impactul unor tulpini rizobacteriene asupra …...în scopul aprecierii efectelor induse de...
TRANSCRIPT
UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA” IAŞI FACULTATEA DE BIOLOGIE
PROIECT IDEI nr. 249/01.10.2007, COD CNCSIS 440
IMPACTUL UNOR TULPINI RIZOBACTERIENE ASUPRA PROCESELOR DE CRESTERE SI
DEZVOLTARE LA PLANTE DE SOIA (GLYCINE MAX L. MERR.)
- sinteză lucrare fază unică 2009 -
Director proiect, Lect. dr. Ştefan Marius
2
1. INSAMINTAREA IN LOTURI EXPERIMENTALE A MATERIALULUI SEMINCER INOCULAT CU PGPR
3
1.1. Obţinerea biopreparatelor pe baza de PGPR 3 1.2. Inocularea boabelor de soia in vederea însămânţării în câmp 3 1.3. Înfiinţarea şi întreţinerea dispozitivelor experimentale conform protocolului experimental 3
2. STUDIUL INFLUENTEI PGPR ASUPRA DEZVOLTARII IN VIVO A PLANTELOR DE SOIA IN DIFERITE FAZE ONTOGENETICE
4
2.1. Determinarea activităţii unor markeri enzimatici (catalaza, superoxidismutaza) 4 2.2. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori în ţesuturile foliare 7 2.3. Determinarea conţinutului de glucide reducătoare solubile în boabele recoltate 8 2.4. Determinarea conţinutului de lipide totale în boabele recoltate 8 2.5. Determinarea conţinutului de proteine solubile totale în boabele recoltate. 8 2.6. Analiza unor parametri biometrici (înălţimea plantei, nr. de frunze, suprafaţa foliară) 9
3. APRECIEREA PRODUCTIEI/HA 12 3.1. Determinarea MMB 13 3.2. Determinarea MH 13 3.3. Determinarea nr. de plante/ha (densităţii) 13 3.4. Determinarea nr. mediu de păstăi/plantă 13 CONCLUZII 14 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 14
3
Numeroase studii au demonstrat că unele bacterii asociate suprafeţelor radiculare pot stimula creşterea şi dezvoltarea plantelor de soia [6, 9, 12], fiind numite din acest motiv „plant growth-promoting rhizobacteria” (PGPR).
Mecanismele prin care rizobacteriile pot stimula creşterea şi dezvoltarea plantelor nu sunt încă pe deplin elucidate, cunoscându-se însă faptul că ele pot include:
1. capacitatea de a produce fitohormoni: acid indolilacetic, acid giberelic, citokinine [9]; 2. fixarea azotului atmosferic [11]; 3. stimularea formării de nodozităţi active fixatoare de azot [5]; 4. reducerea sau prevenirea efectelor dăunătoare cauzate de fitopatogeni [18], producând ß-1,3-
glucanază [8], chitinază [14], antibiotice [17] etc; 5. solubilizarea fosforului anorganic şi a altor nutrienţi [7]. Deoarece soia reprezintă o plantă cu o valoare economică deosebită şi pentru că diferite tipuri de
tratamente chimice se aplică atât pe materialul semincer cât şi în vegetaţie, investigaţiile noastre au fost realizate în scopul aprecierii efectelor induse de utilizarea unor tulpini rizobacteriene (izolate şi caracterizate pe parcursul fazei din 2008 a prezentului contract) asupra creşterii şi dezvoltării plantelor de soia în condiţii ecologice (nu s-au utilizat îngrăşăminte, nu s-au aplicat pesticide sau alte tipuri de tratamente chimice pe parcursul desfăşurării experimentelor). 1. ÎNSĂMÂNŢAREA ÎN LOTURI EXPERIMENTALE A MATERIALULUI SEMINCER INOCULAT
CU PGPR
1.1. Obţinerea biopreparatelor pe bază de PGPR
Cinci tulpini rizobacteriene: Bacillus macerans Rs1, Bacillus macerans Rs2, Bacillus pumilus Rs3, Bacillus pumilus Rs4 şi Arthrobacter globiformis Rs5, izolate din rizosfera plantelor de soia, au fost utilizate pentru obţinerea unui biopreparat. Toate tulpinile au prezentat capacitatea de a solubiliza fosforul anorganic şi au demonstrat activitate antimicrobiană faţă de o serie de bacterii test: (Staphylococcus aureus ATCC - 6538p, Bacillus cereus ATCC – 9634, Pseudomonas aeruginosa Ip – 5838, Escherichia coli ATCC – 10536). Deoarece rizobacteriile răspund diferit după inoculare la condiţiile de mediu [15], s-a preferat utilizarea unui amestec din cele 5 tulpini în vederea obţinerii efectului de stimulare a creşterii plantelor de soia. Fiecare tulpină a fost cultivată separat pe mediu lichid Bunt Rovira, în baloane de 2000 ml, agitate (210 rpm) la temperatura de 270 C. După cinci zile au fost subcultivate în aceleaşi condiţii ca cele descrise anterior. Înainte de inocularea boabelor de soia, volume egale din cele cinci subculturi rizobacteriene au fost amestecate, fiind lăsate apoi 30 min la temperatura camerei, obţinându-se astfel o densitate celulară de 6,4 x 107 UFC/ml.
1.2. Inocularea boabelor de soia în vederea însămânţării în câmp Boabele de soia (Pioneer PR91M10/91M10) au fost iniţial pregătite pentru semănare folosind metoda
descrisă de Bhuvaneswari et al. [3], ce cuprinde o etapă de sterilizare cu hipoclorit de sodiu (2 % conţinând 4 ml/l Tween 20) şi una de spălare cu apă distilată sterilă. Boabele probă au fost ulterior inoculate prin spălare rapidă cu suspensia alcătuită din cele cinci tulpini rizobacteriene, în timp ce boabele lotului martor au fost trecute rapid prin apă distilată sterilă. După uscare, toate boabele au fost transportate în condiţii sterile la locul însămânţării.
1.3. Înfiinţarea şi întreţinerea dispozitivelor experimentale conform protocolului experimental
Experienţa de tip monofactorial a fost amplasată în com. Botesti, jud. Vaslui, fiind realizată după metoda blocurilor randomizate în 4 repetiţii, suprafaţa unei parcele fiind de 40 m2 (Foto 1). S-a utilizat o rotaţie de doi ani soia – porumb.
FACTORI EXPERIMENTALI V1 – Martor netratat V2 – varianta inoculată cu rizobacterii În toamna anului 2008 s-a efectuat lucrarea de bază a solului (arătură la 25 cm adâncime), cu plugul
reversibil în agregat cu Tractorul Valtra. Pregătirea patului germinativ în primăvara anului 2009 s-a realizat cu combinatorul Lemken în agregat
cu tractorul Valtra în preziua semănatului. Semănatul s-a realizat cu SPC-6+U650, utilizându-se o normă de sămânţă (Pioneer PR91M10/91M10) de 90 kg/ha (450.000 boabe/ha).
Înainte de semănat s-a realizat inocularea cu biopreparatul format din cele 5 tulpini rizobacteriene pentru varianta V2. Nu s-au administrat îngrăşăminte organo-chimice şi nici erbicide preemergente. Combaterea
4
buruienilor s-a realizat numai prin praşile mecanice fără a utiliza nici un fel de produs chimic. Ulterior s-a urmărit răsărirea şi dezvoltarea plantelor pe întreaga perioadă de vegetaţie. Periodic s-au recoltat probe de plante şi sol în vederea efectuării determinărilor biochimice şi analizele de productivitate, iar în teren s-au efectuat măsurători morfometrice şi biometrice ale plantelor, diferenţiat pentru fiecare variantă în parte.
Foto 1 – Amplasarea loturilor experimentale pe parcursul anului 2009
2. STUDIUL INFLUENŢEI PGPR ASUPRA DEZVOLTĂRII IN VIVO A PLANTELOR DE SOIA ÎN
DIFERITE FAZE ONTOGENETICE
Pentru aprecierea influenţei exercitate de tulpinile rizobacteriene asupra dezvoltării in vivo a plantelor de soia, ne-am propus investigarea unor markeri biochimici şi ai unor parametri biometrici. În acest sens au fost prelevate probe medii reprezentate din frunze complet formate şi s-au efectuat măsurători în diferite faze ale dezvoltării ontogenetice a plantelor de soia:
- 7.07.09 – vegetaţie - 14.07.09 – vegetaţie - început înflorire - 30.07.09 – înflorire - 12.08.09 – fructificare - 14.08.09 – fructificare
2.1. Determinarea activităţii unor markeri enzimatici (catalaza, superoxidismutaza) Este cunoscut faptul că în cursul etapelor de fosforilare oxidativă din cadrul procesului de respiraţie,
transferul electronilor în cadrul lanţului transportor de electroni nu este 100 % eficient [13]. Pierderile de electroni duc întotdeauna la formarea de specii reactive de oxigen (ROS). Apariţia acestora este deci normală şi până la un punct, este direct proporţională cu capacitatea celulei de a produce ATP, deci cu nivelul energetic al acesteia. Recent s-a demonstrat de asemenea că nivele crescute de ROS în celule duc la inhibarea procesului de fotosinteză [10].
În cadrul experimentelor realizate, singura sursă de ROS o reprezintă respiraţia. Chiar dacă, prin activitatea lor din sol, rizobacteriile utilizate ar putea genera ROS, este foarte puţin probabil ca aceste specii reactive de oxigen să ajungă în frunze, în special datorită timpului de înjumătăţire extrem de mic.
Ţinând cont de aceste elemente, enzimele implicate în neutralizarea speciilor reactive de oxigen devin indicatori preţioşi în primul rând al metabolismului energetic al celulei şi în al doilea rând al capacitaţii de apărare împotriva stresului oxidativ.
Enzimele folosite ca indicatori au fost catalaza (determinată prin metoda cu bicromat de potasiu descrisă de Artenie şi colab. [2]) şi superoxidismutaza (folosind metoda cu riboflavină descrisă Artenie şi colab. [2]).
Inocularea cu rizobacterii a boabelor de soia înainte de germinaţie nu determină modificări semnificative ale activităţii catalazei (Fig. 1) şi nici ale superoxid-dismutazei (Fig. 2) pe parcursul dezvoltării vegetative. Aceste observaţii pot indica intensităţi asemănătoare ale proceselor respiratorii în plantele probă şi martor.
În plus, faţă de activităţile prevăzute în planul de realizare, s-au efectuat investigaţii şi în ceea ce priveşte metabolismul proteinelor la plantele de soia. Această alegere este motivată de faptul că importanţa economică a plantei investigate rezidă tocmai din capacitatea ei de a depozita în seminţe cantităţi mari de proteine. În acest scop s-au determinat, pe de o parte, cantitatea de proteine totale solubile din frunze (folosind
5
metoda Bradford [4], iar pe de altă parte, două enzime importante din calea de biosinteză a aminoacizilor: alanin-aminotransferaza şi aspartat-aminotransferaza, folosind metoda propusă de Artenie şi colab.[1].
0
5
10
15
20
25
30
35
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09
data recoltarii
mic
roM
/min
/g
MartorProba
Fig. 1 - Variaţia activităţii catalazei în ţesuturile foliare pe parcursul dezvoltării plantelor de soia
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09
data recoltarii
USO
D/m
g MartorProba
Fig. 2 - Variaţia activităţii superoxid-dismutazei în ţesuturile foliare pe parcursul dezvoltării
plantelor de soia
Analizând datele prezentate în Fig. 3 se pot observa o serie de diferenţe înregistrate între plantele martor şi cele inoculate cu PGPR în ceea ce priveşte conţinutul de proteine totale solubile. Dacă în etapele de creştere vegetativă şi de înflorire diferenţele sunt nesemnificative, pe parcursul procesului de fructificare (14.08.09) se poate observa o creştere semnificativă statistic a concentraţiei proteinelor în ţesuturile foliare ale plantelor probă (p<0,033).
0
20
40
60
80
100
120
140
7 iulie 09 14 iulie 09 12 august 09 14 august 09
data recoltarii
mg/
ml Martor
Proba
Fig. 3 - Conţinutul de proteine totale solubile din ţesuturile foliare ale plantelor de soia
6
Analiza calitativă a proteinelor solubile folosind electroforeza în condiţii denaturante (SDS-PAGE în sistemul de soluţii tampon al lui Laemli) [16] – Foto 2 – demonstrează de asemenea că nu există diferenţe semnificative între variantele experimentale.
În ceea ce priveşte activitatea aspartat şi alanin aminotransferazelor (Fig. 4, Fig. 5), nu s-au evidenţiat diferenţe statistic semnificative între cele doua variante experimentale. Se pare totuşi că există o oarecare sincronizare între activităţile celor două enzime analizate. În cazul alanin-aminotransferazei, datele înregistrate în iulie (momentul înfloririi şi începutul fructificaţiei) demonstrează o activitate mai intensă în cazul martorului comparativ cu proba. Odată cu luna august, corespunzătoare momentului fructificării, asistăm la o creştere a activităţii acestei enzime în ţesuturile foliare ale probei comparativ cu martorul. În cazul aspartat-aminotransferazei situaţia este opusă, martorul prezentând nivele ale activităţii acestei enzime mai reduse în luna iulie, respectiv mai ridicate în luna august comparativ cu proba.
0
50
100
150
200
250
300
350
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09
data recoltarii
mic
roM
piru
vat /
min
/g
MartorProba
Fig. 4 - Variaţia activităţii alanin-aminotransferazei în ţesuturile foliare pe parcursul dezvoltării plantelor
de soia Alanin-aminotranferaza se constituie ca o legătură între metabolismul glucidelor şi cel al proteinelor
prin intermediul acidului piruvic [13]. Din acest considerent am ales să determinăm suplimentar concentraţia de glucide reducătoare solubile în frunze prin metoda cu acid dinitrosalicilic [2].
Dinamica activităţii alanin-aminotranferazei descrisă anterior poate fi corelată atât cu concentraţia glucidelor solubile (Fig. 6) cât şi cu cea a proteinelor solubile determinate în frunze.
Foto 2 – Analiza electroforetică a extractelor de proteine solubile din frunzele de soia
M - marker de masă moleculară 1,3,5,7 – plante inoculate cu PGPR 2,4,6,8 - plante martor, neinoculate
7
0
5
10
15
20
25
30
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 12 august 09 14 august 09
data recoltarii
mic
roM
piru
vat /
min
/g
Martor
Proba
Fig. 5 - Variaţia activităţii aspartat-aminotransferazei în ţesuturile foliare pe parcursul dezvoltării
plantelor de soia 2.2. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori în ţesuturile foliare Determinarea conţinutului de clorofilă a, b şi caroteni s-a realizat prin metoda spectrofotometrică
descrisă de Artenie şi colab. [1], folosind acetonă ca solvent extractant. În condiţiile agro-climatice ale anului 2009, inocularea boabelor de soia cu rizobacterii a influenţat nesemnificativ statistic concentraţia pigmenţilor asimilatori în perioada premergătoare înfloririi (Fig. 7).
0
2
4
6
8
10
12
14
7 iulie 09 14 iulie 09 30 iulie 09 14 august 09
data recoltarii
mg/
g gl
ucoz
a MartorProba
Fig. 6 – Concentraţia glucidelor reducătoare solubile în frunzele de soia
151,92
46,12
80,63
143,21
48,60 76,29
0
50
100
150
200
250
clorofilă a clorofilă b caroteni
mg
% m
at. v
eg.
martorprobă
Fig. 7 – Concentraţia pigmenţilor asimilatori în frunzele de Glycine max (L.) Merr. - perioada creşterii
vegetative (valorile sunt medii ± E.S.M., n=5/lot)
8
La momentul înfloririi, conţinutul de pigmenţi asimilatori în frunzele plantelor de soia a variat între 149,61 mg % clorofilă a, 51,82 mg % clorofilă b, 63,42 mg % caroteni (martor) şi 180,56 mg % clorofilă a, 68,37 mg % clorofilă b, 79,43 mg % caroteni (probă) – Fig. 8. Aplicarea testului „T” a demonstrat existenţa unor diferenţe semnificative între martor şi probă (p < 0,04 - clorofilă a, p < 0,009 - clorofilă b şi p < 0,04 - caroteni), ceea ce poate demonstra o intensificare a proceselor de fotosinteză ca urmare a prezenţei pe suprafaţa rădăcinilor a tulpinilor bacteriene testate.
2.3. Determinarea conţinutului de glucide reducătoare solubile în boabele recoltate Din motive obiective (necorelarea perioadei de recoltare cu cea de raportare), în cele ce urmează vom
prezenta date obţinute pe parcursul anului 2008 când au fost derulate experimente similare. Pentru determinarea conţinutului de glucide reducătoare din seminţele recoltate s-a metoda cu acid
dinitrosalicilic [2]. Experienţele au demonstrat că nu există diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte conţinutul de glucide reducătoare între variantele experimentale (Tabel 1).
63,4251,82
149,61
79,4368,37
180,56
0
50
100
150
200
250
clorofilă a clorofilă b caroteni
mg
% m
at. v
eg.
martorprobă
* *
*
Fig. 8 – Concentraţia pigmenţilor asimilatori în frunzele de Glycine max (L.) Merr. la momentul înfloririi:
*p < 0,04, **p < 0,009, *p < 0,04 faţă de martor (valorile sunt medii ± E.S.M., n=5/lot)
Tabel 1. Indicatori biochimici investigaţi
Indicator biochimic Martor neinoculat (media ± eroarea
standard)
Probă inoculate cu PGPR (media ± eroarea
standard)
P(T<=t) two-tail
Concentraţia de glucide reducătoare solubile (mg glucoză/g)
2,44 ± 0,087 2,53 ± 0,08 0,47
Conţinut de proteine solubile (mg/g) 425,52 ± 6,22 438,13 ± 3,87 0,002 Conţinut de lipide (%) 22,08 ± 0,39 21,76 ± 0,28 0,52 Umiditatea relativă (%) 6,02 ± 0,06 6,13 ± 0,077 0,31
2.4. Determinarea conţinutului de lipide totale în boabele recoltate Utilizarea unui aparat Soxlet pentru extracţia lipidelor folosind eter de petrol urmată de determinarea
gravimetrică a materialului extras [2] nu a evidenţiat modificări statistic semnificative ale conţinutului de lipide totale în boabele recoltate de la plante probă comparativ cu martorul (Tabelul 1).
2.5. Determinarea conţinutului de proteine solubile totale în boabele recoltate Proteinele solubile din seminţele de soia au fost extrase folosind tampon TRIS/HCL, pH 7,01,
concentraţia lor fiind măsurată folosind metoda Bradford [16]. Determinările efectuate demonstrează că utilizarea PGPR pentru inocularea seminţelor poate duce la o
creştere a concentraţiei proteinelor în boabele recoltate de la plantele probă comparativ cu martorul (Fig. 9), diferenţele înregistrate fiind semnificative statistic (p<0,002).
Analiza extractelor proteice prin SDS-PAGE a demonstrat faptul că nu apar diferenţe de natură calitativă între cele două tipuri de boabe supuse analizelor (Foto 3), deci diferenţele cantitative pot fi puse doar pe seama creşterii ratei de acumulare a proteinelor normale în seminţe. Din acest punct de vedere, folosirea
9
PGPR ca biofertilizatori poate prezenta un avantaj economic deosebit faţă de metodele clasice, permiţând creşterea concentraţiei de proteine din boabele de soia.
405
410
415
420
425
430
435
440
445
Prot
eine
sol
ubile
(mg/
g B
SA)
MartorProba
Fig. 9 - Concentraţia proteinelor totale solubile în seminţele de Glycine max (L.) Merr.
2.6. Analiza unor parametri biometrici (înălţimea plantei, nr. de frunze, suprafaţa foliară) Înălţimea plantelor Pe parcursul perioadei de vegetaţie, activitatea rizobacteriilor inoculate au determinat o creştere a
înălţimii plantelor de soia (Fig. 10).
15
30
45
60
75
90
25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009 12 08 2009
cm
probamartor
Fig. 10 – Efectele inoculării cu rizobacterii asupra înălţimii plantelor de soia
Foto 3 – Analiza electroforetică a extractelor de proteine solubile din frunzele de soia
M - marker de masă moleculară S - plante inoculate cu PGPR C - plante martor, neinoculate
10
Diferenţele înregistrate între cele două variante experimentale sunt statistic semnificative (p≤0.005) pe întreaga durată a desfăşurării experimentelor: p<0.0004 (25.06.2009), p<0.00001 (07.07.2009), p<0.002 (14.07.2009), p<0.012 (30.07.2009), p<0.015 (12.08.2009).
Numărul de frunze Prezenţa tulpinilor rizobacteriene testate a determinat o stimulare a dezvoltării aparatului foliar (Fig. 11).
Deşi numărul de frunze la plantele lotului probă a fost mai mare comparativ cu cele martor pe întreaga durată a derulării experimentelor, diferenţele au fost statistic semnificative doar în primele faze ale dezvoltării vegetative (25.06.2009, 07.07.2009).
0
5
10
15
20
25
30
25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009 12 08 2009
număr
ul d
e fru
nze
probamartor
Fig. 11 – Efectele inoculării cu rizobacterii asupra numărului de frunze
O altă observaţie efectuată pe durata derulării experimentelor in vivo este legată de faptul că plantele
lotului probă au înflorit mai devreme comparativ cu plantele martor. Acest decalaj în dezvoltarea celor două tipuri de plante de soia ar putea fi determinat de efectul indus de activitatea rizobacteriilor testate. După momentul înfloririi, strategia de dezvoltare se modifică, toate resursele nutritive ale plantei fiind îndreptate către formarea florilor şi procesul de fructificare. În acest sens, creşterea vegetativă scade în intensitate, numărul de frunze rămânând practic constant. Acest parametru biometric devine, după înflorire, lipsit de semnificaţie pentru stabilirea efectului indus de utilizarea rizobacteriilor, fapt demonstrat şi de evoluţia sa marcată în Fig. 11, diferenţele înregistrate în fazele târzii (14.07.2009, 30.07.2009, 12.08.2009) fiind nesemnificative statistic.
Suprafaţa foliară Pentru aprecierea suprafeţei foliare s-a măsurat mereu foliola centrală a ultimei frunze complet formate
(Foto 4), utilizându-se metoda planimetrică. Pe durata desfăşurării experimentelor în câmp s-a observat că utilizarea rizobacteriilor determină creşterea suprafeţei foliare comparativ cu plantele lotului martor. Diferenţele înregistrate între cele două variante experimentale au fost semnificative statistic – Fig. 12.
Foto 4 – Modalitatea de apreciere a suprafeţei foliare la plantele de soia cultivate in vivo
11
0
10
20
30
40
50
60
70
25.06.2009 07.07.2009 14.07.2009 30.07.2009 12 08 2009
cm2
proba
martor
Fig. 12 – Efectele inoculării cu rizobacterii asupra suprafeţei foliare
Analiza indicilor biometrici utilizaţi demonstrează că inocularea cu rizobacterii, în condiţiile neutilizării
fertilizanţilor, poate stimula creşterea şi dezvoltarea plantelor de soia. În cadrul experimentelor realizate, plantele inoculate s-au dezvoltat mai bine pe înălţime, au prezentat un număr mai mare de frunze şi o suprafaţă foliară mai bine reprezentată. Pe lângă aceasta, rizobacteriile testate au dus la o dezvoltare ontogenetică mai rapidă a plantelor provenite din seminţe inoculate.
Aceste rezultate ne îndreptăţesc să afirmăm că tulpinile rizobacteriene testate de noi ar putea fi utilizate ca biofertilizatori - premisă a practicării unei agriculturi ecologice.
Rezultatele obţinute în condiţiile noastre experimentale confirmă informaţiile prezentate în literatura de specialitate. Astfel, o serie de autori [7], [18] menţionează efectul benefic al bacteriilor din rizosfera plantelor în procesele de creştere şi dezvoltare.
În plus faţă de indicii biometrici prevăzuţi iniţial în planul de realizare, s-a urmărit şi influenţa
rizobacteriilor testate asupra procesului de formare al nodozităţilor fixatoare de azot (numărul de nodozităţi active).
Tulpinile bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia şi inoculate ulterior pe suprafaţa boabelor au determinat creşterea numărului de nodozităţi fixatoare de azot la plantele investigate. Determinările efectuate au evidenţiat prezenţa unui număr mai mare de nodozităţi active la plantele de soia aparţinând lotului probă (media variind între 59,9 şi 171,5) comparativ cu plantele lotului martor (media variind între 49,4 şi 129,1) - Fig. 13, Foto 5. Diferenţele înregistrate sunt semnificative statistic cu o probabilitate de 0,001001 pentru F (12,10875) > F critic (4,019541).
129,1
49,4
120,359,9
170,7171,5
020406080
100120140160180200
nr. n
odoz
ităţii
act
ive
martor probă
Fig. 13 – Numărul de nodozităţi active la Glycine max (L.) Merr
1 iul. 09 8 iul. 09 30 iul. 09
12
Foto 5 – Influenţa inoculării cu rizobacterii asupra procesului de formare a nodozităţilor fixatoare de
azot: stg. - martor, dr. - probă
Stimularea de către rizobacteriile utilizate a procesului de formare a nodozităţilor pe rădăcinile plantelor de soia poate exercita efecte directe asupra fixării azotului atmosferic şi indirect asupra dezvoltării plantelor prin creşterea cantităţii de azot atmosferic fixat.
Creşterea numărului de nodozităţi ca urmare a utilizări unor microorganisme rizosferice constituie o preocupare a oamenilor de ştiinţă. Astfel Hossain şi Alexander (1984) consideră că adăugarea unor bacterii izolate din rizosfera plantelor de soia are ca prim efect modificarea microbiotei rizosferice cu efecte directe asupra formării nodozităţilor fixatoare de azot. Al-Mallah şi colab. (1990), Dashti şi colab. (1998), Lucas-Garcia şi colab. (2004) evidenţiază, prin studiile efectuate la soia, rolul rizobacteriilor în stimularea procesului de formare a nodozităţilor.
Din datele prezentate anterior se poate observa că diferenţele înregistrate între probă şi martor în cazul
markerilor biochimici nu sunt semnificative din punct de vedere statistic, în timp ce indicii bio-morfo-metrici arată clar efectul de stimulare a creşterii pe care microorganismele testate de noi le au asupra plantelor in vivo. O posibilă explicaţie a acestui fapt o poate constitui sensibilitatea metodelor biochimice utilizate. Este posibil ca diferenţele dintre martor şi probă să nu poată fi decelate prin metodele experimentale folosite. Din acest considerent ne propunem ca în următoarea fază a proiectului să îmbunătăţim şi să selectăm metode şi indicatori noi, cu o mai mare precizie.
3. APRECIEREA PRODUCŢIEI/HA
Din motive obiective (necorelarea perioadei de recoltare cu cea de raportare), în cele ce urmează vom prezenta date obţinute pe parcursul anului 2008 când au fost derulate experimente în câmp similare.
În cazul analizelor de productivitate s-au determinat masa a o mie de boabe (MMB - conform SR 6123/1999), masa hectolitrică (MH - conform SR 6123-2/1999 – utilizând o balanţă tip Buhler MLI 55) şi producţia pentru fiecare variantă în parte exprimată în kg/ha la umiditatea STAS (Axinte M. şi colab., 1992, 1999). De asemenea, s-au făcut măsurători şi determinări biometrice: nr. ramificaţii/plantă, nr. păstăi/plantă, nr. boabe/păstaie, nr. boabe/plantă, în scopul evidenţierii eventualelor diferenţe dintre variantele experimentate (Tabelul 2).
Tabelul 2 - Influenţa tratamentului cu PGPR asupra caracteristicilor biometrice şi a elementelor de productivitate
Producţia Determinare Varianta U.M. % faţă de M
Diferenţa (U.M.)
Semnificaţia statistică
martor 1,95 100,0 - proba 2,30 117,9 0,35 Nr.
ramificaţii/planta DL5% = 0,8 nr./pl
DL1% = 1,4 nr./pl
DL0,1% = 3,1 nr./pl
13
martor 47,6 100,0 - - proba 53,0 111,5 5,45 Nr. păstăi/plantă DL5% = 22,1 nr./pl
DL1% = 40,6 nr./pl
DL0,1% = 90,0 nr./pl
martor 2,3 100,0 - - proba 2,3 100,3 0 Nr. boabe/păstaie
DL5% = 0,1 nr/pas. DL1% = 0,2 nr/pas.
DL0,1% = 0,5 nr/pas.
martor 110,5 100,0 - - proba 123,5 111,7 12,97 Nr. boabe/plantă DL5% = 44,1 b/pl
DL1% = 81,0 b/pl
DL0,1% = 179,4 b/pl
martor 71,2 100,0 - - proba 71,5 100,5 0,37 MH (kg) DL5% = 1,0 kg DL1% = 1,9 kg DL0,1% = 4,3 kg martor 175,9 100,0 - - proba 178,4 101,5 2,55 MMB (g) DL5% = 15,5 g DL1% = 28,4 g DL0,1% = 63,0 g martor 2833 100,0 - - proba 3006 106,1 172,55 Producţie (kg/ha)
DL5% = 608,6 kg/ha DL1% = 1117,7 kg/ha DL0,1% = 2476,6 kg/ha
Elementele de productivitate la cultura de soia prezintă variabilitate sub influenţa factorului studiat dar,
cu diferenţe mici, nesemnificative din punct de vedere statistic. Determinarea MMB Masa a o mie de boabe (MMB) a avut valori foarte apropiate pentru cele două variante studiate (Tabelul
2) fiind cuprinsă între 175,9 - 178,4 g. Se observă o valoare mai mare pentru varianta tratată dar, diferenţa de 1,5% s-a dovedit a fi neasigurată statistic.
Determinarea MH Masa hectolitrică (MH) a fost cuprinsă între 71,2 - 71,5 kg (Tabelul 2). Şi acest indicator a oscilat în
limite foarte restrânse. S-a remarcat totuşi o diferenţă pozitivă în cazul variantei tratate cu PGPR faţă de martorul netratat dar nesemnificativă statistic.
Producţia fizică Producţiile obţinute la cultura de soia au fost cuprinse între 2833 kg/ha la varianta martor şi 3006 kg/ha
în varianta tratată. S-a constatat faptul că varianta tratată a prezentat un spor de producţie important de 172 kg/ha (aprox. 6,1 %) în plus faţă de martor. Totuşi, această diferenţă, pentru anul de experimentare, s-a dovedit a fi neasigurată din punct de vedere statistic.
Determinarea densităţii: nr. de plante/ha Tratamentul la sămânţă nu a influenţat în nici un fel gradul de răsărire al culturi astfel încât nu s-au
semnalat nici un fel de diferenţe între variante din acest punct de vedere. Determinarea nr. ramificaţii/plantă Analizând numărul mediu de ramificaţii/plantă s-a constatat că plantele din varianta tratată s-au
dezvoltat mai puternic vegetativ, numărul de ramificaţii fiind mai mare decât în varianta martor în medie cu 17,9 % în plus. Din punct de vederea statistic, diferenţa nu a fost semnificativă.
Determinarea nr. mediu de păstăi/plantă Şi în acest caz s-au semnalat diferenţe pozitive faţă de martor dar, neasigurate din punct de vedere
statistic. Astfel, plantele din varianta tratată au avut în medie un număr de 53 de păstăi/plantă faţă de numai 47,6 în varianta martor.
Determinarea nr. de boabe/păstaie Numărul mediu de boabe /păstaie a fost egal pentru cele două variante studiate.
14
Determinarea nr. de boabe/plantă Numărul mediu de boabe/plantă a fost mai mare în varianta tratată cu până la 11,7 % faţă de martor
datorită, evident datorită numărului mai mare de păstăi pe care le-au avut plantele din varianta studiată. Şi în acest caz diferenţa s-a dovedit a fi neasigurată din punct de vedere statistic.
CONCLUZII Inocularea cu rizobacterii a boabelor de soia semănate nu determină modificări semnificative ale
activităţii enzimelor analizate (catalază, superoxid-dismutază, alanin-aminotransferază şi aspartat-aminotransferază) pe parcursul dezvoltării vegetative. De asemenea, nu s-au înregistrat diferenţe semnificative de natură cantitativă sau calitativă între variantele experimentale în ceea ce priveşte conţinutul de proteine totale solubile din frunze.
Utilizarea tulpinilor rizobacteriene testate determină o creştere a cantităţii de pigmenţi asimilatori (clorofilă a şi b, caroteni) în ţesuturile foliare, cu efecte directe asupra proceselor de fotosinteză şi implicit asupra cantităţii de glucide solubile reducătoare.
Analiza indicilor biometrici utilizaţi demonstrează o stimulare a proceselor de creştere şi dezvoltare a plantelor probă în condiţiile neutilizării fertilizanţilor. Plantele inoculate cu PGPR s-au dezvoltat mai bine pe înălţime, au prezentat un număr mai mare de frunze, o suprafaţă foliară mai bine reprezentată, un număr mai mare de nodozităţi fixatoare de azot şi au intrat mai rapid în faza de înflorire.
Tratamentul seminţelor de soia cu PGPR a influenţat în mod evident elementele de productivitate. Toate determinările efectuate au scos în evidenţă efectul pozitiv al tratamentului dar, datorită condiţiilor specifice anului de experimentare, diferenţele în general s-au dovedit a fi neasigurate din punct de vedere statistic.
Analiza principalilor compuşi cu valoare nutritivă depozitaţi în seminţele recoltate arată că aplicarea PGPR pe suprafaţa boabelor înainte de însămânţare nu modifică semnificativ conţinutul de glucide reducătoare şi lipide. Acest tratament duce însă la o creştere semnificativă (p<0,002) a cantităţii de proteine depozitate în seminţele obţinute din lotul probă, fără a modifica din punct de vedere calitativ spectrul electroforetic.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Artenie, V., Tanase, E. (1981) Practicum de biochimie generala. Editura Univ Al. I Cuza, Iasi, 2. Artenie, V., Ungureanu, E., Negura, A. M. (2008) Metode de investigare a metabolismului glucidic si lipidic. Editura Pim, Iasi. 3. Bhuvaneswari, T. V., Goodman, R. N., Bauer, W. D. (1980) Early events in the infection of soybean (Glycine max L. Merr.) by Rhizobium japonicum. I. Location of infectible root cells. Plant Physiol. 66, 1027-1031. 4. Bradford, M. M. (1976 ) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Analytical Biochem. 72, 248-254. 5. Cattelan, A. J., Hartel, P. G., Fuhrmann, J. J. (1998) Bacterial composition in the rhizosphere of nodulating and non-nodulating soybean. Soil Science Society of America Journal 62, 1549-1555. 6. Dashti, N., Zhang, F., Hynes, R., Smith, D. L. (1997) Application of plant growth-promoting rhizobacteria to soybean (Glycine max [L] Merr) increases protein and dry matter yield under short-season conditions. Plant and Soil 188, 33-41. 7. De Freitas, J. R., Banerjee, M. R., Germida, J. J. (1997) Phosphate-solubilizing rhizobacteria enhance the growth and yield but not phosphorus uptake of canola (Brassica napus L.). Biol. Fertil. Soils 24, 358-364. 8. Fridlender, M., Inbar, J., Chet, I. (1993) Biological control of soilborne plant pathogens by a ß-1,3-glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biol. Biochem. 25, 1211-1221. 9. Glick, B. R. (1999) Biochemical and genetic mechanisms used by plant growth-promoting bacteria. ICP, River Edge, NJ. 10. Hideg, E., Schreiber, U. (2007) Parallel assessment of ROS formation and photosynthesis in leaves by fluorescence imaging. Photosynth Res 92, 103-108. 11. Jacobson, C. B., Pasternak, J. J., Glick, B. R. (1994) Partial purification and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carbooxylate deaminase from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR 12-2. Can. J. Microbiol 40, 1019-1025. 12. Khalid, A., Arshad, M., Zahir, Z. A. (2004) Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. J Appl Microbiol. 96, 473-480. 13. Matews, C. K., K.E., v. H., Ahern, K. G. (2000) Biochemistry, third edition. Addison-Weasly Publishing Company, San Francisco. 14. Renwick, A., Campbell, R., Coe, S. (1991) Assessment of in vivo screening systems for potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathol. 40, 524-532. 15. Saleh, S. S., Glick, B. R. (2001) Involvement of gacS and ropS in the transcriptional regulation of the plant growth promoting bacteria Enterobacter cloacae CAL2 and UW4. Can. J. Microbiol. 47, 698-705.
15
16. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 17. Shanahan, P., O’Sullivan, D. J., Simpson, P., Glennon, J. D., O’Gara, F. (1992) Isolation of 2,4-diacetylphloroglucinol from a fluorescent pseudomonad and investigation of physiological parameters influencing its production. Appl. Environ. Microbiol. 58, 353-358. 18. Zahir, Z. A., Arshad, M., Frankenberger, W. T. J. (2003) Plant growth promoting rhizobacteria: applications and perspectives in agriculture. Advances in Agronomy 81, 97-168.