Istoria pleistocena si holocena a speciei

Rhyacophila aquitanica (Insecta: Trichoptera) ın

Muntii Carpati – centre potentiale de speciatie

Doctorand: Balint Miklos

Conducator stiintific: Prof. Dr. Octavian Popescu

2008

Universitatea Babes-Bolyai, Facultatea de Biologie si GeologieCluj-Napoca, Romania

1

Cuprins

1 Trichoptera – aspecte generale 4

2 Familia Rhyacophilidae, grupul tristis si specia Rhyacophila aqui-

tanica 5

3 Diferentiere si speciatie ın ape montane: diferente morfologice ıntre

populatiile de R. aquitanica 7

4 Revizuirea taxonomica a speciei Rhyacophila aquitanica (Trichoptera:

Rhyacophilidae) pe baza rezultatelor moleculare si morfologice si

schimbarea statutului taxonomic al Rhyacophila aquitanica ssp.

carpathica ın Rhyacophila carpathica stat. n. 10

5 Centre de speciatie si refugii pleistocene: structuri moleculare la

R. aquitanica si R. carpathica 14

6 Concluzii 24

7 Multumiri 27

8 Publicatii 28

Bibliografie 30

2

Rezumat

Prezentul studiu a fost realizat ın vederea investigarii relatiilor dintre

diferitele populatii ale unei specii de trichoptere montane. Muntii Europei

sunt caracterizati de o biodiversitate considerabila, iar speciile montane acvat-

ice si semiacvatice care fac parte din aceasta diversitate nu sunt suficient stu-

diate. Am ales Rhyacophila aquitanica McLachlan 1879 ca organism model

deoarece populatiile acestei specii sunt descrise ın diferite masive muntoase

europene, prezentand o distributie foarte fragmentata. Distributia fragmen-

tata a speciei ridica o serie de ıntrebari privind originea si identitatea acestor

populatii. Relatiile taxonomice dintre populatiile de R. aquitanica au fost

descrise ın lucrari anterioare, facilitand alegerea noastra. Specimenele anal-

izate ın acest studiu au fost colectate din aproape fiecare zona de distributie a

speciei. Diferite analize moleculare si morfometrice au fost realizate folosind

specimenele colectate sau obtinute din colectii de muzeu. Rezultatele obtinute

dovedesc faptul ca populatiile speciei cunoscute anterior ca R. aquitanica din

Carpati, Alpii de Sud si ariile din nord-vestul Alpilor, sunt entitati taxo-

nomice distincte. Studiul dezvaluie fenomene importante de speciatie ıntre

zonele montane europene, prezentand dovezi ale unei diferentieri alopatrice

ıntre aceste regiuni. Lucrarea arata ca structura diversitatii montane ob-

servata astazi este rezultatul unor procese care pot fi mult mai vechi decat

ultima glaciatiune pleistocena. Evenimentele de speciatie ın cazul complex-

ului R. aquitanica au avut loc, probabil, mult mai devreme decat ın timpul

maximului ultimei glaciatiuni. Importanta habitatelor acvatice montane ca

“hot-spoturi” de biodiversitate este demonstrat, accentuandu-se rolul lor ın

conservarea biodiversitatii montane europene.

Cuvinte-cheie biogeografie, diversitate genetica, specii acvatice montane, filoge-

netica, schimbari climatice

3

1 Trichoptera – aspecte generale

Grupul Trichoptera a prezentat un interes deosebit pentru oamenii de stiinta ai sec-

olelor anterioare din numeroase motive. Trichopterele sunt studiate intensiv de catre

entomologi chiar si astazi datorita, de exemplu, relatiilor filogenetice interesante cu

ordinul Lepidoptera si datorita fenomenelor ecologice fascinante prezente ın stadiul

larvar, stadiu folosit frecvent ın cercetarile privind bioindicatorii.

In 1997 (Morse) grupul Trichoptera cuprindea aproximativ 10.000 de specii dis-

tribuite ın 45 de familii. Acest numar a crescut la 12627 de specii pana ın 2006.

Aceste specii sunt ıncadrate ın 610 genuri si 46 familii; ın plus, se cunosc 488 de

specii fosile grupate ın 78 genuri si 5 familii (Moor si Ivanov, 2008). S-a estimat ca

exista, probabil, peste 50.000 de specii de trichoptere pe glob (Schmid, 1984).

S-a ıncercat, ın repetate randuri crearea unei filogenii a trichopterelor pornind de

la analiza caracterelor morfologice. Trichopterele sunt grupate ın trei mari grupe:

Annulipalpia, Integripalpia si Spicipalpia. Conform cunostintelor actuale primele

doua grupuri sunt considerate ca fiind monofiletice, ın timp ce Spicipalpia este con-

stituita din grupuri mai mult sau mai putin diferite. Familia Rhyacophilidae face

parte din acest grup divers. Grupul Spicipalpia a fost considerat, la un moment

dat, un grup bazal pentru Trichoptera (Wiggins si Wichard, 1989), dar acest lu-

cru este contestat de numeroase lucrari recente, bazate pe abordari moleculare sau

pe metode statistice avansate de prelucrare a datelor morfometrice (de ex., Ivanov,

1997, 2002;Kjer et al., 2001, 2002).

In Fauna Romaniei acest grup este reprezentat de peste 250 de specii (Ciubuc,

1993). Lista acestor specii a suferit schimbari ulterioare (de ex., Ujvarosi, 2002) si nu

poate fi considerata ca avand o forma finala. Familia cea mai mare de trichoptere

din Romania (ca si ın alte parti ale Europei – Banarescu, 1990) este cea a Lim-

nephilidaelor. Fauna de trichoptere a Carpatiilor contine un numar ridicat de specii

si subspecii endemice (Botosaneanu, 1973) apartinand familiilor de Limnephilidae

si Rhyacophilidae. Pe baza numarului crescut al speciilor endemice din Carpatii le

putem considera peninsule mediteraneene, subliniind rolul lor ca refugii pleistocene.

4

2 Familia Rhyacophilidae, grupul tristis si specia

Rhyacophila aquitanica

Familia de Rhyacophilidae este formata din patru genuri: Fansipangana, Hi-

malopsyche, Philocrena si Rhyacophila. Genul cel mai bine reprezentat este Rhya-

cophila, descris ın detaliu de catre Schmid (1970). Schmid (1970) a folosit diferite

caracteristici ale organelor genitale masculine pentru clasificarea acestui gen. Un

numar important de aspecte ce caracterizeaza femelele si larvele de Rhyacophila

sunt ınca necunoscute, prezentand un interes major pentru cercetatorii interesati de

grupul Trichoptera (de ex., Kumanski, 1971). Grupul tristis este considerat ca fiind

un reprezentant primitiv al genului Rhyacophila. Multe specii din acest gen sunt

limitate la zonele Crenale si Epirhitrale ale apelor curgatoare, unele specii putand

fi gasite si ın zonele mai joase (de ex., Rhyacophila tristis Pictet 1834).

Grupul tristis este unul dintre cele doua grupuri de Rhyacophila originare ın

Europa. Majoritatea speciilor din acest grup au o distributie limitata, multe dintre

ele fiind endemice pentru anumite masive muntoase; numai cateva specii sunt larg

raspandite (de ex., R. tristis). Grupul este absent ın Africa, iar limita estica de

distributie este Caucazul, cu trei specii cunoscute. Speciile endemice sunt distribuite

inegal ın Europa si ın Asia Mica: majoritatea endemismelor fiind semnalate ın Alpi,

Carpati si Balcani (de ex., Botosaneanu si Malicky, 1978; Botosaneanu si Marinkovic,

1967; Kumanski, 1987, 1998). Culoarea corpului ın cazul adultilor este, de obicei,

maro ınchis (de ex., McLachlan, 1879). Lungimea specimenelor este cuprinsa ın

intervalul 0,8 – 1,2 cm. Se cunosc ın acest moment nouasprezece specii din grupul

tristis. Larvele lor sunt adaptate la ape cu concentratii ridicate de oxigen dizolvat,

fenomenul fiind probabil rezultatul unei capacitati scazute de asimilare a oxigenului;

astfel, aceste larve pot fi considerate buni bioindicatori ai apelor curate.

Rhyacophila aquitanica a fost descrisa de Robert McLachlan ın 1879, ın lu-

crarea “A monographic revision and synopsis of the Trichoptera of the European

fauna”. Primele specimene de R. aquitanica au fost colectate de Eaton ın anii

1870 ın Masivul Central, Franta. McLachlan a ınteles imediat ca aceste spec-

imene nu apartin speciei R. tristis, ci sunt reprezentantii unei specii noi, dar foarte

asemanatoare. Holotipurile de R. aquitanica (identificate de Martin E. Mosely) au

fost colectate ın Mt. Mezenc, Masivul Central si sunt pastrate ın Muzeul de Istorie

Naturala, Londra, ın colectia McLachlan (nr. BM 1938-674). Rhyacophila aquitan-

ica a fost mentionata ıntr-o serie de localitati din Carpati, dar Botosaneanu (1995)

5

a subliniat ca ın multe cazuri specia a fost semnalata eronat, fiind prezenta numai

ın Carpatii Meridionali, ıntre Dunare si Valea Oltului. Perioada de zbor a speciei

este ın lunile iulie si august (Botosaneanu, 1957). Populatiile de R. aquitanica din

Carpati au fost descrise ca R. aquitanica ssp. carpathica de Botosaneanu (1995).

Existenta subspeciei nu a fost general acceptata, dar a fost confirmata mai tarziu

(Balint et al., 2008a). Balint et al. a gasit dovezi ca alaturi de populatiile din

Carpati, populatiile din Alpii de Sud sunt de asemenea, diferite de cele gasite ın

Masivul Central, Vosgi, Padurea Neagra etc.

6

3 Diferentiere si speciatie ın ape montane: diferente

morfologice ıntre populatiile de R. aquitanica

Analiza morfometrica a specimenelor de R. aquitanica colectate din ıntreaga

zona de distributie a speciei a fost efectuata pentru o ıntelegere mai completa a

biogeografiei specifice si pentru a adresa urmatoarele ıntrebari:

1. Sunt diferente semnificative ıntre populatile de R. aquitanica colectate din

diferite regiuni, adica este posibila identificarea entitatilor morfologice reprezen-

tative unei regiuni geografice bine conturate?

2. Mai multe entitati morfologice endemice sunt prezente ın diferitele sisteme

montane, sau o singura entitate apare ın mai multe masive muntoase?

3. Exista diferente cantitative ın ceea ce priveste variabilitatea morfologica ıntre

aceste entitati?

4. Exista diferente de variabilitate intrapopulationala ın grupurile geografice bine

conturate?

5. Care sunt implicatiile biogeografice si taxonomice?

Am analizat 126 de masculi de R. aquitanica si 4 de R. tristis (outgroup),

masurand doua caractere corporale si noua caractere ale organelor genitale. Anal-

iza discriminanta lineara s-a efectuat cu ajutorul programului SPSS. Analiza de

“clusteri” cu bootstrap a fost efectuata pe cele sase variabile cu cea mai mare

corespondenta ıntre fiecare variabila si primele doua functii discriminante folosind

pachetul R pvclust (Suzuki si Shimodaira, 2006).

Toate variabilele analizate au prezentat un grad considerabil de abatere. Populatiile

de R. aquitanica au prezentat o variabilitate geografica localizata, cu diferente sem-

nificative ıntre cele trei entitati geografice distincte: Europa de Vest, sud-estul Alpi-

lor (Lombardia si Carintia) si Carpatii Meridionali (Figura 1).

Pe baza caracterelor morfologice R. aquitanica este ımpartita ın trei grupuri

geografice clar diferentiate. Doua dintre aceste entitati sunt endemice ın Alpii de

Sud si ın Carpatii Meridionali, iar a treia este raspandita ın Masivul Central, Vosgi,

Padurea Neagra si cantonul Fribourg (CH). Acest lucru sugereaza o izolare veche

a populatiilor, diferentiate cel putin la nivel subspecific, dar probabil chiar si la

nivel specific. Centrele de diferentiere cele mai plauzibile ale acestor trei entitati

taxonomice au fost situate ın nord-vestul Alpilor, ın sudul Alpilor si ın apropierea

7

Carpatilor Meridionali. Izolarea populatiilor din Alpii de Sud si din Carpati s-a

petrecut, probabil, cu mult ınainte de glaciatiunea Wurm, ın timp ce populatiile din

Masivul Central, Padurea Neagra si Vosgi au fost izolate destul de recent. Populatiile

de R. aquitanica din Carpati si Alpi au supravietuit probabil ciclurilor glaciare ın

apropierea habitatelor actuale, cu schimbari de altitudine ın timpul oscilatilor cli-

matice pleistocene. O migratie mult mai extinsa a avut loc ın cazul grupului din

vestul Europei, care a avut probabil o distributie continua ın timpul perioadelor cu

temperaturi scazute; distributia populatiilor din acest grup a devenit fragmentata

numai ın timpul perioadelor interglaciale, caracterizate de temperaturi mai ridi-

cate. Toate acestea au condus la separarea recenta (cel mai probabil postglaciala)

a populatiilor din vest, fara divergenta morfologica ıntre ele.

Istoria cuaternara a fost diferita ın cazul speciilor acvatice, a celor din habitatele

terestre si a speciilor acvatice continentale/mediteraneene (Hewitt, 2004; Schmitt,

2007). In timp ce speciile terestre sau acvatice continentale/mediteraneene au reusit

sa efectuezea migratii extinse ın timpul schimbarilor climatice, populatiile speciilor

acvatice alpine au fost prinse ın loc de conditiile climatice si hidrologice nefavorabile.

Ca o consecinta, aparitia divergentelor si a evenimentelor de speciatie este mai

frecventa ın cazul acestor organisme.

8

Figura 1: Analiza de “clusteri” a specimenelor de R. aquitanica

9

4 Revizuirea taxonomica a speciei Rhyacophila

aquitanica (Trichoptera: Rhyacophilidae) pe baza

rezultatelor moleculare si morfologice si schim-

barea statutului taxonomic al Rhyacophila aqui-

tanica ssp. carpathica ın Rhyacophila carpath-

ica stat. n.

Pentru o buna perioada de timp identificarea corecta a speciilor R. aqui-

tanica si R. tristis s-a dovedit problematica, rezultand un numar mare de identificari

gresite. Problema diferentelor morfologice la nivelul organelor genitale masculine a

fost abordata ın mai multe publicatii (de ex., Schmid, 1970). Botosaneanu (1995),

avand ındoieli asupra identitatii populatiilor vest-europene cu cele din Carpati a

descris entitatile carpatine ca R. aquitanica ssp. carpathica. Existenta subspeciei

nu a fost acceptata de Malicky (2005), dar o analiza morfometrica recenta confirma

diferentierea morfologica a acestor entitati (Balint et al., 2008a). In prezentul studiu

am investigat bazele moleculare ale diferentelor morfologice dintre populatiile vest-

europene si carpatine de R. aquitanica si gradul de diferentiere a acestei a fata de

specia R. tristis.

In acest studiu molecular am folosit 15 specimene colectate cu plasa ın pe-

rioada 2006-2008 ın Masivul Central din Franta si ın Carpatii Meridionali. Indivizii

de R. tristis au fost colectati ın Franta si ın Romania. Specimenele au fost depozitate

ın alcool etilic concentrat ın vederea conservarii materialului genetic.

Abdomenul indivizilor masculi si picioarele unei femele au fost macerate ın solutie

tampon cu proteinaza K, dupa care ADN-ul a fost extras folosind kit-uri comerciale.

O secventa a genei mitocondriale pentru citocrom-oxidaza I ( ∼ 630 perechi de baze)

a fost amplificata folosind PCR, cu amorsele degenerate Jerry si S20. Fragmentul

a fost amplificat ın 35 de cicluri de PCR la o temperatura de aliniere de 40oC.

Secventele de 505 perechi de baze obtinute au fost aliniate si corectate folosind pro-

gramul MEGA 4 (Tamura, Dudley, Nei si Kumar 2007). Secventele de aminoacizi,

arborele neighbor-joining si de parsimonie maxima au fost generate ın MEGA 4.

Suportul statistic pentru arborii obtinuti a fost verificat prin bootstrap (100.000 de

repetitii). Distantele dintre speciile investigate au fost calculate folosind modelul

maximum composite likelihood.

10

Redescrierea speciei

Rhyacophila carpathica Botosaneanu, 1995 stat. n.

Rhyacophila aquitanica carpathica Botosaneanu, 1995

Figurile 2.1, 2.1a si 2.1b

Aspectul general seamana cu aspectul speciilor R. aquitanica si R. tristis : cu-

loarea corpului si aripilor este maro ınchis, lungimea aripilor anterioare este de 7-10

mm.

Organele genitale masculine: segmentul 9 al abdomenului este similar cu cel de

la R. aquitanica. Exista diferente importante ın ceea ce priveste forma segmentului

10, variabilitatea acestuia fiind recunoscuta de Botosaneanu (1995). Aici, dorim sa

descriem caracterele care pot ajuta la separarea facila a speciei R. aquitanica de R.

carpathica.

Dintr-o perspectiva laterala, partea dorsala a segmentului 10 este obtuza, cu o

indentare apicala careia ıi lipseste varful ascutit, caracteristica speciei R. aquitanica.

Diferentele sunt evidente si din perspectiva caudala: deschiderea segmentului 10 (db.

X) este larga ın cazul speciei R. carpathica, si ıngusta si ınchisa de varful respectiv

la R. aquitanica.

Specimenele tip de R. carpathica stat. n. au fost colectate de Bela Kis in 1969

ın Muntii Lotrului (Obarsia Lotrului si Valea Pravatului, 1500-1800 m), si au fost

identificate de Botosaneanu (1995). Holotipul mascul si sase paratipuri mascule

sunt pastrate ın Muzeul Zoologic din Amsterdam; un singur paratip mascul este

depozitat ın Muzeul de Istorie Naturala din Londra.

In Carpatii Meridionali R. carpathica se gaseste de multe ori ın aceasi vale cu

R. tristis. Dupa colectarea a numerosi indivizi ın diverse localitati putem sustine ca

R. carpathica domina regiunile de altitudine ale paraielor (regiuni Crenale si Crenal-

Epirhitrale), ın timp ce R. tristis este prezenta ın regiunile Epi- si Metarhithrale (si

chiar ın Hyporhithral, un exemplu bun fiind valea Iauna ın Muntii Cernei).

Secventele mitocondriale analizate au evidentiat existenta a importante diferente

nucleotidice ıntre cele doua specii. Majoritatea mutatiilor nucleotidice observate

sunt sinonime, cu putine exceptii. Sinonimiile observate se datoreaza degenerarii

codului genetic. Conform divergentelor la nivelul secventelor mitocondriale R. car-

pathica se afla la o distanta mai mare de R. aquitanica decat R. aquitanica fata

de R. tristis (Figura 3). Cladele de R. carpathica si R. aquitanica sunt sustinute

de valori ridicate de bootstrap, sustinerea fiind mai scazuta pentru R. tristis, care

reprezinta alte substructuri geografice.

11

Figura 2: Organele sexuale masculine la R. carpathica (1) si R. aquitanica (2)

12

Figura 3: Arbore neighbor-joining bazat pe secvente mitocondriale pentru R. car-pathica (rhyacarp), R. aquitanica (rhyaaqui) si R. tristis (rhyatris)

Diferentele observate la nivelul molecular corespund originii geografice a spec-

imenelor si diferentelor morfologice prezentate de Botosaneanu (1995) si Balint et al.

(2008a); consideram ca distinctia entitatilor R. aquitanica si R. carpathica la nivel

specific este justificata.

Delimitarea arealului de distributie a speciei R. aquitanica a fost ıntotdeauna

problematica deoarece specia prezinta numeroase similaritati cu R. tristis, rezultand

ıntr-un numar crescut de identificari eronate. Lista urmatoare contine regiunile unde

prezenta speciei R. aquitanica a fost confirmata de Balint et al. (2008b): Franta –

Masivul Central, Vosgi; Germania – Padurea Neagra; Italia – Alpii de Sud; Austria

– Carintia. Conform literaturii de specialitate aceasta lista reflecta opiniile general

acceptate privind distributia speciei; nu am reusit sa obtinem specimene din Elvetia,

unde prezenta speciei este mentionata de unii autori (de ex., Lubini-Ferlin si Vicen-

tini, 2005). Doi masculi de R. aquitanica a caror identitate a fost verificata (pastrati

ın Muzeul de Istorie Naturala din Londra) au fost colectati ıntr-o localitate numita

“Fribourg”, denumire ce se refera probabil la cantonul elvetian (Balint et al., 2008a).

13

5 Centre de speciatie si refugii pleistocene: struc-

turi moleculare la R. aquitanica si R. carpath-

ica

Analizele moleculare efectuate pe indivizi apartinand speciei R. aquitanica

au devenit esentiale pentru validarea rezultatelor aduse de studiile morfometrice.

Analizele moleculare au fost facute pornind de la specimene obtinute din ıntregul

areal de distributie a complexului, adica din: Franta, Germania, Italia, Austria si

Romania. Am folosit un segment conservat al genei mitocondriale pentru citocrom-

oxidaza I; acest fragment a furnizat deja rezultate bune pentru alte trichoptere,

de ex., Drusus discolor Rambur 1942 (Pauls et al., 2006). Secventele obtinute

de la indivizii de R. aquitanica si R. carpathica au fost comparate cu secventele

specimenelor de R. tristis si Rhyacophila orghidani Botosaneanu 1952.

Am ıncercat sa raspundem la urmatoarele ıntrebari:

1. Sunt speciile R. aquitanica si R. carpathica entitati monofiletice?

2. Este R. carpathica o entitate monofiletica?

3. In cazul speciei R. aquitanica putem gasi structuri genetice cu implicatii tax-

onomice?

4. Care sunt relatiile dintre R. tristis, R. aquitanica si R. carpathica?

5. Ce fel de procese de speciatie au contribuit la formarea structurilor actuale

observate ın complexul R. aquitanica?

6. Unde au fost localizate refugiile pleistocene ale speciilor R. aquitanica si R.

carpathica?

7. Care din aceste refugii au avut un rol important ın recolonizarea postglaciala

a speciilor analizate?

O colectare extensiva a fost efectuata ın vederea ıntelegerii diversitatii ge-

netice a populatiilor considerate anterior R. aquitanica. Diferentele dintre aceste

populatii au fost analizate folosind specimene de R. tristis si R. orghidani ca out-

group. Colectarea a fost realizata ın 2006, 2007 si 2008 ın ıntregul areal de distributie

a speciilor R. aquitanica si R. carpathica; un numar important de specimene a fost

obtinut de la entomologi din strainatate.

14

Indivizii au fost conservati ın alcool etilic concentrat; specimenele au fost identifi-

cate la nivel de specie (larvele si femelele la nivel de grup), folosind determinatoarele

lui Malicky (1983; 2004), Waringer and Graf (1997), operele lui Pitsch privind larvele

trichopterelor din Europa Centrala (1993) si un numar de articole stiintifice (de ex.,

Botosaneanu, 1995; Kumanski, 1971, 1987).

ADN-ul a fost extras din specimene mascule cand acest lucru a fost posibil,

deoarece identificarea masculilor pe baza examinarii organelor genitale este relativ

usoara, ın timp ce identificarea larvelor si femelelor nu este posibila pentru majori-

tatea speciilor din grupul tristis. In anumite cazuri a fost important sa folosim ADN

extras din larve si femele; ın aceste cazuri specimenele au fost identificate folosind

secventa nucleotidica. Metodele folosite pentru extragerea ADN-ului, PCR etc. au

fost similare cu cele prezentate ın sectiunea anterioara.

Majoritatea secventelor au fost obtinute ın Centrul de Biologie Moleculara al Uni-

versitatii Babes-Bolyai din Cluj-Napoca, iar cateva probe (38) au fost secventate la

o companie comerciala din Germania (AGOWA). Am obtinut o matrice continand

secvente cu o lungime de 477 de perechi de baze, pentru 168 specimene. Identi-

tatea secventelor a fost verificata prin BLAST (Altschul et al., 1997) – acestea s-au

aliniat cu alte secvente mitocondriale de trichoptere (de ex., Hesperophylax designa-

tus Walker 1852 – Myers et al., 2001; Drusus annulatus Stephens 1837 – Pauls

et al., 2008).

Calculele statistice au fost efectuate folosind programul MEGA 4 (Tamura,

Dudley, Nei si Kumar 2007). Haplotipurile au fost identificate ın DnaSP4 (Rozas

et al., 2003). Arborii neighbor-joining, UPGMA au fost construiti ın MEGA 4.

Suportul statistic pentru acesti arbori a fost verificat folosind metoda bootstrap

(20.000 de repetitii – Felsenstein, 1981); pentru arborii NJ am aplicat si testul

interior branch. Un arbore de parsimonie maxima a haplotipurilor identificate a

fost construit ın MEGA 4 si a fost verificat prin bootstrap (100 000 de repetitii).

Arborii maximum likelihood au fost construiti ın programul Garli 0.96 (Zwickl,

2006), folosind General Time Reversible (GTR) ca model de substitutii. Analizele

bayesiene au fost efectuate ın MrBayes 3.2 (Huelsenbeck si Ronquist, 2001), cu

setarile intrinseci (GTR+Γ+I). Doua analize independente si simultane au fost efec-

tuate folosind 2 000 000 de generatii pentru baza de date cu haplotipuri si 6 000

000 de generatii pentru baza de date cu specimene. Arborii produsi de MrBayes

si Garli au fost vizualizasi ın TreeView 1.6.6 (Page, 2002).

Ca alternative ale unor arbori (Posada si Crandall, 2001) am construit retele

filogenetice; pentru aceste retele am folosit modelele de median-joining (Bandelt

15

Tabela 1: Relatiile ıntre R. aquitanica, R. tristis si R. carpathicaNJ UPGMA B/MC/MC MP

statuts bs statut bs statut pp statut bsR. aquitanica poli - poli - poli - poli -R. aquitanica (Masivul Central) mono 99 mono 100 mono 0.98 mono 99R. aquitanica (Alpii de Sud) mono 98 mono 99 mono 1.00 mono 96R. carpathica mono 100 mono 96 mono 1.00 mono 99R. tristis mono 95 mono 100 mono 0.99 mono 93

mono – monofiletic, poli – polifiletic, bs – bootstrap, pp – probabilitate posterioara

et al., 1999) implementate ın programul Network 4.502 (Fluxus Technology Ltd.,

2008).

Structurile genetice ale populatiilor au fost analizate cu AMOVA (Analysis of

MOlecular VAriance, Weir si Cockerham, 1984; Excoffier et al., 1992; Weider et al.,

1996) implementate ın Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005). Valorile FST si testul

exact al diferentierii (Raymond and Rousset, 1995; Goudet et al., 1996) au fost

calculate, respectiv efectuat ın programul Arlequin. Corelatiile Pearson dintre

valorile FST si distanta geografica logtransformata dintre populatii au fost calculate

ın programul R (R Core Development Team, 2007).

Analizele moleculare au dezvaluit structuri genetice robuste ıntre R. tristis,

R. carpathica, R. orghidani si cladele de R. aquitanica din Masivul Central si Alpii

de Sud. Aceste rezultate au subliniat validitatea clasificarilor existente si au facut

dovada existentei unor structuri necunoscute ın complexul R. aquitanica.

Folosind metode diferite pentru realizarea arborilor s-a ajuns la rezultate similare

atat ın ceea ce priveste topologia cladogramelor cat si suportul statistic al acestora

(aici prezentam rezultatul analizei bayesiene, Figura ??). Specimenele problematice

(larvele si femelele) au fost identificate dupa gruparea lor ın clade bine sustinute din

punct de vedere statistic. Rhyacophila orghidani ocupa o pozitie bazala ın aceste

analize, confirmand clasificarea propusa de Schmid (1970). Monofilia speciilor R.

tristis si carpathica este bine suportata; R. aquitanica este clar polifiletica, alcatuita

din doua clade monofiletice bine suportate (cele din nord-vestul Alpilor si cele din

Alpii de Sud, Tabel 1). Substructuri importante au fost descoperite ın Masivul

Central si ın Alpii de Sud.

Relatiile dintre grupele R. aquitanica din Masivul Central si din Alpii de Sud

sunt prezentate cu ajutorul unei retele median-joining (Figura 5). Exista numeroase

mutatii ıntre cladele de R. aquitanica din Masivul Central si Alpii de Sud; sunt clar

vizibile accentuatele substructuri din clada de vest.

Au fost identificate 29 de haplotipuri de R. aquitanica si R. carpathica. Tes-

16

Figura 4: Arbore filogenetic construit prin metode bayesiene folosind 168 de indivizide R. tristis, R. aquitanica, R. carpathica si R. orghidaniSunt prezentate probabilitati posterioare ≥ 0.95.

17

Figura 5: Retea median-joining pentru specia Rhyacophila aquitanica (cladele dinMasivul Central si Alpii de Sud) si R. carpathicaEste indicat numarul mutatilor ıntre entitati.

18

Tabela 2: Rezultatele testului AMOVA cu suport statistic bazat pe 10100 depermutatii

Intre indivizi, ın populatii Intre populatii, ınspecii/clade

Intre specii/clade

Procentul variabilitatii 4.13 % 9.75 % 86.13 %Indice de fixatie φST = 0.95874 φSC = 0.70262 φCT = 0.86126Suport statistic p < 0.001 p < 0.001 p < 0.001

tul AMOVA a evidentiat diferente genetice semnificative la fiecare nivel structural

(ıntre indivizii din populatii, ıntre populatii si ıntre specii/clade; toate valorile φ

sunt semnificative, Tabel 2). Variabilitatea genetica cea mai accentuata poate fi ob-

servata la nivelul speciilor/cladelor; valoarea φST este ridicata (0,95874, p <0,001),

evidentiind un grad ridicat de diferentiere ıntre grupurile geografice predefinite.

Valorile FST si testul exact al diferentierii dintre populatii au dezvaluit o diferentiere

puternica ıntre populatii. Valorile FST s-au corelat ın mod semnificativ cu distantele

geografice dintre populatiile de R. aquitanica si R. carpathica (Figura 6a, df = 64,

coeficient de corelatie cc = 0,83, p < 0,001) analizate. Valorile FST au prezentat

corelatii semnificative cu distantele geografice dintre populatiile din clada Masivului

Central (Figura 6b, df = 8, cc = 0,799, p = 0,006) Nu am gasit corelatii semni-

ficative ın cazul cladei de R. aquitanica din Alpii de Sud (Figura 6c, df = 4, cc =

0.451, p = 0.369) si la R. carpathica (Figure 6d: df = 1, cc = -0.241, p = 0.845).

Un arbore maximum likelihood proiectat pe harta Europei evidentiaza de aseme-

nea puternicele corelatii dintre distantele genetice si cele geografice (Figura 7).

Rezultatele studiului molecular au confirmat rezultatele studiului morfomet-

ric. Structurile geografice si morfologice identificate au fost regasite si la nivel molec-

ular: existenta celor doua clade de R. aquitanica (cele din zonele de la nord-vest

de Alpi si cele din Alpii de Sud) este puternic sustinuta, iar diferentierea speciei R.

carpathica ca o entitate monofiletica este sustinuta ın continuare.

In urma analizarii rezultatelor genetice putem respinge monopfilia complexului

R. aquitanica. Dovezile moleculare sustin teoria conform careia clada de R. aqui-

tanica din Alpii de Sud reprezinta o specie criptica. O analiza mai completa a

caracterelor morfologice ale indivizilor de R. aquitanica din Alpii de Sud ne vor per-

mite probabil, descrierea taxonomica a acestei entitati criptice endemice. Monofilia

ambelor clade (din Masivul Central si din Alpii de Sud) este puternic suportata

de secventele analizate, confirmand opinia originala a autorului speciei R. aquitan-

ica (McLachlan, 1879), care a sustinut ca aceasta specie reprezinta un endemism

adevarat al Europei de Vest.

19

●

●

● ●

●●●●

●●●

●●

●

●●●

●

●●●

●

● ●●●

●

●●●

●●●●

●

●●●

●●●●

●●●

●

●

●

●●

●●

●

●●

●

●

●●●●●●

●

●●

0 500 1000 1500

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

a

Geographic distance (km)

Pop

ulat

ion

diffe

rent

iatio

n (F

st v

alue

s)

●

●

● ●

●●

●●

● ●

0 100 200 300 400 500 600 700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

b

Geographic distance (km)

Pop

ulat

ion

diffe

rent

iatio

n (F

st v

alue

s)

●

●

●

●

●

●

0 50 100 150 200 250

0.2

0.4

0.6

0.8

c

Geographic distance (km)

Pop

ulat

ion

diffe

rent

iatio

n (F

st v

alue

s)

●

●

●

30 35 40

0.00

0.05

0.10

0.15

d

Geographic distance (km)

Pop

ulat

ion

diffe

rent

iatio

n (F

st v

alue

s)

Figura 6: Distanta geografica vs. diferentierea dintre populatii (FST)a – toate populatiile ambelor clade de R. aquitanica si R. carpathica; b – R. aqui-tanica, Masivul Central; c – R. aquitanica, Alpii de Sud; d – R. carpathica

20

Figura 7: Arborele maximum likelihood pentru specimenele de R. aquitanica si R.carpathica, proiectat pe harta Europei

Pe baza putinelor specimene analizate, pare posibil ca R. tristis sa fie o entitate

monofiletica aflata la o distanta similara fata de cladele de R. aquitanica si R.

carpathica. Distantele similare dintre aceste entitati sunt probabil, rezultatul unor

procese de speciatie care au avut loc ıntr-un timp relativ scurt.

Diversitatea moleculara si morfometrica a organismelor investigate sub-

liniaza existenta evenimentelor de speciatie alopatrica, care au avut loc ın trecutul

ındepartat, cu mult ınainte de ultima era glaciara. Structura populatiilor arata

totusi ca si ultimele schimbari climatice au jucat un rol important ın dezvoltarea

prezentei distributii a diversitatii genetice a speciilor studiate.

Majoritatea habitatelor de R. carpathica din Carpati au fost repopulate cu un

singur haplotip, ın timp ce, o singura localitate (lacul Gales din Retezat) pastreaza

o diversitate a haplotipurilor unica, care se regaseste numai aici. Acest fenomen este

probabil rezultatul repopularii Carpatiilor dintr-un numar limitat de refugii (Figura

8).

In cazul cladei din Masivul Central se pare ca specia a supravietuit ın refugii

multiple. Rezultatele genetice sustin ipoteza formulata pornind de la rezultatele

morfometrice – cel mai probabil recolonizarea postglaciala recenta a zonelor nordice

21

Figura 8: Figura 8: Rute potentiale de recolonizare pentru specia R. carpathica ınCarpati

Figura 9: Refugii si rute potentiale de recolonizare pentru populatiile de R. aqui-tanica ın Europa de vest

22

Figura 10: Rute potentiale de recolonizare pentru specia R. aquitanica ın Alpii deSud

de distributie a speciei (de ex., Vosgi, Padurea Neagra) s-a efectuat din refugii

localizate ın nordul Masivului Central (Figura 9).

Clada din Alpii de Sud prezinta o remarcabila diversitate genetica; din hap-

lotipurile identificate pentru specia R. aquitanica, aici, multe apar ın toate populatiile

investigate. Probabil, ultima repopulare a partilor nordice ale Italiei a fost efectuata

simultan din numeroase refugii glaciare; populatiile au supravietuit schimbarilor cli-

matice cu ajutorul unei scurte migratii verticale. Unele haplotipuri sunt regasite ın

mai multe populatii din Alpii de Sud ca rezultat al unui flux genic recent (Figura

10).

Studiul scoate ın evidenta rolul Carpatilor, Alpilor de Sud si al Masivului Cen-

tral ca centre importante de speciatie pentru organismele acvatice montane. Aceste

masive muntoase au jucat un rol esential ca zone de refugiu ın timpul schimbarilor

climatice pleistocene pentru speciile cu o capacitate limitata de dispersie. Astazi,

habitatele speciilor cu caracteristici ecologice similare cu ale R. aquitanica, R. car-

pathica etc. (multe insecte acvatice, amfibieni) sunt foarte importante ın conservarea

biodiversitatii montane si au nevoie de protectie.

23

6 Concluzii

Evenimentele de speciatie care stau la baza formarii speciei R. carpathica si

a celor doua clade de R. aquitanica au devenit evidente. Aceste entitati prezinta

caracteristici distincte ın morfologie, dar si la nivelul ADN-ului mitocondrial. Cen-

trele de speciatie ale acestor entitati par a fi fost Carpatii, Alpii de Sud si Masivul

Central, fluxul genic fiind ıntrerupt, probabil, cu mult ınainte de glaciatia Wurm.

Rhyacophila carpathica si cladele de R. aquitanica din Masivul Central si Alpii de

Sud s-au format cel mai probabil ın urma evenimentelor de speciatie alopatrica.

Aceste entitati sunt separate astazi de distante geografice mari si de o multitudine

de habitate neadecvate.

Datele morfometrice si distantele genetice sugereaza ca specia R. carpathica s-a

despartit mai devreme de R. aquitanica, ın timp ce fluxul genic dintre cladele din

Alpii de Sud si cele din vest s-a oprit ceva mai tarziu. Rhyacophila tristis, specie larg

raspandita, este situata la o distanta genetica apropiata fata de aceste entitati. Pe

baza rezultatelor morfometrice si genetice putem afirma ca evenimentele de speciatie

au avut loc, probabil, ıntr-o perioada relativ scurta. Se pare ca procese alopatrice de

speciatie au jucat un rol important ın separarea de R. aquitanica si R. carpathica.

Rezultatele noastre nu sunt suficiente pentru a ne ındreptati sa tragem concluzii

despre istoria pleistocena a specii R. tristis. Deoarece ın timpul studiilor am folosit

un numar relativ mare de specimene de R. tristis, obtinute din localitati distincte,

putem totusi lansa unele ipoteze interesante privind originea acestei specii, ipoteze

care pot fi verificate ın viitorul apropiat.

Ipotetic vorbind, este posibil ca ın timp ce stramosii R. aquitanica si R. car-

pathica au fost fortati sa supravietuiasca perioadelor glaciare ın Carpati, Alpi si

Masivul Central, stramosii R. tristis au trecut, probabil, printr-o migratie lunga si

au supravietuit undeva ın sud. Diferentele genetice (si probabil morfologice si ecolog-

ice) acumulate ın timpul perioadelor petrecute ın izolatie au ımpiedicat amestecarea

stramosilor R. tristis cu stramosii ai R. aquitanica si carpathica dupa recolonizarea

postglaciala.

Reconstructia rutelor de recolonizare a devenit posibila ın urma obtinerii

rezultatelor morfometrice si moleculare, care sunt relativ similare ıntre marile regiuni

geografice. Cu toate acestea, exista cateva neconcordante ıntre rezultatele morfo-

metrice si cele genetice ın ceea ce priveste mai ales relatiile populatiilor din Carpati.

Pe baza morfometriei pare plauzibil ca recolonizarea recenta a zonelor contemporane

de distributie ale speciei R. aquitanica ın vestul Europei sa fi fost efectuata dintr-un

numar scazut de refugii.

24

In Alpii de Sud rezultatele genetice sustin ipoteza morfometrica privind recolo-

nizarea habitatelor actuale din multiple refugii glaciare: exista un numar crescut de

haplotipuri comparativ cu numarul specimenelor analizate si majoritatea acestora

distribuite ıntre mai multe localitati. Aceast fenomen poate fi rezultatul unui flux

genic destul de recent ıntre diferitele localitati din Alpi.

Populatiile apartinand cladei R. aquitanica din Masivul Central prezinta struc-

turi diferite: populatiile din nord si cele din sud nu au haplotipuri comune. Populatiile

din partea sudica a Masivului Central (Mont Aigoual si Montagne Noire) sunt com-

plet separate, ın timp ce, cele mai multe populatii din nord (colectate ın vechea

regiune vulcanica Auvergne – Mt. Mezenc, Boree) sunt mult mai asemanatoare.

Comparand populatiile din sud cu cele din nord observam ca acestea sunt caracter-

izate de un numar redus de haplotipuri, cateva din aceste haplotipuri regasindu-se

ın mai multe localitati. In Vosgi si ın Padurea Neagra am gasit un singur haplotip

care este mult mai asemanator cu haplotipurile gasite ın Auvergne, decat cele din

Auvergne cu haplotipurile gasite ın sudul Masivului Central, ın ciuda distantei ge-

ografice considerabile. Specimenele analizate morfometric au fost colectate numai

ın regiunea Auvergne, Padurea Neagra si Vosgi (plus doua specimene din Elvetia)

si astfel, putem afirma ca similaritatea morfologica si genetica a specimenelor este

rezultatul unei divergente recente, care a avut loc cel mai probabil dupa glaciatiunea

Wurm.

Rezultatele genetice obtinute analizand cateva populatii din sudul Masivului

Central au adaugat mai multe detalii la istoria cladei occidentale a speciei R. aqui-

tanica. Aceste populatii sunt izolate din punct de vedere genetic si se pare ca fluxul

genic nu a fost restabilit ıntre ele dupa ultimul ciclu glaciar. Explicatia cea mai

plauzibila pentru diversitatea genetica observata ın Masivul Central este existenta

multiplelor refugii pleistocene extra-mediteraneene ın aceasta regiune. Dupa era

glaciara (dupa glaciatia Wurm) doar populatiile din nord au contribuit la extin-

derea arealului speciei, ın timp ce populatiile din sud au fost prinse de conditiile

nefavorabile ın apropierea refugiilor. Izolarea populatiilor sudice a fost facilitata si

ın perioada postglaciala cand ariditatea crescuta a ımpiediat extinderea eficienta

a populatiilor. Populatiile nordice au trecut prin efecte de bottleneck, suferind o

”saracire” genetica ın timpul expansiunilor recente.

Situatia populatiilor de R. carpathica este destul de interesanta. In timp ce rezul-

tatele morfometrice indica existenta refugiilor multiple ın era glaciara, rezultatele

genetice au identificat un singur haplotip mtCOI foarte raspandit, fiind unicul hap-

lotip la aproape toate siturile studiate, cu exceptia unei localitati de altitudine din

Retezat (2000 m, lacul Gales), unde au fost gasite cinci haplotipuri.

25

In contrast cu rezultatele morfometrice, cele genetice prezinta dovada ca recolo-

nizarile recente au fost probabil efectuate din foarte putine refugii glaciare. Populatia

de la lacul Gales prezinta patru haplotipuri unice alaturi de cel mai raspandit hap-

lotip. Majoritatea habitatelor din Carpati au fost recolonizate probabil printr-o

expansiune rapida a haplotupului dominant. Haplotipurile care nu au fost eficiente

ın recolonizare au ramas ın apropierea refugiilor glaciare. Odata cu ıncalzirea cli-

matului habitatele potrivite pentru acestea s-au mutat la altitudini mai mari. Acest

lucru poate explica de ce exista cinci haplotipuri ıntr-un habitat de mare altitudine,

ın timp ce un singur haplotip domina habitatele mai joase.

Importanta muntilor din Europa Centrala ın conservare este accentuata;

acestia au servit ca refugii ın timpul glaciatiunilor pleistocene, contribuind la supra-

vietuirea speciilor acvatice montane ın zone extra-mediteraneene. Majoritatea habi-

tatelor actuale ale speciilor cu preferinte ecologice similare cu cele ale R. aquitanica

si R. carpathica sunt localizate ın apropierea refugiilor glaciare. Aceste zone sunt

adaposturi foarte importante, ın timpul perioadelor reci, pentru aceste specii car-

acterizate prin capacitate limitata de raspandire, iar astazi, sunt esentiale ın con-

servarea diversitatii genetice a acestora. Aceste adaposturi sunt adevarate “puncte

fierbinti” ale biodiversitatii, iar ıntelegerea rolului lor contribuie la conservarea di-

versitatii montane europene.

26

7 Multumiri

As dori sa multumesc ın primul rand conducatorului meu Prof. Dr. Octavian

Popescu; Dr. Lujza Ujvarosi, Dr. Peter C. Barnard, Dr. Thomas Schmitt,

Peter Neu, Gennaro Coppa, Prof. Dr. Hans Malicky, Dr. Wolfram Graf, Dr.

Verena Lubini, Dr. Steffen Pauls, Kathrin Theissinger, Dr. Lazare Botosaneanu,

Dr. Marco Valle, Dr. Andrea Sundermann, Dr. Endre Sarkany-Kiss, Dr.

Omar Lodovici, Dr. Zoltan Laszlo si Cristi Domsa pentru idei si pentru aju-

torul acordat ın timpul colectarii probelor si analizarii datelor. Ideea principala a

studiului a venit de la Lujza Ujvarosi, care m-a sprijinit pe parcursul fiecarei faze

lucrarii, de la colectarile din teren pana la identificarea specimenelor. Cele mai multe

specimene R. aquitanica au fost analizate morfometric ın Muzeul de Istorie Naturala

din Londra cu ajutorul unui grant SYNTHESYS, acordat de Uniunea Europeana;

unele specimene au fost analizate ın Muzeul Senckenberg ca urma castigarii unui

grant Communitas. Colectarile si procesarile din laborator au fost finantate partial

de granturile CNCSIS 1342/2006, CNCSIS-TD 38/2007, alocate de guvernul roman

si de Fundatia Eurotrans. O bursa DAAD asigurata de guvernul german a facut

posibila pregatirea unui manuscris despre diversitatea morfologica a speciei studi-

ate; imaginile SEM au fost facute la Centrul de Microscopie Electronica din Cluj cu

ajutorul d-lui Dr. Lucian Barbu si a Prof. Dr. Constantin Craciun. As dori sa

multumesc colegilor mei (ın special Dr. Beatrice Kelemen, Dr. Annette DAmert,

Dr. Iulia Lupan, Sergiu Chira, Dr. Beatrix Ferencz, Endre Jakab, Szilard

Bucs) de la Centrul de Biologie Moleculara pentru ajutorul oferit pe parcursul re-

alizarii analizelor moleculare. In final as dori sa multumesc Csopi – Noemi-Krisztina

Nagy -- pentru sprijinul si rabdarea de care a dat dovada pe parcursul fiecarei etape

a lucrarii, de la lungile campanii de colectare pana la analizele stresante ale datelor

obtinute. Fara ea, toate aceste etape ar fi fost mult mai putin interesante.

27

8 Publicatii

[1] Balint, M., P. C. Barnard, T. Schmitt, L. Ujvarosi and O. Popescu: 2008, ‘Dif-

ferentiation and speciation in mountain streams: a case study in the caddisfly

Rhyacophila aquitanica (Trichoptera)’. Journal of zoological systematics and

evolutionary research 46(4), 340-345.

[2] Balint, M., E. Sarkany-Kiss and M. Braun: 2006, ‘Changes in caddis larvae

community composition: effect of unknown contaminants’. In: K. C. Donelly

and L. H. Cizmas (eds.): Environmental Health in Central and Eastern Europe.

pp. 73-80, Springer, Dordrecht, The Netherlands.

[3] Balint, M. and L. Ujvarosi: 2008, ‘Distribution patterns of Hydropsyche incog-

nita (Pitsch 1993) and H. pellucidula (Curtis 1834) in Transylvania, with

special reference on their ecological requirements (Trichoptera: Hydropsychi-

dae)’. Bulletin de la Societe des naturalistes luxembourgeois -, accepted for

publication.

[4] Balint, M., L. Botosaneanu, L. Ujvarosi and O. Popescu: 2008, ‘Taxonomic

revision of Rhyacophila aquitanica (Trichoptera: Rhyacophilidae), based on

molecular and morphological evidences and change of taxon status of Rhya-

cophila aquitanica ssp. carpathica to Rhyacophila carpathica stat. n.’. Zootaxa

-, submitted for publication.

[5] Pauls, S. U., K. Theissinger, L. Ujvarosi, M. Balint and P. Haase: 2008, ‘Pat-

terns of population structure in two closely related, sympatric caddisflies in

Eastern Europe: historic introgression, limited dispersal and cryptic diver-

sity’. Journal of the North American Benthological Society -, submitted for

publication.

[6] Sarkany-Kiss, A., M. Balint, M. Braun, D. Z. Szabo, Zs. Szabo and Zs. Bıro:

2006, ‘A Szamos bentonikus makrogerinctelen kozossege a nagybanyai cianid-

szennyezes utan’. In: I. Mocsi and T. Neda (eds.): Proceedings of the Sapientia

Environmental Science Conference. pp. 213-228, Sapientia University, Cluj,

Romania.

[7] Sarkany-Kiss, E. and M. Balint: 2007, ‘A szekelyfoldi folyovizek kornyezet- es

termeszetvedelmi problemai’. In: R. Horvath (ed.): A szekelyfoldi fejlesztes

alapjai. UDMR / RMDSZ, Cluj, Romania, pp. 103-122.

28

[8] Buczko, K., E.K. Magyari, J. Kedl, M. Braun and M. Balint: 2008, ‘Multi-fold

use of siliceous microfossils in palaeoecological reconstruction: a case study

from the Southern-Carpathians’. In: N. Jasprica, A. Car and M. Calic (eds.):

Abstracts book of the 20th International Diatom Symposium, pp. 113.

[9] Buczko, K., E.K. Magyari, M. Braun and M. Balint: 2008, ‘Use of diatoms in

paleoecological reconstruction in the Carpathian region’. In: M. Cantonati,

A. Scalfi and E. Bertuzzi (eds.): Abstracts of the 2nd Central Europan Diatom

Meeting, pp. 62.

[10] Balint, M.: 2007, ‘Populations of Rhyacophila aquitanica (McLachlan 1879) in

potential high-mountain speciation centers: signs of isolation’. In: Abstracts

of the Phylogeography and Conservation of Postglacial Relicts. Musee national

d´histoire naturelle Luxembourg, pp. 76.

[11] Balint, M.: 2005a, ‘Antropogen eredetu szennyezodes kimutatasa a Szamos

menten tegzeskozossegek (Insecta: Trichoptera) szerkezetet hasznalva bio-

indikatorkent (Bioindication using Trichoptera along the Somes River)’. In:

P. Bıro (ed.): Abstracts of the XLVII. Hidrobiology Days. Tihany, Hungary.

[12] Balint, M.: 2008, ‘Jegkorszak a Karpatokban (Ice age in the Carpathians)’. In:

Abstracts of the IX. Biology Days. Cluj, Romania.

[13] Balint, M. and L. Ujvarosi: 2007, ‘Eghajlatvaltozas es speciacio: morfologiai

kulonbsegek egy magashegyi tegzesfaj populacioi kozott (Speciation and cli-

mate change: morphological differences among populations of a high-mountain

caddisfly)’. In: Abstracts of the VIII. Biology Days. Cluj, Romania.

[14] Sarkany-Kiss, E., M. Balint and M. Braun: 2004, ‘Changes of Trichoptera

populations in the Somes River (Romania) in 2002 November as an effect of

different pollutions’. In: Abstracts of the V. Biology Days. Cluj, Romania.

29

Bibliografie

***: 2007, ‘R: A language and environment for statistical computing, R Develop-

ment Core Team’. Computer program, http://www.r-project.org/.

***: 2008, ‘Network 4.502, Fluxus Technology Ltd’. Computer program, Suffolk,

England, http://www.fluxus-engineering.com/.

Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller,

and D. J. Lipman: 1997, ‘Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of

protein database search programs’. Nucleic acids research 25(17), 3389–3402.

Bandelt, H. J., P. Forster, and A. Rohl: 1999, ‘Median-joining networks for inferring

intraspecific phylogenies’. Molecular biology and evolution 16(1), 37–48.

Balint, M., P. C. Barnard, T. Schmitt, L. Ujvarosi, and O. Popescu: 2008a, ‘Dif-

ferentiation and speciation in mountain streams: a case study in the caddisfly

Rhyacophila aquitanica (Trichoptera)’. Journal of zoological systematics and evo-

lutionary research 46(4), 340–345.

Balint, M., L. Botosaneanu, L. Ujvarosi, and O. Popescu: 2008b, ‘Taxonomic revi-

sion of Rhyacophila aquitanica (Trichoptera: Rhyacophilidae), based on molecular

and morphological evidences and change of taxon status of Rhyacophila aquitan-

ica ssp. carpathica to Rhyacophila carpathica stat. n.’. Zootaxa -, submitted for

publication.

Banarescu, P.: 1990, Zoogeography of fresh waters. AULA-Verlag, Wiesbaden.

Botosaneanu, L.: 1957, ‘Recherches sur les Trichopteres (imagos) de Roumanie’.

Bulletin Entomologique de la Pologne 26(25), 383–460.

Botosaneanu, L.: 1973, ‘Les Trichopteres de l’espace carpato-balkanique, four-

nisseurs de documents pour l’etude de l’evolution’. Rivista di Biologia 12, 119–152.

Botosaneanu, L.: 1995, ‘Additional documents to the knowledge of the Trichoptera

of Romania, with data on European taxa from outside this country (Insecta:

Trichoptera)’. Faunistische Abhandlungen 20, 57–88.

Botosaneanu, L. and H. Malicky: 1978, Limnofauna Europaea, Chapt. Trichoptera,

p. 333–359. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart.

Botosaneanu, L. and M. Marinkovic: 1967, ‘Sur quelques Rhyacophila du groupe de

tristis (Trichoptera)’. Annales de la Societe Entomologique de France 3, 1145–

1151.

30

Ciubuc, C.: 1993, ‘Checklist of Romanian Trichoptera (Insecta)’. Travaux du Mu-

seum National d’Histoire Naturelle ”Grigore Antipa” 33, 11–147.

Excoffier, L., G. Laval, and S. Schneider: 2005, ‘Arlequin ver. 3.0: An integrated

software package for population genetics data analysis’. Evolutionary bioinfor-

matics online 1, 47–50.

Excoffier, L., P. E. Smouse, and J. M. Quattro: 1992, ‘Analysis of molecular variance

inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human

mitochondrial DNA restriction data’. Genetics 131(2), 479–491.

Felsenstein, J.: 1981, ‘Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likeli-

hood approach’. Journal of molecular evolution 17(6), 368–376.

Goudet, J., M. Raymond, T. de Meeus, and F. Rousset: 1996, ‘Testing differentiation

in diploid populations’. Genetics 144(4), 1933–1940.

Hewitt, G. M.: 2004, ‘The structure of biodiversity – insights from molecular phy-

logeography’. Frontiers in Zoology 1(4), 4.

Huelsenbeck, J. P. and F. Ronquist: 2001, ‘MrBayes: Bayesian inference of phy-

logenetic trees’. Bioinformatics (Oxford, England) 17(8), 754–755.

Ivanov, V. D.: 1997, ‘Rhyacophiloidea: a paraphyletic taxon’. In: R. W. Holzen-

thal and O. S. Flint (eds.): Proceedings of the 8th International Symposium on

Trichoptera. pp. 189–193, Ohio Biological Survey, Columbus, USA.

Ivanov, V. D.: 2002, ‘Contribution to the Trichoptera phylogeny: new family tree

with consideration of Trichoptera-Lepidoptera relations’. Nova Supplementa En-

tomologica 15, 277–292.

Kjer, K. M., R. J. Blahnik, and R. W. Holzenthal: 2001, ‘Phylogeny of Trichoptera

(caddisflies): characterization of signal and noise within multiple datasets’. Sys-

tematic biology 50(6), 781–816.

Kjer, K. M., R. J. Blahnik, and R. W. Holzenthal: 2002, ‘Phylogeny of caddisflies

(Insecta, Trichoptera)’. Zoologica Scripta 31(1), 83–91.

Kumanski, K.: 1971, ‘Beitrag zur Kenntnis der Wasserstadien einiger Rhyacophila-

Arten (Rhyacophilidae, Trichoptera)’. Bulletin de l’Institut de Zoologie et Musee,

Sofia 33, 49–70.

31

Kumanski, K.: 1987, ‘On the group of tristis of genus Rhyacophila in Bulgaria

with description of a new species (Trichoptera, Rhyacophilidae)’. Acta Zoologica

Bulgarica 35, 16–22.

Kumanski, K.: 1998, ‘Rhyacophila margaritae: a new insect species (Trichoptera:

Rhyacophilidae) from Bulgaria’. Dokladi na Bulgarskata Akademia na Naukite

51(3-4), 59–62.

Lubini-Ferlin, V. and H. Vicentini: 2005, ‘Der aktuelle Kenntnisstand der Kocher-

fliegenfauna (Insecta: Trichoptera) der Schweiz’. Lauterbornia 54, 63–78.

Malicky, H.: 1983, ‘Chorological patterns and biome types of European Trichoptera

and other freshwater insects’. Archiv fur Hydrobiologie 96(2), 223–244.

Malicky, H.: 2004, Atlas of European Trichoptera. Springer, New York, 2 edition.

Malicky, H.: 2005, ‘Ein kommentiertes Verzeichnis der Kocherfliegen (Trichoptera)

Europas und des Mediterrangebietes’. Linzer biologische Beitrage 37, 533–596.

McLachlan, R.: 1879, A monographic revision and synopsis of the Trichoptera of

the European fauna. John van Voorst, London.

Moor, F. C. d. and V. D. Ivanov: 2008, Freshwater animal diversity assessment,

Chapt. Global diversity of caddisflies (Trichoptera: Insecta) in freshwater, pp.

393–407. Springer, The Netherlands.

Morse, J. C.: 1997, ‘Phylogeny of Trichoptera’. Annual review of entomology 42(1),

427–450.

Myers, M., F. Sperling, and V. Resh: 2001, ‘Dispersal of two species of Trichoptera

from desert springs: conservation implications for isolated vs connected popula-

tions’. Journal of insect conservation 5(3), 207–215.

Page, R. D. M.: 2002, Current Protocols in Bioinformatics, Vol. 6, Chapt. Visu-

alizing phylogenetic trees using TreeView, p. Unit 6.2. John Wiley and Sons,

Inc.

Pauls, S. U., W. Graf, P. Haase, H. T. Lumbsch, and J. Waringer: 2008, ‘Grazers,

shredders and filtering carnivores–the evolution of feeding ecology in Drusinae

(Trichoptera: Limnephilidae): insights from a molecular phylogeny’. Molecular

phylogenetics and evolution 46(2), 776–791.

32

Pauls, S. U., H. T. Lumbsch, and P. Haase: 2006, ‘Phylogeography of the montane

caddisfly Drusus discolor : evidence for multiple refugia and periglacial survival’.

Molecular ecology 15(8), 2153–2169.

Pitsch, T.: 1993, ‘Zur Larvaltaxonomie, Faunistik und Okologie mittereuropaischer

Fießwasser-Kocherfliegen (Insecta - Trichoptera)’. Ph.D. thesis, Technische Uni-

versitat Berlin, Landschaftsentwicklung und Umweltforschung, Germany.

Posada, D. and K. A. Crandall: 2001, ‘Intraspecific gene genealogies: trees grafting

into networks’. Trends in ecology & evolution 16(1), 37–45.

Raymond, M. and F. Rousset: 1995, ‘An exact test for population differentiation’.

Evolution 49(66), 1280–1283.

Rozas, J., J. C. Sanchez-DelBarrio, X. Messeguer, and R. Rozas: 2003, ‘DnaSP,

DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods’. Bioinformat-

ics (Oxford, England) 19(18), 2496–2497.

Schmid, F.: 1970, ‘Le genre Rhyacophila et la famille des Rhyacophilidae (Tri-

choptera)’. Memoirs of the Entomological Society of Canada 66(68), 1–230.

Schmid, F.: 1984, ‘Un essai d’evaluation de la faune mondiale des Trichopteres’. In:

J. C. Morse (ed.): Proceedings of the 4th International Symposium on Trichoptera.

p. 337, Dr. W. Junk Publishers, The Hague, The Netherlands.

Schmitt, T.: 2007, ‘Molecular biogeography of Europe: Pleistocene cycles and post-

glacial trends’. Frontiers in zoology 4:11.

Suzuki, R. and H. Shimodaira: 2006, ‘pvclust: Hierarchical clustering with p-values

via multiscale bootstrap resampling’. Computer program, R package version 1.2-0,

http://www.is.titech.ac.jp/ shimo/prog/pvclust.

Tamura, K., J. Dudley, M. Nei, and S. Kumar: 2007, ‘MEGA4: Molecular Evolu-

tionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0’. Molecular biology and

evolution 24(8), 1596–1599.

Ujvarosi, L.: 2002, ‘The present stage of knowledge on the Trichoptera of the Central

Group of the Eastern Carpathians in Romania’. Nova Supplementa Entomologica

15, 379–394.

Waringer, J. and W. Graf: 1997, Atlas der osterreichischen Kocherfliegenlarven.

Facultas Universtaetsverlag, Wien.

33

Weider, L. J., A. Hobaek, T. J. Crease, and H. Stibor: 1996, ‘Molecular characteriza-

tion of clonal population structure and biogeography of arctic apomictic Daphnia

from Greenland and Iceland’. Molecular ecology 5(1), 107–118.

Weir, B. and C. Cockerham: 1984, ‘Estimating F-statistics for the analysis of pop-

ulation structure’. Evolution 38(6), 1358–1370.

Wiggins, G. B. and W. Wichard: 1989, ‘Phylogeny of pupation in Trichoptera, with

proposals on the origin and higher classification of the order’. Journal of the North

American Benthological Society 8(3), 260–276.

Zwickl, D. J.: 2006, ‘Genetic algorithm approaches for the phylogenetic analysis of

large biological sequence datasets under the maximum likelihood criterion’. Ph.D.

thesis, The University of Texas at Austin, USA.

34