea bacteriilor pe medii de cultura. Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta n bacteriologia medicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de cultura destinate izolarii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice. Mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric, mediul Lwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch, mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele si multe altele. Se ultilizeaza diferite substraturi biologice nutritive complexe care au n compozitia lor aceste ingredinente. Astfel: peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origine animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine definita, iar prin continutul n peptide si aminoacizi constituie o sursa universala de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic n prepararea tuturor mediilor de cultura, extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita. Acesta contine cantitati importante de creatina, xantina, hipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree, glutamina ca sursa de azot precum si glicogen, hexozofosfati, acid lactic etc. ca sursa de carbon, extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B, n afara de ingredientele mai sus mentionate mai amintim: clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale ntr-o concentratie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentratie poate creste pna la 10%, mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot nmbogati mediile, deoarece constituie surse de carbon usor accesibile multor bacterii 28. Definiti notiunea de crestere si multiplicare bacteriana Cresterea si nmultirea bacteriilor este rezultatul nutritiei si al metabolismului bacterian. Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare dar nu toate bacteriile se divid repede. Baciul tuberculos, de pilda, a carui timp de generatie este de 24 de ore, se va nmulti lent si va produce o infectie cu evolutie insidioasa, cronica. Cresterea oricarui organism are loc prin sinteza de noi molecule; Multiplicarea= o consecinta a cresterii(se restabileste rap dintre volum si si supraf celulei). Multiplicarea se face de obicei prin diviziune simpla. n organism, cresterea si multiplicarea bacteriilor este diferita de multiplicarea in vitro, fiind stresata de necesitati nutritive (prin competitie cu flora normala) si prin mecanismele de aparare antiinfectioasa. Conditiile pe care microorganismele le ntlnesc n organism le selecteaza pe acelea care cresc n anumite limite de temperatura, osmolaritate si pH. 29. Definiti notiunea de mediu selectiv, electiv si de imbogatire; exemple Mediul electiv: prezinta ingrediente speciale pentru un anumit tip de bacterie. Loeffler: bacil difteric Lowenstein: Mycobacterium tuberculosis Mediul selectiv: Inhiba dezvoltarea unor bacterii in detrimentul altora. Se deosebesc bacterii patogene de cele saprofite. slab selective: McConkey moderat selective: Hectoem inalt selective: Chapman cu telurit: bacil difteric Mediul de imbogatire: se dezvolta o anumita specie de bacterie in detrimentul alteia Chapman: stafilococ Selenit: Salmonella 30. Definiti notiunea de mediu diferential; exemple Bacteriile se diferentiaza pe baza unui singur caracter: geloza sange: bacterii saprofite de stafilococ - hemolitic AABTL: lactozo+ (E.Coli) de lactozo- (Salmonella) Chapman: manito+ (stafilococ auriu) de manito- [prezenta/absenta zaharului MANITA] 31. Ce este o colonie bacteriana? Cum se pot obtine colonii bacteriene izolate? O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din nmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila n general cu ochiul liber. Introducerea mediilor de cultura solide a nsemnat un progres urias n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase. Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen n ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan n ser fiziologic - colonii de tip R (rough). n general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt nevirulente. 32. Fazele dezvoltarii unei culturi bacteriene Faza de lag. n aceasta perioada nu se remarca o crestere a numarului de celule, cu toate ca ele cresc n volum si dovedesc o activitate metabolica intensa. Durata acestei faze variaza n functie de specie, conditiile de mediu, de numarul de celule din inocul si este intervalul de timp n care celulele se adapteaza noilor conditii de mediu. Faza exponentiala sau logaritmica este precedata de o faza de accelerare n care celulele bacteriene ncep sa se nmulteasca din ce n ce mai repede. Celulele se divid constant prin fisiune binara, deci n progresie logaritmica, raportul dintre numarul bacteriilor si timp fiind liniar. Aceasta rata intensa de multiplicare este posibila doar in vitro, in vivo ea fiind mult frnata de mecanismele apararii antiinfectioase. Durata acestei perioade este dependenta de aceleasi conditii de mediu ca si faza precedenta dar si de specie. Astfel E.coli are un timp de generatie de aproximativ 10 minute iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore Faza stationara. Multiplicarea bacteriilor n progresie logaritmica nu mai este posibila, rata de nmultire scade treptat pna cnd bacteriile trec n faza stationara. Numarul bacteriilor ramne constant, ele nici nu se nmultesc si nici nu mor. n aceasta faza, celulele nu mai cresc, ci are loc o activitate metabolica endogena, prin care celula si sintetizeaza rezerve de energie si produsi intermediari necesari mentinerii n viata n noile conditii. Faza de declin care dureaza mai multe zile se caracterizeaza prin scaderea numarului de bacterii, remarcndu-se o divergenta ntre curba care ilustreaza numarul total de bacterii si cea care reprezinta bacteriile vii. Ea se datoreaza scaderii substantelor nutritive si acumularii de substante toxice pentru bacterii. Modificarile morfologice sunt pregnante att n ceea ce priveste forma, dimensiunile ct si caracterele tinctoriale. 33. Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; corelatii intre acestea si patogenitate; exemple Aspectul culturilor pe mediile solide Dimensiunea Mari, >2mm (Staphylococcus spp, K. pneumoniae) Medii 1-2 mm( Streptococcus pyogenes) Mici ,1mm ( Streptococcus viridans) Foarte mici( Mycoplasma, Ureaplasma) Bacteriile si fungii facultativ anaerobi se dezvolta in toata masa de lichid, tulburandu-l Bacteriile strict aerobe se dezvolta la suprafata mediului Tulpinile care pe medii solide formeaza colonii tip S , tulbura omogen mediul, tulpinile care formeaza colonii R tulbura mai putin omogen, sau pot lasa mediul limpede formand flocoane care se depun, sau un strat, val Se mai poate remarca pigmentogeneza sau aparitia unui miros caracteristic Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni ntrun anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul bacteriilor n produsul de examinat (infectii urinare). 34. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide corelatii intre acestea si patogenitate; exemple Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta n mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa). Unele medii de lichide au ca factor electiv anumite substante, ca, de exemplu, selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale. 35. Sisteme de culturi continue; definitii si exemple (?!) 36. Definiti notiunile de asepsie si antisepsie; exemple de antiseptice; aplicatii Antisepsia consta n aplicarea unor substante bactericide sau bacteriostatice n scopul de a omor sau inhiba dezvoltarea florei patogene la nivelul tegumentelor, mucoaselor, plagilor. Asepsia cuprinde toate masurile care mpiedica contaminarea cu agenti infectiosi a unei plagi. Antisepticele sunt substante cu actiune bacteriostatica, uneori bactericida, putnd fi aplicate pe tegumente sau ca spalaturi ale unor mucoase (vaginala, uretrala, otica etc.). Aceeasi substanta poate fi antiseptic sau dezinfectant n functie de concentratie. Ca antiseptice se folosesc mai frecvent: acidul boric: 2-3% n solutii apoase, 10% n unguente si 0,005 - 1,6% pentru colire. Nu se aplica sugarilor, pentru ca este toxic si nu se aplica pe plagi ntinse, acidul acetil glacial: diluat 28 -32% se utilizeaza n dermatologie si stomatologie ca antiseptic, astringent, cauterizant si antifungic. 37. Definiti notiunile de spreilizare si dezinfectie; exemple de dezinfectante; aplicatii Dezinfectantele sunt substante puternic bactericide la concentratii relativ scazute, folosite la decontaminarea obiectelor si ncaperilor. Dupa folosirea de catre Lister a fenolului pentru dezinfectia salilor de operatii, s-a convenit ca acest compus sa fie socotit dezinfectantul standard, cu toate ca actioneaza n concentratii mai mari dect majoritatea dezinfectantelor folosite astazi. Sterilizarea-distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafata sau dintr-un mediu(lichid sau solid).prin sterilizare se realizeaza asepsia. Dezinfectia-distrugerea formelor vegetative microbiene(uneori si a sporilor) din anumite medii (lichide,solide) sau de pe suprafete.Se realizeaza cu ajutorul unor agenti fizici sau cu ajutorul substantelor dezinfectante.(realizeaza antisepsia) Dezinfectante-substante toxice sau iritante pentru tesuturile vii ,puternic germicide, care se utilizeaza pentru decontaminarea obiectelor si suprafetelor(in functie de concentratie unele dezinfectante pot fi folosite si ca antiseptice) Exemple:alcoolii,halogenii(clor iod),fenolii,compusi cuaternari de amoniu,aldehide(glutaraldehida,formaldehida),peroxizii(apa oxigenata,acid peracetic) 38. Antiseptice si dezinfectante. Mecanisme de actiune In functie de mecanismul de actiune se clasifica in: a. Substante care denatureaza proteinele: alcoolul etilic 70-95%, utilizate atat ca antiseptice cat si ca dezinfectante b. Substante care oxideaza gruparile libere ale enzimelor : hipermanganat de potasiu 1 o/oo, peroxid de hidrogen 3%, halogenii: hipocloriti, lugol, betadina c. Substante care lezeaza membranele celulare: fenoli, detergenti anionici (sapunuri), detergenti cationici (saruri cuaternare de amoniu) d. Substante care altereaza acizii nucleici: coloranti bazici (Al de metilen, fucsina bazica, violet de gentiana), rivanol 39. Sterilizarea prin caldura umeda; metode, presiune, temperatura, aplicatii Caldura umedaa este mai eficienta dect caldura uscata, distrugnd bacteriile la o temperatura mai scazuta si timp mai scurt. Formele vegetative a majoritatii bacteriilor, fungilor si virusurilor animale sunt omorte de caldura umeda n 10 minute la temperaturi cuprinse ntre 50oC (Neisseria gonorrhoeae) si 65oC (Staphylococcus aureus) Omorrea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea proteinelor structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi prin expunere la caldura umeda la 121o timp de 30 de minute. fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se efectueaza la 100oC timp de 1/2 de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de mica chirurgie pasteurizarea: consta n ncalzirea lichidului la 62C pentru 30 de minute (pasterurizare joasa), 71oC 15 minute (pasteurizare medie), 80-85o 3-5 minute (pasteurizare nalta) sau introducerea unor vapori filanti la o temperatura de 130 -150oC sub presiune pentru cteva secunde, este o metoda eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta n lapte (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numarul lor reducndu-se dupa pasteurizare cu 97-99% tyndalizarea consta n ncalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rnd, n baie de apa la 56100oC cte o ora. autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar n laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc ntr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121oC, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, n aparate speciale numite autoclave sau la 134 oC, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute. 40. Autoclavarea principiu, parametrii, tehnici, utilizari Autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar n laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc ntr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121oC, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, n aparate speciale numite autoclave sau la 134 oC, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute. Autoclavul are ca piesa principala un cazan su pereti rezistenti care se inchide etans si in interiorul caruia, vaporii de apa sunt comprimati la presiunea necasare sterilizarii.Exista mai multe tipuri de autoclave. Prin autoclavare se pot steriliza-substante in solutie,sticlarie(cu exceptia pipete si lamele),materiale contaminate de laborator,instrumentare chirurgical(metalic,cauciuc sau bumbac),medii de cultura,aparate de filtrat. 41. Sterilizarea prin caldura uscata; metode, presiune, temperatura, aplicatii Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor celulare. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160o, timp de 60 de minute. Caldura uscata de 100o C distruge n 60 de minute bacteriile care sunt omorte prin calduraa umedaa la 60oC n 30 de minute. Sporii fungilor sunt distrusi n 60 de minute la 115oC, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse ntre 120-160oC. n laboratorul de microbiologie se utilizeaza urmatoarele tehnici de sterilizare: ncalzirea la rosu n flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice n laboratorul de microbiologie; flambarea (trecerea prin flacara pentru cteva secunde) se aplica gtului baloanelor, eprubetelor dupa deschiderea si nainte de nchiderea lor, pipetelor nainte de utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de mica chirurgie, dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de nalta pentru a asigura o sterilizare optima; sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti dubli ntre care se gaseste un strat de azbest care mpiedica pierderile de caldura, o sursa de caldura care este energia electrica si un termoregulator. n interior pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele de sterlizat. Temperatura de sterilizarea la pupinel este de 180oC timp de o ora. La pupinel se sterilizeaza ntreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie suprancarcat, pentru ca aerul sa poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat. sterilizarea cu raze infrarosii este folosita pentru sterilizarea seringilor faraa armaturaa metalicaa la o temperatura de 180oC. Sterilizarea se poate efectua ssi la 200oC n vid, aplicndu-se instrumentelor chirurgicale. 42. Congelarea si liofilizarea bacteriilor definitie, efecte asupra viabilitatii germenilor, aplicatii - temperaturile joase au in general un efect bacteriostatic. La temperaturi scazute, reactiile biochimice incetinesc, multiplicarea este stopata. In functie de viteza de racire avem situatii diferite. a) CONGELAREA LENTA la temperaturi superioare celei de -21,3; are efecte bactericide prin formarea de cristale de gheata si prin hiperconcentratie salina cu denaturarea proteinelor. b) CONGELAREA BRUSCA la -70 are efect de conservare a bacteriilor prin solidificare in masa a apei fara aparitia cristale de gheata. c) LIOFILIZAREA (criodesicarea) reprezinta congelarea brusca concomitent cu desicatia (deshidratarea in vid). O suspensie microbiana , in mediu protect, liofilizata poate fi pastrata in fiole inchise timp indelungat (vaccinul BCG). 43. Bacteriofagii definitie, structua, tipuri de intearctiune fag bacterie (enumerare) Bacteriofagii : Sunt virusuri care pazariteaz bacteriile. Se cunosc 6 grupe morfologice de bacteriofagi, cei mai bine studiai fiind bacteriofagii T ai bacilului coli. Bacteriofagii sunt formai dintr-un cap hexagonal, un gt i o prelungire numit picior (coad). Capul este alctuit dintr-un nveli proteic caracteristic virusurilor (capsida) i adpostete ADN. Coada este un cilindru rigid nvelit ntr-un manon proteic asemntor miozinei i se termin cu o plac hexagonal ce conine o enzim de tipul lizozimului. De placa bazal se aprind 6 fibre cu rol n fixarea bacteriofagului pe suprafaa bacteriei. Relatii bacteriebacteriofag: sunt 2 tipuri: de tip litic/productiv; de liogenizare/de tip reductiv. Sunt strict specifice si sunt mediate de receptori. 44. Interactiunea fag bacterie: ciclul litic (etape, evidentiere) 1. Atasarea: atasarea este specifica, exista receptori(R) strict specifici la nivelul fagului ce recunosc receptorii de la nivel bacterian. Fixarea pe R este initial reversibila ( prin fibrele cozii), apoi ireversibila (prin crosetele placii bazale) 2. Penetrarea: fagul elibereaza muramidaza care lizeaza mureina. Teaca cozii se contracta si antreneaza cilindrul axial injectarea ADN fagic in citoplasma bacteriana; 3. Multiplicarea dupa 4 min ADN-ul bacterian este blocat, functia este preluata de ADN fagic. 4. Maturarea (asamblarea) fagului; 5. Liza bacteriana si eliberarea fagului matur, virulent. EVIDENTIERE: - in mediu lichid (tulbure), inocularea fagului duce dupa un timp la limpezirea mediului pe mediu solid insamantat uniform, apare o zona de liza, clara, bine circumscrisa (plaja de liza). Bact lizosensibile permit adsorbtia, penetrarea si multiplicarea fagilor pana la realizarea lizei celulare. 45. Interactiunea fag bacterie: ciclul lizogen, proprietatile bacteriilor lizogene Dupa atasare si penetrare, ADN fagic: - fie se integreaza liniar in cromozomul bacteriei gazda si se replica sincron cu aceasta; fie se circularizeaza si atasat de membrana citoplasmatica se replica sincron cu diviziunea bacteriana. Bacteria a devenit lizogena, se reproduce si transmite descendentilor fagul latent (profag, fag temperat); in anumite conditii el poate deveni fag virulent. Proprietatile bacteriilor lizogene: 1. este imuna fata de un fag omolog profagului 2. pot aparea fenomene importante dpdv genetic: transductia, conversia, recombinarea genetica (bact parazitata de 2 fagi diferiti, dar inruditi), inductia fagica (sub infl ag inducori ex raze UV sau spontan profagul isi recastiga virulenta>fag virulent liza bact. Bact lizorezistente nu permit infect cu un fag fie datorita lipsei R specifici, fie datorita unei stari de imunitate. Bact lizogene sunt imune la fagii virulenti omologi profagului. 46. ADN bacterian; localizare, structura, rol Genomul viral este constituit fie dintr-o molecul de ADN, fie din ARN dispus helical, linear sau circular, monocatenar sau bicatenar. n structura ADN intr dezoxiriboza, adenina, guanina, citozina, timina i radicalul fosfat. n structura ARN intr riboza, adenina, guanina, citozina, uracilul i radicalul fosfat. Nucleotidele sunt legate ntre ele prin legturi fosfodiesterice. Un virus este alctuit dintr-un nveli proteic numit capsid i un miez de acid nucleic. Miezul de acid nucleic este constituit din ADN sau ARN, niciodat ambele (ADN la dezoxiribovirusuri i ARN la ribovirusuri). ADN poate fi dublu catenar, linear sau circular sau dublucatenar linear. ADN bacterian nu este complexat cu proteine histonice, dar la unele grupe bacteriene ADN este asociat cu proteine bazice asemntoare histonelor. Se presupune c aceste proteine au rol n neutralizarea ncrcturii negative a gruprilor fosfat ale ADN, asigurndu-i stabilitatea. Din punct de vedere chimic nucleoidul este un complex ADN-ARN-proteine (80% ADN, 10% ARN ARNr i ARNm i 10%proteine ARN polimeraz). Rol: depozitarea informatiei genetice; replicarea; transcrierea si traducerea genetica; protejarea materialului genetic propriu; reglarea si controlul activitatii celulare. 47. Replicarea ADN bacterian; mecanism Structura dublu spiralat a ADN permite replicarea lui identic, semiconservativ. Spirala se deschide ca un fermuar la locul iniial al replicrii sub aciunea unei ADN-giraze. Pe fiecare spiral se va sintetiza o spiral nou, complementar, cu participarea ADN - polimerazei (I, II, III) din direcia captului 5' terminal spre captul 3' terminal. 48. Plasmidele; definire, tipuri, roluri in celula bacteriana Plasmidele sunt formaiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere n citoplasm, reprezentate de molecule circulare de ADN care se replic independent de cromozom. Plasmidele pot fi: conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezisten la antibiotice R, neconjugative, care nu pot prsi ele nsi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codific secreia de beta-lactamaz la S.aureus) episomi, care se pot integra prin recombinare n cromozomul bacterian, pierzndu-i astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate). 49. Factorul F si factorul R; definitie, roluri Plasmidele R -de rezisten la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau n esen din dou regiuni genetice distincte: genele care codific rezistena la antibiotice R, care pot fi unice sau multiple i genele care confer plasmidului capacitatea de a se transfera FTR. Rezistena la peste 90% din tulpinile de spital este de natur plasmidic. Existena acestor plasmide se explic prin aglomerarea mai multor gene de rezisten R, pe acelai plasmid, prin fenomenul transpoziiei repetate de material genetic. Plasmide de rezisten au fost evideniate la genurile Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia din familia Enterobacteriaceae, la genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, i Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gramnegativi sunt mai mari dect cele evideniate la bacteriile gram-pozitive. Plasmidul F se mai numete i plasmid de sex, sau factor de fertilitate ( factor F) i conine, pe lng ali determinani genetici, genele de transfer tra. Plasmidul F se poate transmite altor celule bacteriene prin conjugare. El se poate integra n cromozomul bacterian putnd media transferul de gene cromozomiale de la o celul bacterian donor la cea receptor. n funcie de prezena factorului F, bacteriile se mpart n: bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele i care sunt receptoare de material genetic, bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid n citoplasm i care sunt celule donoare, bacterii Hfr care au factorul F+ integrat n cromozom, de asemenea masculine, bacterii F care au factorul F+ ca plasmid autonom, dup ce acesta a fost integrat n cromozom i l-a prsit rupnd un fragment ADN din cromozom. i aceste celule dunt donoare, deci masculine. 50. Definiti notiune de genom, genotip si fenotip; variabilitatea genetica si fenotipica Genomul = suma genelor din organism. Totalitatea info genetice a unui organism = genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip in interactiune cu mediul ambiant = fenotip. Variabilitatea fenotipica: reprezinta modificarile morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variabilitatea genotipica: reprezinta modificarile definitive ale materialului genetic (cromozomiale sau extracromozomiale) care se transmit descendentilor. Mecanisme: mutatie ; transfer genetic urmat de recombinarea genetica. 51. Mutatiile la bacterii; definitie, tipuri de mutatii, clasificare Modificrile spontane ale genomului se numesc mutaii i constau din modificarea secvenei de nucleotide dintr-o gen. Ele pot fi punctiforme, inversii, inserii, deleii i mutaii secundare. Mutaiile punctiforme afecteaz un singur nucleotid n cadrul unei gene i sunt reversibile. nlocuirea unui codon cu altul, ceea ce se va traduce prin nlocuirea unui aminoacid cu altul din structura unui polipeptid. Aceast mutaie se numete mutaie cu sens greit, apariia unui codon nonsens. Mutaia nonsens mpiedic sinteza n continuare a unui polipeptid, iar dac ea se produce la nceputul genei ce codific un polpeptid - mutaie polar, acesta nu se va mai putea sintetiza deloc. Inseria i deleia nseamn adugarea, respectiv pierderea a dou pn la sute sau chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaie duce la modificarea important a secvenei de aminoacizi, fiind denumit mutaie cu schimbare de proiect. Mutaiile secundare sunt mutaiile reverse, care restabilesc o secven nucleotidic ce s-a modificat, iar mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a unei gene care a suferit o mutaie, fr restaurarea codonilor iniiali. Acest fenomen se explic prin sinteza unui ARNt care tie s citeasc un codon nonsens. Frecvena pe unitatea de timp cu care se produc mutaiile este diferit i se numete rat de mutaie. Mutaia spontan variaz de la gen la gen ntre 10 -6 i 10 -10. MUTATII REGRESIVE (retromutatii) afecteaza celulele mutante, determinand revenirea acestora la tipul initial. MUTATII SUPRESOARE permit exprimarea functiilor anterioare ale genei, desi o modificare a secventei bazelor nucleotidice persista. MUTATIA SPONTANA apare in conditii d mediu obisnuite si fara interventia unui factor decelabil MUTIA INDUSA care se produce sub actiunea unor factori fizici (radiatii, raze UV) sau chimici care actioneaza ca agenti mutageni. MUTATIILE EXTINSE alterari care depasesc limitele unui codon, putand afecta secvente mai mari ale uneia sau mai multor gene. 52. Transformarea la bacterii; definitie, mecanism Reprezint transferul de material genetic de la o celul donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracie chimic. Acest proces a fost observat pentru prima oar la pneumococi de Griffith n 1928. ADN-ul pneumococilor viruleni, capabili s sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urm dobndind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea s-a pus n eviden ulterior la numeroase genuri cum sunt, de pild, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella etc. i se petrece nu numai ntre tulpiile aceleiai specii, ci i ntre specii diferite. Transformarea genetic este posibil numai dac bacteria receptoare se afl n stare de competen, stare care-i permite nglobarea de ADN strin. Competena este o stare fiziologic temporar a bacteriei, care variaz n funcie de specie i de faza de multiplicare n care se afl bacteria. Dup unii autori, celulele competente au pe suprafaa lor un antigen special numit factor de competen. n timpul strii de competen se modific structura peretelui celular, care devine mai poros, ncrcat electropozitiv, favoriznd legarea ADN-lui strin. 53. Transductie; definitie, mecanism, tipuri de transductie Transducia reprezint un transfer de gene cromozomiale de la o celul bacterian la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili s transfere orice gen bacterian (transducie generalizat) iar alii numai anumite gene (transducia specializat). Transducia generalizat este mediat de fagii viruleni, litici, care dup ptrunderea n celula bacterian se multiplic i determin liza celulei gazd. n timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmenteaz. Se poate ntmpla, ocazional, ca un fragment cu o dimensiune apropiat de cea a genomului fagic s se integreze n capisda bacteriofagului, n locul genomului fagic. Astfel de fagi sunt defectivi i nu se vor mai putea replica, dar pot ptrunde n alte celule bacteriene injectndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra n cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi, ca, de exemplu, rezistena la chimioterapice, proprieti ce in de patogenitatea bacteriei etc. Transducia specializat este mediat de fagii temperai. Dup ptrunderea n celula bacterian a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta sufer iniial un proces de circularizare dup care se inser n cromozom prin recombinare sub forma de profag. Inseria n cromozom se face pe baza homologiei dintre 10 perechi de baz ale ADN fagic i bacterian. Profagul devine parte integrant a cromozomului bacterian, se va replica o dat cu acesta i nu independent, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazd. Bacteriile care au integrate n cromozomul lor un profag sunt n stare de lizogenie. n anumite condiii, ns, are loc un proces de derepresie i genomul bacteriofagic prsete cromozomul bacterian devenind din nou autonom. Cnd prsete cromozomul bacterian poate detaa din acesta un fragment de ADN care va rmne legat de genomul bacteriofagic. Acest bacteriofag nu se va putea nmuli, fiind defectiv, dar va putea intra n alt celul integrndu-se n cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la prima celul bacterian poate s codifice diferite caractere (rezistena la antibiotice, secreia unor enzime, toxine etc.), ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazd. Cel mai bine studiat exemplu de transducie specializat este cea mediat de fagul lambda i gena bacterian ce codific degradarea galactozei (lambda-gal). Transducia specializat nu trebuie s se confunde cu conversia lizogen. In acest caz caracterul nou al celulei bacteriene este codificat chiar de genomul bacteriofagului temperat. Fenomenul a fost descris pentru prima oar, aa cum am mai artat, la Corynebacterium diphteriae, toxigeneza fiind tributar prezenei unui fag temperat n cromozomul bacterian. 54. Conjugarea bacteriana Reprezinta un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) prin efectuarea unei legaturi intre celule. Prin intermediul factorului F+ inserat n cromozom se poate transfera o copie ntreag a cromozomului celulei donoare la cea receptoare. Conjugarea la bacilii gram negativi. Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiionat de prezena n plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului i de transferul plasmidului. Conjugarea ncepe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezeni pe peretele celular al bacteriei receptoare. Dup formarea legturii dintre celula donor i cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O caten parental de ADN va rmne n celula donor, iar a doua va trece n celula receptoare, pe tiparul lor sintetizndu-se catene complementare. Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten - plasmidele R. frecvena transferrii: frecvena transferului multor plasmide slbatice pe receptori adecvai este relativ sczut 10-4/ cel. Dac se incubeaz donorii i receptorii mpreun mai multe ore, numrul de celule recombinante cresc; spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circul ntre specii diferite. Dar nu exista transfer intre bacterii G+ si G- Conjugarea la bacterii gram-pozitive S-au descris procese de mperechere i la bacteriile gram-pozitive ca, de pild, la genurile Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazndu-se pe performana celulei receptoare. Celula receptoare produce un peptid cu mol. mic (GM=1000 daltoni) care determin sinteza unor substane proteice de agregare de ctre celula donoare cu afinitate pentru unele substane adezive de pe suprafaa receptorului. Se produce astfel o legtur strns ntre receptor i donor cu formarea unei puni intercelulare care permite transferul de material genetic. Prin analogie cu substanele atrgtoare la insecte peptidul ce induce substana de agregare a fost desemnat ca sexpheromon. 55. Substante antibiotice si chimioterapice; definitie, utilizari in clinica si laborator In trecut chimioterapicele erau substantele antimicrobiene din sinteza chimica si antibioticele erau cele secretate de unele bacterii si mucegaiuri. Acum un atibiotic este o substanta de origine biologica, semisintetica sau sintetica care are activitate electiva impotriva bacteriilor si astfel poate fi utilizata in tratamentul infectiilor. Conditii pentru un atibiotic ideal: Spectru larg de activitate, poate distruge sau inhiba multe specii de microorg. patogene Absenta toxicitatii pentru gazda Absenta efectului alergizant pentru gazda Absenta efectelor de eliminare a florei normale din organismul gazdei Capacitatea de a accesa zonele anatomice in care se dezvolta infectia Stabilitate chimica Inductor slab al rezistentei microorg. In clinica sunt utilizate in vederea combaterii infectiilor (nu trebuie folosite abuziv sau fara interpretarea corecta a datelor de laborator). In laborator antibioticele sunt testate pentru a se observa daca unele tulpini bacteriene mai sunt sau nu sensibile la acestea. 56. Antibiotice bactericide si bacteriostatice exemple Bactericid = actiunea antibioticelor duce la distrugerea bacteriilor. Exemple: penicilina, vancomicina, cefalosporine, bacitracina Bacteriostatic = antibiotice care opresc multiplicarea bacteriana. Exemple: tetraciclina, eritromicina, sulfamidele 57. Clasificarea antibioticelor dupa mecanismul de actiune exemple 1. Inhibitori ai sintezei peretelui celular: beta lactamice (penicilina, cefalosporine) 2. Inhibitori ai functiei membranei celulare: polimixinele (B, E) 3. Inhibitori ai sintezei proteice la niv. ribozomilor: tetracicline, aminoglicozidele 4. Inhibitori ai sintezei acizilor nucleici: rifampicina, sulfamide 58. Clasificarea antibioticelor dupa structura chimica exemple 1) Beta lactamice: peniciline, cefalosporine 2) Aminoglicozidele: streptomicina 3) Cicline: tetraciclina 4) Ansamicinele: rimfapicina 5) Macrolidele: eritromicina 6) Polipeptide ciclice: bacitracina 7) Care nu se incadreaza 59. Rezistenta la actiunea antibioticelor. Definitii, tipuri Definitie: rezistenta la antibiotice reprezinta capacitatea unor microorganisme de a supravietui si a se multiplica in prezenta antibioticelor Poate fi: naturala (determinata genetic) si/sau dobandita; cromozomiala si/sau extracromozomiala Tipuri: A. Dupa nr. de antibiotice la care este rezistenta bacteria: monovalenta plurivalenta B. Dupa tipul de antibiotice la care este rezistenta directa (1 bacterie se leaga de un antibiotic) incrucisata (1 bacterie este rezistenta fata de mai multe antibiotice asemanatoare) C. Dupa ritmul de instalare: Rapid: streptomicina Intermediar: eritromicina Lent: penicilina Foarte lent: vancomicina 60. Antibiograma difuzimetrica = metoda calitativa a antibiogramei = metoda Kirby Bauer 1. Mediul de cultura: agar Mueller Hinton (nu contine subst. cu actiune inhibitoare). pentru anumite tulpini se pot adauga Ca2+, Mg2+ pH neutru: 7.2-7.4 grosime: 4 mm (25 ml mediu/9 cm placa) 2. Inoculul din 5 colonii izolate = cultura pura (1 celula -> 1 colonie) turbiditate = 0,5 unitati McFarland 3. Timp de incubare 37 grade C => 18-20h 4. Microcomprimatele cu antiobiotic diametru: 6 mm 8 comprimate/placa => 8 zone de inhibitie depunere: manuala, automana (dispencer) 5. Interpretare: masurarea zonei de inhibitie in mm => corelatii cu tabel Tehnica de lucru inocularea unei bacterii intinderea bacteriei pe placa depunerea comprimatelor antibioticul difuzeaza => se formeaza cercuri. Daca nu exista cercuri => zona de inhibitie este de 6 mm, nu de 0 mm! citire cu rigla => comparare cu tabel = CRITERIUL pentru determinarea antibiogramei 61. Definiti notiunea de CMI si CMB. Cum se determina si care este utilitatea. CMI = concentratia minima inhibitorie. Cea mai mica concentratie de antibiotic care determina inhibitia dezvoltarii unei culturi bacteriene. => efect bacteriostatic CMB = concentratia minima bactericida. Cea mai mica concentratie de antibiotic care determina distrugerea bacteriilor => efect bactericid Determinarea CMI a. in mediu solid se face prin metoda E-Test asemenea metodei difuzimetrice metoda E- test exprim direct, cantitativ, prin valori CMI, gradul de sensibilitate microbian se adauga pe mediu un strip de plastic, marcat pe scara valorilor MIC n g/ml. dupa difuzia antibioticului se citeste diametrul zonei de inhibitie pe striperul de plastic se compara cu tabel b. in mediu lichid in bulion Mueller-Hinton se prepara dilutii binare de antibiotic (descrescator) in fiecare tub se adauga cant. fixa de inocul se folosesc martori+ si martori- incubare 18-20h, 37 grade C ultimul tub ramas limpede = CMI Determinare CMB se fac treceri pe medii solide din tuburile ramase vizibil limepezi (de la det. CMI) CMB corespunde ultimei concentratii de antibiotic care a determinat distrugerea completa a bacteriilor (efect bactericid) Indicatiile determinarii CMI: Infectii sistemice, grave: septicemii, endocardite, meningite purulente, osteomielite etc. 62. Definiti notiunile de simbiozia, comensalism, parazitim; exemple ntre organismul uman si microorganisme (bacterii, virusuri, fungi, protozoare) se stabilesc relatii care pot fi de comensalism, mutualism si parazitism. Comensalismul este o asociatie n care un microorganism foloseste ca mediu de viata un alt organism fara sa-l prejudicieze. Omul este gazda unei flore comensale foarte bogate, prezenta pe piele, mucoase, tract digestiv etc. si care alcatuieste flora normala. Simbioza (Mutualismul) este o relatie care se stabileste n beneficiul ambilor parteneri ai asociatiei. De exemplu, ntre bacilii lactici si gazda umana exista un beneficiu reciproc: vaginul ofera conditii de viata bacililor lactici iar acestia la rndul lor acidifica, mediul mpiedicnd dezvoltarea altor microorganisme. Parazitismul este o relatie care se stabileste n mod cert n beneficiul microorganismului si n detrimentul gazdei umane. Din aceasta categorie fac parte microorganismele patogene. Parazitismul consta n folosirea unei specii de catre o alta specie ca habitat. Exista multe forme de parazitism ntre microorganisme, dar din punct de vedere medical importante sunt virusurile care paraziteaza bacterii (bacteriofagii). Prin relatiile care se stabilesc ntre bacteriofagi si celulele parazitate se pot raspndi diverse caractere, dintre care de interes medical sunt cele legate de patogenitatea si rezistenta la antibiotice ale bacteriilor. Subliniem, nsa, ca acestor tipuri de relatii nu le corespund grupe taxonomice fixe de microorganisme, deoarece relatiile ce se stabilesc depind n egala masura de gazda umana. Astfel, n anumite conditii, relatia de comensalism sau mutualism poate sa se transforme ntr-o relatie de parazitism cu efecte nefavorabile asupra gazdei. Asadar, microorganismele nu se pot clasifica rigid din punct de vedere al patogenitatii, deoarece n anumite conditii acelasi microorganism stabileste relatii diferite cu gazda umana. 63. Definiti patogenitatea si virulenta; exemple de factori de patogenitate Patogenitatea este un proces complex si multifactorial, care cuprinde totalitatea mecanismelor biochimice prin care microorganismele produc infectii. Ea este dependenta att de microorganism ct si de gazda n care acesta patrunde. n timp ce unele microorganisme (patogene) produc n mod obisnuit infectii la indivizii neimunizati dar cu rezistenta naturala intacta, altele (oportuniste) produc infectii doar la indivizi cu barierele apararii naturale compromise. Virulenta este gradul de patogenitate a unei tulpini n cadrul speciei. Spre deosebire de patogenitate, care este un caracter de specie, virulenta este un caracter de tulpina. De exemplu, n cadrul speciei Corynebacterium diphteriae exista specii toxigene virulente si