Capitolul 3 - SCOPUL LUCRRII

n prezent sunt cunoscute dou tipuri de toxiinfecii alimentaredeterminate de Bacillus cereus: tipul vomitiv, determinat de o toxin cu efectemetizant (o polipeptid ciclic numit i cereulid) i tipul diareic, determinatde cel puin trei enterotoxine (enterotoxina NHE, hemolizina BL ienterotoxina T).Bacillus cereus este o bacterie Gram pozitiv, sporulat, aerob saufacultativ anaerob, izolat relativ frecvent din sol, ap, aer i din alimente, n ceea ce privete alimentele Bacillus cereus este cunoscut ca agent spoliator dar mai ales ca agent etiologic al toxiinfecii lor alimentare.Abilitatea de a sporula i de a crete la temperaturi sczute constituiefactori care contribuie la incidena crescut a bacteriilor din aceast specie n produsele alimentare de origine vegetal i animal, iar echipamentul enzimatic bogat determin reducerea considerabil a conservabilitii acestor produse.Bacillus cereus este strns nrudit cu alte specii ale genului Bacillus (B.anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis), nrudire manifestat prin asemnri morfologice, biochimice i chiar genetice, fiind, deseori, dificil de difereniat de acestea.Escherichia coli este o bacterie comun ce se gsete n mod obinuit n tubul digestiv al omului i al animalelor cu snge cald. Majoritatea tulpinilor de Escherichia coli sunt nepatogene. cu toate acestea, sunt tulpini, printre care i Escherichia coli O157H7 (EHEC) care produc mbolnviri severe. Aceast tulpin se transmite la om prin consumul de alimente contaminate, cum ar fi carnea de vit consumat crud sau insuficient tratat termic sau laptele crud de vac. Escherichia coli O157H7 a devenit o problem de sntate public n adevratul sens al cuvntului n anul 1982, Escherichia coli O157H7 produce toxine cunoscute sub denumirea de verotoxine sau Shiga-like toxine deoarece sunt similare cu toxinele produse de Shighella dysenteriae. Escherichia coli O157H7 se dezvolt la temperaturi cuprinse ntre 7 C i 50 C cu un optim de temperatur de 37 C; se dezvolt n alimente acide-la un pH de 4,4, precum i n alimente cu un coninut sczut de ap. Este distrus prin tratarea termic a alimentelor, astfel nct temperatura n interiorul produsului s ating 70 C. Escherichia coli O157H7 reprezint serotipul de referin al grupului de bacterii enterohemoragice n relaie cu sntatea public, fiind cel mai des implicat n episoade de toxiinfecii alimentare.Avnd n vedere aceste detalii, am considerat oportun s efectum un studiu care s ne dea informaii referitoare la gradul de contaminare a alimentelor de origine animal (carne de vit i carne tocat de vit, precum i telemeaua de vac i produsele lactate).n intervalul de timp luat n discuie s-au analizat un numr total de 181 probe, reprezentnd cele trei tipuri de matrici. probele au fost recoltate din uniti de procesare carne sau lapte i de la productori particulari.Probele recoltate se individualizeaz prin etichetare, se ambaleaz separat, astfel nct s nu se deterioreze n timpul transportului i se sigileaz pentru a mpiedica substituirea acesteia. Apoi se trimit la laborator, n condiii care s nu determine modificri ale nsuirilor avute n momentul recoltrii.

Capitolul 4 MATERIAL I METODE

n perioada ianuarie 2011 - aprilie 2011 au fost examinate 210 probe delapte i produse lactate, precum i 180 de probe de carne de vit, carne tocat de vit i telemea vac recoltate de la diferii comerciani, care aveau lavnzare aceste produse pentru consum sau pentru prepararea unor produseca materii prime. Probele au fost recoltate n funcie de specificul alimentului,cu respectarea condiiilor care s previn modificarea caracteristiciloracestora. Probele au fost pstrate la temperatura de refrigerare pn laanalizare. Probele au fost examinate n vederea izolrii, identificrii icaracterizrii biochimice a tulpinilor de Bacillus cereus i Escherichia coli O157H7 din alimente-carne de vit, carne tocat de vit i telemea de vac.

4.1 Izolarea, identificarea i caracterizarea biochimic a unor tulpini deBacillus cereus izolate din lapte i produse lactatePentru izolarea i identificarea tulpinilor de Bacillus cereus s-a folosit metoda SR-ISO 7932/1997. Confirmarea coloniilor caracteristice,dezvoltate pe mediul MEYP dup incubare la 30 C timp de 24 ore, s-a realizat pe baza caracterelor morfologice, culturale i prin testareafermentrii glucozei, a reducerii nitrailor i a producerii de acetil-metil-carbinol.Gradul de contaminare cu B. cereus s-a determinat prin metodadescris n SR-ISO 7932/1997.Pentru completarea identificrii s-au aplicat teste API, iar pentrudiferenierea speciei B. cereus de speciile nrudite (B. anthracis, B. mycoidesi B. thuringiensis) s-au folosit testul pentru evidenierea activitii hemolitice,testul pentru motilitate i testul pentru identificarea oxidazei.Caracterizarea biochimic a tulpinilor de Bacillus cereus izolate s-arealizat cu ajutorul sistemul de teste API (API 50CHB i API 20E), testndu-se, n principal, metabolismul hidrailor de carbon dar i alte caracteristicimetabolice ale acestora. Interpretarea rezultatelor obinute n urma efecturii testelor API s-a fcut computerizat, folosind programul APLIAB 3,2 (bio Merieux Frana) (fig. 2, 3 i 4). Figura. 2 Colonii mari, neregulate de nconjurate de Figura. 3 Colonii mari cu margini aproape ; zon hemolitic larg regulate

Figura. 4 Teste

Examinarea probelor de lapte i produse lactate a condus la izolareaunui numr de 41 de tulpini prezumtive de B. cereus din care, prin proceduradescris de metoda standard, au fost confirmate ca fiind B. cereus 37 detulpini (92,6%). Cele trei tulpini prezumtive neconfirmate, au fost izolate dinlapte crud (2 tulpini) i din lapte pasteurizat (1 tulpin). Aceste tulpini aufurnizat rezultate negative fie la testul pentru reducerea nitriilor, fie la testulVoges Proskauer, fie la ambele teste (tab. 7).n urma examinrii prin teste API a 17 tulpini de B. cereus din cele 37de tulpini confirmate prin metoda standard, au fost nregistrate dou tipuride rezultate: fie sistemul a propus numai o specie (B. cereus), procentulde identificare fiind mare (peste 90%), fie a propus dou sau chiar trei specii,din cadrul grupului B. cereus, cu procente de identificare mai mici.

Tabelul nr.7

Nr.crt.Alimentexami-natNr. probeexami-nateTulpiniTulpiniTulpini neconfirmateTotalDin care:Nr.Nr.%Nr.%VP-Nit-Glu-1.Lapte crud42121083,3216,61102.Lapte405480,0120,01103.Lapte praf321212100000004.Lapte UHT12000000005.Smntn3533100000006.Brnz vaci395510000000TOTAL200373492,637,4220Izolarea i identificarea tulpinilor de Bacillus cereus prin metoda SR ISO 7932/1997

n primul caz, specia a fost considerat identificat dar n cel de-al doilea caz s-au efectuat teste de fifereniere a speciilor nrudite. Rezultatele au confirmat apartenena la specia B. cereus a tuturor celor 17 tulpini testate.

Identificarea tulpinilor de bacillus cereus prin sistemul de teste APITabelul nr. 8

Tulpina i sursade infestare

% idTSpeciaprezumtivTeste de difereniereRezultatfinal

Mobilita-teOxidazaHemoliza

Lapte crud

Proba 193,80,43B. cereus+-+B.

Proba 263,5/36,30,82/0,83B. cereus/B.++B.cereus

Proba 376,6/22,80,46/0,37B. cereus/B.++B.cereus

Proba 481,9/16,1/0,93/0,91B. cereus/ B.++B.cereus

Lapte pasteurizat

Proba 199,90,45B. cereus+-+B.

Proba 263,9/36,10,90/ 0,84B.mycoides++B.cereus

Lapte praf

Proba 197,00,57B. cereus+-+B.

Proba 299,00,63B. cereus+-+B.

Proba 349,1/41,20,88/0,86B.mycoides+-+B.cereus

Proba 495,40,65B. cereus+-+B.

Brnz de vaci

Proba 193,90,55B. cereus+-+B.

Proba 246,8/35,9/17,30,72/0,6 1 / 0,60B.mycoides/B. cereus++B.cereus

V. Smntn consum

Proba 198,50,62B. cereus+-+B.

Prevalena speciei B. cereus n alimentele examinate a variat ntre8,5% i 37,5%. Prevalenta cea mai mare s-a constatat la probele de laptepraf i la cele de urd.Dei prevalena speciei B. cereus n alimentele examinate este relativridicat, gradul de contaminare este redus, rareori depind valori deordinul 103-104/g. Valorile cele mai mari s-au gsit la urd i la laptele praf(tab. 9).Gradul de contaminare cu Bacillus cereus a probelor de alimente examinateTabelul nr. 9

Nr.Crt.DenumireaprodusuluiNr. probeexaminateNr. probepozitive(%)Intervalul ncare avariat nr.de B.Nr. probelor pozitive (%) nfuncie de nivelul decontaminare*Limitamax.conf.ord.