29. 1. Definiie. ncadrareStafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalaz-pozitivi.Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluznd mai multe specii).S. aureus este i specia recunoscut cel mai de mult (Rosenbach, 1884), n timp ce una dintre speciile recunoscute mai recent, S. succinus, se estimeaz c ar avea o existen de mai multe milioane de ani. Numrul speciilor din acest gen a ajuns la 35, ns numrul este i mai mare dac lum n consideraie i subspeciile (de ex. S. aureus subspecia aureus i S. aureus subspecia anaerobius).Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de:- S. aureus;- S. epidermidis (produce un pigment alb);- S. saprophyticus (produce un pigment citrin).S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce celelalte dou specii sunt de obicei nepatogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus.29. 2. Caractere generale 29. 2. 1. Habitat 29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale 29. 2. 3. Caractere de cultur 29. 2. 4. Caractere biochimice 29. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici 29. 2. 6. Structur antigenic 29. 2. 7. Rspuns imun 29. 2. 8. Caractere de patogenitate29. 2. 1. HabitatS. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor i mucoaselor (n special n zonele piloase i la nivelul vestibulului nazal).Exist o serie de factori care determin i/sau influeneaz starea de purttor pentru S. aureus. O parte dintre aceti factori sunt legai de aprarea la nivel de gazd, o parte sunt corelai cu anumite proprieti ale bacteriei. Dintre acestea, menionm formarea de biofilm (caracteristic tulpinilor care se preteaz portajului nazal, dar nu i celor care nu determin stare de portaj) (1), care pare s faciliteze nu numai creterea supravieuirii bacteriilor n contextul tratamentului antibiotic, dar i evitarea mecanismelor de aprare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease inhibitor), catelicidine, alfa i beta defensine (2), inclusiv beta defensina uman 3 (HBD-3), cea mai eficient dintre beta defensine n ceea privete rolul n infeciile cu S. aureus (3).Deoarece unele studii arat c circa 20% dintre persoanele sntoase sunt purttoare n mod permanent de S. aureus iar n circa alte 50-60% dintre cazuri este discutat situaia portajului temporar, s-a intuit c exist un anumit grad de influen genetic privind starea de purttor de S. aureus. ntr-un studiu transversal recent la care au participat n mod voluntar colegii tineri aflai n finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studeni au fost purttori de Staphylococcus aureus, nazal i/sau faringian. Un studiu similar, transversal, efectuat n 2010 n Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari (incluznd studeni aflai n finalul anilor 1 i 2 de facultate n domeniile: farmacie, medicin dentar i medicin general), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la meticilin de 0,5 g/mL i un CMI (90) de 1 g/mL. Datele obinute de noi n Romnia sunt comparabile cu cele obinute n Brazilia, cu att mai mult cu ct exist similitudini i la nivelul loturilor de voluntari incluse n studiu.Stafilococii coaguloaz-negativi (SCN) formeaz microcolonii la nivelul foliculilor piloi (4) i la nivelul glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de vestibulul nazal.Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicai n infecii la nivelul tegumentelor i anexelor pielii (infecii nsoite de puroi), dar pot fi implicai i n infecii localizate la nivelul oricrui alt esut sau organ.29. 2. 2. Caractere morfotinctorialeStafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiulrealizat din cultura pe medii solide se poate remarca o dispoziie n grmezi neregulate. n frotiurile realizate din culturi pe medii lichide sau din produse patogene, se pot dispune n lanuri scurte, perechi sau coci izolai. n culturile cu o vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot aprea ca i Gram-variabil sau chiar i Gram-negativi la limit.29. 2. 3. Caractere de culturSe dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, au diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat. Pigmentarea devine mai pronunat dup meninerea plcii cu mediul de cultur nc 24-48 ore la temperatura camerei.Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar (-hemoliz), dar S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine.Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (exemplu mediul Chapman).29. 2. 4. Caractere biochimiceStafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manit-pozitiv) i SCN (manit-negativ). Stafilococii sunt catalaz-pozitivi.29. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimiciStafilococii sunt relativ rezisteni fa de agenii din mediul extern. n culturi (bulion, geloz), rezist la temperatura frigiderului cteva luni; n puroi uscat pot supravieui 2-3 luni.Sunt relativ rezisteni la anumite antiseptice i dezinfectante (de exemplu, rezist peste 30 minute la alcool 70i peste 10 minute n fenol 2%). Sunt distrui n 60 minute la o temperatur de 60C.29. 2. 6. Structur antigenic29. 2. 6. 1.Structuri antigenice legate de corpul celulara). Capsula este prezent la un numr mic de tulpini de S. aureus; este alctuit din acid glucozaminuronic. In vivo pare a fi mai frecvent dect s-ar crede (examinnd la microscop tulpinile cultivate). Tulpina ncapsulat prototip de S. aureus (tulpina Smith) d natere spontan la variante necapsulate.b). Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, n timp ce la S. epidermidis s-a pus n eviden un polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. Astzi se cunoate structura ambilor acizi teichoici, precum i a gruprilor rspunztoare de specificitatea antigenic a fiecruia.c). Proteina A apare ca o component de suprafa la toate tulpinile de S. aureus (proteina Cowan). Are o greutate molecular de 42 kDa i poate induce apariia de anticorpi specifici (este imunogen). Este de menionat faptul c proteina A interacioneaz nespecific cu poriunea Fc a imunoglobulinelor de la practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a interaciunii dintre proteina A i fragmentul Fc, apar o serie de efecte biologice precum: anafilaxie local i sistemic la animale, reacii urticariene la om, activarea complementului pe calea clasic i alternativ urmat de generarea de factori chemotactici, inhibarea activitii opsonizante a anticorpilor (prin competiie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite), proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafa A este unul dintre factorii determinani ai virulenei i ai formrii de biofilm (5), iar un studiu recent (2) a sugerat i o asociere a statusului de purttor nazal de S. aureus cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine.d). Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus aglutineaz atunci cnd sunt suspensionate n plasm sau n soluii de fibrinogen. Factorul rspunztor de aceast reacie este o coagulaz legat (clumping factor; factor de aglutinare/agregare) la nivelul suprafeei celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent i la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. n cazul n care n testul coagulazei pe lam se folosete plasm uman, rezultatul poate fi pozitiv i pentru S. lugdunensis i S. schleiferi (subspecia schleiferi).e). Adezinele sunt proteine de suprafa specifice, prin care stafilococii se fixeaz pe proteinele matriciale de la suprafaa celulelor gazdei (ex. laminin, fibronectin, elastin, colagen, proteina A etc). Par a fi implicate n colonizarea matricei intercelulare, n invazia esuturilor i n rezistena la fagocitoz.29. 2. 6. 2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococia). Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene. Majoritatea sunt proteine accesorii care, n condiii de cretere optime, sunt sintetizate la sfritul perioadei de cretere exponenial sau la nceputul fazei staionare. n condiii suboptime (de exemplu deficit de Mg2+), condiii care se pot ntlni i n esuturile infectate, aceste proteine pot fi sintetizate n tot cursul fazei exponeniale.b). Filtratele culturilor de S. aureus coaguleaz plasma recoltat de la o serie de specii animale sub aciunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au descris mai multe coagulaze antigenic distincte. Exist totui i tulpini de stafilococ implicate patogenic care sunt coagulaz-negative. Unele tulpini coagulaz-negative produc o metaloproteinaz care are o activitate asemntoare cu cea a coagulazei, ceea ce poate crea probleme n identificare.Coagularea necesit prezena unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un derivat de protrombin. Complexul coagulazei realizat cu FCR convertete fibrinogenul n fibrin. Procesul difer de coagularea normal prin faptul c nu sunt necesari o serie de factori (ex. Ca2+) iar cheagul care se formeaz este mai friabil i nu se retract. Studii recente demonstreaz c TFPI (inhibitorul cii factorului tisular), prin secvena sa C-terminal, joac un rol antimicrobian mpotriva S. aureus i mpotriva altor bacterii Gram-pozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa) i chiar mpotriva fungilor Candida albicans i Candida parapsilosis (6).c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:- stafilokinaza, care determin liza cheagului (prin convertirea plasminogenului n plasmin) sub controlul unui material genetic fagic;- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- i exonucleazic asupra ADN i ARN, genernd 3'-nucleotide;- diferite lipaze evideniabile prin opacifierea agarului cu glbenu de ou sau prin scindarea substanei numit Tween; contribuie la supravieuirea stafilococului la nivel dermic;- hialuronidaza;- ureaza;- diferite proteaze (serin proteaz, cistein proteaz, metaloproteaz).d). n momentul se fa se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpin anume poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug i alte celule, ducnd la o necroz local i pot avea efecte letale asupra animalelor de experien. Principalele caractere ale hemolizinelor sunt urmtoarele:1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizin produs de S. aureus. Are activitate maxim asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afecteaz trombocitele i celulele umane n cultur. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experien (injectat local) i efect letal (injectat intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muchilor netezi vasculari. S-a identificat receptorul de pe suprafaa membranei eritrocitului, o sialoglicoprotein. Este secretat sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjeaz n contact cu un receptor de membran, formnd un hexamer cilindric care strpunge membrana celulei i proemin la suprafaa ei, genernd un por cu un diametru de 23 nm (exist asemnri cu complexul litic C5b-C9 al C').2. -hemolizina este produs de majoritatea stafilococilor identificai la animale, dar numai de 10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliz de tip cald-rece. Este de fapt o sfingomielinaz C, activat de Mg2+, nu ns i de Ca2+. Efectul (n ordine descresctoare) se exercit asupra hematiilor de oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu concentraia de sfingomielin a hematiilor). Este citotoxic pentru diferite culturi de celule. n doze mari, este toxic pentru animalele de experien.3. g-hemolizina este un complex de dou proteine bazice care acioneaz n cooperare. Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu i cele de cal sau pasre. Efectul ei este inhibat de agar i de diferii polimeri sulfatai. Nu are efect atunci cnd se utilizeaz plci cu agar-snge. Aciunea este inhibat de colesterol i de alte lipide.4. d-hemolizina este produs de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Const din agregate heterogene de subuniti de circa 5.000 Da. Acioneaz pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) i nu are specificitate de specie.e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe activiti patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toatecelule T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blocheaz funcia de clearance a sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip ntrziat. Efectul piretogen se realizeaz cel puin n parte prin stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A i B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) i respectiv TSST-1, cauza sindromului de oc toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine. Aproximativ 15% produc TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A i B.f). Leucocidina este produs de majoritatea tulpinilor de S. aureus i acioneaz numai asupra polinuclearelor i macrofagelor de om i iepure. Are dou componente, F i S. Componenta S se fixeaz pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holeric) i activeaz o fosfolipaz endogen, legat de membran. Produii acesteia se fixeaz apoi pe componenta F, inducnd apoi un canal ionic pentru K+i conducnd astfel la citoliz.g). Exfoliatina (toxina epidermolitic) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o protein termolabil i acid-labil, cu greutatea molecular de 24.000 Da, produs de circa 5% din tulpinile de S. aureus. S-au descris dou variante antigenice, ETB (codificat de un plasmid) i respectiv ETA (codificat cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acioneaz prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat.29. 2. 6. 3.BacteriocineS. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) i Pep5, care sunt lantibiotice. S. gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte n special asupra bacteriilor Gram-pozitive, chiar i asupra unor tulpini de stafilococi din alt specie dect cea productoare.29. 2. 7. Rspuns imunImunitatea postinfecioas este specific fa de produii extracelulari (toxine, enzime) i fa de antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este sczut (crete, eventual, n cursul unor infecii generalizate, dar nu influeneaz evoluia spre vindecare) i nu are utilitate practic n diagnostic. Exist un nsemnat potenial de producere a unui vaccin stafilococic care s poat fi acceptat n Uniunea European (deocamdat nici un astfel de produs nu are licen la nivelul UE).S. aureus are posibilitea de a i modifica fenotipul, prezentndu-se sub forma de SCV (small colony variants), pentru a scpa sistemului imun i pentru a genera o infecie cronic. Un studiu pe modele celulare a artat c printre tehnicile de persisten se afl modificarea expresiei factorilor de virulen, auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de cretere) dar i aceast diversitate fenotipic, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic, fenotipurile SCV transformndu-se rapid napoi n fenotipurile slbatice complet virulente n momentul prsirii localizrii intracelulare (7).29. 2. 8. Caractere de patogenitateAtt S. aureus ct i o parte dintre SCN sunt inclui n categoria microorganismelor condiionat patogene.S. aureus apare mai frecvent implicat n producerea unor infecii, de obicei la nivelul tegumentelor i mucoaselor, nsoite de formarea de puroi, dar cu potenial de generalizare. Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, n special datorit prezenei acidului lipoteichoic, proteinei A i altor adezine. Dup aderare i multiplicare, n cursul infeciilor pot fi produse o serie de substane cu rol n patogenitate (enzimele i toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).De menionat i faptul c stafilococii reprezint unele dintre primele microorganisme pentru care s-a descris fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice. Rezistena la penicilin (mediat de o -lactamaz) a fost evideniat nc din anul 1947. Ulterior, pe msura utilizrii n infeciile stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a penicilinelor penicinilazo-rezistente), s-au selectat tulpini rezistente la meticilin, oxacilin, tetraciclin, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.Un studiu recent a evaluat prevalena portajului de MSSA i de MRSA n departamentele de urgen din SUA, la pacieni n principal fr manifestri sugestive pentru infecia stafilococic. Prevalena portajului MSSA a fost estimat la 39% iar prevalena colonizrii cu MRSA a fost de 5%. Dintre pacienii colonizai MRSA, 80% au prezentat i cel puin o colonizare extranazal, pe cnd 45% au prezentat colonizare exclusiv extranazal (8).Pn n anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecie al infeciilor cu S. aureus rezistent la alte antibiotice i chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la vancomicin. n privina sensibilitii/rezistenei la vancomicin au fost descrise trei variante de S. aureus, respectiv: S. aureus cu un nivel intermediar de rezisten la vancomicin (VISA), S. aureus cu hetero-rezisten la vancomicin (hVISA) i S. aureus rezistent la vancomicin (VRSA).n mod clasic era considerat c o tulpin de S. aureus intr n categoria VISA n cazul n care CMI este 6 g/ml (determinare prin E test) i n categoria VRSA n cazul n care CMI este 32 g/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpin de stafilococ este rezistent la vancomicin n cazul n care CMI este > 2 g/ml.Opiunile de tratament n infeciile cu VRSA sunt limitate. O clas de antimicrobiene care poate fi utilizat n tratamentul VRSA este reprezentat de streptogramine (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin).Cu toate acestea, a fost identificat rezisten i la streptogramine (9), existnd totui posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i streptogramina B (10).29. 3. Patologie specific i principalele afeciuni produseStafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i mbinarea acestor mecanisme).Determinanii patogenitii stafilococului includ produsele toxice i enzimatice, care au fost prezentate la punctul 29. 2. 6. Spre exemplu, a-toxina are rol n generalizarea infeciilor i respectiv apariia sepsisului; d-hemolizina i leucocidina explic de ce S. aureus este mai dificil de distrus prin fagocitoz n comparaie cu SCN; lipaza este important n mecanismul de producere a furunculelor; coagulaza contribuie la localizarea i persistena infeciei; hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menionat c tulpinile izolate de la nivelul unor furuncule sunt mai bogate n lipaz i mai srace n hialuronidaz fa de cele izolate din impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (mpiedic fagocitoza); frecvena lor pare a fi mai mare in vivo, deci rolul capsulei pare a fi mai important dect se credea anterior. Datorit faptului c nici unul din caracterele enumerate nu pare a fi decisiv n virulena stafilococilor, tulpinile de S. aureus nu pot fi clasificate net n patogene i nepatogene, aa cum se poate face de ex. n cazul tulpinilor de Corynebacterium diphteriae, tox+sau tox-.S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc.Toxiinfeciile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de greuri, crampe abdominale, vrsturi, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore dup ingestia alimentelor contaminate. Se vindec n general n circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate n general de ctre cei care le manipuleaz (de exemplu buctarul prezint un panariiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brnza, ngheata, carnea i produsele din carne (acestea pot constitui adevrate medii de cultur pentru bacterii). Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezist 30 minute la 100C), ceea ce impune pstrarea alimentelor la frigider, att nainte ct i dup preparare.Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativ generalizat (boala Ritter) care poate aprea la nou nscut; epidermonecroza toxic (ntlnit la copii i eventual la aduli); impetigo bulos i scarlatina stafilococic (spre deosebire de cea streptococic, nu afecteaz limba i palatul). Leziunile aprute sunt extinse, de multe ori impresionante, dar este posibil vindecarea fr cicatrici deoarece sediul leziunilor este n stratul granular al pielii (sub ele rmnnd un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi masive de lichid i pentru a proteja straturile profunde de infecii supraadugate). n mod frecvent, stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolai de la nivelul leziunii.Sindromul de oc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor infecii locale cu S. aureus productor de TSST-1 (toxina 1 a ocului toxic). Principalele semne i simptome sunt reprezentate de apariia strii de oc, febr mare, greuri, vrsturi, diaree, trombocitopenie, insuficien renal i hepatic acut, rash (erupie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor i plantelor). Mortalitatea n cazurile necomplicate este de circa 2%. n formele complicate, mortalitatea poate ajunge la 50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mrci de tampoane destinate igienei intime feminine s-au dovedit a stimula producia de TSST-1 de ctre tulpini proprii de stafilococ. Deoarece s-a demonstrat c TSST-1 crete toxicitatea endotoxinei germenilor Gram-negativi, cazurile cele mai grave au aprut atunci cnd infecia stafilococic local s-a asociat cu o infecie cu germeni Gram-negativi.Stafilococii coagulaz-negativi sunt implicai n infecii aprute dup manevre medico-chirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere).O infecie grav produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, situaie n care administrarea necontrolat / abuziv a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). n etiologia enterocolitei postantibiotice sunt recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupnd primul loc.29. 4. Diagnostic de laboratorDiagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) i respect etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, ncepnd cu recoltarea i transportul produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschis, superficial, fie din leziuni nchise, profunde). Cultivarea n vederea obinerii de colonii izolate se continu cu identificarea n care pe lng caracterele morfologice, de cultur i biochimice se face testul coagulazei pe lam i/sau n tub. Antibiograma completeaz n mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecii stafilococice.Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus.Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape.1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal, pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.).De menionat c din anul 2002 a fost pus la punct o tehnic PCR pentru identificarea S. aureus rezistent la meticilin, direct n produsul patologic (vezi Direcii de cercetare).2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial).3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz ct mai rapid (pentru a diminua riscul modificrilor ce ar putea aprea n structura microbian) i n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Stafilococii se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). n cazul n care produsul este recoltat de la nivel nazal (existnd certitudinea c produsul conine mai multe specii de microorganisme) este recomandat utilizarea mediilor hiperclorurate.4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Caractere de cultur: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manit-pozitiv) i SCN (manit-negativ). S. aureus este catalaz-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca i ceilali stafilococi). De importan egal taxonomic i recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenei la specia S. aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile.Se poate face i testul fosfatazei (poate fi pozitiv i la unele specii coagulaz-negative). Exist sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc). Caractere antigenice: Pentru diferenierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect). Se pot utiliza i truse cu anticorpi monoclonali fa de endo--N-acetil-glucozaminidazei stafilococice. Caractere de patogenitate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce coagularea pe lam poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. n cazul n care n testul coagulazei pe lam se folosete plasm uman, rezultatul poate fi pozitiv pentru S. lugdunensis i S. schleiferi (subspecia schleiferi). Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i capitolele 20 i 23). Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la aciunea litic a bacteriofagilor a fost sistematizat pentru tulpinile de S. aureus ntr-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referin. Exist un set de baz de bacteriofagi, care permit ncadrarea S. aureus n unul din grupele I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluat comparativ cu capacitatea discriminatorie a testelor care au ca mecanism biologia molecular (ex. ribotiparea). Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumenteautomatizate pentru evidenierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur (testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin, de ex. amplificarea genic, PCR pentru gena mecA, dar i pentru genele femA, femB) i/sau pentru diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN.5. Antibiograma (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 7). Pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilin (MRSA) se poate detecta prezena genei mecA (dup amplificare genic, prin PCR).29. 5. TratamentMulte persoane sunt purttoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dac stafilococii ar fi eliminai complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid (4).Totui, n anumite situaii (ex. pacieni supui dializei peritoneale sau hemodializei, pacieni infectai cu HIV sau la personalul medical care lucreaz de ex. n secii de ari) ncercarea de eliminare a strii de purttor are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocin. Este nc n studiu utilizarea lizostafinei n acest scop (lizostafina este o enzim litic produs de o tulpin de S. simulans; atac puntea pentaglicinic de la nivelul lanurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost fcute experimente pe animale de laborator obinndu-se rezultate promitoare) (11).Tratamentul unei stafilococii, n cazul n care este necesar antibioterapia, se va face conform antibiogramei.Principial, dac un stafilococ este sensibil la penicilin (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente prin producerea de beta-lactamaz, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui s includ acest antibiotic. Din experiena centrului de referin din INCDMI Cantacuzino, procentul tulpinilor sensibile la penicilin este de circa 5%. Datorit rezistenei la penicilin au fost produse peniciline rezistente la aciunea beta-lactamazelor (penicilinele M de la meticilin), de ex. oxacilina, cloxacilina i derivaii acestora.Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.Ca i principiu de tratament, MRSA rspunde potenial la tratamentul cu vancomicin. VRSA poate rspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificat rezisten i la streptogramine (9), existnd totui posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i streptogramina B (10).n cazul coleciilor purulente reamintim i considerm c este de reinut ca fiind de prim importan utilizarea inciziei i drenajului, fr de care antibioterapia nu are nici un sens. De multe ori, incizia i drenajul sunt suficiente.29. 6. EpidemiologieStafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecie cea mai comun este reprezentat de leziunile stafilococice de la nivelul tegumentului. De menionat posibilitatea rspndirii infeciei cu stafilococi rezisteni la antibiotice (de spital), atunci cnd persoanele purttoare sunt reprezentate chiar de personalul medical i auxiliar.Referitor la sindromul de oc toxic stafilococic (SSTS), n SUA s-au raportat 157 de cazuri n 1997, 138 de cazuri n 1998 i 113 cazuri n 1999, cu o inciden anual de 0,050/0000. n anul 2005 au fost raportate numai 90 de cazuri (incidena fiind 0,040/0000). Tot n anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de infecie cu S. aureus cu sensibilitate intermediar la vancomicin (VISA) i 3 cazuri de infecie cu S. aureusrezistent la vancomicin (VRSA).n Romnia nu sunt disponibile (la nivel naional) date privind SSTS sau rezistena la vancomicin a tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referin pentru stafilococ din INCDMI Cantacuzino, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), n Romnia nu au fost semnalate tulpini de S. aureus rezistente la vancomicin.Laboratorul de referin pentru stafilococ din INCDMI Cantacuzino poate detecta prin metode moleculare prezena genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine,TSST1, n culturi de S. aureus.29. 7. ProfilaxiePrevenirea transmiterii infeciei are la baz metodele de igien, asepsie i antisepsie. n spital, seciile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensiv, slile operatorii i saloanele unde se afl pacieni cu cancer aflai sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. n aceste situaii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator i este de preferat ca persoanele purttoare de stafilococi coagulaz-pozitivi s nu aib acces n aceste incinte i s nu aib contact direct cu pacienii n cauz. Ca alternativ trebuie s se pun accentul pe proceduri adecvate, care s evite contaminarea pacienilor.Utilizarea substanelor antiseptice i ncercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal (ex. lizostafin, mupirocin) ar putea fi utile. (11)Utilizarea vaccinului stafilococic poate s amelioreze starea clinic n anumite situaii, de ex. la pacieni care necesit hemodializ, prezena de catetere etc. Din pcate la nivel internaional (EU) nu exist un vaccin stafilococic care s fi primit autorizaie de utilizare. n ara noastr vaccinul stafilococic produs de INCDMI Cantacuzino a avut autorizaie de utilizare pn n anul 2010.29. 8. Direcii de cercetare29.8.1 Tratamentul infeciei cu S. aureusAntibioticele convenionale acioneaz n general pe bacteriile aflate n cursul ciclului de multiplicare (12). n cursul evoluiei clinice a unei infecii, acestea coexist cu cele aflate n afara ciclului de multiplicare, motiv pentru care este aproape imposibil ca ntreaga populaie bacterian s fie distrus simultan. Astfel, rmn viabile o serie de bacterii care au fost deja expuse antibioticului i care au avut timpul necesar pentru dezvoltarea mutaiilor de rezisten.Terapia intit pe bacteriile non-multiplicative este un concept nou, existnd o serie de astfel de antibiotice n curs de dezvoltare i cercetare. Unul dintre acestea este HT61, un derivat quinolonic, a crui eficacitate a fost demonstrat (pe culturi celulare i pe modele murine de colonizare cutanat) mpotriva MSSA, MRSA i chiar i MRSA rezistent la mupirocin. Acest medicament acioneaz prin depolarizarea membranei celulare i prin distrucia peretelui bacterian, n decurs de 2 ore. Pe parcursul unui an de studiu, n cadrul a 50 de culturi seriate, nu a fost decelat niciun fenotip de rezisten la HT61. Acest tip de terapie reprezint promisiunea unui tratament de durat mai scurt, eficien mai ridicat i cu un risc sczut de instalare a rezistenei.Un antibiotic cunoscut din clasa streptograminelor B, etamycin, i-a demonstrat recent eficiena asupra MRSA (att tulpinile comunitare ct i cele spitaliceti) pe modele murine cu infecie sistemic letal MRSA (13). Etamycin a fost izolat de la actinomicete marine descoperite recent (CNS-575), ceea ce a atras atenia asupra mediului marin privit ca potenial surs pentru identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente ale diverselor specii bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficien experimental asupra mai multor patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-citotoxic la concentraii de 20 de ori mai mari dect CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru MRSA comunitar sau spitalicesc).29.8.2 Detecia direct a rezistenei la meticilinPrintre metodele de detecie direct a rezistenei la meticilin a S. aureus se numr i testele de latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris n 2010, de Qian et al. (14) n Journal of Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu de tip geloz-snge) prin utilizarea unei proteine de legare a penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a).Acest test (PBP-LA) i-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% i o specificitate de 97,5%, valori doar cu puin mai sczute fa de sensibilitatea i specificitatea efecturii tehnicii PCR. Dintre avantajele utilizrii acestei metode menionm: obinerea de rezultate rapide, tehnic uor de utilizat, preuri sczute ale reactivilor utilizai. n vederea creterii sensibilitii testului, acesta poate fi utilizat n combinaie cu alte teste de identificare rapid, precum: DNA-aza termostabil, API Rapidec, i FISH (peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).29. 9. Povestire adevratSuper-bug ... Acesta este numele dat de U.S. Department of Health S. aureus meticilino rezistent (MRSA). Aceast denumire a fost preluat de reprezentanii mass-media i n momentul de fa acest nume a devenit de notorietate n Statele Unite i nu numai.Avnd n vedere faptul c numai pe o perioad de un an s-au raportat n SUA circa 20.000 de pacieni care au fost internai cu acest diagnostic, definiia i numele par a fi potrivite i este strict necesar ca sistemul de raportare s se ocupe cu atenie de aceast situaie. Din pcate, i n acest caz, trebuie s ne bazm n special pe datele din literatura de specialitate internaional, datele publicate n Romnia fiind fie puine, fie irelevante.Din evenimentele care au avut loc recent (octombrie 2007) n legtur cu acest subiect, amintim decizia luat de Guvernatorul Statului Virginia, care a promulgat n regim de urgen o lege, prin care toate unitile sanitare erau obligate s raporteze cazurile suspecte i confirmate de infecie cu Staphylococcus aureus meticilino rezistent (MRSA), contribuind la stabilirea unui sistem activ de raportare, pentru a se putea astfel demonstra care este evoluia infeciilor cu MRSA n contextul unei campanii speciale de control a acestor infecii.Toate aceste reacii, inclusiv msura fr precedent de nchidere a peste 20 de uniti de nvmnt pentru dezinfecie i sterilizare au fost instituite n contextul n care un tnr de 17 ani a decedat prin sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie n care au participat n colaborare unitile de nvmnt, elevii din aceste uniti, sistemul medical (inclusiv centrul de prevenire i control al bolilor, mass-media, reprezentanii autoritilor locale i o serie de politicieni).Dup cum am discutat n prezentul capitol, dar i n alte capitole ale acestui manual, stafilococii sunt prezeni n mod normal pe tegumente i mucoase. Totui, stafilococii pot fi implicai i n patologie. Pot fi vizate persoane imuno-competente, copii, adolesceni, tineri.De suficient de multe ori, cei care consider c nu sunt vulnerabili sau cred c au un risc foarte sczut de mbolnvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practic sporturile mai dure, nsoite de contact direct i care se consider indestructibili) pot fi printre cei mai expui la infecie i chiar la o evoluie grav a acesteia. La universitatea din Virginia, ntreg lotul de lupte greco-romane s-a infectat venind n contact cu o saltea de lupt contaminat de un coleg care s-a rnit n timpul antrenamentului.De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igien general i personal pot contribui semnificativ la prevenirea apariiei infeciilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul individual, cercetarea bazelor de date i experiena ctigat cu fiecare caz consultat, investigat, analizat i discutat ne ajut s ajungem la cea mai bun ipotez diagnostic, la cel mai bun diagnostic diferenial, la cel mai potrivit tratament n vederea celui mai bun prognostic pentru pacientul sau pacienii pe care i vom examina de-a lungul ntregii cariere medicale sau medico-chirurgicale.