GENETICA GENERALA

LUCRARI PRACTICE

CUPRINS

1. Ciclul celular mitotic

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza 2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare 2.1.1. Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n = 16) 2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n mitoz cu soluie carmin-acetic 2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale 3. Meioza 4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza 4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante 5. Cariotip si idiograma 5.1. Definirea termenilor, nomenclatur 6. Ploidia la plante 7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante 8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura 8.1. Studiul aberaiilor cromosomiale n ana-telofaza mitozei la unele plante de cultur 9. Drosophila melanogaster obiect de studiu in genetica 9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster 8.1.1. Cromosomii uriai 8.1.2. Cromosomii somatici Bibliografie

1. Ciclul celular mitotic n diviziunea celular se disting dou categorii de evenimente: evenimente reproductive,

prin care sunt dublate structurile funcionale ale celulei, esenial fiind dublarea cromosomilor, i evenimente distributive, prin care materialul rezultat n urma replicaiei este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaional, este modalitatea de diviziune celular prin care, dintr-o celul somatic rezult dou celule fiice cu numr egal de cromosomi, att ntre ele, ct i cu celula mam. Mitoza este diviziunea celular care are loc n celule somatice i asigur transmiterea fidel a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi ns, diferite influene care adaug aparentei stabiliti a caracterelor, noi valene. Ciclul celular mitotic, la plante i animale, cuprinde n principal urmtoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (i a centrozomului la animale) i deplasarea spre poli a cromosomilor fii, dup care, urmeaz diviziunea citoplasmei. n procesul mitozei se organizeaz aparatul mitotic alctuit din structuri cromatice i acromatice, care este complet n metafaz. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a cror sintez necesit un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatic de la formare i pn la scindarea ei n dou celule fiice, cu numr de cromosomi egal cu numrul de cromosomi al celulei din care au provenit, alctuiesc ciclul celular.

Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre dou diviziuni succesive) i cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise - profaza, metafaza, anafaza i telofaza avnd o durat variabil, n funcie de specie, tipul de celule, temperatur etc., de la cteva ore, la zeci i sute de ore.

Interfaza Interfaza are cea mai mare durat n timp n ciclul mitotic i este caracterizat de procese

de biosintez. Durata interfazei este variabil, de la cteva ore pn la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza dureaz 70-110 minute (profaza = 30 - 45 min., metafaza = 5 - 10 min., anafaza = 15 - 20 min. i telofaza = 20 - 30 min.) (Toma i Ni, 1995). La celula animal, un ciclu tipic dureaz 18 - 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (n general variaz cel mai mult), faza S (timpul necesar replicrii genomului) dureaz 6 - 8 ore, iar faza G2 este, de regul, cea mai scurt (mai ales cnd mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei dureaz mai puin de o or (Lewin, 1994).

Cercetrile microfotografice i microradiografice au demonstrat c interfaza este foarte puin activ din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activ din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dubleaz de la 2C la 4C. Pe baza acestor observaii, Howard i Pelc, n 1953 au mprit interfaza n trei perioade:

- perioada G1 (engl. gap = gol) perioad presintetic, n care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizeaz ARN (n special ARNm) i proteine;

- perioada S (engl. synthesis = sintez) perioada de sintez a ADN; pn la sfritul fazei S toat cantitatea de ADN se replic (pe parcursul fazei S cantitatea total de ADN crete de la 2C la 4C). La sfritul acestei perioade, cromosomii sunt alctuii din dou cromatide foarte lungi i subiri;

- perioada G2 perioad postsintetic, cnd sinteza ADN se oprete; are loc biosinteza proteinelor i a ARN, care se desfoar i n celelalte perioade ale interfazei. Celula conine cromosomi bicromatidici.

Fig. 1. Ciclul celular mitotic (dup Alberts i colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidratai, despiralizai i nu se observ la

microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului n interfaz, n celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (dup Hartl i

Jones, 1998)

n afar de celulele la care ciclul mitotic se desfoar n mod normal, exist celule n

repaus sau n perioada G0, asemntoare fazei G1, dar diferit prin faptul c celulele nu pot intra n faza S. n faza G0 intr celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla n repaus n faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semine), astfel nct, intr direct din G0 n G2; alteori, din G0 pot intra n G1 timpuriu (Lewin, 1994).

n explicarea cauzelor ce determin intrarea celulei n diviziune mitotic (trecerea din G2 n mitoz) exist diferite ipoteze. Se pare c declanarea mitozei este determinat de modificarea raportului nucleu / citoplasm.

Profaza n profaz au loc procesele: mrirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor,

stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariia nucleolilor i formarea fusului acromatic.

La nceputul acestei faze, cromosomii se prezint sub form de filamente subiri, lungi, alctuind un spirem. n profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun n tot spaiul nuclear (n celulele vii se observ uor, avnd indicele de refracie 1,50 fa de cel al carioplasmei de 1,37). n profaza trzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor crete i ei devin mai scuri i mai compaci, aprnd formai din dou cromatide, foarte apropiate ntre ele i nfurate una n jurul celeilalte. La nceputul profazei, are loc o prim spiralizare a cromosomilor denumit spiralizarea mic, ce se realizeaz prin micorarea numrului de spire i mrirea diametrului lor. Spre sfritul profazei, are

diviziunea mitotic

interfaza

celule fiice

2cADN

2cADN

2cADN

4cADN

loc a doua spiralizare denumit spiralizare somatic, n care numrul de spire continu s scad, ele apropiindu-se tot mai mult.

n profaz, distana dintre cromosomi crete treptat i are loc dezorganizarea nucleului i a membranei nucleare, dispariia nucleolilor i formarea fusului mitotic. Centriolii migreaz spre polii celulei, plasndu-se n dou puncte opuse. ntre centrioli se organizeaz fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alctuit dintr-un numr mare de filamente, cu extremitile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul cruia se realizeaz distribuirea egal a cromosomilor n cele dou celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de dou tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiioneaz structura fusului i filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate i pleac de la centromerul fiecrui cromosom i nainteaz simultan, cu aceeai vitez, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz

timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n profaz

trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Stadiul final al profazei prometafaza, se caracterizeaz prin totala dezorganizare a

membranei nucleare, care se fragmenteaz n poriuni relativ mari, ce pstreaz infrastructura de membran dubl i rmn, n parte, n interiorul fusului de diviziune, participnd mai trziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercit micri neregulate ntre polii celulei i planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza n aceast faz are loc desvrirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizai la maxim,

se dispun n placa ecuatorial metafazic (Fig.5). Micarea de dispunere a cromosomilor n placa ecuatorial, la distan egal de polii fusului de diviziune prezint trei componente:

adunarea cromosomilor ntr-o poziie de echilibru ntre cei doi poli, micare datorat interaciunii ntre polii fusului i centromeri;

orientarea cromosomilor n placa ecuatorial astfel ca, centromerii s fie situai n axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;

distribuirea cromosomilor n placa metafazic se realizeaz n jurul unui fus central gol (n seciune transversal apare ca un halo), cromosomii fiind dispui la periferia fusului, cu braele orientate n afar.

Morfologia cromosomilor se studiaz n metafaz, deoarece n aceast faz ei sunt condensai n cel mai nalt grad. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide i prezint n lungul acestora, spre sfritul metafazei, o fisur longitudinal, care reprezint spaiul dintre cele dou cromatide surori. La sfritul metafazei (Fig.6), cromatidele surori ncep s se separe (clivarea longitudinal), fcndu-se trecerea spre anafaz.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n

metafaz timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n

metafaz trzie(dup Hartl i Jones, 1998)

Anafaza Anafaza se caracterizeaz prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii i

migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debuteaz n anafaza timpurie, cnd are loc clivarea centromerilor, cromatidele rmnnd nc apropiate unele de altele. O dat terminat clivarea centromerilor, ncepe separarea cromatidelor n lungul fisurii longitudinale evideniate n metafaz (Fig.7). Dup Lewin (1994), la celulele animale, n anafaz, centromerul este duplicat funcional. Cnd i acest proces se ncheie, cromatidele fiice, fiecare cu cte un centromer propriu, ncep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii.

Se admite c micarea cromosomilor spre poli este o consecin a scurtrii filamentelor fusoriale de sprijin, care leag polii fusului (prin pierderea sau adiia de tubulin din microtubuli). Alungirea determin stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat n micarea cromosomilor spre poli. Aceast micare este posibil datorit existenei n structura fusului mitotic a unor proteine de natur actinic. n cazul n care setul de cromosomi migreaz aproape perfect sincron, se formeaz placa anafazic sau dublul aster. Chiar dac micarea cromosomilor nu este sincron, ea nu ncepe dect dup ce toi cromosomii sunt plasai n placa ecuatorial.

n celulele animale, de regul, autosomii migreaz concomitent, iar heterosomii au o vitez de migrare diferit. n celulele plantelor, spre sfritul anafazei, fusul mitotic se mrete n volum n regiunea ecuatorial i ia form de butoia, formnd ulterior fragmoplastul.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz

timpurie (dup Hartl i Jones, 1998)

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n anafaz

trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Telofaza Telofaza este ultima faz a mitozei, caracterizat prin prezena fenomenelor opuse celor

din profaz. Cromosomii sufer un proces de despiralizare i revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membran nuclear migreaz spre periferia fusului de diviziune; numrul lor crete printr-o sintez suplimentar. Aceste vezicule se agreg n jurul masei cromosomiale, se turtesc, nconjoar nucleul interfazic i formeaz noua membran nuclear. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcaie dintre cele dou celule fiice. Are loc i reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce ndeplinesc funcia de organizatori nucleolari (Fig.9 i Fig.10).

Fig.9 Celul din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat n telofaz timpurie (dup Hartl i

Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparinnd unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflat

n telofaz trzie (dup Hartl i Jones, 1998)

Citochineza n mod obinuit, diviziunea nuclear este urmat de citochinez (plasmodierez,

citodierez sau plasmotomie). Citochineza poate avea loc centripet la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra),

cnd membrana ce separ cele dou celule fiice apare sub forma unui inel ce crete centripetal, asemntor unei diafragme (Toma i Ni, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. Dup Buvat, n zona ecuatorial a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercaleaz fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migreaz n aceast regiune dinspre poli. mpreun cu elementele microtubulare, se formeaz o structur fibrilar. n jurul fibrelor microtubulare se aglomereaz vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se mresc, se contopesc i vin n contact cu pereii celulei mame, formnd lamela median (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaboreaz membrana primar, strbtut de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale,

separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin trangulare(Fig.12 a, b).

Fig. 11 Formarea peretelui despritor, ntre celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (dup De Robertis i De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formrii inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (dup De Robertis i De Robertis,1983)

n celulele normale, mitoza i citochineza sunt riguros coordonate. Dac are loc blocarea

citochinezei, mitoza se desfoar normal, producndu-se o celul binucleat. Odat cu replicarea cromosomilor, are loc i replicarea organitelor citoplasmatice sau

separarea lor din celula mam n celulele fiice, dup care acestea i completeaz, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. n profaz, reticulul endoplasmic este transformat ntr-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse n special n regiunile periferice ale citoplasmei. n metafaz, mitocondriile se adun n jurul fusului; n anafaz, ele se grupeaz n jurul regiunii ecuatoriale, odat cu separarea celulelor fiice avnd loc i repartizarea acestora. n interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipic.

n diviziunea mitotic, metafaza i anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, n timp ce profaza, uneori i telofaza, sunt cele mai lungi. Desfurarea n timp a mitozei depinde i de tipul celulei, vrst, starea fiziologic, condiii de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate fi blocat prin aciunea ocurilor de temperatur, narcoticelor, otrvurilor etc. (Raicu i colab., 1973).

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza

2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare

Cromosomii la plantele superioare se evideniaz n celulele aflate n diviziune mitotic din

esuturile meristematice, din zonele de cretere ale organelor vegetative (apex radicular, apex caulinar), sau n celulele meristemoide din calus.

n lucrrile practice de citogenetic vegetal se folosesc mai ales specii de plante cu cromosomi de dimensiuni mari i n numr relativ mic. Pentru evidenierea cromosomilor, n celulele aflate n diviziune mitotic, se folosesc esuturile meristematice din zona de cretere a rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16), secar Secale cereale L. (2n = 14), bob Vicia faba L. (2n = 12) etc.

Materialul biologic tipic, este reprezentat de esutul meristematic din apexul radicular al rdcinii de ceap Allium cepa L. (2n = 16).

Rdcinile de ceap se obin dup o perioad de 2-3 zile de la punerea ntr-un pahar cu ap a bulbului de ceap, astfel ca numai discul s ptrund n lichid. La temperatura camerei, rdcinile ating n 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm i pot fi detaate (Fig.13).

a b c d e

b a

Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceap, n laborator

Pentru obinerea rdcinielor embrionare, seminele se pun la germinat pe hrtie de filtru,

umectat cu ap, n cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea seminelor la unele specii de plante se face n nisip umed , n condiii speciale. Recoltarea rdcinilor se realizeaz cnd acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare cnd un numr mare de celule se afl n diviziune se determin prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei zile este ntre orele 7 - 10, funcie de durata ciclului celular la specia respectiv.

2.1.1. Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n = 16)

Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanelor pectice din pereii celulari i colorarea difereniat a constituenilor celulari.

Principiul metodei:

n celulele n diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv n rou violaceu, de ctre o soluie de fuxin bazic decolorat (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborat de Feulgen i Rossenbeck (1924) i modificat de Tomasi (1936); se aplic pentru evidenierea cromosomilor mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967).

Materiale necesare: material biologic (rdcini de ceap de 1-1,5 cm); sticlrie (pahare Berzelius, flacoane, lame de microscop, lamele, pipete); instrumentar (pensete, lame, bee de chibrit); aparatur (microscop optic, termostat, frigider); hrtie de filtru reactivi prefixatori: soluie apoas de colchicin (0,01 - 0,2%);

sau

ap rece la 2-4 C fixatori nucleari: alcool etilic absolut acid acetic glacial (3 :1), sau; fixator Carnoy (6 pri alcool etilic absolut : 3 pri cloroform : 1 parte acid acetic

glacial), sau; fixator Battaglia (5 pri alcool etilic absolut : 1 parte acid acetic glacial : 1 parte formol :

1 parte cloroform) colorani: reactiv Schiff - preparat dup Darlington i La Cour (1960) (cf. Tudose, 1967).

Soluia folosit la colorare se recomand s nu se arunce, deoarece poate fi folosit de nenumrate ori, pn cnd capacitatea ei de colorare scade.

Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea este necesar pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinnd

acumularea de celule n metafaz. Aceast etap nu se recomand s se execute cnd se urmrete observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesar ns, la

efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realiznd o scurtare prin spiralizare, a cromosomilor.

Materialul biologic (rdcinile de ceap de 1 - 1,5 cm lungime) se introduce n flacoane mici de sticl, adugndu-se 2 - 3 ml de prefixator. Dup trecerea timpului necesar prefixrii, prefixatorul se ndeprteaz cu o pipet sau prin decantare. Ca prefixatori se foloseste de exemplu, soluie apoas de colchicin 0,01-0,2% sau ap rece la 2 40C, 4 - 24 ore, la frigider. Pentru studiul cromosomilor n mitoz la ceap, recomandm prefixarea bulbilor de ceap germinai, cu rdcini de 1 - 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-40C), sau prefixarea cu soluie de colchicin, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei.

Fixarea Fixarea are rolul de a omor celulele, n starea n care se afl n acel moment i de a

coagula constituenii celulari, fr a modifica structura intern i extern a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coaguleaz, constituenii celulari putndu-se colora cu diferii colorani.

Fixarea se realizeaz prin adugarea peste materialul biologic a 2-3 ml de fixator, dup ndeprtarea substanei de prefixare. La ceap, se preleveaz rdcinile i se plaseaz ntr-un flacon de sticl, n vederea efecturii fixrii cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura camerei. n general, timpul de fixare variaz n funcie de soluia de f ixare i de consistena materialului fixat.

Dac prelucrarea materialului biologic nu se continu imediat, el se conserv la frigider (2 40C), n alcool etilic 70%.

Splarea Rolul splrii este de a ndeprta urmele de fixator. Splarea se realizeaz cu soluie de

HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se ndeprteaz soluia de fixare i se adaug soluia de splare.

Hidroliza

Rolul hidrolizei este de a uura colorarea, prin dizolvarea parial a substanelor pectice intercelulare, distrugerea parial a pecto-celulozei parietale, precum i uurarea etalrii celulelor ntre lam i lamel.

Dup ndeprtarea soluiei de fixare, sau a alcoolului, se realizeaz hidroliza la cald sau la rece. Hidroliza la cald se realizeaz la temperatura de 600C, prin adugarea de 2 - 3 ml HCl 1N. Timpul este variabil, funcie de duritatea esuturilor; se stabilete prin tatonri (la ceap, 7 - 8 min.). Hidroliza la rece se realizeaz prin adugarea de soluie HCl 50%, dup ndeprtarea soluiei de splare. La ceap, hidroliza se realizeaz timp de 10-15 min., la temperatura camerei.

Colorarea

Dup ndeprtarea soluiei de hidroliz (cu ajutorul unei hrtii de filtru se ndeprteaz urmele de soluie de hidroliz), se adaug 2-3 ml de reactiv Schiff, astfel nct rdcinile s fie scufundate n colorant, iar colorantul s rmn incolor. Dup 15-20 de min., zona meristematic din vrful rdcinii ncepe s se coloreze n rou-violaceu, apoi n violet intens, deoarece aici se afl celule n diviziune; restul rdcinii, unde frecvena diviziunilor este sczut, iar celulele sunt mari i alungite, rmne vizibil necolorat. Pentru o bun colorare sunt necesare 30 min. - 1 or, la temperatura camerei. O colorare intens, uniform, se obine dac materialul introdus n colorant se pstreaz la frigider, cteva ore. Pentru mrirea contrastului ntre cromosomi i citoplasm se recomand meninerea rdcinilor scoase din colorant ntr-o soluie de acid acetic 45%, timp de 10 - 15 min. sau n ap, timp de 30 de min., splnd astfel excesul de colorant. n cazul n care nu s-a realizat o colorare satisfctoare, intensificarea ei se realizeaz prin executarea preparatului ntr-o pictur de carmin acetic. n colorant, la frigider, materialul se poate pstra maxim 1-2 zile, dup care se degradeaz, avnd loc i colorarea citoplasmei.

Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash)

Preparatele microscopice rapide se obin prin etalarea vrfului colorat al rdcinii (de preferin o poriune de 1-2 mm), pe o lam de microscop curat i degresat (prin splarea lamelor n amestecuri oxidante speciale folosite n lucrrile de citologie, n alcool etilic 96%, sau n spirt sanitar, urmate de o bun tergere cu o bucat de tifon, naintea efecturii preparatului), ntr-o pictur de acid acetic 45%. n prealabil, vrful colorat al rdcinii se poate trece printr-un cristalizor cu ap. Aeznd deasupra vrfului detaat al rdcinii o lamel i innd cu un deget o latur a lamelei, se etaleaz preparatul prin bti ritmice i sistematice n lamel, cu un b de chibrit, pentru dispunerea celulelor ntr-un singur strat i dispersarea cromosomilor n celule. Eliminarea excesului de soluie i desvrirea dispersrii celulelor i a cromosomilor se

realizeaz cu ajutorul unei hrtii de filtru, apsnd cu degetul mare peste lamel, fr a o mica. Pentru a mpiedica mprtierea cromosomilor i pentru o bun fixare a celulelor pe lam, se recomand ungerea acesteia naintea executrii preparatului cu albumin glicerinat. Lama uns este trecut cu partea uscat deasupra unei flcri, evitnd coagularea albuminei glicerinate.

Cu ct etalarea se efectueaz mai bine, cu att preparatul este mai bun, prezentnd cromosomii bine dispersai i individualizai. Trebuie evitat deplasarea lamelei pe lam n timpul etalrii, fapt ce duce la rostogolirea celulelor i la compromiterea parial sau total a preparatului. Dup etalare, ntre lam i lamel, trebuie s se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat n violet.

Preparatele astfel obinute, se pot observa la microscop imediat dup efectuare, timp de cteva ore, deoarece la lumin i la temperatura camerei, colorantul va dispersa n citoplasm.

Efectuarea preparatelor semipermanente

Pentru studiul preparatelor i n ziua urmtoare, acestea se efectueaz semipermanent, pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de preparate se realizeaz prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adugare de glicerin pe marginile acesteia, la contactul cu lama i ndeprtarea excesului de glicerin cu ajutorul unei hrtii de filtru. Lamele semipermanente se pot pstra la frigider timp de 24 - 48 de ore. Dup o pstrare ndelungat, colorarea se intensific, cuprinznd i citoplasma.

Efectuarea preparatelor permanente prin includere n balsam de Canada Preparatele microscopice pe care dorim s le pstrm timp ndelungat, cu scopul de a servi

drept model, sau ca dovad a unei cercetri tiinifice, se monteaz n balsam de Canada (rin miscibil cu xilenul sau toluenul). n jurul lamelei se pune o pictur de alcool 96% i cu ajutorul unei lame de ras, se desprinde cu atenie lamela de pe lam, printr-o micare de ridicare a lamelei. Materialul de studiu rmne prins de lam i de lamel. Att lama, ct i lamela, se trec prin dou bi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic i dou bi de xilen sau toluen, timp de 2-5 min., pentru fiecare baie.

Rolul alcoolului este acela de a deshidrata esuturile i de a le spla de acidul acetic; xilenul va nlocui apa din esuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul.

Lamele se introduc n pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele n capsule de sticl sau porelan, ntotdeauna cu preparatul biologic plasat la faa superioar. Pe lama umed, n regiunea unde sunt celule, se pune o pictur de balsam de Canada, iar deasupra se aplic o lamel curat i degresat. Pe aceeai lam, alturi (n regiunea fr celule) se pune o alt pictur de balsam de Canada peste care se aeaz lamela iniial, cu faa ce conine celulele, n jos. Se ndeprteaz excesul de balsam de Canada printr-o uoar apsare pe lamele, cu o bucat de hrtie de filtru, realizndu-se astfel, i prinderea lamelelor de lam. Preparatul se usuc la termostat, la 400C, timp de cteva zile i se eticheteaz (se noteaz specia i esutul din care s-a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat preparatul etc.), putnd fi pstrat apoi timp ndelungat.

Examinarea preparatelor la microscopul optic

Examinarea preparatelor se efectueaz n lumin puternic, cu folosirea unui filtru verde, care mrete contrastul ntre cromosomi i citoplasm. Se recomand ca observarea s nceap cu obiectivul 10x, apoi, se schimb obiectivele 20x, 40x i chiar 90x (cu imersie n ulei de cedru).

Deoarece reactivul Schiff coloreaz selectiv numai ADN-ul, la microscopul optic, se vor observa cromosomii colorai n rou-violet; nucleolii, citoplasma i organitele celulare rmnnd incolore. Pereii celulari nu se coloreaz, fiind greu vizibili, de culoare glbuie; uneori se observ doar cromosomii celulelor n diviziune i nucleii celulelor n interfaz. Pentru a delimita celulele, se poate realiza o uoar colorare a citoplasmei, cu o soluie alcoolic foarte slab de verde de metil. Aceast colorare se realizeaz naintea efecturii preparatului permanent, prin trecerea lamei i a lamelei pentru un timp foarte scurt (cteva secunde), prin soluie alcoolic de verde de metil. Astfel, citoplasma se coloreaz n verde deschis i celulele pot fi uor delimitate, iar cromosomii se observ mai bine, datorit contrastului de culoare.

La microscopul optic se vor observa celule n interfaz cu nuclei mici, colorai n rou-violet, cu nucleoli incolori, ce apar ca nite corpusculi luminoi de form mai mult sau mai puin rotund. Se observ i celule n diferite faze ale diviziunii mitotice:

celule n profaz timpurie, cnd cromosomii ncep s devin vizibili la microscopul optic i au aspectul unor filamente fine i subiri; n profaza trzie, cnd cromosomii se

individualizeaz, fiind situai n nucleu. Spre sfritul profazei se dezorganizeaz membrana nuclear;

celule n metafaz (faz cu frecven ridicat n preparatele microscopice, n cazul n care s-a efectuat prefixarea); se pot numra i observa morfologic cromosomii care au atins maximul spiralizrii, fiind bine individualizai. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu uurin i se pot numra 16 cromosomi, de forma unor bastonae, cu capetele mai mult sau mai puin ndoite. Prin studiu mai amnunit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia fiecrui cromosom n parte, putndu-se executa microfotografii;

celule n anafaz n anafaz timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se deplaseaz spre polii celulei i anafaz trzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub form de stea - diaster;

celule n telofaz timpurie, cnd cromosomii fii au ajuns la polii celulei i telofaz trzie, caracterizat prin formarea nucleilor fii i apariia peretelui despritor (fragmoplastul).

2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n mitoz cu soluie carmin-acetic

Metoda a fost elaborat n 1926 de ctre Belling (cf. Tudose, 1967)i se bazeaz pe faptul c acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti), se comport ca un colorant acid n soluie alcalin i se ncarc negativ, iar n soluie acid, ca un colorant bazic, ncrcndu-se pozitiv. Aceast metod este des folosit n studiile de citogenetic vegetal, deoarece este uor de efectuat, necesitnd un timp scurt.

Materialul biologic, sticlria, instrumentarul i reactivii utilizai sunt identici cu cei folosii n cazul metodei Feulgen.

Colorantul utilizat este soluia carmin acetic (55 cm3 ap distilat la 1000C, 45 cm3 acid acetic glacial i 0,5 g carmin). Amestecul se pune ntr-un balon de sticl, se agit i se aeaz n bain-marie, lsndu-se s fiarb cteva minute. Se agit din nou i se las s se rceasc; se filtreaz i se adaug cteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolv ncet n soluie, excesul depunndu-se la baza vasului. Se pstreaz la ntuneric i la rece (la frigider).

Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea materialului biologic lipsete, sau poate fi efectuat la fel ca la metoda Feulgen. Fixarea

Fixarea nu este necesar; se poate realiza n fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 - 12 ore, sau cu alt fixator. Dac nu se continu lucrul, materialul poate fi pstrat la rece, n fiole cu alcool 70%, bine nchise.

Hidroliza i colorarea Hidroliza i colorarea se efectueaz simultan, n soluia carmin-acetic. ntr-o sticl de ceas

sau o capsul de porelan, se pun 3 - 5 cm3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (rdcinie de 10 - 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaug cteva picturi (10 - 15) de HCl 1N; se nclzete 20 - 25 min. la flacra unei lmpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitnd fierberea i agitnd, pn cnd materialul capt culoarea rou nchis, devine moale i se las la baza vasului.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele microscopice se realizeaz pe o lam de microscop, ntr-o pictur de carmin acetic, n care se aeaz vrful unei rdcinie. Pentru intensificarea culorii, se amestec uor colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se aeaz deasupra o lamel, se etaleaz i se ndeprteaz excesul de colorant, n acelai mod ca la metoda Feulgen.

2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct n esuturile cu activitate mitotic intens (esut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, esuturi embrionare sau de regenerare, ct i indirect n culturi de esuturi.

Metode pentru studiul cromosomilor n diferite esuturi provenite de la animale

adulte Studiul cromosomilor la peti (Fam. Cyprinidae). Tehnica Ohno (1965) Material biologic: splin, rinichi, gonade, branhii.

Reactivi: colchicin 0,5%, ap distilat, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa. Instrumentar: lame de microscop, lamele, sering, foarfece, ac spatulat, pensete etc. Etape de lucru: Pretratament

Pretratamentul se realizeaz cu colchicin. Colchicina blocheaz celulele n diviziune n stadiul de metafaz, prin inhibarea activitii fusului nuclear, determinnd acumularea n esuturile tratate a unui numr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizai, liberi n citoplasm.

Se injecteaz animalele adulte intramuscular (n musculatura dorsal) cu soluie de colchicin 0,5%, n cantitate de 0,5-1 ml. (n funcie de talie), cu dou ore nainte de sacrificare.

Tratament Tratamentul se realizeaz cu soluie hipotonic (hipoton), ce determin o umflare i o

fluidizare a citoplasmei celulare, permind astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare superioar.

Dup sacrificarea animalului se recolteaz splina, rinichiul, gonadele i branhiile, care se fragmenteaz n buci de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizeaz n ap distilat, la pH neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei.

Fixare Fixarea are rolul de a omor celulele, fr s altereze componentele celulare. Drept fixator

se folosete soluia de acid acetic 50%, timp de 15-30 min., la temperatura camerei. Hidroliz Hidroliza se efectueaz n scopul macerrii esuturilor, n vederea facilitrii ptrunderii

colorantului n nucleu; se realizeaz cu HCl 1N, la 600C, timp de 10-15 min. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie Giemsa, n scopul obinerii contrastului necesar

examinrii microscopice a cromosomilor. Efectuare de preparate microscopice de tip squash

Pe o lam de microscop, ntr-o pictur de acid acetic 45%, se plaseaz un fragment de esut, se acoper cu lamela i se etaleaz prin bti ritmice cu un b de chibrit.

Preparatele se pot realiza permanente n balsam de Canada, dup tehnica descris. Studiul cromosomilor la amfibieni. Tehnica Spurway i Callan (1960) Aceast tehnic este utilizat pentru evidenierea cromosomilor din celulele esutului

gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus. Etape de lucru: Tratament

Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesar nlocuirea tratamentului hipotonic cu o colchicinizare cu soluie de colchicin 0,04% n ap distilat, timp de 30 min., la 370C.

Fixare

esutul gonadal fragmentat se fixeaz 2-3 ore n fixator alcool acetic 3/1. Colorare Colorarea se realizeaz cu soluie carmin acetic 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min. Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele se efectueaz prin tehnica squash. Se plaseaz o poriune din esutul colorat pe lam i se acoper cu lamela, apoi se preseaz uor pentru etalare.

Efectuarea preparatelor permanente

Preparatul se introduce n acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei i se trece n alcool acetic 3/1, timp de cteva secunde. Ulterior se trec att lama, ct i lamela prin dou bi de alcool i dou bi de xilol, apoi se monteaz preparatul n balsam de Canada.

Studiul cromosomilor la mamifere. Tehnica Fredga (1964) Material biologic: cornee de obolan, oarece, hamster, cobai. Hipotonia

Se asfixiaz animalul (obolan, oarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform i se extirp globii oculari cu un foarfece fin i o pens curb, evitnd atingerea corneei. Globii oculari se plaseaz ntr-un vas cu soluie hipoton de citrat de sodiu 0,7% (n ap distilat), la 370C, timp de 30 min.

Fixarea

Fixarea materialului se realizeaz n soluie de acid acetic 50% - 9 pri i o parte HCl 1N, 5 min.

Colorarea Colorarea se realizeaz n soluie de orcein acetic 2%, 2 min. Efectuarea preparatelor microscopice

Globul ocular se plaseaz pe o lam de microscop curat i cu un ac spatulat se rzuie celulele din epiteliul cornean ntr-o pictur de colorant. Se acoper cu lamela i se preseaz cu grij, realizndu-se un preparat de tip squash.

3. Meioza

Este procesul complex de diviziune, n urma cruia rezult celule-fiice cu numr de cromosomi redus la jumtate fa de celula-mam (de la care s-a pornit n diviziune). Termenul provine de la grecescul meiosis (reducere).

Ca rezultat al meiozei se formeaz gameii la animale i sporii la plante, acest tip de diviziune fcnd trecerea de la un nucleu diploid (2n), la unul haploid (n), diplofaza fiind nlocuit cu haplofaza. Reducerea la jumtate a numrului de cromosomi n cursul meiozei, este un proces indispensabil, pentru c, prin unirea n procesul fecundaiei a gameilor paterni (cu n cromosomi), cu cei materni (tot cu n cromosomi), are loc, n zigot, restabilirea numrului iniial (2n) de cromozomi, i nu dublarea acestuia.

Deci, pentru toate organismele ce se nmulesc pe cale sexuat, este obligatoriu procesul alternrii fazelor ce se deosebesc dup numrul de cromosomi (haplofaza i diplofaza); ciclul de via individual cuprinde ambele faze.

Meioza reprezint un proces complex, ce implic desfurarea succesiv a dou diviziuni. Cele dou diviziuni, sunt precedate de o interfaz premeiotic (identic cu interfaza mitotic) i separate de o interfaz meiotic scurt, din care lipsete perioada sintetic (replicarea ADN). Prima diviziune meiotic este denumit i reducional (heterotipic), iar a doua diviziune este denumit ecvaional (homeotipic sau de maturaie).

Schematic meioza poate fi redat astfel:

Prima diviziune meiotic Ca i n cazul diviziunii mitotice, autoreplicarea ADN-ului precede meioza, astfel nct, la

nceputul profazei, fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide surori (este bicromatidic). Profaza Aceast etap este mprit n cinci stadii: leptoten, zigoten, pachiten, diploten i

diachinez. Leptotenul (leptonemul) - de la grecescul lepto = subire; tenuis = panglic. Materialul cromatic din interfaz ncepe s se condenseze. Cromosomii sunt nc foarte

despiralizai i se individualizeaz sub forma unor filamente lungi i fine de cromatin. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide surori unite la nivelul centromerului i intim asociate, ceea ce confer cromosomului un aspect monocromatidic. Cromosomii sunt ataai cu ambele capete de nveliul nuclear, prin intermediul unor structuri specializate, numite plci de ataare.

n

n

n

n

n

n

2n

n

Diviziunea I Diviziunea II

ntre leptoten i zigoten, n mod frecvent, se observ un stadiu intermediar, n care filamentele cromatice se adun la un loc, formnd un ghem compact (spirem).

Spre sfritul leptotenului, se observ tendina aezrii paralele a cromosomilor omologi.

Fig. 14 Zea mays L. profaza I - leptoten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Zigotenul (zigonemul) de la grecescul zygo = jug. Acest stadiu se caracterizeaz prin conjugarea cromosomilor omologi (unul de origine

matern i cellalt de origine patern), proces denumit sinapsis (sinapsare). Sinapsisul ncepe prin condensarea fiecrui cromosom n jurul unei structuri denumit element axial, care este aparent de natur proteic.

Dup aceea, elementele axiale ale cromosomilor corespunztori se dispun fa n fa, i constituie elementele laterale ale unei structuri tripartite (complexul sinaptonemal), fiind separate

de un element central, cu care sunt conectate prin intermediul unor benzi proteice transversale, dispuse n mod similar treptelor unei scri.

Conjugarea cromosomilor omologi, ce formeaz bivalenii, are loc treptat. Din punctul de iniiere, conjugarea se extinde progresiv, cuprinznd integral cromosomii prealiniai ntr-o manier zipper - like (engl. zipper = fermoar; like = ca i). Cnd cei doi cromosomi nu sunt perfect omologi, conjugarea se produce numai ntre poriunile omoloage. Conjugarea cromosomilor X i Y, este posibil datorit existenei la cei doi cromosomi de sex a unei regiuni terminale omoloage. Se presupune c forele care determin conjugarea sunt de natur electrostatic sau hidrodinamic.

n acest stadiu cromosomii sunt n numr diploid. La autopoliploizi (3x, 4x etc.) numrul cromosomilor mperecheai poate fi mai mare de doi. Deci, n loc de bivaleni, vor fi multivaleni (trivaleni, tetravaleni etc.).

Pachitenul (pachinemul) de la grecescul pachy = gros n acest stadiu, continu scurtarea i ngroarea cromosomilor ce formeaz bivalenii.

Scurtarea este att de intens, nct devine evident structura dublu cromatidic a fiecrui cromosom. Astfel, cei doi omologi ai bivalentului formeaz o figur tetracromatidic, numit tetrad. Numrul tetradelor este egal cu jumtate din numrul diploid al cromosomilor.

Orice modificare n structura cromosomilor, care altereaz omologia, poate fi eventual decelat prin analiza bivalenilor n pachiten.

Spre sfritul pachitenului se observ ncruciarea reciproc a celor doi cromosomi omologi din acelai bivalent. Are loc schimbul reciproc de segmente ntre cromosomii omologi, ca rezultat al crossing-overului (recombinarea intracromosomial).

Fig. 15 Zea mays L. profaza I - pachiten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Diplotenul (diplonemul) de la grecescul diplo = dublu Este stadiul n care, ntre cromosomii omologi ncep s acioneze fore de respingere,

acetia ndeprtndu-se ntre ei, ncepnd din zona centromerilor spre extremiti. Omologii mai rmn nc unii n anumite puncte, denumite chiasme, considerate a reprezenta locul n care s-a realizat schimbul fizic ntre cromosomi. Dei ncep s se formeze n pachiten, chiasmele devin vizibile numai dup desinapsarea cromosomilor ce alctuiesc bivalentul. S-a constatat absena

chiasmelor n regiunile heterocromatinice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate n evenimente crosing-over.

Diachineza n limba greac dia = prin i kinesis = micare. Cromosomii continu contractarea, fiind uor vizibili la microscop i se detaeaz de

membrana nuclear. Se remarc fenomenul de terminalizare a chiasmelor (adic migrarea chiasmelor intercalare spre capetele cromosomilor), care face ca bivalenii s capete de regul forme inelare, omologii rmnnd asociai prin capetele lor.

n cursul acestei faze, nucleolul i membrana nuclear se dezintegreaz i cei doi centromeri ai fiecrei tetrade se ataeaz de fibrele fusului nuclear, ce a aprut concomitent cu ruperea membranei nucleare.

Fig. 16 Zea mays L. profaza I - diploten (Mertens i Hammersmith, 1998)

Metafaza I

n aceast etap a primei diviziuni, cromosomii ating maximum de scurtare i ngroare. Bivalenii migreaz spre placa metafazic i se dispun ntr-un singur plan, perpendicular pe fibrele fusului. Sunt nc vizibile chiasmele terminale ale fiecrei tetrade. n cadrul fiecrei tetrade, centromerul unuia din cromosomii bivaleni este orientat spre un pol, iar centromerul celuilalt cromosom al aceluiai bivalent, spre cellalt pol al fusului. Orientarea centromerilor cromosomilor de origine matern ori patern, ctre un pol sau cellalt este aleatorie (recombinare intercromosomial sau dansul cromosomilor). n aceast faz, cromosomii se coloreaz intens, astfel nct pot fi uor numrai i studiai din punct de vedere morfologic.

Anafaza I

Omologii din cadrul fiecrei tetrade se separ, n urma disjunciei rezultnd cte doi cromosomi univaleni ce ncep s migreze spre polii opui (n funcie de orientarea centromerilor). Segregarea aleatorie a acestor cromosomi, st la baza principiului mendelian al segregrii independente a factorilor ereditari. Jumtatea de origine patern a fiecrei tetrade va migra ctre unul sau cellalt pol (n mod aleatoriu), iar jumtatea de origine matern va migra n fiecare caz ctre polul opus.

La sfritul anafazei I, la fiecare pol al fusului, se afl cte un set haploid de cromosomi.

Fig. 17 Zea mays L. profaza I - diakinez (stnga) i metafaza I (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

Dac nu a avut loc nici un crosing-over n profaza I, fiecare cromosom univalent va fi

alctuit doar din cromatidele de origine matern ori patern.

Fig. 18 Zea mays L. - anafaza I (Mertens i Hammersmith, 1998)

Telofaza I Cromosomii univaleni, ajuni la cei doi poli, sufer procese inverse celor din profaz (se

despiralizeaz). n jurul fiecrui set haploid de cromosomi, se formeaz membrana nuclear. n final, se formeaz cei doi nuclei, n fiecare aflndu-se cte jumtate din cromosomii nucleului celulei iniiale. Apoi, are loc divizarea citoplasmei i apariia a dou celule (denumite celule n diad) cu nuclei haploizi (n).

Dup telofaza I, urmeaz o scurt interchinez, i apoi ncepe a doua diviziune meiotic (diviziune de maturaie). La majoritatea speciilor, telofaza I i interchineza sunt foarte scurte. La unele specii aceste faze lipsesc. n aceast scurt interfaz, nu are loc replicarea ADN-ului.

Fig. 19 Zea mays L. telofaza I (stnga) i profaza II (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

A doua diviziune meiotic A doua diviziune a meiozei (diviziunea de maturaie), este de fapt o diviziune mitotic.

Prezentm fazele pe scurt: Profaza a II a Lipsete la organismele care nu au nici interchinez. Acolo unde este prezent, are loc

simultan n cele dou celule ale diadei. Deci, n fiecare din aceste dou celule, cromosomii se spiralizeaz, se scurteaz i se individualizeaz. Sunt bicromatidici (univaleni).

Se formeaz fusul de diviziune. Metafaza a II a

Cromosomii se inser pe filamentele fusului de diviziune i migreaz n placa ecuatorial, dispunndu-i centromerii n acelai plan.

Fig. 20 Zea mays L. metafaza II (Mertens i Hammersmith, 1998)

Anafaza a II a Cromatidele surori ale fiecrui bivalent se separ i se deplaseaz ctre polii opui ai

fusului. Telofaza a II a

Cromosomii ajuni la polii fusului de diviziune se despiralizeaz. n final, dintr-o diad n se formeaz o tetrad (patru celule) n.

n urma proceselor morfofiziologice, cele patru celule ale tetradei se transform n gamei.

Fig. 21 Zea mays L. anafaza II (stnga) i telofaza II (dreapta) (Mertens i Hammersmith, 1998)

Fig. 22 Zea mays L. - Citokinez i formarea tetradei (Mertens i Hammersmith, 1998)

A doua diviziune a meiozei, dup mecanismul de desfurare este asemntoare mitozei,

dar prezint i deosebiri. Diferena principal const n faptul c, datorit crossing-overelor ce au loc n profaza I, cromatidele surori nu sunt identice. Cromosomii ce au participat la crosing-over sunt o combinaie de informaie genetic de origine matern i patern. O alt deosebire este c, n mitoz unitatea funcional este cromatida, iar n meioz unitatea funcional este cromosomul (dou cromatide).

4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza

4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante

Metoda de colorare rapid carmin-acetic Aceast metod a fost elaborat de Belling (1926) i ea se bazeaz pe capacitatea

acidului carminic ca n soluie alcalin s fie ncrcat negativ i s se comporte ca un colorant acid, iar n soluie acid s fie ncrcat pozitiv i s se comporte ca un colorant bazic. Colorantul carmin care se folosete n mod curent n citologie este preparat dintr-un extract al femelelor homopterului Coccus cacti. Acest colorant nu este pur din punct de vedere chimic, acidul carminic fiind ns constituentul pe care se bazeaz activitatea sa. Pentru intensificarea capacitii sale de colorare, n soluia de carmin n acid acetic se adaug acetat de fier.

Ca material biologic, se folosete secara Secale cereale L. (2n=14). n general, la secar ca i la alte cereale, meioza are loc n momentele cnd tinerele antere

i-au pierdut transluciditatea. Spicele sunt recoltate n faza de burduf cnd au lungimea de 4-6 cm, fiind nvelite n teaca ultimei frunze.

Pentru studiul cromosomilor sunt necesare urmtoarele operaii: Etape de lucru Fixarea

Se face n fixator (soluie alcool-acid acetic n proporie de 3 :1), sau n soluie Carnoy, n care anterele se las 24-48 de ore. Se pot conserva fie n fixator, fie n alcool de 700 (n fiole bine nchise i la rece 0-40C, materialul se poate pstra timp ndelungat. Operaia fixrii poate lipsi, dup cum nici hidroliza nu este absolut necesar.

Colorarea i efectuarea preparatelor microscopice Se ia un spic, se prelev florile din partea de mijloc i se scot staminele (cte 3 stamine n

fiecare floare). Fiecare stamin se plaseaz pe o lam curat, ntr-o pictur de soluie carmin acetic. Cu un ac spatulat se taie transversal la mijloc i apoi se apas ncet pe cele dou jumti pentru a goli antera de coninut, adic de celulele mam ale granulelor de polen unde are loc meioza. Se ndeprteaz resturile staminei cu o penset fin. Peste acest material se pune o lamel curat i uscat, (sau uns cu albumin glicerinat i trecut prin flacr), dup care cu o

bucat de hrtie de filtru se apas pe lamel pentru a etala bine celulele i pentru a ndeprta excesul de colorant.

Colorarea materialului are loc foarte repede, astfel c imediat poate ncepe observarea la microscop. Pentru intensificarea colorrii, se poate nclzi lama cteva minute deasupra unei flcri de la o lamp de spirt, evitnd fierberea.

Pentru a evita evaporarea soluiei, se parafineaz marginile lamelei sau se pune soluie de lipit cauciucul.

Examinnd preparatul la microscop, pot fi ntlnite trei situaii: 1. nu a nceput diviziunea, anterele fiind prea tinere n acest caz, celulele mam ale

granulelor de polen sunt n interfaz. 2. a nceput diviziunea se observ celule n diferite faze ale meiozei. 3. s-a terminat diviziunea - se vor observa gruncioarele de polen care au form

caracteristic. n general se consider c staminele din aceeai floare se afl n aceeai faz de diviziune.

Dac la microscop nu am gsit diviziuni meiotice, se caut flori spre baza sau spre vrful spicului (nfloritul n cadrul unui spic ncepe mai nti la mijlocul spicului i se propag apoi spre baza i vrful spicului).

Pentru cercetare se recomand folosirea metodei Feulgen pe care o vom descrie n continuare (cromosomii se coloreaz mai bine, contrastul este mai mare ntre cromosomi i citoplasm i n general se obin preparate mai bune).

Studiul cromosomilor n meioz prin metoda de colorare Feulgen Aceast metod a fost elaborat de Feulgen i Rossenbeck (1924) i apoi modificat de

De Tomasi (1936). n celulele n diviziune numai cromatina cromosomilor se coloreaz efectiv n rou-violaceu de ctre fuxin, n timp ce acidul ribonucleic din nucleoli i citoplasm nu se coloreaz. Reacia Feulgen pozitiv este considerat ca fiind un indice sigur al prezenei acidului dezoxiribonucleic.

Pentru studiul meiozei prin metoda Feulgen se poate folosi ca material biologic secara Secale cereale L. (2n=14).

n general meioza are loc n momentele cnd tinerele antere i pierd transluciditatea, acest moment coinciznd la gru i la secar cu faza n care spicele sunt n burduf i au o lungime de 3-6 cm. Pentru a repera momentul cnd are loc meioza folosim metoda rapid carmin-acetic (descris anterior). n cazul n care la microscop am gsit diviziuni meiotice se fixeaz ntregul spic.

Sunt necesare urmtoarele operaii: Fixarea

Se realizeaz n soluie alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3:1). n momentul fixrii se adaug o pictur de soluie de perclorur de fier la cca. 5 cm3 de fixator. Fixarea se efectueaz n fiole de sticl n care se pun 2-3 cm3 de fixator. n fixator anterele se las cel puin o or la temperatura camerei, sau cel mult 24-48 de ore n frigider, dup care se trec n alcool absolut pentru o jumtate de or, pentru ndeprtarea acidului acetic din esuturi. De aici materialul se trece n fiole cu alcool de 700 care se nchid ermetic prin parafinare i se pun n frigider la 0-40C, unde se pot pstra timp ndelungat. Dac materialul se pstreaz n alcool de 700 timp mai ndelungat, se poate renuna la trecerea prin alcool absolut.

Hidroliza

Materialul se scoate din alcool 700 dup ce a stat cel puin o jumtate de or i se spal cu ap. n acest scop se ndeprteaz alcoolul din fiole, se pune ap i se agit anterele pn ce cad la fund. Materialul se las n ap o jumtate de or, dup care se face hidroliza n acid clorhidric normal, la temperatura de 600C, timp de 12 min. la orz, 8-9 min. n cazul grului etc.

Colorarea Se face n soluie de fuxin bazic (reactivul Schiff) n care materialul se las cel puin o

jumtate de or. n colorant anterele pot rmne cteva ore, timp n care se fac preparatele microscopice. Nu se recomand ca materialul s rmn prea mult timp n colorant deoarece se reduce contrastul dintre culoarea cromosomilor i a citoplasmei, iar preparatele au o ca litate mai slab.

Efectuare preparatelor microscopice

Pe o lam de microscop se pune o pictur de acid acetic 45% i n aceasta se plaseaz o stamin. Cu un ac spatulat se taie transversal stamina n dou jumti. Se apas uor pe ele pn ce ies celulele mame ale granulelor de polen i apoi sacii polinici se ndeprteaz. Peste material se pune o lamel uns cu albumin glicerinat i trecut prin flacra unei lmpi de spirt. Cu o bucat de hrtie de filtru se apas pentru etalarea celulelor i pentru ndeprtarea excesului de soluie.

Pentru a pstra preparatele cteva zile se poate parafina marginea lamelei sau se poate pune soluie de lipit cauciucul. Preparatele permanente se pot face prin montarea n euparal sau balsam de Canada.

5. Cariotip si idiograma

5.1. Definirea termenilor, nomenclatur

La conferina de la Denver (1960), termenul de cariotip a fost definit ca fiind o aranjare sistematic a cromosomilor unei singure celule, preparai prin desenare sau fotografiere, n nelesul lrgit conform cruia cromosomii unei singure celule pot reprezenta cromosomii unui individ sau chiar ai unei specii, iar termenul de idiogram ca reprezentarea diagramatic a unui cariotip, care se bazeaz pe msurtori ale cromosomilor din cteva sau din mai multe celule.

Cariotipul, reprezint n esen, numrul, forma i mrimea cromosomilor, este constant n ontogenia i chiar n filogenia unei specii, fiind tot mai des utilizat n taxonomie.

Studiul cariotipului furnizeaz elemente pentru analiza procesului de speciaie, pentru cunoaterea gradului de nrudire ntre specii etc.

Pentru fiecare specie, exist un cariotip standard. Eventualele rearanjamente cromosomiale (eliminri de cromosomi, duplicaii, translocaii, deleii etc.), se pot stabili prin comparaii cu cariotipul standard.

Indivizii aceleiai populaii care au o alt aranjare a genelor pe cromosomii omologi (consecin a modificrilor structurale ale cromosomilor), sunt denumii heterocariotipici, antonimii lor fiind cei homocariotipici.

n funcie de tipul cromosomilor pe care i conine, un cariotip poate fi simetric (toi cromosomii sunt de acelai tip) sau asimetric. Cariotipul cu cromosomi uniformi, este considerat primitiv comparativ cu cel cu cromosomi neuniformi. Sensul evoluiei cariotipului se consider a fi acela al reducerii numrului de baz al cromosomilor i asimetrizrii lui (prin inversii, translocaii, fuziuni centrice, etc.).

Metodologia elaborrii unei analize cromosomiale Indiferent de materialul celular din care au fost preparai cromosomii, sau de proveniena de

specie a acestora, pentru a obine maximum de informaii citogenetice este necesar adoptarea unui procedeu de lucru care conine mai multe etape.

Stadiul de diviziune cel mai adecvat analizei cariotipului, este metafaza mitotic, cnd cromosomii prezint maximum de condensare i colorabilitate.

n continuare, vom prezenta pe scurt etapele de lucru necesare alctuirii cariotipului. Etapa prelucrrii microscopice A. Vizualizarea preparatelor microscopice. Cutarea metafazelor presupune baleierea

(micarea lamei microscopice n sens orizontal sau vertical), fr a omite nici o poriune pe care se afl celule. Are ca scop:

Alegerea metafazelor potrivite analizei citogenetice. Procentajul metafazelor apte

studiului citogenetic, este extrem de variabil, depinznd de materialul celular studiat, de tehnica de preparare a cromosomilor, de abilitatea i experiena examinatorului. Cutarea metafazelor trebuie fcut cu un obiectiv ct mai mic (maxim 10x). Se poate schimba obiectivul cu unul mai mare (20x sau 40x), pentru a rezolva anumite incertitudini. n alegerea metafazelor utilizabile sunt eseniale dou criterii: s nu existe suprapuneri de cromosomi, sau dac sunt, numrul lor s fie mic i s nu intereseze mai mult de doi cromosomi; cromosomii s nu fie mprtiai pe o suprafa prea mare, iar dispunerea lor s pstreze o form variabil ntre un cerc i un patrulater. Acest ultim criteriu, este deosebit de important, deoarece poate elimina metafazele sparte, cu cromosomi pierdui, care la examenul ulterior pot s sugereze apariia de complemente cromosomiale cu cromosomi lips.

B. Studiul microscopic al cromosomilor. Etapa observaiei directe a cromosomilor, urmrete obinerea primelor rezultate citogenetice asupra materialului celular n studiu prin:

Numrtoarea de cromosomi, care prezint o mare importan, fiind prima caracteristic citogenetic a populaiei celulare examinate. Aceast numrtoare se poate face direct n placa metafazic, delimitnd eventual anumite regiuni, dar mai precis este numrarea dup fotografie. Mai demult, se numra dup desen (se desenau schematic cromosomii pe o coal de hrtie, sau prin procedeul clasic , folosind camera clar).

Identificarea cromosomilor aparinnd la diferite grupe (de exemplu din grupele D i G ale cariotipului uman, din grupele M sau S la Vicia faba, etc.

Pentru elaborarea unui cariotip, prima condiie este identificarea morfologic a cromosomilor.

Metode de identificare a cromosomilor Procedeul cel mai larg folosit n studiul cromosomilor metafazici, este acela al

msurtorilor. Se msoar lungimea integral a cromosomilor, lungimea braelor cromosomiale, poziia constriciilor secundare n raport cu aceea a centromerului etc.

Dar aceste criterii nu permit ntotdeauna o identificare precis a cromosomilor. Dificultile in mai ales de existena unor fluctuaii care pot masca considerabil diferenele reale dintre cromosomi. La fluctuaiile strict biologice se pot aduga: imprecizia msurtorilor (eroarea personal, eroarea optic), heteropicnoza unor regiuni cromosomiale sau a unor cromosomi ntregi (cromosomii sexului de exemplu), gradul de ntindere al regiunii centromerice, momentul metafazic pe baza cruia se efectueaz analiza etc. Se tie de exemplu c, maximum de contractare este atins de ctre cromosomii mai mari n stadiile mai avansate ale metafazei, n timp ce cromosomii mici ating acest nivel n stadii mai timpurii.

Dei metoda analizei cromosomiale prin msurtori a fost contestat (Patau, 1965) ea a rmas pn n prezent una dintre metodele de baz pentru identificarea cromosomilor.

n caracterizarea acestora, conferina de la Denver a adoptat urmtorii trei parametrii: 1. lungimea fiecrui cromosom, raportat la lungimea total a unui complement

haploid normal exprimat la 1000; 2. raportul braelor cromosomiale exprimat prin raportul dintre braul lung / braul scurt; 3. indexul centromeric exprimat prin raportul dintre braul scurt i lungimea total a

cromosomului, raportat la 100 (braul scurt / cromosom nmulit cu 100). n afara acestor parametrii, Patau, recomanda reprezentarea cromosomilor sub form de

puncte ntr-un sistem de coordonate, n care, pe abscis s-ar nota lungimea braului lung, iar pe ordonat lungimea braului scurt, ambele exprimate n procente din lungimea total a complementului cromosomial haploid (cariogram).

Pentru identificarea morfologic a cromosomilor, poziia centromerului, una din caracteristicile cele mai constante ale cromosomului, poate fi exprimat prin relaiile:

d = l-s; sau r = l/s n care l i s reprezint lungimea braului lung i respectiv a celui scurt al cromosomului, d

diferena ntre braul lung i scurt, iar r raportul dintre brae. Putem calcula lungimea braului lung conform relaiei:

l = c(100-i)/100 n care c este lungimea cromosomului iar i, indexul centromeric. Poziia centromerului,

determinat prin asemenea relaii, este exprimat simbolic ca mai jos: Levan i colab. (1964) au propus denumirea standardizat a cromosomilor n funcie de

poziia centromerului: Cromosomi metacentrici, cu centromerul situat n punctul median (M) sau n

regiunea median (m) i cu un raport al braelor 1,0-1,7 Cromosomi telocentrici, cu centromer terminal (T) Cromosomi acrocentrici, cu centromerul n regiunea terminal (t) Cromosomi submetacentrici i subtelocentrici cu centromerul situat n regiunea

submedian i respectiv subterminal (raportul braelor 1,7-3,0 i respectiv 3,0-7,0)

Nomenclatura cromosomilor pe baza poziiei centromerului (dup Levan i colab., 1964)

Poziia centromerului

Nomenclatura cromosomului

Index centromeric

Raportul braelor

Echivalarea cu nomenclatura citogenetic

curent

Median sensu stricto

Regiunea median

Submedian

Subterminal

Regiunea terminal

Terminal sensu stricto

M

m

sm

st

t

T

50,0

37,5

25,0

12,5

-

0,0

1,0

1,7

3,0

7,0

-

-

Metacentric

Submetacentric

Subtelocentric

Acrocentric

Telocentric

Constriciile cromosomiale includ constriciile primare sau centromerice i constriciile secundare. Constriciile secundare, cuprind regiuni cromosomiale diferite ca structur i funcie, cum sunt regiunile organizatoare nucleolare (regiunile SAT), care delimiteaz sateliii de restul cromosomului i constriciile localizate n general interstiial pe braele cromosomilor.

Identificarea aberaiilor cromosomiale are loc n primul rnd n aceast etap. Observaiile privind prezena anumitor aberaii cromosomiale se vor nota pe fotografia (desenul) mitozei examinate, preciznd tipul de aberaie, localizarea sa pe cromosom i pe bra etc. Atunci cnd se urmrete efectul citogenetic al unui agent fizic, chimic sau biologic (radiaii ionizate, substane chimice mutagene, virusuri etc.), nregistrarea aberaiilor cromosomiale reprezint obiectivul central al analizei cromosomiale.

Etapa prelucrrii fotografice Microfotografierea se desfoar n mai multe etape: O prim etap este alegerea mitozelor pentru fotografiere (o dat cu studiul

microscopic al mitozelor). Se vor alege pentru fotografiat doar metafaze foarte clare (este de dorit ca numrul acestora s fie ct mai mare, minimum 10% din mitozele examinate).

A doua etap, fotografierea mitozelor se face cu orice dispozitiv de microfotografie. Se utilizeaz filme alb-negru cu granulaie foarte fin, cu contrast sczut spre mediu.

Pentru obinerea de fotografii corespunztoare, calitatea superioar a microscopului este decisiv, n special a lentilelor utilizate la ocular i obiectiv. Pentru fotografiere se aleg doar metafazele extrem de clare. Dup aceea, cromosomii sunt decupai i aranjai n cariotip.

Prepararea cariotipurilor Se recomand ca alctuirea cariotipului s se desfoare pe baza a cel puin dou copii

fotografice ale metafazei i imaginii microscopice nsi a metafazei, luat cu un obiectiv cu imersie. nainte de a trece la decuparea propriu-zis a cromosomilor, este indicat s se verifice nc o dat toate particularitile metafazei respective, eventualele aberaii, limitele cromosomilor, eventuale suprapuneri, etc. Decuparea cromosomilor se face cu atenie, tind cu foarfeca fiecare cromosom n parte i lsnd ntotdeauna o margine alb n jurul imaginii fotografice negre. Cromosomii decupai se aeaz pe o coal de carton, sau hrtie mai tare, alb, pe care urmeaz s fie aranjat i lipit cariotipul. Pentru decuparea cromosomilor suprapui se taie un cromosom dintr-o copie i al doilea cromosom din alt copie. n aceast situaie, numai imaginea la microscop precizeaz limitele cromosomilor.

Aranjarea cromosomilor n cariotip, (cu excepia studiilor ce urmresc stabilirea cariotipului unor specii nestudiate nc), trebuie s porneasc de la cunoaterea cariotipului normal al speciei.

Primul criteriu de aranjare a cromosomilor n cariotip este cel al lungimii, cromosomii fiind dispui n ordine descresctoare. Se msoar de obicei ambele cromatide (de-a lungul axelor lor individuale) i se face o medie a rezultatelor. Regiunea centromeric se include n msurtoare, iar sateliii nu se msoar.

Al doilea criteriu, este cel al dispunerii pe grupe morfologice. Cariotipurile normale au adesea perechile de cromosomi aranjate pe grupe morfologice, care se noteaz cu litere

majuscule n ordine alfabetic, sau cu cifre. Aceste grupe cuprind dou sau mai multe perechi de cromosomi care se identific greu sau deloc prin mijloace uzuale ale analizei citogenetice.

Al treilea criteriu folosit n aranjarea cromosomilor n cariotip, este acela al mperecherii cromosomilor omologi. Plecnd de la premisa c omologia genetic corespunde unei omologii morfologice, cromosomii presupui omologi sunt dispui n perechi sau grupe n funcie de gradul de gradul de poliploidie al celulei respective (diploid, triploid, tetraploid etc.).

Aranjarea cromosomilor pe perechi, notate de obicei cu numere n cadrul cariotipului normal, presupune folosirea a cel puin doi parametrii de caracterizare a cromosomilor respectivi: lungimea i raportul braelor.

mperecherea cromosomilor omologi, prin simpla observaie vizual, se poate realiza inndu-se seama de anumite condiii:

1. se pot mperechea cu mai mult precizie cromosomii dintr-o metafaz mai puin avansat, cu braele puin contractate;

2. pentru mperecherea cromosomilor din cadrul unei grupe morfologice primul criteriu luat n considerare este raportul braelor i nu cel al lungimii;

3. la cromosomii mici, mperecherea pe criteriul raportului braelor este relativ, deoarece diferenele dintre msurtori la acest indice sunt mici;

4. se va ine cont de condiiile n care fotografierea poate modifica realitatea microscopic, mrind anumii cromosomi sau micorndu-i pe alii, n funcie de gradul de expunere i de copiere.

Cariotipul uman normal La Conferina de la Denver (1960), s-a czut de acord asupra unui sistem standard de

nomenclatur a cromosomilor din cariotipul uman normal. Principiile enunate la aceast conferin au fost confirmate i dezvoltate la Conferina de la Londra (1963) i cea de la Chicago (1966).

Cariotipul uman normal este reprezentat prin 7 grupe distincte de cromosomi autozomali,

aranjai n ordine descresctoare a lungimii lor i numerotai de la 1 la 22 ct i o pereche de cromosomi sexuali (X i Y). n cadrul aceluiai grup, cromosomii sunt aranjai dup mrime. Identificarea cromosomilor din aceste grupe nu este foarte simpl. De exemplu, n grupa de cromosomi numerotai 6-12, incluznd i cromosomul X, deosebirile dintre cromosomi sunt extrem de dificil de precizat. Se disting ceva mai uor cromosomii 6 i X de restul grupei. Pentru desemnarea grupelor cromosomiale se folosesc cifrele indicnd extremele fiecrei grupe unite printr-o liniu sau litere de la A la G.

Conferina de Londra (1963) a considerat drept caracteristici importante ale cromosomilor constriciile secundare i modul difereniat de ncorporare a timidinei marcate radioactiv demonstrabil prin autoradiografie.

Att la Conferina de la Londra (1963), ct i la cea de la Chicago (1966) s-a stabilit c anumii cromosomi umani prezint variaii morfologice la indivizi normali fenotipic.

Pentru descrierea complementului cromosomial Conferina de la Chicago (1966) propune folosirea unor simboluri care permit o nelegere uoar, scris i codificat, a acestora. Nomenclatura acestor simboluri este urmtoarea:

A-G grupurile de cromosomi

1-22 numerele autosomilor (sistemul Denver)

X, Y cromosomii sexuali

(/) separ linii celulare la descrierea mozaicismului

(+) sau (-) aezat imediat dup desemnarea numrului de autosomi sau a literei de grup, indic faptul c acel cromosom este n plus sau lipsete; aezat imediat dup indicatorul de bra sau de structur, semnaleaz c acel bra sau acea structur este mai mare sau mai mic dect normal

(?) indic o identificare discutabil a cromosomului sau structurii

Cromosomiale

Asterisc () indic un cromosom sau o structur cromosomial explicat n text sau n not de subsol

Ace acentric

Cen centromer

Dic dicentric

End endoduplicaie

Ih constricie secundar sau regiune necolorat (colorat negativ) izocromosom

Inv inversiune

inv (p + q - ) sau inv (p q + ) inversiune pericentric

Mar cromosom marcher

Mat origine matern

P braul scurt al cromosomului

Pat origine patern

Q braul lung al cromosomului

R cromosom inelar

S satelit

T translocaie

Tri tricentric

simboluri repetate duplicare de structur cromosomial.

Raportul Conferinei de la Chicago completeaz folosirea simbolurilor prezentate att pentru aberaiile numerice, ct i pentru cele structurale.

ntr-o descriere de cariotip, primul care trebuie nregistrat este numrul total de cromosomi, inclusiv cromosomii sexuali, desprii printr-o virgul. Constituia cromosomilor sexuali este indicat ulterior. De exemplu:

45,X 45 de cromosomi, un cromosom X; 47,XXY 47 de cromosomi, cromosomi sexuali XXY. Autosomii se specific n cazul n care exist o anomalie. Dac exist o aberaie numeric

a autosomilor, litera grupului din care face parte autosomul extra sau lips este urmat de semnul (+) sau (-), aezat dup indicarea cromosomilor sexuali. De exemplu:

45, XX, C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lips n grupul C. Atunci cnd cromosomul sau cromosomii lips sau suplimentari pot fi identificai cu

siguran, se poate folosi numrul cromosomului: 45, XX, 16- 45 de cromosomi, doi cromosomi X, un cromosom numrul 16 absent. Semnul (?) indic incertitudine. De exemplu: 45, XX, ? C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lips, care face

parte probabil din grupul C. O celul triploid sau poliploid este evideniat prin numrul de cromosomi i prin alte

indicative. De exemplu: 69, XXY sau 70, XXY, G +. O metafaz endoreduplicat poate fi indicat punnd abrevierea end naintea indicativului

cariotipului astfel: end 46, XX. Mozaicisme cromosomiale. Constituia cromosomial a diferitelor linii celulare este

nregistrat n ordine numeric sau alfabetic, indiferent de frecvena tipurilor celulare la individul studiat. Indicarea cariotipului se separ printr-o diagonal (/). De exemplu:

45, X / 46, XY mozaicism cromosomial cu dou tipuri celulare, unul cu 45 de cromosomi i un singur X, cellalt cu 46 de cromosomi i cromosomi sexuali XY.

Braul scurt al unui cromosom este indicat prin litera p, braul lung prin litera q, un satelit prin litera s, o constricie secundar prin litera h, iar centromerul prin abrevierea cen.

Creterea n lungime a unui bra cromosomial, se indic punnd semnul (+), iar micorarea lungimii, punnd semnul (-) dup indicativul braului. De exemplu: 2p+; Gq-.

Pentru o modificare a unui bra la un cromosom mediocentric (1, 3, 19 i 20) se pune un semn de ntrebare ntre indicativul cromosomului i semnul + sau -. De exemplu, un cromosom nr.3 cu un bra alungit va fi indicat astfel: 3?+.

Rezultatul unei inversiuni pericentrice se indic prin p+q- sau p-q+, care se nchide n parantez i este precedat de abrevierea inv. De exemplu: inv (D p+q-).

O translocaie este indicat prin litera t, urmat de paranteze care includ cromosomul interesat. De exemplu:

46, XY, t (Bp-;Dq+) o translocaie reciproc balansat ntre braul scurt al unui cromosom B i braul lung al unui cromosom D

Translocaiile care afecteaz un cromosom sexual i un autozom, vor fi desemnate astfel: 46, X, t (Xq + ; 16p-) o translocaie reciproc ntre braul lung al unui cromosom X i braul

scurt al unui cromosom 16 la o femel. Separarea cromosomilor dintr-o parantez prin punct i virgul (;), indic prezena a doi

cromosomi alterai structural i balansarea translocaiei. ntr-o translocaie de tip fuziune centric, n care un singur cromosom translocat este prezent, semnul de punct i virgul se omite. De exemplu:

45, XX, D - ,G - , t (DqGq) + 45 de cromosomi, cromosomii sexuali XX, un cromosom este

absent din grupul D i unul din grupul G, braele lor lungi formnd pin unire un cromosom translocat DG.

Dac un anume cromosom a fost motenit de la mam sau de la tat, aceasta se poate nota prin abrevierile mat saupat.

Structurile cromosomiale duplicate se indic prin repetarea indicativului. Izocromosomii se indic prin litera i aezat dup braul cromosomial interesat. Cromosomii inelari se indic prin litera r aezat dup cromosomul afectat. n cazul celulelor cu complemente cromosomiale profund dezechilibrate i anormale,

Conferina de la Chicago propune aplicarea urmtoarei convenii n nomenclatura cariotipurilor: numrul de cromosomi ntr-o celul dat va include toate structurile cromosomiale centrice prezente n celul, indiferent de numrul de centromeri. Cromosomii neidentificai, sunt indicai prin mar (marker). Fragmentele acentrice nu se include n numr, dar se vor indica prin abreviaia ace. Cromosomii dicentrici i tricentrici se vor numra ca unul singur i se vor indica prin dic i tri.

Pentru indicative care nu figureaz n sistemul de nomenclatur propus de Conferina de la Chicago, se sugereaz folosirea primelor trei litere mici, definite cu claritate i aezate imediat naintea sau dup simbolul cromosomului sau al indicativului cromosomului la care se refer n paranteze.

Cariotipul la animale Cariotipul la hamsterul auriu Cariotipul la hamsterul auriu (Fig.23) (unul dintre animalele de laborator larg studiate n

laborator), a fost elaborat de mai multe grupe de cercettori (Ishihara i colab., 1962, Lehman i colab., 1963 i Nachtigal, 1965).

Complementul cromosomial al celulelor somatice este constituit din 44 de cromosomi (21 de perechi de autosomi i 2 cromosomi sexuali heteromorfi, X i Y). Cromosomii autosomali se distribuie n cinci grupe morfologice, notate cu primele litere ale alfabetului. Perechile de autosomi se numeroteaz de la 1 la 21. Cromosomul X este caracteristic i uor de recunoscut.

Grupa A (prima grup), cuprinde perechile 1-4. Prima pereche (A1) este mai mare sau de aceeai mrime cu perechea a doua (A2) fiind de asemenea mai submetacentric. Celelalte perechi se dispun n ordinea descresctoare a raportului braelor.

Grupa B cuprinde perechile 5-10. Perechile 5 i 10 reprezint cromosomi metacentrici, uor de identificat. Perechea B6 este format din subtelocentrici, cu un raport mare al braelor i se poate relativ uor identifica. Perechile B7-B9 se dispun n ordinea descresctoare a raportului braelor cromosomiale.

Grupa C cuprinde perechile 11-15. Prima pereche a acestei grupe, se poate uor identifica, fiind vorba de cromosomi subtelocentrici. Ultima pereche a grupei se identific mai greu (constituind cei mai mici submetacentrici). n cadrul acestei grupe, perechile 13 i 14 se deosebesc greu, fiind cromosomi submetacentrici asemntori.

Grupa D cuprinde 4 perechi de cromosomi subtelocentrici asemntori ntre ei, dar deosebii uor de toi ceilali.

Grupa E este constituit dintr-o singur pereche de cromosomi metacentrici mici, iar grupa F din perechea 21 de cromosomi subtelocentrici.

Fig. 23 Cariotipul (sus) i metafaza care a stat la baza ntocmirii acestuia (jos), la Mesocricetus auratus (2n = 44)

(Raicu i Nachtigal, 1969)

Cariotipul la unele plante de cultur Metodele de alctuire a cariotipului sunt relativ diferite n funcie de specie i de autori.

Prezentm n cele ce urmeaz cariotipurile la cteva specii de plante cultivate. Cariotipul i idiograma la Allium cepa L. (2n=16) Conform studiilor noastre (utiliznd o prefixare a rdcinilor, timp de 2 ore la temperatura

camerei, cu o soluie de colchicin 0,2%; dup prefixare, prelucrarea materialului s-a realizat dup metoda Feulgen), raportnd datele obinute la nomenclatura dup Levan i colab., 1964, am realizat cariotipul i idiograma la Allium cepa L. (2n = 16) (Fig. 25). Utiliznd sistemul de stabilire a tipurilor de cromosomi dup Levan i colab. (1964), am ncadrat cele opt perechi de cromosomi de la ceap n dou grupe:

cromosomi metacentrici mediani n sens strict M (perechea VII) - n regiune median m (per. I, II, III, IV, V, VIII);

cromosomi subtelocentrici cu satelit, la nivelul braului scurt (perechea VI). Perechile de cromosomi omologi au fost numerotate de la I la VIII n ordinea

descresctoare a lungimii totale.

Fig.25 Metafaz, cariotip (sus) i idiograma (jos) la Allium cepa L. (original)

Cariotipul i idiograma la Secale cereale L. (2n = 14) Secara, ca i ceapa, este un material mult folosit n cercetrile de citogenetic vegetal. Ca

atare, descrierea cromosomilor mitotici la secar a fost realizat de muli cercettori; caracteristicile cromosomilor de secar studiai de diferii autori prezint diferene datorate probabil polimorfismului cromosomial al acestei specii, precum i metodelor de lucru. Diferenele ntre autori apar i datorit sistemului diferit de clasificare a cromosomilor.

Tudose (1970), utiliznd prefixarea cu soluie de colchicin 0,2% i colorarea prin metoda Feulgen, grupeaz cromosomii la Secale cereale L. (2n = 14), n patru tipuri morfologice (Fig. 26):

Tipul A dou perechi de cromosomi (II i III), cu centromer median; Tipul B dou perechi de cromosomi (I i VI), cu centromer submedian; Tipul C o pereche de cromosomi (VIII), cu centromer submedian i satelii mari,

constricia secundar fiind uor de evideniat, n regiunea ei formndu-se nucleul; Tipul D dou perechi de cromosomi (IV i V) cu centromer submedian, pe braul

scurt cu o constricie secundar i satelii mici care pot fi pui n eviden numai folosind tratamente speciale (temperaturi sczute 0C, timp de 24-48 ore), ei aprnd ca urmare a evidenierii zonelor heterocromatice.

Caracteristicile cantitative ale cromosomilor la Secale cereale L. (dup I.Gh.Tudose, 1970)

Perechea de

cromosomi

Poziia centromerului

Bra lung ( m)

Bra scurt

( m)

Suma

braelor

Lungimea total a

cromosomului

xsx

Indicele

braelor

I Submedian 7,38 4,57 11,95 12,55 0,12 1,61

II Median 5,88 5,22 11,10 11,74 0,10 1,12

III Median 5,72 5,19 10,91 11,55 0,09 1,10

IV* Submedian 5,98 3,97 9,95 11,48 0,12 1,50

V* Submedian 5,87 3,76 9,63 10,96 0,10 1,54

VI Submedian 5,75 3,57 9,32 9,95 0,11 1,60

VII* Submedian 6,05 2,98 9,03 11,34 0,12 2,03

cromosomi cu satelit, pe braul scurt.

I II III IV V VI VII VIII

10

Fig.26 Cariotip (sus) i idiogram (jos la Secale cereale (2n = 14) (Tudose, 1970)

6. Ploidia la plante

n celulele plantelor superioare se gsete un numr dublu de cromosomi 2n (celule diploide), fa de n cromosomi n spori i gamei (celule haploide). Datorit unor dereglri ale diviziunii celulare, produse ca urmare a aciunii diferiilor factori mutageni naturali sau artificiali de exemplu, colchicina numrul de cromosomi din celule se poate modifica.

Poliploidia const n multiplicarea numrului de cromosomi din celulele somatice fa de numrul de baz.

Numrul de baz sau numrul fundamental (numrul de origine), notat cu x, reprezint setul haploid, cu cel mai mic numr de cromosomi al numrului somatic diploid de cromosomi ai unei specii.

n anul 1916, Winkler introduce noiunea de genom (numrul de cromosomi din garnitura de baz x, difereniai morfologic i genetic) i definete poliploidia ca fenomenul de multiplicare a numrului de cromosomi (Anghel i Ignat, 1974).

Dup numrul de garnituri de cromosomi n celulele somatice ale plantelor, acestea pot fi: haploide (x), diploide (2x), triploide (3x), tetraploide (4x), pentaploide (5x) etc. Gradul de ploidie (P) al unei specii se apreciaz din relaia 2n/x. De exemplu, aplicnd aceast relaie, se poate afla gradul de ploidie la speciile:

Secale cereale L. - secara diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. - secara tetraploid (4x)are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum monococcum grul diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. Triticum durum - grul tetraploid (4x) are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum aestivum - grul hexaploid (6x) are 2n=42; n=21; x=7, deci P=2n/x=6. Prin cercetri de citogenetic s-a constatat c, la plante, n cadrul aceluiai gen numrul de

cromosomi este, de obicei, un multiplu al numrului de baz x. n cadrul unor genuri exist mai multe specii cu diferite grade de ploidie, constituind serii (iruri) poliploide, ca n cazul genului Triticum.

n cadrul genului Rosa, se ntlnesc specii cu 2n=14; 21; 28; 35; 42; 56 de cromosomi. n natur s-au descoperit o serie de astfel de genuri, ca: genul Chrysantemum cu x=9 - cu specii 2n=18 (2x); 36 (4x); 54 (6x); 72 (8x) i 90 (10x) cromosomi; genul Solanum cu x=12 - cu specii 2n=24 (2x); 36 (3x); 48 (4x); 60 (5x); 72 (6x); 96 (8x); 108 (9x); 120 (10x) i 144 (12x).

Seriile poliploide, n funcie de numrul par sau impar de garnituri cromosomiale sau genomuri, pot fi clasificate n:

- artioploide (artiopoliploide), cu numr par de genomuri (4x, 6x, 8x etc.); - perisoploide (perisopoliploide), cu numr impar de genomuri (3x, 5x, 7x, 9x etc.), de obicei

sterile. Primele organisme poliploide au aprut dup apariia procesului sexual, respectiv a fecundrii,

prin care, organismele nou formate dobndesc un numr dublu de cromosomi (2n), fa de cel al gameilor (n) (Tudose, 1967).

Dup originea cromosomilor, Kihara i Ono (1926), clasific pentru prima dat fenomenul de poliploidie n:

1. Autopoliploidie (autoploidie) - multiplicarea numrului propriu de genomuri sau de seturi (garnituri) cromosomiale.

Forme autopoliploide se cunosc la Secale cereale, Beta vulgaris, Trifolium pratensis etc.

Poliploidia este ntotdeauna nsoit de importante modificri morfo-fiziologice. Creterea numrului de cromosomi determin mrirea nucleului, a celulei, a esutului i organului i / sau a organismului, ajungndu-se astfel la gigantism.Se pare c fiecrui gen de organisme i este caracteristic un nivel optim al efectului pozitiv al poliploidizrii, nivel care dac este depit, poate determina efecte negative (Coman, 1991).

La plante, care se nmulesc i vegetativ, poliploidia s-a dovedit a fi avantajoas. La Angiosperme 64% din genurile actuale posed serii poliploide naturale. Pentru speciile ce se nmulesc exclusiv pe cale sexuat, poliploidia este dezavantajoas determinnd dereglarea meiozei i scderea fertilitii. Poliploidia este prezent i n grupul Gimnospermelor i al Pteridofitelor, dar n procente mai mici. Prezena poliploidiei n regnul vegetal este mult mai mare dect n cadrul regnului animal (Coman, 1991).

Poliploidia este foarte rspndit n special n special n regiunile cu climat mai aspru: regiuni nordice, montane, deerturi. Un procent ridicat de specii poliploide se ntlnete n flora Saharei, n regiunile de rm ale Japoniei, unde se ntlnesc variaii mari de temperatur, n regiunile srturoase etc. Este interesant de remarcat c procesul de apariie al autopoliploidiei este mai intens la plantele cultivate, deoarece acestea sunt puse n condiii foarte variate de mediu, fapt care mrete posibilitatea de apariie a plantelor poliploide (Anghel i Ignat, 1974).

2. Allopoliploidie (amfipoliploidie) - multiplicarea numrului de genoame prin hibridare interspecific i nsumarea lor la hibrid, urmat de dublarea numrului diploid de cromosomi.

De exemplu, la gru s-a demonstrat c formele diploide au genomul A provenit de la specia Triticum monococcum; formele tetraploide au genomul AB, cu genomul B provenit de la specia Aegilops speltoides; formele hexaploide au genomul ABD, cu genomul D provenit de la specia Aegilops squarrosa.

n afar de Triticum aestivum (2n=42) se cunosc n natur mai multe specii amfiploide: Gossypium hirsutum (2n=52), provenit din hibridarea speciilor Gossypium arboreum (2n=26) cu Gossypium raimondii (2n=26); Nicotiana tabacum (2n=42) provenit din ncruciarea speciilor Nicotiana silvestris (2n=24) cu Nicotiana tomentosiformis (2n=24) etc.

Pseudopoliploidia - multiplicarea numrului de cromosomi are loc prin fragmentarea cromosomilor cu centromeri multipli sau difuzi, fr a avea loc o mrire corespunztoare a cantitii de ADN.

Pseudopoliploidia poate fi evideniat prin msurarea lungimii cromosomilor, atunci cnd fragmentarea lor este transversal; prin studiul citofotometric al cantitii de ADN din celule sau prin studiul comportrii cromosomilor n profaza sau metafaza diviziunii mitotice reducionale.

Pseudopoliploidia a fost observat la speciile ctorva genuri de plante (Carex) sau animale (Ascaris) etc.

Metode pentru inducerea autopoliploidiei la plante n general, pentru ploidizare se folosesc specii de plante ce prezint un numr redus de

cromosomi n celulele somatice, plante alogame, plante cultivate pentru organele lor vegetative etc. Obinerea autotetraploizilor se poate realiza prin distrugerea fusului de diviziune sau oprirea

plasmodierezei din timpul diviziunii celulare. n acest scop se folosesc mai multe metode: a. Metoda centrifugrii, elaborat de Kostoff (1937) const n centrifugarea plantelor cu

esuturi meristematice, n vederea distrugerii fusului de diviziune i formarea celulelor cu numr dublu de cromosomi. Metoda este greoaie i prezint o serie de dezavantaje. Astfel, numai o mic parte din celulele meristematice devin poliploide, ele fiind de obicei eliminate ulterior, deoarece viteza lor de diviziune este mai mic dect a majoritii celulelor diploide.

b. Metoda ocurilor de temperatur, elaborat de Randolph (1932) se bazeaz pe influena ocurilor de temperatur ridicat asupra primelor mitoze ale zigotului. Astfel, un oc de temperatur de 43-45, timp de 24 de ore, asupra zigotului la Zea mays produce 5% plante poliploide.

c. Metoda poliembrioniei, bazat pe observaiile lui Muntzing (1938) conform crora la majoritatea plantelor superioare se afl un procent redus de semine cu doi sau mai muli embrioni (la Gramineae, aproximativ 0,007-0,15%), dintre care o parte (5%) au un numr diferit de cromosomi.

d. Metoda acionrii cu insecte parazite asupra vrfurilor de cretere ale plantelor, bazat pe observaia c galele prezint celule poliploide. Metoda este dificil, obinndu-se un procent mic de plante poliploide.

e. Metoda regenerrii, elaborat de Winkler (1916) i Joergensen (1928), se bazeaz pe observaia c o parte din lstarii provenii din rnirea calusului format n urma tierii altoiului de la locul

de altoire, sunt poliploizi. Metoda se utilizeaz la speciile care se preteaz la altoire (din genurile Solanum, Nicotiana etc.).

f. Metoda iradierii, utilizat n vederea distrugerii fusului de diviziune, urmat de formarea gameilor diploizi sau a celulelor somatice poliploide (prin autopoliploidie), precum i fragmentarea cromosomilor. Astfel, n mod experimental, n urma iradierii cu radiaii gamma a seminelor uscate de Lactuca sativa soiul "Polul Nord" (2n=18) s-au obinut celule somatice tetraploide (2n=36) i octoploide (2n=72). Celulele tetraploide au fost obinute printr-un proces de autopoliploidie, n urma distrugerii fusului de diviziune, iar celulele octoploide datorit fenomenului de pseudoautopoliploidie, prin fragmentarea ulterioar a tuturor cromosomilor unei celule autotetraploide.

g. Aciunea substanelor de tipul paradiclorbenzenului mpiedic plasmodiereza, rezultnd celule cu dou sau mai multe nuclee ce pot fuziona ulterior.

h. Metoda colchicinizrii, bazat pe proprietatea colchicinei i a altor substane (acenaften, feniluretan etc.) de a inhiba sau e a distruge fusul de diviziune, rezultnd, n urma diviziunilor, celule al cror nucleu de restituie are numr dublu de cromosomi.

Descoperirea n 1937 de ctre Blakeslee i Avery a efectului poliploidizant al colchicinei asupra plantelor a deschis noi perspective de obinere experimental a poliploizilor (Anghel i Igat, 1974).

Colchicinizarea se efectueaz cu o soluie de 0,05 -1% colchicin n care se introduc semine negerminate, semine germinate sau plantule. Soluia de colchicin poate fi aplicat i pe vrfurile de cretere: direct (Bragdo, 1955 - la secar; Sears, 1941 - la gru; Mihilescu i Raicu, 1968 - la orz; Raicu i Anghel, 1966 - la Citrullus vulgare) sau n amestec cu agar-agar (Swaminathan, 1951 - la cartof), sau ca past de lanolin-cu acid indolil-3-acetic (Howard i Swaminathan, 1953 - la Solanum demissum), n vederea mpiedicrii evaporrii ei rapide. La pomi i vi de vie se trateaz mugurii cu soluie de colchicin. Timpul de aciune i concentraia difer de la o specie la alta. Soluia de colchicin se consider cu aciune optim atunci cnd: o parte din plante pier, o parte din plantele tratate devin mixoploide (cu celulele n diferite grade de ploidie) datorit unei colchicinizri pariale, iar o parte din plante devin autotetraploide.

7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante

Pentru depistarea organismelor poliploide naturale din cadrul populaiei unei specii sau pentru evidenierea speciilor poliploide ale unui gen, ca i pentru determinarea indivizilor poliploizi produi pe cale artificial n vederea separrii lor dintr-un amestec, au fost elaborate o serie de metode directe i indirecte.