clonarea genica

UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI

MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE

AMPOSDRU

Fondul Social European

POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale

2007-2013

OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI

CLUJ-NAPOCA

Pag. 1/17

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investeşte în

OAMENI

ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482

Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea

ştiinţifică interdiciplinară

POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European

prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea

Resurselor Umane 2007-2013

Investeşte în oameni! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară 1 „Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării” Titlul proiectului „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară ” Contract POSDRU/21/1.5/G/36154

Raport ştiinţific

Expert ştiinţific: LUPAN Iulia

Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea

de proteine

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot

ADN în sine are doar 2 funcţii importante şi anume păstrarea informaţiei genetice şi furnizarea

acesteia pentru sinteza de proteine. Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o

generaţie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN şi împărţirea egală din timpul diviziunii

celulare. A doua funcţie este legată de descifrarea informaţiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul

informaţiei între ADN şi proteine este ARN care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o

enzimă numită ARN polimerază. ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul de traducere a ADN (sinteza

proteinelor) care are loc în ribosomi. Practic ARN este cărăuşul informaţiei din nucleu în citoplasmă unde

are loc sinteza proteinelor. Dogma centrală a biologiei presupune transmiterea unidirecţională a informaţiei

de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1). Informaţia genetică nu poate fi transmisă invers de

la proteine la ADN. Informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul retrovirusurilor la

care materialul genetic este ARN. Nu există cazuri de transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine.

Figura 1. Dogma centrală a biologiei.

Replicare

Transcriere

Traducere

Proteină

ADN

ARNm

Nucleu

Citoplasmă



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 2/17


Investeşte în

OAMENI









Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi introducerea ei în alte celule gazdă

pentru multiplicare şi în unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot

obţine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar procesul clonării constă din următoarele etape:

- amplificarea genei de interes

- introducerea genei de interes într-un vector de clonare

- introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă

- selecţia celulelor transformate (purtătoare ale moleculei recombinate)

- verificarea moleculelor recombinate

Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie într-

o moleculă de ARN. Moleculele de ARN rezultate în urma transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii:

- ARN funcţional

- ARN informaţional

ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte anumite funcţii în celulă (în cea mai mare

parte participă la procesul de traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă ARN

ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt).

ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un polipeptid şi serveşte ca matriţă în

procesul de traducere (sinteză a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonării

codifică un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este obligatoriu o genă, ci un fragment de ADN care

nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. Din această cauză în

continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile.

Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un genom este necesară extragerea

acestuia. Există 2 modalităţi de a obţine fragmentul dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin

copierea acestuia. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă deoarece necesită prezenţa unor situsuri

(secvenţe specifice) la capetele fragmentului, care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente

generate, iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică.

A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des utilizată. În acest scop se

utilizează tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Această tehnică poate fi considerată un adevărat

copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă deoarece necesită cantităţi foarte mici

de ADN matriţă. O condiţie obligatorie pentru o amplificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă, în

special la capetele acesteia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci se vor analiza cel puţin secvenţe ADN

omoloage de la alte specii sau secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă. Principiul

tehnicii PCR este o imitaţie a procesului de replicare a ADN care are loc în celule. Dacă în celule pentru

replicare se foloseşte o întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici,

cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene.

Procesul este reversibil, catenele complementare formând molecula dublu catenară după înlăturarea

agentului de denaturare. Reacţia de amplificare este una ciclică, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:

- denaturarea ADN

- alinierea amorselor

- sinteza catenei complementare de către ADN polimerază

După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează, iar după 35-40 de cicluri se obţin milioane

de copii ale fragmentului ţintă pornind de la o singură copie.

Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizează

temperaturi înalte de 94-98ºC. Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece pentru

denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de

denaturare după primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec.



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 3/17


Investeşte în

OAMENI









Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite şi oligonucleotide, sunt secvenţe scurte de

ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremităţile secvenţei ţintă şi formează porţiuni

scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenţele complementare, temperatura este coborâtă la

40-60ºC timp de câteva zeci de sec. Această etapă este numită de aliniere sau hibridizare. Temperatura de

aliniere se stabileşte la câteva grade (2-5) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura

de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de

calcul, cea mai simplă formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:

Unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze azotate. Numărul de G şi C se

înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece între acestea există 3 legături de hidrogen, în consecinţă moleculele

bogate în G şi C au o temperatură mai mare topire.

Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:

- numărul de nucleotide este de 15-35

- temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 şi 70ºC

- conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%

- la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoarece oferă o stabilitate mai mare

- amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă, în caz contrar amorsa poate forma

secvenţe interne dublu catenare care au aspect de buclă

- cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare între ele,

altfel se vor forma porţiuni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica

porţiunile scurte rămase monocatenare.

De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi amorsa ADN, polimeraza poate

iniţia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia

5'→3' (Figura 2). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea fragmentului amplificat, dar şi ca punct

start pentru ADN polimerază care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'.

Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolată de la bacteria Escherichia coli

care are activitatea optimă de sinteză la 37°C. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era

inactivarea termică în timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de reacţie trebuiau schimbate de la o

temperatură la alta şi după fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază. Astfel amplificarea

fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi

descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluţionară în acest sens, pe larg utilizată

şi astăzi este Taq polimeraza. Această enzimă este o ADN polimerază, izolată de la o bacterie termofilă

Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei), care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat

într-un lanţ polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Taq polimeraza are activitatea optimă la 72°C şi nu se

denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de

activitate este nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de aproximativ 1000 de

nucleotide per minut. Durata elongării necesare sintezei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă.

Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de

nucleotide – 2minute.

Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 4/17


Investeşte în

OAMENI









5'

5' 3'

3'

5'

5' 3'

3'

5'

5' 3'

3'

5'

5'

3'

3'

5'

5' 3'

3'

5'

5' 3'

3' 5'

5'

3'

3'

3'

5' 3'

5'

5' 3'

3'

3'

5' 3'

5'

5' 3'

3'

ADN genomic cu

fragmentul ţintă

Etapa iniţială de

denaturare

Alinierea amorselor

la capetele

fragmentului ţintă

Etapa de elongare sau

sinteză a catenei

complementare de către

ADN polimerază

Sfârşitul

primului ciclu

Ciclu

II

Ciclu I



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 5/17


Investeşte în

OAMENI









Figura 2. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă. Acest tip este asemănător PCR

obişnuit, doar că foloseşte o matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de această sinteză

este transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN polimerază ARN-dependentă. Taq polimeraza este o

ADN polimerază deoarece sintetizează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează o matriţă ADN

pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la virusurile care au material genetic ARN şi în

momementul intrării în celulă necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. RT-PCR se utilizează

pentru obţinerea copiilor de gene eucariote care nu conţin introni şi analiza exprimării de gene. În ambele

cazuri se porneşte de la ARNm (informaţional care codifică proteine). Exprimarea genelor sau transcrierea

este etapa intermediară între ADN şi proteine. ADN codifică informaţie genetică despre sinteza proteinelor,

calea de la ADN la proteine constituie dogma centrală a biologiei.

Enzime de restricţie. Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu

catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN.

Restrictazele recunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri specifice de recunoaştere, se fixează de

acestea şi taie legăturile fosfoesterice între nucleotide.

Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că funcţia lor este de apărare contra

bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). În momentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de restricţie

digeră aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricţie prin metilarea

unor baze azotate, enzimele de restricţie, în general, nu taie ADN metilat. Până acum au fost descrie 4000 de

enzime de restricţie de la câteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I, II şi III.

Această clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de recunoaştere. Enzimele cele

mai utilizate în tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi

utilizează ioni de Mg2+

ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele

catene în direcţia 5′→3′ este identică.

5' 3'

5' 3'

3'

3'

5'

5'

5' 3'

5' 3'

3'

3'

5'

5'

5' 5'

3'

3'

3'

3'

3' 5'

5' 3' 3' 5'

3'

Ciclu

III

Taq polimeraza

amorsă

amorsă ce indică direcţia de sinteză



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 6/17


Investeşte în

OAMENI









Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea bacteriei de la care a fost izolată.

Astfel, HindIII este izolată de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina

RY13.

Figura 3. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi SmaI (B) şi capetele libere

după tăiere. Locurile de tăiere sunt indicate cu săgeţi.

Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte.

Enzima BamHI şi EcoRI generează capete coezive după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează capete

drepte sau netede (Figura 3).

Cu ajutorul unor programe speciale se pot alcătui hărţi de restricţie care reprezintă situsurile de

recunoaştere pentru diferite restrictaze într-o secvenţă (Figura 4).

Figura 4. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre în

paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricţie.

Ligarea fragmentelor de ADN

Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri

sau nu există nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită ADN

ligază. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3′) şi

gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (capătul 5′) (Figura 5). Funcţia ligazei în celule vii este

legarea fragmentelor în timpul replicării, recombinării şi după repararea ADN. Cea mai des utilizată este

ADN ligaza T4 izolată de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizează ATP ca şi cofactor.

GGGCCC

CCCGGG

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

5′

5′ 3′

3′

SmaI

5′

5′ 3′

3′

A B

GGG

CCC

G

CTTAA

AATTC

G 5′

3′ 5′

3′

CCC

GGG 3′

5′

5′

3′

YLR377C

1047 bp

NcoI (7 77)

EcoRV (58)

BamHI (533)

BamHI (773)

EcoRI (605)

EcoRI (633)H infI (32)

H infI (7 5)

H infI (461)

H infI (616)

H infI (942)



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 7/17


Investeşte în

OAMENI









Figura 5. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a două fragmente ADN

care au capete netede.

Vectori de clonare

Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN

străin în celulele gazdă. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi vectori

artificiali. Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul clonării. Cele mai pe larg utilizate sunt

plasmidele. Un plasmid este o moleculă dublu catenară de ADN, care este circulară, închisă şi capabilă de

replicare autonomă în celule gazdă. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de

la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nişte secvenţe specifice necesare replicării, clonării,

selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pentru replicarea autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa

ori, care este originea de replicare. Nicio moleculă de ADN nu poate fi replicată fără o origine de replicare.

Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate începe replicare şi care este

recunoscută de anumite proteinele care iniţiază replicarea.

O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul

englezesc este Multiple Cloning Site). În această regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu ajutorul

enzimelor de restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi fragmentul ADN este tăiat cu aceleaşi enzime de

restricţie şi legate împreună cu ajutorul ligazei. SMC conţine secvenţele de recunoaştere pentru mai multe

enzime de restricţie şi care nu se conţin în altă regiune a vectorului. O altă componentă foarte importantă a

plasmidelor sunt markerii de selecţie care sunt de obicei nişte gene a căror produs (enzimă) fac posibilă

selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai des utilizaţi markeri

sunt genele ce conferă rezistenţă la antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă rezistenţă. Spre

exemplu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină. Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă

vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dacă un amestec de celule transformate cu

plasmide care vor conţine atât celule cu cât şi fără plasmid, se însămânţează pe un mediu cu ampicilină, vor

supraveţui doar celulele care conţin plasmidul.

Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu plasmid recombinat adică cu insert de

cele cu plasmid fără insert. Insert se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul multiplu

de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN

atunci gena este intactă, produsul ei este o proteină activă. Dacă în SMC a fost introdus un fragment ADN

atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv. Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZ′ care

codifică subunitatea α a enzimei β-galactozidază, atunci produsul acestei gene împreună cu subunităţile

codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o enzimă activă capabilă să metabolizeze un

derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în mediu şi este

incolor. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va metaboliza acest substrat iar produsul format în urma

reacţiei va avea o culoare albastră. În acest fel coloniile rezultate după transformare care conţin vectorul fără

insert vor fi albastre, iar cele ce conţin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă activă

G G A T

C C T A

C G C A A

G C C T T

5′

3′

3′

5′

OH

HO

P

OH

O

OH

OH

O P

OH



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 8/17


Investeşte în

OAMENI









capabilă de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie utilizează o enzimă toxică pentru celulele

bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor.

Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncţională şi vor supraveţui.

Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva mii de pb şi în care pot fi inserate

fragmente de ADN de la 100 pb până la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristică importantă pentru

plasmide este numărul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un număr mai mare de

copii per celulă. Acest fapt permite obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de

bacterii (din 3-5ml de cultură se pot obţine câteva μg de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numărul

copiilor per celulă este mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN este necesară o

cantitate mai mare de cultură.

Figura 6. Hărţile unor vectori plasmidici. A – harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezistenţă la

antibiotice: Apr conferă rezistenţă la ampicilină, iar TC

r rezistenţă la tetraciclină, situsul multiplu de clonare îl

poate constitui oricare dintre cele două gene de rezistenţă, în dependenţă de gena selectată pentru inserare,

rezistenţa la antibioticul respectiv se va pierde . B – harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de

firma Fermentas. Plasmidul are rezistenţă la ampicilină iar situsul multiplu de clonare se află în gena lacZ' care

oferă selecţia alb-albastră a clonelor pozitive. C – harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care

include gena bla care conferă rezistenţă la ampicilină, situsul multiplu de clonare care conţine un codon

START şi un codon STOP după eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

pBR322

4361 bp

TC r

AP r

ORI

BamHI (376)

Cla I (25)

EcoRI (4360) HindIII (30)

Pst I (3612)

EcoRV (188)

Bst Z17I (2247)

Pvu I (3737)

SalI (652)

Sca I (3847)

Sph I (567)

pTZ57R

2886 bp

LacZ

bla(AmR)

MCS

T7 promoter

Ori

BamHI (655)

EcoRI (616)

HindIII (691)

Pst I (677)

Xba I (645)

Sac I (626)

SalI (668)

Kpn I (632)

Apa I (666)

A B

pET-21a

5443 bp

bla (Ap)

lacI

M CS

T7 promoter

His tag

ColE1 pBR322 origin

f1 origin

T7 terminator

BamHI (199)

BglII (343)

EcoRI (193)

HindIII (174)

NdeI (239)

Not I (167)

Sac I (191)

SalI (180)

XhoI (159)

C



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 9/17


Investeşte în

OAMENI









Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care mai oferă în plus posibilitatea

exprimării genei clonate(Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus

faţă de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc şi în genom şi fac parte dintr-o genă:

promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START şi STOP care delimitează cadrul deschis de

citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se află în amonte de

genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază

transcrierea. Numai în prezenţa promotorului exprimarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul de legare al

ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secvenţă care se transcrie dar care nu se

traduce şi care este recunoscută de ribosomi. Ribosomii se leagă la acest situs şi se deplasează de-a lungul

ARNm până întâlnesc primul codon START de unde începe traducerea. Codonul START la procariote este

în cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus în situsul multiplu de clonare, în caz contrar

acesta se poate introduce în fragmentul ţintă cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus şi el de obicei

în situsul de clonare. În unele cazuri acesta este prezent după regiuni care codifică anumite aşa-zise etichete.

Etichetele facilitează purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des

utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei

(Maltose Binding Protein, MBP este termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte integrantă a

proteinelor la capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau

înainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate faţă de

anumite răşini cromatografice.

Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă

Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se numeşte transformare dacă sunt utilizate

celule bacteriene sau transfecţie dacă sunt celule eucariote. În continuare se va detalia doar transformarea

celulelor procariote, acestea având cea mai mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi

proteinelor recombinate. Există două tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate în

laboratoarele de biologie moleculară:

- transformarea chimică

- transformare sub influenţa câmpului electric.

Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei competenţe de transformare, deoarece E. coli

nu are proprietăţi de transformare naturală.

Această competenţă în cazul transformării chimice este indusă cu CaCl2. În acest scop se realizează o

cultură de E. coli şi prin tratarea celulelor cu clorură de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor

bacteriene (Figura 7 A). Celulele sunt şocate termic foarte scurt, timp de maxim 2 minute, la 42°C. Acest

timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele bacteriene.

Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât transformarea chimică. Prepararea celulelor

competente presupune doar creşterea lor până în faza logaritmică (D=600nm = 0,6-0,8) şi înlăturarea prin

spălări repetate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta

transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea

câmpul electric între doi electrozi. Amestecul de celule competente şi plasmide recombinate vor fi depuse

într-o cuvă specială de electroporare, ai cărei pereţii laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o

tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura 7 B). După transformare celulele şocate sunt

preluate în mediu de cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice.

Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate

adică fără plasmid. Eficienţa de transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o

cantitate de 1ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile rezultate. Numărul de colonii va corespunde

numărului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia naştere dintr-o singură celulă. Numărul

obţinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoarea la

1000). O eficienţă bună de transformare este 106, ceea ce înseamnă ca la transformarea unui μg de plasmid s-



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 10/17


Investeşte în

OAMENI









ar obţine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie

sau de câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în amestecul de ligare numărul de

molecule recombinate este mic şi din această cauză este de dorit o eficienţă cât mai mare a celulelor

competente.

Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa

de transformare şi de costuri. Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar mai

ieftină deoarece nu necesită aparatură şi cuve costisitoare.

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A – transformarea chimică cu

CaCl2; B – electroporarea celulelor bacteriene.

Electroforeza acizilor nucleici

Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină într-un câmp electric. Migrarea

moleculelor se realizează printr-o matrice specifică. Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a

acizilor nucleici. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza proteinelor în condiţii denaturante în gel

de poliacrilamidă (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice şi pentru

electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a separării fragmentelor de ADN, mai ales în

cazul fragmentelor mici. Această matrice este folosită mai rar în laboratoarele de analize genetice, deoarece

este mai laborioasă. Primul loc în utilizarea vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de

agaroză. Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă, ea este utilizată cu succes deoarece

este mai simplă.

Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Această sarcină face

posibilă migrarea moleculelor de ADN şi ARN într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de

molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin

porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi în dependenţă de

masa lor moleculară. Pentru estimarea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelaşi gel dar în godeu

separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de

molecule se numeşte marker molecular.

Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile de agaroză se realizează prin

încălzirea agarozei într-un tampon specific. Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1 şi 3% în dependenţă

de scopul urmărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare, cu atât mărimea porilor va fi mai mică. La

concentraţii mai mici de agaroză, porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. În concluzie

concentraţii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru

Spălarea celulelor

bacteriene

A

B Celule de

E.coli

CaCl2 2 min

42ºC

1800 V

5 msec

Celule transformate

de E.coli

Însămânţarea

celulelor

transformate pe

mediu selectiv



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 11/17


Investeşte în

OAMENI









fragmente mici. Gelurile de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate oferind separarea moleculelor între 0,1

şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt plasate între cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de

migrare. Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE

(Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA).

Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesară utilizarea unui colorant. Cel mai

des folosită în acest scop este bromura de etidiu, care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine

fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate din

molecula dublu catenară de ADN. Lungimea de undă a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie să

fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. A – imaginea gelului la expunerea în UV; B – fotografia aceluiaşi gel.

Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi purificarea ADN. Vizualizarea ne

oferă informaţii despre integritatea ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor

enzimatice, estimarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie. ADN poate fi purificat din

gel de agaroză după migrare prin excizarea fragmentului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special

predestinate acestui tip de purificări.

Verificarea moleculelor recombinate

Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-18 ore de la transformare când apar

coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a clonării,

deoarece acestea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi colonii cu plasmid fără insert. Chiar dacă se

foloseşte un sistem alb-albastru de selecţie a coloniilor pozitive, acestea necesită totuşi o dovadă în plus a

prezenţei plasmidului recombinat. În acest scop se va efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu

antibiotic care se va însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37°C.

Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu

ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie enzimatică şi apoi prin

secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus

în vector sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această digestie va confirma prezenţa

insertului în plasmid şi aproximativ mărimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa

fragmentului clonat.

Secvenţializarea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a clonării. Această verificare este

necesară deoarece ADN polimeraza utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de

sinteză. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN polimerază care are proprietatea de a

corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza ş.

a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigură de obicei randamente de sinteză mai

mari. În unele cazuri se utilizează un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu

polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescută.

A B



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 12/17


Investeşte în

OAMENI









În cadrul Centrului de Biologie Moleculară există 2 secvenţiatoare: Analizorul Genetic ABI Prism

310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ™ 8800

Genetic Analysis System (laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizează principiul

Sanger de secvenţiere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secve nţiere.

Matriţa ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată, apoi la unul din capetele sale are loc

ataşarea unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul

PCR conţine dezoxiribonucleotide trifosfat (dNTP) dar şi didezoxiribonucleotide trifosfat (ddNTP)

care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a dezoxi ribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă

continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul nucleotide.

Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se fooseşte o singură amorsă) de

diferite mărimi. Numărul de cicluri este de 40 ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se

opresc în toate punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu

un fluorcrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care

presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinal micrometrilor. O cantitate de câţiva

microlitri vor fi separaţi în gelul din capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de

mărimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. În ultima parte a capilarului

există o fereastră transparent prin care un fascicol laser va excita frluorocromii, iar fluores cenţa emisă

va fi captată şi prezentată sub forma unei cromatograme (Figura 9). Cromatogramele sunt apoi

analizate şi comparate cu secvenţa existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot

fi secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matriţe dificile (cu

secvenţe repetitive) este necesară utilzarea unor kituri speciale.

Figura 9. Cromatograma unei secvenţe obţinută cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.

Exprimarea genelor în sistem procariot

Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau

exprimarea genei clonate. Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus

analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei şi la care se

urmăreşte cunoaşterea secvenţei. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare,

iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate.

Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite

adevărate fabrici de proteine la comandă, care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi

de ce cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul exprimării genei şi obţinerii de proteină

recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi

clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conţin neapărat un promotor recunoscut de



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 13/17


Investeşte în

OAMENI









ARN polimeraza celulei gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START şi unul STOP la

capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire,

adică împărţirea exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. Promotorii din aceste

tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid),

care este un analog al galactozei. Spre exemplu vectorii de tip pET de la Novagen asigură de obicei o

supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7, situsul de

recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul multiplu de clonare şi codonul STOP după o etichetă

de 6 histidine. Dacă se optează pentru prezenţa unei etichete 6His la capătul C-terminal a proteinei pentru

facilitarea purificării atunci din genă se va înlătura codonul STOP. Dacă această etichetă nu este necesară,

atunci în genă se păstra codonul STOP şi traducerea se va opri înainte de etichetă. Promotorul T7 nu este

recunoscut de către ARN polimeraza de la E. coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bacteriene nu

va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin gena pentru ARN

polimeraza de la fagul T7. Această genă se află sub controlul promotorului lacUV5 şi a operatorului lac

(Figura 10).

Figura 10. Inhibiţia exprimării genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 şi a genei ţintă în

celulele gazdă de E. coli în lipsa inductorului.

Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină numită represorul lac. Atunci când în

mediu nu există lactoză (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi împiedică

transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraza. În absenţa T7

ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este codificat de gena

lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi în plasmidul de exprimare. Agentul care induce

exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac şi cauzează

disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E.

coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaşte promotorul T7 din

plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o

producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene.

pET21

lacI

lac

lac

lacI

P lac Lac O

Lac O

P T7

represorul lac

gena lacI

promotorul lac

operatorul lac

gena pentru T7 ARN polimerază

promotorul T7

gena ţintă

ADN genomic



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 14/17


Investeşte în

OAMENI









Purificarea proteinelor recombinate

Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare cât mai bună

din amestecul total de proteine este necesară purificarea în cel puţin 2 etape prin metode cromatografice

diferite. Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură purificarea proteinelor într-o singură etapă,

ceea ce reduce timpul necesar şi asigură randamente de purificare mai mari (Figura 11). Dacă eticheta

deranjează în analiza ulterioară a proteinei, atunci se poate recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu

peptidaze. În acest scop pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţin situsul pentru

peptidază, cum este spre exemplu situsul pentru trombină în cazul plasmidului pET28.

Figura 11. Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie

de afinitate. A – încărcarea amestecului total de proteine pe coloana cu răşină; B – spălarea coloanei cu

tampon şi fixarea proteinei ţintă de răşină; C – eluarea proteinei ţintă de pe coloană.

2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii

interdisciplinare

Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică indispensabilă în laboratoarele de biologie

moleculară. Una dintre aplicaţiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii

interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor şi exprimarea

lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. În cele mai multe cazuri purificare unei

proteine din celulele în care aceasta se exprimă în mod firesc natural prezintă mai multe dificultăţi:

- cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre exemplu pentru purificarea unei proteine

din bacterii este necesară o cantitate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul

purificărilor în câteva etape pot fi sub 1g de proteină;

- obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum

este cazul unor bacterii pe care nu putem să le cultivăm în condiţii de laborator;

- obţinerea materialului pentru purificare implică probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul

unor proteine umane, obţinerea de proteine din celule umane ar fi imposibilă;

A B C

5'



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 15/17


Investeşte în

OAMENI









- purificarea se face în mai multe etape care necesită timp, consumabile şi are randamente mai

mici.

Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic sunt eliminate în cazul exprimării

genelor în celule gazdă. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care pot

dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea proteinei. Prin intermediul tehnicilor de

mutageneză pot fi introduse mai multe tipuri de mutaţii:

- mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;

- deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi înlăturate;

- inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena codificatoare şi respectiv în

proteina recombinată;

- fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei

proteine, spre exemplu regiunea N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu

capătul C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;

- proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate cu anumite molecule care sunt

introduse în proteine în procesul lor de sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este

marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod specific sau randomic. Un alt

exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi

facilitează detecţia lor.

Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este tehnica la care se apelează cel mai des,

deoarece este mai rapidă şi mai puţin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare,

astfel o proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi cuaternară. Exprimarea genelor şi sinteza

proteinelor în celulele procariote asigură doar structura primară exactă a polipeptidului sintetizat. În unele

cazuri proteinele adoptă structura secundară independent după sinteză, în alte cazuri este nevoie de condiţii

speciale şi alte proteine care contribuie la adoptarea conformaţiei proteinei active. Unele proteine atât de la

eucariote cât şi de la procariote sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o structură

secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplasma formează corpi de incluziune. Există

cazuri când acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune oferă

posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii denaturante. Proteinele denaturate purificate în

acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai important

aspect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a proteinei şi nu structura ei secundară sau terţiară.

Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza apartenenţei genei sau

pe baza analizei structurii primare. O altă problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Cauzele

neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Un alt dezavantaj (deşi în unele cazuri este un

avantaj) este lipsa modificărilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacteriene. Majoritatea

proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări conformaţionale dar şi modificări post-traducere cum

ar fi fosforilări, glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară, atunci se va recurge la

clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-

traducere este un avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte să se cunoască rolul

grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest fel proteina recombinată nu va fi modificată şi se va

putea deduce rolul acestor grupări în activitatea proteinei.



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 16/17


Investeşte în

OAMENI









3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară

Denumire echipament Caracteristici

Instalaţie de preluare şi prelucrare a imaginilor

Ced Limited, Marea Britanie

Achizitia şi interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamidă sau

geluri de agaroză

Instalaţie de apă ultrapură, Elga-Lab Water,

Marea Britanie Purificarea apei până la o rezistivitate de 18,2 MΩ/cm (apa MilliQ)

Centrifugă cu răcire Sigma 3K18 (4 rotoare),

Sigma, Germania

Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg,

răcire de la temperatura camerei la 0°C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor

6x30ml, rotor 8x50ml si rotor 4x250ml

Centrifugă de masă Sigma 1-13, Sigma, Germania Fără răcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg)

“Thermocycler”, Eppendorf, Germania Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml, 0,5ml si

placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatură în tub

“Thermocycler”, Corbett Research, Australia Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml şi plăci

ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatură

Electroporator Eppendorf, Germania Transformarea celulelor electrocompetente – bacterii şi drojdii

Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301,

CamSpec, Marea Britanie Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm

Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu

termostatare, Jasco, Japonia

Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm, cu termostatare,

pentru cinetică enzimatică

Patru instalaţii electroforeză proteine, Consort,

Belgia Electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă, max. 32 probe

Şase instalaţii electroforeza acizi nucleici,

Consort, Belgia Electroforeza orizontală în gel de agaroză, max. 48 probe

pH-metru P901 (două bucăţi), Consort, Belgia Masurarea pH-ului, electrod combinat prevăzut cu senzor de temperatură

Congelator temperaturi foarte scăzute, 70 litri,

Sanyo, Japonia Congelare probe biologice la -82ºC

Congelator temperaturi foarte scăzute, 100 litri,

Snijders Scientific, Olanda Congelare probe biologice la -82ºC

Două balanţe analitice, Scaltec, Germania Domeniul de măsurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfaţă pentru

calculator şi imprimantă

Două incubatoare bacteriologice, Memmert,

Germania

Incubarea culturilor bacteriene şi a probelor moleculare de la

temperatura camerei la 70ºC

Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Incubarea probelor biologice pana la 100ºC, (3%)

Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied

Biosystems, SUA laser cu detecţie pentru 5

fluorocromi Secvenţierea fragmentelor de ADN, identificare umană şi

determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilară la

15kV; soft-uri speciale pentru secvenţiere şi genotipare; Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis

System laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi

Instalaţie Real Time PCR, Corbett Research,

Australia

Amplificarea ADN-ului în timp real; detecţia simultană a 4

fluorocromi

Instalaţie HPLC, Jasco, Japonia Separarea probelor prin cromatografie de înaltă performanţă; gradient

binar de înaltă presiune şi gradient cuaternar de joasă presiune

Microscop inversat NIKON Eclipse TE2000S,

Nikon, Japonia

Studiul preparatelor celulare şi tisulare în lumina normală, contrast de

fază şi fluorescenţă

Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umedă sau uscată a mediilor de cultură, materialelor şi

instrumentelor Autoclav AE-75-DRY Raypa, Spania

Ultrasonicator cu patru sonde, Sonics & Materials Dezintegrarea celulelor bacteriene, ţesuturilor animale şi vegetale în

volume de la 1ml până la 1 litru

Hota PCR cu flux laminar steril, Telstar, Spania Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, iluminare, preparare

probe PCR (4%

Hota flux laminar biohazard 100, Coreea de Sud Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 µm 99,97%),

prefiltru reciclabil (3-30 µm); flux de aer reglabil în 9 trepte (0,35-0,5 m/s);



AMPOSDRU


POSDRU 2007-2013


2007-2013


CLUJ-NAPOCA

Pag. 17/17


Investeşte în

OAMENI









4. BIBLIOGRAFIE

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell,

4th edition, New York: Garland Science.

Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York: W. H. Freeman

Company.

Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition, Wiley-Blackwell

Publishing.

Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant DNA, 2nd Edition,

Academic Press.

Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of

Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press.

Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical

Approach Series), 2d edition, Oxford University Press.

Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic Analysis, New York: W.

H. Freeman Company.

Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An Introduction to Genetic

Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company.

Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology,

4th edition, New York: W. H. Freeman Company.

McPherson M.J., and. Mǿller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, Springer-

Verlag Telos.

Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis.

Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor in geluri de poliacrilamidă, Editura Tehnică, Bucureşti.

Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes -

A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.

http://www.garlandscience.com/

http://www.whfreeman.com/

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_1?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Terry%20A.%20Brown

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_1?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Sue%20Carson

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Dominique%20Robertson

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Jack%20J.%20Pasternak

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_3?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Cheryl%20L.%20Patten

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_1?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=D.%20M.%20Glover

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=B.%20D.%20Hames





http://www.amazon.com/James-D.-Watson/e/B001HCVN6K/ref=ntt_athr_dp_pel_1

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Richard%20M.%20Myers

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_3?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Amy%20A.%20Caudy

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_4?_encoding=UTF8&sort=relevancerank&search-alias=books&field-author=Jan%20A.%20Witkowski

clonarea genica

Documents