Ingineria genic 1

Ingineria genic

Ingineria genic poate fi definit drept ansamblu de metode i tehnici prin care este posibil manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular pentru a obine pe ci netradiionale produi utili omului i genotipuri noi, avnd la baz tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN.

Ingineria genic se profileaz ca direcie tiinific i tehnologic n anii '70. Apariia ei a fost determinat, n primul rnd, de aprofundarea cunotinelor de genetic la nivel celular i molecular, de dezvoltarea cunotinelor privind materialul genetic al organismelor vii, i anume:

descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informaiei ereditare: transformaia (A. Avery, C. MacLeod, M. MacCarty, 1944) prin intermediul fragmentelor de ADN; sexducia (J. Lederberg, E. Tatum, 1946) prin conjugarea bacteriilor i transducia (J. Lederberg, 1952) cu ajutorul fagilor;

descoperirea structurii moleculei de ADN (J. Watson, F. Crick, 1953); descoperirea i izolarea enzimelor de restricie i legare a fragmentelor de ADN

(H. Smith, 1970); descoperirea fenomenului transcripiei inverse a informaiei genetice de la ARN la

ADN (H. Temin, S. Mizutani, D. Baltimor, 1970); descoperirea sintezei chimice a genelor (A. Kornberg, 1967; H. Khorana, 1970,

1976).

1. Bazele tehnico-materiale ale ingineriei genice

Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat i la transferul de gene peste barierele de specie.

Tehnica recombinrii genetice n vitro include trei etape principale: 1) extragerea sau sinteza chimic a ADN-ului din diferite specii; 2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN; 3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN ntr-o celul vie pentru

reproducerea i expresia ei (fig. 1).

Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice.

Ingineria genic 2

Extragerea ADN-ului se produce utilizndu-se o serie de enzime specifice, n primul rnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de ADN n anumite locuri. Enzima de restricie extras din Escherichia coli Eco RI recunoate urmtoarea secven de nucleotide:

G AATTC CTTAAG.

Restrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci). Prima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul i se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 i cartarea lui (Kelly, Smith, 1970).

Nu toate restrictazele se utilizeaz n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoarele proprieti:

pot tia molecula de ADN n fragmente discrete; posed o specificitate de aciune nalt (taie molecula de ADN ntr-o anumit

succesivitate site-ul de recogniie); pot forma, n rezultatul restriciei, margini lipicioase la capetele fragmentului de

ADN (aceast proprietate nu este caracteristic tuturor restrictazelor); pot fi izolate relativ uor n stare pur din mediul incubaional. La repartiia ADN-ului este implicat ADN-ligaza, care poate lega unele fragmente de

restricie. Acestea i alte enzime stau la baza obinerii moleculelor recombinate de ADN (fig.2).

Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizai vectorii (moleculele speciale de ADN ce transfer informaia genetic dintr-o celul n alta) reprezentai prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial i ADN cloroplastic.

Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informaiei strine n celulele (organismele) gazd, trebuie s corespund urmtoarelor cerine:

inofensivitatea vectorului;

multiplicarea rapid n celula-gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare n celulele altor organisme;

prezena unui numr restrns de situri de recogniie; prezena genelor marker pentru selectarea de clone dup moleculele recombinate

de ADN; izolarea relativ uoar, clonarea i expresia n celulele (organismele) strine. n calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit. Plasmidele reprezint nite molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot

exista autonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistena la antibiotice, agresivitatea.

Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie. n acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de ADN exogen n plasmid.

Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S. Cohen (1973).

Ingineria genic 3

Fig.2. Obinerea moleculelor recombinate de ADN: A) metoda ligazic; B) metoda terminal.

Ca vector plasmidic, la plante se folosete plasmidul Ti (Tumour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condiioneaz formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate.

A doua tehnic de introducere a unei gene ntr-o bacterie folosete ca vector un bacteriofag (fagul leambda ), al crui genom (10-50 gene) integreaz gena strin. Ea se va sintetiza ntocmai ca i celelalte gene ale virusului, dac acesta din urm se va replica n celula bacterian.

Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusul tumoral SV-40 i virusul papiloma bovin (BPV). Se crede c vectorii virali vor putea fi utilizai i la plante.

Un tip particular de vectori reprezint liposomii, picturi foarte mici de lipide produse artificial, n care pot fi incluse gene, precum i diferite medicamente, enzime etc.

Genomul mitocondriilor i cloroplastelor este similar celui bacterian i, ca urmare, se crede c el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote.

Celulelor utilizate n experimentele ingineriei genice le sunt naintate o serie de cerine care au menirea de a asigura securitatea investigaiilor tiinifice. Conform Regulilor despre molecule recombinate de ADN celulele-gazd trebuie s satisfac urmtoarele cerine:

capacitatea sporit de implicare n investigaiile tiinifice;

Ingineria genic 4

incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare n afara laboratorului; capacitatea lizrii ADN-ului su n afara laboratorului; imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme; imposibilitaea polurii mediului nconjurtor n rezultatul transformrii i/sau

transfeciei. n prezent, de rnd cu E. coli, n calitate de obiecte de studiu (celule gazd), se

utilizeaz bacilul fnului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de celule i esuturi vegetale i animale, culturile de protoplati.

Dup obinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate n celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea i transmiterea informaiei ereditare).

De menionat c, n cazul operrii cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regul, nu se manifest n celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifest doar parial. Iat de ce, n aceste experimente se acord o deosebit atenie direciei transferului de informaie ereditar a moleculelor recombinate, adic: de la celula procariot n celulele pro- sau eucariote i invers, de la celula eucariot n eu- sau procariote.

Moleculele recombinate ale procariotelor funcioneaz uor n celulele procariote (n calitate de repliconi).

Sunt descrise i cazuri de funcionare a genelor procariotelor n celulele eucariotelor. K. Merril i colab. (1971), In. Hors i colab. (1975) au demonstrat posibilitatea

transferului genei -galactozidazei din E. coli n fibroblastele umane ale unui bolnav de galactozimie cu ajutorul fagului (galactozimia este o boal autozomial recesiv ce provoac dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei 1-D-galactozo-1-fosfaturidiltransferazei).

Expresia genelor eucariotelor n celulele procariote, de asemenea, este posibil. Devis (1976) a transferat gena histidinei drojdiilor n E. coli cu ajutorul fagilor. Astzi se obin pe scar larg produse ale organismelor eucariote n baza bacteriilor (hormoni, interferoni etc.).

Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde n celula (organismul) gazd, este protejat pe diferite ci:

metilarea ADN-ului (virusurile); transferul moleculei liniare de ADN n form circular (fagul ); blocarea sistemului de restricii al celulei-gazd (fagul T3); aciunea restrictazelor. n acelai timp, celula-gazd i protejeaz informaia ereditar prin diferite

mecanisme:

aciunea restrictazelor specifice;

metilarea ADN;

aciunea vecintii epigenetice;

aciunea nespecific a nucleazelor celulare;

protecia mecanic prin membranele celulare; aciunea proteinelor histonice i nehistonice;

Ingineria genic 5

aciunea interferonului.

2. Realizrile ingineriei genice

Datorit cercetrilor n tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene n celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile. Astfel, a devenit posibil producerea i chiar comercializarea pe scar larg a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc.

a) Obinerea insulinei umane i a altor hormoni. Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesit un tratament cu insulin. n 1916, E. Sharpy-Schafer a descoperit c insulina este secretat de celule care

alctuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a determinat s numeasc hormonul insulin. n 1921, F. Banting i H. Best, la Toronto, au izolat din pancreasul de cine hormonul insulin, demonstrnd aciunea lui antidiabetic. n 1923, firma farmaceutic american Eli Lilly pune deja n vnzare prima insulin animal (n prezent, pentru a obine circa 100 grame de insulin, este nevoie de 800 kg de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 200-250 grame)).

Insulina uman este alctuit din dou catene polipeptidice A i B, compuse respectiv din 21 i 30 de aminoacizi, a cror secven a fost stabilit n 1955 de F. Sanger.

n perioada 1963-1965, trei grupe de cercettori (americani, germani i chinezi) au reuit sinteza artificial a insulinei prin intermediul a 170 de reacii chimice, lucru ce fcea imposibil producerea insulinei pe cale industrial.

Noile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost posibile odat cu extragerea genei insulinei (W. Gillbert i colaboratorii si, 1980) i crearea moleculelor recombinate de ADN n baza plasmidelor (fig.3).

Fig.3. Schema obinerii insulinei umane.

Ingineria genic 6

Moleculele recombinate de ADN sunt transferate n colibacili (Escherichia coli), unde are loc realizarea informaiei genetice codificate n molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i insulina. Pentru a proteja insulina uman (ea nu este proprie colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), n molecula recombinat de ADN se ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o gen reglatoare care codific o protein specific colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al manifestrii informaiei genetice a moleculei recombinate de ADN, se obine o caten polipeptidic hibrid, din care mai apoi se separ insulina.

Datorit utilizrii tehnologiei ADN-ului recombinat, se obin aproximativ 200 grame de insulin de pe 1 m3 de mediu de cultur, adic tot atta ct se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

Probele clinice efectuate cu insulina uman, produs prin tehnici de inginerie genic, au demonstrat c ea nu are efecte secundare i c poate fi comercializat, adic folosit la tratarea bolnavilor de diabet (din 1982 n SUA, din 1983 n Marea Britanie).

Un hormon de mare importan biologic este hormonul de cretere sau somatotropina (HGH Human Growth Hormone), secretat de lobul anterior al hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 de aminoacizi. Absena lui provoac nanismul hipofizar, ce are o frecven de 7-100 per milion de persoane. Tratamentul cu acest hormon se realizeaz ncepnd cu vrsta de 4-5 ani i pn la puberitate, n doze de minimum 6 mg pe sptmn per persoan. Somatrotopina este un hormon cu o specificaie nalt i nu poate fi utilizat de la animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg de hormon, heterogen i impurificat. Iat de ce, producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genic prezint un interes deosebit.

Sinteza acestui hormon pe cale artificial s-a nceput cu producerea de ADNc (ADN-ul copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, avnd ca matrice ARNm din hipofize (transcripie invers). Acesta a fost clonat, apoi tiat cu enzime de restricie pentru obinerea secvenei nucleotidice corespunztoare somatotropinei, cu excepia fragmentului ce determin primii 23 de aminoacizi. Fragmentul n cauz era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele dou segmente unite, la ele se adug segmente reglatoare i pe baza plasmidelor se obine plasmidiul recombinat cu gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultur se obine 2,0-2,5 mg somatotropin).

n prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obinui i ali hormoni, de exemplu, thimopoietina ce conine 49 de aminoacizi i este secretat de timus.

n ce privete hormonii cu molecule mai mici (sub 20 de aminoacizi), este preferabil sinteza lor pe cale chimic.

b) Obinerea interferonilor. Interferonii sunt produi de celule specializate pentru lupta mpotriva infeciilor virale.

Ei au fost descoperii n 1957 de F. Isaacs i I. Lindenmann la Institutul Naional de Cercetri Medicale de lng Londra. Interferonii reprezint nite substane proteice (din 146-166 de aminoacizi) i sunt produi n cantiti infime de celula animal sau uman, cnd un virus ptrunde n organism.

Exist mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (), interferonul fibroblastelor () i interferonul limfocitelor T sau interferonul imun ().

Ei pot fi obinui prin tehnici clasice (din celulele sanguine i din fibroblaste) i prin tehnici de recombinare genic.

Pentru a obine interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate cu un virus, iar dup 24 de ore prin centrifugare i purificare se izoleaz din

Ingineria genic 7

mediul de cultur. Dintr-un litru de snge se poate extrage pn la 1 mkg (10-3 grame) de interferon.

n 1980, savanii americani W. Gilbert i C. Weissmann i japonezul T. Taniguki au produs interferonul uman cu ajutorul unor colibacili cu genomul modificat.

Celulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului n interferon activ, de aceea, iniial, complexul de ADN, format dintr-o regiune nucleotidic reglatoare i o regiune ce determin structura interferonului, este supus aciunii enzimelor de restricie, care taie molecula de ADN aproximativ la frontiera acestor dou catene (genei interferonului nu-i ajunge un triplet ATG). Codonul omis (ATG) este anexat prin sintez chimic.

Gena interferonului se ncadreaz n continuare ntr-un plasmid, care se transfer n E. coli. Astfel, colibacilii sintetizeaz interferonul uman. Dintr-un litru de suspensie de E. coli (circa 1011 celule) se pot extrage pn la 5 mg de interferon (adic de 5000 de ori mai mult dect din 1 litru de snge).

Tehnicile de inginerie genic permit obinerea preparatelor hibride de interferon cu un spectru larg de aciune.

c) Transferul de gene n celulele vegetale i animale. Tehnicile de recombinare genetic permit transferul genelor importante n celulele de

plante i animale, iar n rezultat se obin plante i animale transgenice. Pentru transferul de gene la plante sunt utilizate bacteriile Agrobacterium tumerfaciens (descoperite n 1907 de E. Smith i C. Townsend), care provoac formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate).

Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzeaz tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid n celulele vegetale.

Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal include:

introducerea segmentului de ADN-T ntr-un plasmid de E. coli; introducerea n plasmidul format a genei necesare i a genei marker (gena pentru

rezisten la canamicin); introducerea plasmidului recombinat n Agrobacterium tumerfaciens; infecia cu A.tumerfaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.4).

Pentru realizarea transferului de gene n celula vegetal este utilizat metoda culturilor de celule i esuturi n vitro.

Firma american Monsanto comercializeaz deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gndacul de Colorado.

O realizare remarcabil n domeniul transferului de gene n celula animal o constituie oarecii transgenici. Gena hormonului de cretere de la obolan a fost transferat prin microinjecii n cele dou nuclee ale ovulului proaspt fecundat de la oarece (n fiecare nucleu cte circa 600 copii ale genei hormonului de cretere).

Ovulele fecundate (170) au fost implantate n oviductul unei femele-receptor. n consecin, s-au obinut 21 de oricei. La 6 dintre ei s-a constatat o cantitate mrit a hormonului de cretere (de 100-800 de ori). Aceti oricei aveau o cretere mult mai rapid i prezentau greuti corporale superioare animalelor-martor.

Ingineria genic 8

Fig.4. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal.