determinarea efectului anti-inflammator al fructoboratului de calciu, prin evaluarea unor markeri...

7/28/2019 Determinarea Efectului Anti-Inflammator Al Fructoboratului de Calciu, Prin Evaluarea Unor Markeri Biochimici Si a C

1/44

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

CRAIOVA

TEZ DE DOCTORAT(REZUMAT)

Determinarea efectului anti-inflammator al Fructoboratului de Calciu, prin

evaluarea unor markeri biochimici si a calitatii vietii. Studiu in vitro si in vivo

Conductor tiinific :

Prof. Univ. Dr. ANICA DRICU

Doctorand : MD. IULIA DARIA SCOREI

2011


2/44

Studiile au fost finanate din proiectele:

Investete n oameni!FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Axa Prioritar: 1. Educaia i formarea profesional n sprijinul creteriieconomice i dezvoltrii societiiDomeniul Major de Intervenie: 1.5. Programe doctorale i postdoctorale nsprijinul cercetriiTitlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecven prin acordarea deburse doctorale"

Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8

Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie din Craiova

CNMP BUCURESTI, COD PROIECT: 41-063


3/44

CUPRINS

PARTEA I: Stadiul actual al cunoasterii

CAPITOLUL 1. Borul din dieta umana bazata pe plante

1.1 Introducere

1.2 Aportul de Bor afecteaza sanatatea populatiei

1.3 Borul si metabolismul calciului

1.4 Borul si artrita

1.5 Efectele Borului asupra functiei creierului si performantelor cognitive

1.6 Borul din dieta amplifica efectele benefice ale acizilor grasi omega-3 la animale

1.7 Borul din dieta si riscul de cancer

CAPITOLUL 2. Fructoboratul de calciu ca supliment alimentar

2.1 Compozitia moleculara a Fructoboratului de Calciu

2.2 Aportul dietetic al Fructoboratului de Calciu

2.3 Fructoboratul in tesuturi

2.4 Aportul mediu de Fructoborat

2.5 Studiile toxicologice ale Fructoboratului de Calciu

CAPITOLUL 3. Fructoboratul de Calciu ca potential medicament

3.1 Activitatea antiinflamatorie a Borului

3.2 Fructoboratul de Calciu si procesele inflamatorii

3.3 Fructoboratul de Calciu si stressul oxidativ

3.4 Fructoboratul de Calciu si osteoporoza

3.5 Fructoboratul de Calciu si osteoartrita si durerea

3.6 Fructoboratul de Calciu si cancerul de san

3.7 Fructoboratul de Calciu si 10BNCT


4/44

CAPITOLUL 4. Osteoartrita. Generalitati

4.1. Patogenia artritei degenerative (osteoartritei)

4.2 Semne si simptome in osteoartrita

4.3. Subseturi ale osteoartritei primare

CAPITOLUL 5. Boala cardiaca ischemica si angina pectorala stabila. Generaltati

5.1. Efectele ischemiei.

5.2. Angina pectorala

5.3. Angina pectorala stabila

PARTEA a-II-a: CERECETRI PROPRII

1. OBIECTIVE

1.1 Studiul efectului fructoboratului asupra granulocitelor neutrofilice umane stimulate

fMLP in vitro

1.2 Analiza efectului in vitro al tratamentului cu fructoborat asupra poductiei de

mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stmulate LPS

1.3 Evaluarea efectului fructoboratului asupra inflamatiei sistemice si a markerilor

dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara

1.4 Evaluarea efectului resveratrolului combinat cu fructoborat la pacientii cu Angina

Pectorala Stabila

2. MATERIAL I METOD

2.1 Studiile preclinice

2.2 Studiile clinice2.2.1. Evaluarea efectului Fructoboratului de Calciu asupra inflamatiei sistemice

si a markerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita

primara

2.2.2 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu

Angina


5/44

3. REZULTATE

3.1 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra granulocitelor neutrofilice

umane

3.2 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra productiei de mediatori ai

inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stimulate LPS

3.3 Evaluarea efectului Fructoboratului de Calciu asupra inflamatiei sistemice si a

markerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita

primara

3.4 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu Angina

Pectorala Stabila

4. CONCLUZII

STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII

CAPITOLUL I. Borul din dieta umana bazata pe plante

1.1 Introducere

Borul (B) este un element nutritional esential pentru cresterea si dezvoltarea normala a plantelor (Warington, 1923). Aportul mediu

zilnic de B al adultilor este estimat a fi cuprins intre 1 si 4 mg/zi, depinzand de obiceiurile alimentare (vegetarienii au un aport mai crescut de B)

, locatia geografica, si alte surse de expunere la B (Hamilton & Minski, 1973; Hunt & Meacham, 2001; Rainey et al., 1999). Cele mai bogate

surse de B sunt nucile, fructele uscate, ierburile aromatice, si vinul, in special vinul rosu.

Complexele naturale cu B au fost izolate si caracterizate din floemul tulpinii de telina si din nectarul floral al piersicii ca esteri de

acid boric cu fructoza (fructoza-B-fructoza), glucoza(glucoza-B-glucoza) si sorbitolul (sorbitol-B-sorbitol). Acestea reprezinta primele complexe

solubile izolate din plante (Hu, Penn, Lebrilla, & Brown, 1997). Traditional, acidul boric si cativa dintre boratii anorganici au fost utilizati pentru

suplimentarea cu B. Recent, alte cateva componente care contin B au fost introduse pe piata industriei farmaceutice cu acelasi scop (Miljkovic,


6/44

1998). Fructoboratul de calciu (CF) a fost recent demonstrat a avea un efect antioxidant (Scorei, Cimpoiasu, & Iordachescu, 2005),

antiiinflamator (Scorei et al., 2007) si activitate anti-tumorala (Scorei et al., 2008).

1.2 Aportul de bor afecteaza sanatatea populatiei

In urma unor studii de metaanaliza, World Health Organization a sugerat ca dozele de B optime ar trebui sa fie cuprinse intre 1-13

mg/zi la oameni (World Health Organization, 1996).

Odata cu cresterea cantitatii de B in nutritie apar anumite efecte adverse si poate sa creasca efectele estrogenului (Sheng et al.,2001)

si un efect diuretic al B a fost notat in timpul administrari unei doze foarte mari (Tagawa et al.,2000). Efectele toxice ale suplimentarii cu B se

refera la fertilitate redusa, scaderea motilitatii spermei si toxicitatea testiculara (Devirian &Volpe, 2003).

Concentratiile scazute de B (1.48 ppm bor versus 4-6 ppm nivelul normal) in firul de par au fost asociate cu boala osteoarticulara

Kashin-Beck(KBD) din China (Fang, Wu, Hu, and Huang, 2003; Peng, Lingxia, Schrauzer, & Xiong, 2000)

1.3. Borul si metabolismul calciului

Primul studiu care implica B in metabolismul calciului a aratat ca deprivarea de B creste excretia urinara de calciu si magneziu siscade nivelele de 17-beta-estradiol si testosteron la femeile aflate in perioada de postmenopauza (Nielsen, 2004).

Efectele B asupra metabolismului calciului, si in special 25-hidroxicolecalciferolului, ar putea sa aiba implicatii pozitive asupra

metabolismului osos incluzand un risc redus de osteoporoza (Zittermann,2003).

1.4 Borul si artrita

O dieta saraca in B, a fost asociata cu artrita reumatica (Havercroft &Ward, 1991). O comparatie facuta intre tari in ceea ce priveste

incidenta si prevalenta artritei , a ajuns la concluzia ca aparitia artritei este corelata negativ cu nivelul de B din sol si din alimentatie.

1.5 Efectele borului asupra functiei creierului si performantei cognitive

O serie de studii au aratat constant ca deprivarea de B la sobolani si oameni conduce la efecte nedorite asupra electrofiziologiei

creierului (Penland, 1998), iar la subiectii umani , conduce la performante cognitive semnificativ mai reduse in indeplinirea sarcinilor, implicand

coordonarea ochi-mana, atentia, si memoria pe termen scurt(Penland, 1994, 1998). A fost de asemenea demonstrat ca dietele sarace in bor la

oameni sunt asociate cu reducerea dexteritatii manuale, a perceptiei si memoriei pe termen lung(Penland, 1994).

1.6 Borul din dieta amplifica efectele benefice ale acizii grasi omega-3 la animale

In studiile recente de cercetare, oamenii de stiinta au ajuns la concluzia ca beneficiile acizilor grasi omega-3 asupra sanatatii osului

pot fi amplificate, daca acesti acizi grasi sunt combinati cu elementul mineral B (Nielsen &Stoecker, 2006).

Desi B nu a fost inca clasificat ca un nutrient esential, acest lucru va fi schimbat in curand pe baza rezultatelor studiilor, dovezi care

sugereaza ca B joaca multe roluri esentiale in mentinerea santatii scheletului. Studiile ofera sustinere puternica pentru optimizarea aportului deB si acizi grasi omega-3 ca parte dintr-o strategie nutritionala pentru mentinerea oaselor puternice si sanatoase(Gorustovich, Steimetz, Nielsen, &

Guglielmotti, 2008a, 2008b).


7/44

1.7 B din dieta si riscul de cancer

O dieta saraca in B conduce la un mare numar de probleme generale de sanatate si creste riscul de cancer. Cele mai comune simptome

ale deficientei de B include artrita, pierderea memoriei, osteoporoza, bolile degenerative si ale cartilajului , dezechilibre hormonale si o scadere a

libidoului(Scorei&Popa, 2010)

Cancerul de plamani.

Mortalitatea datorata cancerului de plamani a atins valori mai inalte pentru barbati decat pentru femei (Espey et al., 2007). O corelatie

negativa a fost gasita intre aportul de B si incidenta cancerului de plamani, desi mecanismele subiacente raman neclare(Meacham et al., 2007).

Exista corelatii intre cateva subtipuri de cancere de plaman si 17-beta estradiolul, si tratamentul care include Terapia de Substitutie Hormonala

bazata pe 17-beta-estradiolul(HRT)( Schabath et al.,2004). Dieta scazuta in B (singura sau impreuna cu HRT) a fost corelata cu o crestere a

riscului de cancer de plamani la femei (Mahabir et al.,2008). Reducerea riscului de cancer de plaman ar putea sa implice substraturile de legare a

receptorului estrogenic, altul decat estrogenul, incluzand hidrocarburile aromatice policiclice (PAHs) din fumul de tigara condensate(Pike et

al.,1999). Femeile cu aport dietetic inalt de B si care utilizeaza HRT ar putea sa prezinte nivele hormonale mai inalte care competitioneaza cu

carcinogenii din fumul de tigara pentru receptorii de estrogen. Daca acest model este corect, crescand aportul de B in timpul HRT se va limita de

asemenea potentialul carcinogenic al PAHs din fumul de tigara(Mahabir et al., 2008).

Cancerul de prostata.

Riscul de cancer de prostata a fost cu 1/3 mai mic la barbatii care ingereaza mai mult de 1.8 mg B pe zi din alimentatie , comparativ cu

cei care au un aport de numai 0.9 mg B/zi. O corelatie relativ inalta(r=0.63) a fost gasita intre concentratia de B din apa si distributia cancerului

de prostata in Texas(Barranco et al.,2007).

O intelegere mai larga a mecanismelor celulare care implica B au aratat ca acidul boric(BA) inhiba cresterea celulei canceroase

prostatice prin scaderea expresiei ciclinei A-E, prin urmare B nu induce moartea celulara(Barranco et al.,2009). Mai mult de atat, celulele tratate

cu BA demonstreaza o capacitate diminuata de adeziune si migrare, care indica un potential scazut de metastazare.

Cancerul cervical

Cancerul cervical este al doilea ca si frecventa intre toate cancerele la femei in lumea intreaga(Parkin et al., 1993).

Cauza acestei discrepante este inca neclara si poate sa implice o combinatie de factori de mediu, genetici, sociali si infectiosi. De

exemplu, papilomavirusul uman(HPV) este o cauza primara de cancer cervical. HPV 16 si HPV 18 sunt responsabile de aproximativ 95% din

totalul de cancere cervical.

In conformitate cu o ipoteza, incidenta scazuta a cancerului cervical in Turcia se coreleaza cu solul imbogatit cu B. (Sayli et al., 2001;

Simsek et al., 2003).Intradevar , ingestia de B din apa de baut previne riscul de cancer cervical(Korkmaz et al.,2007). Acest efect a fost sugerat a

fi datorita interferentei B in ciclul de viata al HPVs, dar nici un fel de corelatie nu ar putea sa fie gasita privind incidenta cancerelor orale, care

sunt de asemenea induse de catre HPVs.

Cancerul de san

Astazi, cancerul de san este cel mai comun tip de cancer diagnosticat la femei, excluzand cancerele de piele non-melanoma(Greenlee

et al.,2000).

Etiologia cancerului de san este legata de hormonii endogeni. Riscul de cancer de san la femeile aflate in perioada de premenopauza

este direct legata de nivelele circulante ale testosteronului si androstenedione. In concluzie, aportul zilnic dietetic de B la un minim de 10 mg de

B per zi scade nivelul estradiol si creste nivelul de testosteron(Naghii et al., 2010). Aceasta reglare asigura o protectie hormon-dependenta

impotriva cancerului de san.


8/44

Elementele majore in preventia cancerului de san, chemopreventie si chimioterapie cu B include:

1. Pentru preventie, trebuie urmata o dieta bogata in B (in jur de 20 mg de B pe zi) si o balanta adecvata de 4:1 intre omega-6 si

omega-3

2. In chemopreventie, BA si CF sunt inamicii principali impotriva cancerului de san. Bazat pe evidente experimentale, BA induce

apoptoza atat in celulele de melanoma cat si in celulele de cancer de san MDA231 si inhiba cresterea liniilor de celule de cancer

de san, cum ar fi celulele ZR-75-1. CF are efecte inhibitorii asupra celulelor de cancer de san MDA-MB-231. Mai mult de atat,

el creste nivelul de calcitriol in sange, ca urmare crescand astfel nivelul de protectie impotriva dezvoltarii cancerului de san.

3. In chemoterapie, Bortezomibul este un nou targhet in terapia canceroasa, fiind aprobat de catre FDA. El demonstreaza activitati

anti-proliferative, pro-apoptotice, anti-angiogenice si anti-tumorale in cateva modele de cancer, incluzand cancerul de san.

CAPITOLUL II. Fructoboratul de calciu ca supliment de hrana

2.1 Compozitia moleculara a fructoboratului de calciuFructoboratul de Calciu (CF), are compozitia chimica Ca[(C6H10O6)2B]24H2O. Produsul a fost izolat din plante , dar poate sa fie produs si

prin sinteza chimica[Milicovich, 1998; Milicovich et al., 2009].

OOH

OH

HOB

-

Ca2+

2

O

OH

OH

HO

O

O

O

O

a

OHO

OH

OH

O O

OHO

OH

OH

O O

B

-

2

Ca2+

b

Figure 1 Structura chimica a alfa-D-fructofuranozo-boratul de calciu(a) si beta-D-fructofuranozo-boratul de calciu(b)

Cercetari stiintifice in vitro asupra CF arata cateva activitati biologice ale CF , proprietati cu potential terapeutic[Scorei si Rotaru,

2011]: anti-inflamatorii, anti-osteoporoza, antioxidante, si antitumorale. CF contracareaza de asemenea efectele distrugatoare ale deficientei de

vitamina D, datorita corelatiei intre aportul de CF si nivelele serice de vitamina D3. Alt studiu a aratat imbunatatiri in metabolismul vitaminei D3

dupa suplimentarea cu B[Hunt et al., 1994].


9/44

2.2 Aportul dietetic de CF

B este parte din dieta umana normala. Sub conditii fiziologice, si in absenta interactiunii cu bio-molecule, B exista ca acid boric

(B(OH)3 ori anionul borat (B(OH)4 ).B este capabil sa interactioneze cu molecule biologic importante, incluzand polizaharide, piridoxina,

riboflavin, acidul dehidroascorbic, si nucleotidele piridinice. Se leaga puternic de furanoid cis-diols, care include erithritan, riboza, si apioza;

apioza este prezenta de-a lungul peretilor celulari ai plantelor vasculare. Chimia unica a B permite sa reactioneze cu multi alti metaboliti si

enzime, si prin urmare, B poate sa fie capabil sa modifice metabolismul mineral si energetic la oameni si la animale.

2.3 Fructoboratul in tesuturi

Se estimeaza ca , continutul total de B in corpul uman variaza de la 3 pana 20 mg, cu cele mai inalte concentratii gasite in oase,

unghiile de la maini, unghiile de la picioare, si par(4.3 pana la 17.9 ppm). B se acumuleaza in oase, dar nu si in tesuturile moi.

2.4 Aportul mediu de fructoborat[Scorei si Rotaru, 2011]

Rainey et al. a specificat ca exista variatii foarte largi in aporturile de B in cadrul populatiei adulte din USA, mergand chiar pana la9 mg/persoana/zi[Rainey et al., 1999]. Aporturile de B au fost estimate ca fiind cuprinse intre 1.17-2.42 mg/zi pentru barbati si 0.96-1.94 mg/zi

pentru femei. Academia Nationala de Stiinte/Institutul de Medicina(NAS/IOM) a estimat ca luand in consideratie toate sursele de B, aportul de

B trebuie sa fie in jur de 5 mg/persoana/zi.

2.5 Studiile toxicologice ale Fructoboratului

Doza medie letala(LD50) pentru CF este de 18.75 g/kg(0.525 g B elementar) versus 2.6 g/kg pentru acidul boric(0.462 g B

elementar), asa cum a fost determinat de Perry scientific Inc. in studiul 00-1066(PSI-JUD-3), din 5 Februarie 2001.

CAPITOLUL III. Fructoboratul de calciu (FC) ca potential medicament

3.1. Activitatea anti-inflamatorie a B

Actiunile anti-inflamatorii ale B au fost atribuite variatelor mecanisme. Acestea includ supresia proteazelor serinice eliberate de catre

celulele albe sanguine activate de inflamatie, inhibitia sintezei de leucotriene, reducerea speciilor reactive de oxigen generate in timpul ciclului

respirator al neutrofilelor, si supresia activitatii celulei T si a concentratiilor de anticorp[Hunt, 1998].

3.2 CF si procesele antiinflamatorii

Studiile in vitro arata ca CF are efecte profunde asupra celulelor PMN raportate la concentratia lui[Scorei R et al., 2007].Prin

urmare, tratamentul cu CF a PMN stimulate de n-formil-metionil-leucil- fenilalanina(f MLP) pentru 24 de ore, a rezultat intr-o scadere a ciclului

respirator , intr-o maniera dependenta de doza. Scaderea nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) a fost evidenta chiar cand s-au utilizat

doze netoxice( de exemplu scaderea cu 50% cand se utilizeaza 450microM CF), care subliniaza faptul ca CF este un consumator de ion superoxid

si poate sa aiba efecte antiinflamatorii.

Hunt a propus un rol esential al B ca reglator al ciclului respirator prin supresia serin proteazelor eliberate de leucocitele activate de

inflamatie, inhibitia sintezei de leucotriene, reducerea ROS generat in timpul ciclului respirator neutrofilic si supresia activitatii celulei T si a

concentratiilor de anticorpi[Hunt, 1998]. Investigatiile efectelor CF, la nivel intracelular ai anionilor superoxid in celulele PMN nestimulate

intareste idea unei activitati antioxidante exercitate de catre CF, el fiind un consumator de anioni superoxizi.


10/44

3.3 CF si stressul oxidativ

Existe date care sa sustina ipoteza conform careia B dietetic ajuta in controlul procesului inflamator normal servind ca semnal

supresiv care subregleaza activitatile enzimatice specific la situsul de inflamatie care sunt tipic crescute in timpul inflamatiei[Ketriz et al.,

1997].Studiile realizate pe B au aratat ca boratul protejeaza pielea si faciliteaza vindecarea ranilor profunde prin actiunea sa asupra catorva

componente ale matricei extracelulare a tesutului conjunctiv. Exista dovezi care sa sustina ipoteza ca B dietetic ajuta la controlul procesului

inflamator normal servind ca un semnal supresiv care subregleaza activitati enzimatice specific la situsul de inflamatie care sunt tipic crescute in

timpul inflamatiei.

3.4 CF si Osteoporoza

CF poate sa influenteze densitatea osoasa la animalele cu deficienta de vitamina D . B a fost aratat a imbunatati duritatea osoasa la

porci[Amstrong et al., 2001] si sobolani[Dupre e t al., 1994]).Rezultatele arata o crestere dependenta de doza in densitatea osoasa asa cum este

masurata de testul DEXA. Aceste rezultate sugereaza ca suplimentarea cu B previne o hipocalcemie severa a deficientei de vitamina D3 printr-o

cale metabolic alternativa ; inca putin este cunoscut despre asimilarea Ca[Nielsen, 2004].CF a fost de asemenea demonstrat ca, contracareaza

efectele daunatoare ale deficientei dietetic de vitamina D.

3.5 CF, Osteoartrita si durerea

Referindu-ne la artrita, os si sanatatea articulara, presupunem ca CF ar putea sa inhibe activitatea enzimei colagenaze. Aceste

enzime(colagenazele) sunt generate in mod natural in biochimia umana si catabolizeaza colagenul.Efectul lor la batrani contribuie la flaciditatea

pielii, articulatii mai fragile, deteriorare osoasa si vasculara.

CF a fost initial considerat a avea un efect benefic asupra metabolismului lipidic [Milicovich et al., 2009] . Intr-un trial clinic

recent[WHO, 2010], Scorei si colab. au aratat ca in caz de OA asociat cu dislipidemia, CF ar putea sa asigure un prognostic favorabil pentru

bolile cardiovasculare[Scorei et al., 2011]. Ca o consecinta, suplimentarea dietetic cu CF asigura o imbunatatire rapida a calitatii vietii indivizilor

suferinzi de OA si dislipidemie.Aportul zilnic pentru preventia osteoporozei si OA este in jur de 3.5 mg B pe zi[Milicovich et al., 2009].

3.6 CF si cancerul de san

CF este un produs natural din plante (poate fi produs si prin sinteza chimica) si este eficient in preventia si tratamentele(ca

adjuvant) osteoporozei si osteoartritei. CF a demonstrat efecte inhibitorii asupra celulelor canceroase de san MDA-MB-231 de asemenea si intra

in celula(cel mai probabil) printr-un mecanism de co-transport printr-un transportor de zahar[Scorei et al., 2008].

In interiorul celulelor CF actioneaza ca un antioxidant si induce supraexpresia proteinelor legate de apoptoza si a apoptozei. Scorei si colab., intr-

un studiu recent au demonstrat ca CF si BA au inhibat proliferarea celulelor canceroase de san MDA-MB-231 intr-o maniera dependenta de

doza[Scorei et al., 2008].

3.7 Fructoboratul si Terapia de Captare Neutronica10

B(10

BNCT)- o viziune pentru

viitor10BNCT a fost propusa iniial ca un mijloc de a distruge selectiv celulele canceroase, fara a afecta celulele normale

[Locher, 1936]. In prezent 10BNCT folosete un numr de 10B-compusi care se concentreaz preferenial n celulele tumorale [Rolf et al., 2005] .

Zona tumorala este apoi iradiata de un fascicul de neutroni, neutronii interac ionand cu atomul de 10B i rezulta atomi de Heliu extrem de

energetici(particule radioactive alfa) si nuclee de 7Li, mpreun cu energia cinetic i -radiaii:


11/44

)4.2.(7342

115

10

105 MeVradiationLiHeBnB -+++ g

BNCT modern, actual, este o combinatie de chemo si radioterapie si este utilizat in tratamentul glioamelor de grad mare. Pentru ca BNCT sa fie

utila therapeutic, chimicale cu 10B- trebuie sa demonstreze cateva proprietati specifice:

1) o buna solubilitate in apa pentru a fi administrat intravenos,

2) toxicitate scazuta,

3) inalta selectivitate pentru celulele tumorale 4) acumulare in concentratii mari in celulele canceroase.

CAPITOLUL 4. Osteoartrita. Generalitati

Osteoartrita este cea mai frecventa afectiune articulara si reprezinta un grup heterogen de conditii patologice cu modificari

histopatologice si radiologice comune. Este o boala degenerativa care apare prin distrugerea biochimica a cartilajului articular din articulatiile

sinoviale. Desi osteoartrita este considerate a fi consecinta greutatii excesive si a fisurilor cartilajului, modificarile inflamatorii nespecifice

secundare afecteaza de asemeni articulatiile. Istoric osteoartrita a fost impartita in primara si secundara.

4.1. Patogenia artritei degenerative (osteoartritei).

Cauzele si si factori de risc pentru artrita sunt: virsta inaintata, obezitatea, sexul feminin

,trauma, infectia, trauma ocupationala repetitiva factori genetici, istoric de artrita inflamatorie

,afectiuni neuromusculare si metabolice.

Suprafata articulara normala a articulatiilor sinoviale consta din cartilaj hialin compus din condrocite, inconjurate de matrice

extracelulara care include diferite macromolecule, cele mai importante fiind proteoglicanii si colagenul.

4.2 Semne si simptome in osteoartrita:

Osteoartrita primara apare mai ales la nivelul miinii, la articulatiile interfalangiene distale, proximale si primele metacarpofalangiene .

De asemeni debutul la unele persoane poate avea loc la articulatia genunchiului, soldului, regiunea cervicala sau lombara joasa.

Durerea profunda, sub forma de crampe, articulara la activitatile fizice este primul simptom. De asemeni reducerea miscarilor si

crepitantele sunt frecvent prezente. Malaliniamentul articulatiei poate fi vizibil. Se pot palpa osteofitele la articulatiile interfalangiene distale,

caracteristice la femei. Modificarile inflamatorii sunt tipic absente sau slab pronuntate.

4.3. Subseturi ale osteoartritei primare

Unele boli sunt categorii sau subseturi ale osteoartritei primare. Acestea include osteoartrita primara generalizata, osteoartrita eroziva

inflamatorie si condromalacia petelei.

CAPITOLUL 5 Boala cardiaca ischemica si angina pectorala stabile. Generalitati

5.1. Efectele ischemiei.

Oxigenarea necorespunzatoare indusa de ateroscleroza coronariana poate produce perturbari tranzitorii ale functiilor mecanice,

biochimice si electrice ale miocardului. Dezvoltarea brusca a ischemieie severe, asa cum se intampla in ocluzia tota la sau subtotala este a sociata

cu pierderea aproape instantanee a contractiei si relaxarii musculare normale. Perfuzia relativ redusa a subendocardului produce ischemie mai
http://www.romedic.ro/obezitatehttp://www.romedic.ro/crampe-musculare-distoniihttp://www.romedic.ro/crampe-musculare-distoniihttp://www.romedic.ro/obezitate


12/44

intensa a acestei portiuni a peretelui. Ischemia unor arii mai largi ale ventriculului va produce insuficienta ventriculara stanga tranzitorie si, daca

muschii papilari sunt implicati, insuficienta mitrala poate complica acest eveniment.

Atunci cand evenimentele ischemice sunt tranzitorii, ele pot fi asociate cu angina pectorala; daca sunt prelungite, ele pot determina

necroza si cicatrizare miocardica cu sau fara tablou clinic de infarct miocardic acut.

5.2. Angina pectorala

Clasificarea Anginei de catre Societatea Canadiana de Boli Cardiovasculare(Braunwald Eet al., 1994):

Clasa I- Angina apare doar dupa un efort intens, rapid sau prelungit. Activitatea fizica obisnuita nu provoaca angina

Clasa II- Usoara limitare a activitatii zilnice. Angina apare la urcarea rapida a scarilor, urcarea plantelor, mersul dupa masa, in frig, in vant, in

conditii de stress emotional.

Clasa III- Limitare importanta a activitatii fizice obisnuite. Angina apare dupa parcurgerea unei distante de 1-2 strazi sau dupa urcarea unei scari

la viteza normala.

Clasa IV-Imposibilitatea de a desfasura o activitate fizica fara discomfort. Simptomele anginei pot sa fie prezente si in repaos

PARTEA a-II-a: CERECETRI PROPRII

I. OBIECTIVE

1.1 Studiul in vitro al efectului fructoboratului asupra granulocitelor neutrofilice umane

stimulate fMLP (N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine),

n acest studiu preclinic am cercetat aciunea fructoboratului de calciu (FC), care are o structur chimic similar unor forme naturale de B

ce se gasesc in plantele comestibile(Hu et al., 1997), asupra unor neutrofile stimulate , n raport cu rolul sau antioxidant (Scorei et al., 2005) . FC

este un supliment nutritiv pe baza de B, stabil, netoxic, solubil n ap, cunoscut ca si agent care reduce durerea i inflamaia asociata cu

osteoartrita, cunoscut de asemenea pentru mbuntirea absorbiei de calciu in metabolism, creterea nivelului de vitamina D, estrogen si

testosteron, precum si implicarea sa in metabolismul prostatei i creterea nivelurilor de SOD.

1.2 Analiza efectului in vitro al tratamentului cu fructoboratului asupra poductiei de

mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stmulate LPS

n acest studiu experimental am examinat efectele FC asupra produc iei unor mediatori inflamatori folosind celule macrofage RAW

264.7 de murine stimulate LPS ca si model celular. Astfel au fost evaluate modificrile induse de FC n intervalul de doz de 0,2 - 1 mM la

eliberarea de citokine, cum ar fi TNF-, IL-1 i IL-6, nivelul de expresie proteica COX-2 i la producia de NO.


13/44

1.3 Evaluarea efectului fructoboratului asupra inflamatiei sistemice si a markerilor

dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara ,un studiu

pilot

Multe experimente epidemiologice si controlate, realizate atat pe animale cat i pe oameni au furnizat dovezi pentru utilizarea B ca

si tratament sigur si eficace pentru anumite forme de osteoartrita (OA) . Prin examinarea rela iei dintre aportul de B i prevalena OA la nivelmondial, cercetatorii au descoperit c n zonele n care aportul de bor este de 1 mg sau mai putin pe zi, incidenta estimata a artritei este cuprinsa

ntre 20 i 70%. n schimb, n zonele n care aportul de B este de obicei de 3-10 mg pe zi, procentul de artrita este mai mic, variind de la zero la

doar 10%. Aceasta constatare remarcabila constituie o dovada irefutabila a faptului c aportul abundent de B din dieta poate conferi o protecie

puternic mpotriva dezvoltrii OA. Un studiu analitic a artat c, concentraia de B este mai mic la capetele femurului, oase i lichidul sinovial

al pacienilor cu OA, comparativ cu pacienii fr OA. Mai mult dect att, chirurgii au observat c oasele pacienilor care au folosit

suplimentarea cu B au fost mai greu de taiat dect cele ale pacienilor care nu au folosit aceste suplimente . Dovada cea mai convingtoare pentru

utilizarea B n cazul pacienilor cu OA provine dintr-un studiu placebo dublu-orb asupra suplimentarii cu B realizat n Australia care raporta ca

suplimentarea cu B poate ameliora simptomele pentru persoanele cu OA i artrita reumatoida. Studiile experimentale pe obolanii cu artrita au

condus la o ipotez n curs de dezvoltare care sugereaz c B reduce riscul de boli inflamatorii prin reglarea enzimelor raspunsului inflamatori

are un efect imunomodulator benefic la obolanii cu artrita . Studii recente s-au concentrat pe asocierea dintre OA primari dislipidemie (Naghi

et al., 2010)]. Muli cercettori au observat c bolile cardiovasculare (BCV) i OA coexista frecvent la pacieni; n consecin, a fost emisaipoteza ca boala vasculara poate juca un rol patogen in OA, ac ionand n parte prin intermediul cilor metabolice lipidice . Definiiile pentru

dislipidemie, dupa cum sunt definite la instructiunile Programului National pentru Educarea Colesterolului (NCEP), includ colesterolul total (TC)

200 mg/dL, lipoproteinele cu densitate mic (LDL) colesterolul 130 mg/dL, trigliceridele 150 mg/dL, lipoproteinele cu densitate mare

(HDL), colesterolul < 40 mg/dL si raportul TC/HDL 6.5. Studii anterioare au demonstrat o asociere ntre evolutia OA, dislipidemie i

inflamaie, msurat prin nivelurile markerilor sistemici. Proteina C reactiva (PCR), unul dintre cei mai utili markeri de inflamaie sistemic, a

fost recent identificata drept marker al OA cu semnifica ie clinic. Nivelurile PCR sunt in mod moderat ridicate pentru pacientii cu OA,

comparativ cu pacientii fara OA . Nivelurile PCR au o mare importanta clinic, cu valori de referin sub 0,5 mg/dl la pacienii cu OA .

Nivelurile crescute au fost asociate cu evolutia bolii, precum i cu agravarea clinica, ca si rspuns nespecific la inflamaii i infecii.

Fructoboratul de calciu (FC) este folosit ca terapie non-farmacologica recent pentru tratamentul osteoartritei . FC este un complex de

calciu, fructoz i B i se gsete n mod natural in fructe, legume, ierburi proaspete i uscate i vin. Aceast form de B nu este numai una

sigura, ci i bio-disponibila n comparaie cu alte forme comerciale de B. Formula sa structural este Ca[(C6H10O6)2B]24H2O, identica cu cea aunui produs natural .

S-a realizat un studiu pilot accesibil pacientilor, scris de N. Miljkovic si colegii sai de la Clinica de Ortopedie de la Universitatea din

Novi Sad, Novi Sad, Iugoslavia. Scopul studiului a fost s investigheze efectele FC asupra simptomelor de OA. Studiul a inclus 20 de pacieni

cu forme uoare, medii sau severe ale OA. Dou criterii de evaluare au fost utilizate: WOMAC (Western Ontario McMaster University

Osteoarthritis Index) i criteriul Newnham. Dup administrarea FC, rezultatele au fost destul de impresionante; durerea a fost puternic diminuat ,

rigiditatea articulatiilor a disprut, iar mobilitatea i flexibilitatea au fost mbuntite .

Investigaiile noastre anterioare au fost rezumate n dou revieweri care au demonstrat o proprietate anti-inflamatorie a FC pe culturi

celulare. n plus, am emis ipoteza ca FC ar putea avea dublu rol, att ca agent anti-inflamatoriu cat si anti-oxidant, cu efect modificator asupra

metabolismului lipidic .

Acest studiu investigheaz dac FC poate ameliora simptomele OA n subiectii selectati. Oamenii de stiinta au emis ipoteza ca FC

poate avea un rol n diminuarea durerii cauzate de inflamaie, rigiditatii articulare i alte tipuri de disconfort asociate cu OA . Deoarecedisconfortul cauzat de OA este adesea invariabil in ceea ce priveste inflamarea articulatiilor, acest studiu abordeaza efectul FC asupra nivelurilor

markerilor sangvini inflamatorii cum ar fi PCR, fibrinogen (FBR), i asupra coeficientului de sedimentare a eritrocitelor (VSH) i asupra

markerilor metabolismului lipidic, deoarece s-a sugerat c borul este implicat n ambele mecanisme .

Atunci cnd se analizeaza markerii inflamatori, intervalul de timp de 2 sptmni pentru suplimentarea dietei cu FC, a fost suficient de

indelungat pentru a confirma rezultatele noastre anterioare obinute in vitro. Deoarece caracteristic general a efectului placebo are un debut u or

ntrziat i o durat relativ scurt (intre 2 si 6 sptmni dupa cum se citeaza n literatura de specialitate), un interval de timp de dou sptmni a


14/44

fost ales pentru acest studiu pentru a observa cu mai mult precizie eficacitatea pe termen scurt a FC. Acest studiu pilot este doar o punte pentru

un viitor studiu de cercetare mai complex n ceea ce prive te efectele FC asupra simptomelor OA.

1.4 Evaluarea efectului resveratrolului combinat cu fructoborat la pacientii cu Angina

Pectorala Stabila, un studiu pilotObiectivul acestui studiu pilot a fost determinarea efectelor clinice si biologice ale unei suplimentari a dietei pacientilor cu angina

pectorala stabila, timp de 60 de zile cu resveratrol, fructoborat de calciu, ori combinatia lor . Studiul dublu-orb , randomizat, a fost condus pe 3

grupe de subiecti. De-a lungul studiului au fost urmariti : biomarkerii inflamatori(proteina C reactiva inalt senzitiva), markeri ai functionarii

ventriculului stang(NT-proBNP) si markerii lipidici(colesterolul total , LDL-colesterolul , HDL-colesterolul, trigliceridele), calitatea vietii

evaluata prin angina CCS class, numarul de atacuri anginoase pe saptamana, si chestionarul de angina Seattle.137 de subiecti au fost evaluati, din

ei, 87 au fost randomizati in 3 grupuri . Evolutia pacientilor a fost urmarita la 30 de zile si respective 60 de zile de la inceperea studiului . Nu au

fost raportate nici un fel de efecte adverse semnificative.

Tulburarea cardiaca ischemica aterosclerotica este o problema majora de sanatate a lumii moderne. Ateroscleroza este un process

complex, multifactorial. Inflamatia este un factor major in intierea, progresia si complicatiile acute ale placii de ateroscleroza. S-au studiat

evaluarile terapeutice ale inflamatiei subclinice implicate in ateroscleroza, si Resveratrolul a fost in central cercetarii. Resveratrolul, un polifenol

fitoalexin, are diverse actiuni fiziologice si biochimice, incluzand proprietati estrogenice, antiplachetare si antiinflamatorii.[2]Actiunile biologiceale resveratrolului, care s-ar putea dovedi utile in corectia riscului cardiovascular, sunt in principal legate de efectul sau direct antioxidant prin

neutralizarea radicalilor liberi si inhibitia oxidarii LDL. Resveratrolul este un agent antiinflamator potent. El poate sa suprime activarea NFkB

care este strans legata de inflamatie si de expresia unor citokine proinflamatorii cum ar fi TNF, IL-1, IL-6, Il-8, ca de asemenea si de factorii

intracelulari care mediaza inflamatia cum ar fi iNOS, COX-2, 5-LOX si 15-LOX. Resveratrolul inhiba in vitro activitatea cicloxigenazei si

lipooxigenazei. El actioneaza de asemenea ca un antagonist sau agonist estrogenic, depinzand de tipul celular, si de izoforma de receptor

estrogenic(ERalfa ori ER beta) precum si de prezenta estrogenului endogen. Efectele biologice ale resveratrolului au fost demonstrate pe

culturile celulare la doze inalte, biodisponibilitatea scazuta in vivo limitand rezultatele studiilor pe pacienti. Resveratrolul imbunatateste starea

de sanatate a organismului si incetineste progresia bolii in modele variate. Cateva studii au demonstrat ca dietele Mediteraneene, care sunt bogate

in resveratrol, sunt asociate cu un risc semnificativ redus de boala cardiovasculara. Resveratrolul a aratat efecte protective cardiovasculare

semnificative in modelele de infarct miocardic, hipertensiunea sistemica si pulmonara si diabetul de tip II.Cateva mecanisme cardioprotective au

fost identificate incluzand actiunile antioxidante, antiinflamatorii si antifibrotice. Fiecare dintre aceste actiuni este considerata ca are abilitatea saatenueze patofiziologia remodelarii structurale cardiace care rezulta din infarctul miocardic acut. Atat in modelele cornice cat si in cele acute,

resveratrolul atenueaza injuria de reperfuzie ischemica miocardica, ateroscleroza si reduce aritmiile ventriculare(35). Scaderea in

biodisponibilitatea in vivo este cauzata de metabolismul rapid si eliminarea si este un mare dezavantaj pentru resveratrol.

Studiile recente au aratat o stabilizare a resveratrolului prin compusi naturali ai B Compusii B sunt cunoscuti a avea o varietate de

activitati biologice. B exercita actiuni inhibitorii asupra diferitelor enzime , si in particular asupra sintetazelor endoperoxide prostaglandinice

COX1 si COX2. Scopul acestui studiu este evaluarea efectelor pe termen scurt ale Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Calciu asupra

statusului clinic si biologic la pacientii diagnosticati cu angina pectorala stabila.

2. MATERIAL SI METODA

2.1 Studiile preclinice

Reactivi

Fructoboratul de calciu a fost sintetizat n conformitate cu brevetul de inventie al lui Miljkovic. Puritatea FC a fost verificat prin

rezonan magnetic nuclear i prin cromatografie lichid de nalt performan iar rezultatele indica o puritate analitic de 99,9%. Toti reactivii

utilizati pentru sinteza sa; acidul boric, acetona, CaCO3 i fructoza au fost achiziionati de la Sigma Chemicals, USA. Lipopolysaccharides (LPS)

a fost cumparat de asemenea de la aceeasi companie (Sigma Chemicals, USA ) .Anticorpul primar pentru COX-2 a fost achizi ionat de la

Millipore.


15/44

Izolarea neutrofilelor

Proaspetele granulocite neutrofile umane (PMN) au fost obinute de la donatorii sanatosi. Sngele venos a fost recoltat n seringi

heparinizate. Celulele PMN au fost separate prin centrifugarea n conformitate cu Boyum (23). Restul de celule roii din snge au fost eliminate

prin liza hipotonica. Neutrofilele purificate au fost splate i resuspendate n DMEM iar celulele au fost numrate ntr-un hemocitometru. Analiza

morfologic a artat c 90% din celule au fost PMN. Celulele au fost tratate cu fructoborat de calciu (FC), clorur de calciu (CC) i borat de

sodiu (SB), n intervalul 450 - 22 500 mM timp de 24 de ore.

Celulele macrophage RAW 264.7

Celulele macrofage RAW 264.7 murine au fost achizitionate de la ATCC (American Type Culture Collection), USA . Celulele au fost

cultivate la o densitate iniial de 2,5 x 105 cells/cm2 n placi cu godeuri pentru cultura de tesut , in mediu de cultura Dulbecco Eagle modificat,

suplimentat cu ser fetal bovin 10%, antibiotic (100 U / ml de penicilin i 100 g/ml de streptomicin) i meninut ntr-o atmosfer umidifiata cu

5% CO2 la 37 C. Ele au fost activate timp de 24 de ore cu 1 g / ml LPS (Sigma-Aldrich Co), n absen a sau prezena continu a FC adaug la

mediul de cultur in concentraii de 0,2 mM, 0,45 mM i 1mM.

Testele de viabilitate celulara

Testul de viabilitate al PMN a fost efectuat prin analiza colorimetrca MTT. Colorarea cu tetrazoliu 3-(4, 5-dimetiltiazolil-2)-2, 5-

bromur de difeniltetrazoliu) este redusa la un produs colorat de activitatea dehidrogenazelor dependente de NADH- i aceasta indic nivelul de

metabolism energetic din celule. Celulele PMN au fost tratate n 24 de placi cu godeuri i incubate cu 0,5 ml / godeu al MTT (1 mg / ml) timp de

3 ore la 37 C. Dup acest timp formazanul a fost eliberat din celulele cu dimetilsulfoxid. Viabilitatea celular fost evaluate prin msurarea

absorbanei, la 550 nm.

Viabilitatea celular a macrofagelor RAW 264.7 a fost evaluat prin expunere la diferite tratamente pentru perioada specificat de

timp. Celulele RAW 264.7 au fost incubate cu 1mg/ml solu ie MTT la 37 C timp de 2 ore. Coloratia galbena [3-(4, 5-dimetiltiazol-2-yl)-2,

bromur de 5-difeniltetrazoliu] (MTT) este redusa la granule insolubile de formazan violet prin intermediul celulelor active metabolic.

Precipitatul de formazan a fost dizolvat n dimetilsulfoxid, iar dup 10 min de agitare lenta, absorbana a fost nregistrat la 550 nm.

Observarea apoptozei in celulele PMN

Celulele apoptotice au fost observate prin intermediul colorarii annexinului V / iodurii de propidium, care permite distinc ia ntre apoptoza

si necroza. Celulele viabile nu leag Annexina V-FITC sau iodura de propidium (PI). Una dintre caracteristicile timpurii in initierea procesului de

apoptoza, este deteriorarea membranei celulare, cu translocarea fosfatidil serinei (PS) din interiorul catre exteriorul membranei celulare.

Annexina V are afinitate crescuta pentru PS, asociindu-se cu ea in celulele care elibereaza aceasta molecula in procesul incipient al iducerii

apoptozei celulare. Celle Viable, care nu au intrat in procesul de apoptoza , au membrana intacta si nu vor permite patrunderea PI in celula. Mai

trziu, n timpul procesului apoptotic in vitro, membrana devine poroasa i PI poate sa patrunda in celula, asociindu-se cu ADN-ul din nucleu si

este vizibil sub forma de fluorescen roie.

Verificarea ciclurilor respiratorii

Speciile reactive de oxigen(ROS) au fost cuantificate prin msurarea chemiluminescenei luminol dependent la 37 C, Celulele au fost

stimulate cu 1 M de formilmetionil-leucil-fenilalanin (fMLP), i generarea de ROS a fost msurat prin integrarea calculelor fotonice timp de

30 de minute dup adugarea agonistilor. Solventul de control, dimetilsulfoxid (DMSO), nu a stimulat produc ia de ROS.


16/44

Testul de superoxid dismutaza (SOD)

Analiza activitii SOD a fost efectuata prin metoda descris de Paoletti i Mocali (24), care const din secvena de reacie pur chimica ce

genereaz superoxidul din oxigenul molecular, n prezena EDTA, clorur de mangan (II), i mercaptoetanol. Oxidarea NAD(P)H (urmrita prin

diminuarea absorbanei la 340 nm) este legat de disponibilitatea anionilor de superoxid n mediu. Valorile de A340 nregistrate pentru probele

cu activitatea SOD vor scdea progresiv, n funcie de cantitatea de enzim din amestecul de analiza. Schimbarea procentului in cadrul activitatii

enzimei a fost calculat cu datele de la testul celulelor tratate i de control.Neutrofilele umane au fost tratate timp de 24 de ore cu fructoborat de calciu, spalate cu PBS, resuspendate n PBS i lizate prin sonicare.

Modificrile nivelului de anion superoxid intracellular

Orice modificare a nivelului de anion superoxid intracelular a fost determinat de capacitatea anionului superoxid de a reduce sarurile

tetrazoliului nitro-blue (NBT) la depozite intracelulare negru-albastre. Pe scurt, neutrofilele umane au fost incubate cu diferite concentraii de FC

i 0,3 mg / ml NBT. Dup 2 ore, mediul de cultura a fost eliminat iar celulele au fost sp late cu solutie salina cu tampon fosfat i lizate astfel nct

NBT redus sa se dizolve n tamponul de liz iar absorbana optica a fost masurata la 520 nm folosindu-se un cititor microplac .

Compoziia citotoxicitatiiLinia celulara a macrofagelor de murine RAW 264.7 a fost de obicei crescuta, tratata i evaluata n vederea detectrii scurgerilor de

lactat dehidrogenaza (LDH) din citoplasma celulelor deteriorate. Pe scurt, dup 24 ore de tratamente diferite, cu LPS CF, mediile de cultur au

fost recuperate i utilizate pentru a masura pierderea de viabilitatea celular i eliberarea de LDH folosindu-se o trusa toxicologica de testare

(TOX-7, Sigma-Aldrich Co) in vitro, n conformitate cu instruciunile productorului.

Msurarea nitritului

Nivelurile de nitrit din mediile de cultur au fost determinate folosindu-se reacia Griess. Pe scurt, o cantitate de 50 l de mediu de

cultur celular a fost amestecata cu 100 l de reactiv Griess [volume egale de sulfanilamid in procent de 1% (w/v) la acid fosforic in procent de

5% (v/v) i de naftilen-diamina-HCl in procent de 0,1% (w/v)] i incubata la temperatura camerei timp de 10 min. Absorban a a fost apoi

masurata la 520 nm. Mediile de cultur proaspete au fost folosite ca proba de control pentru toate experimentele. Nivelurile de nitri i din mostreau fost determinate folosindu-se o curba standard de nitrit de sodiu.

Testul ELISA pe baza de citokine

Nivelurile de TNF-, IL-1 i IL-6 au fost determinate folosindu-se truse ELISA, achiziionate de la Pierce Biotehnologie Inc, cu

respectarea instruciunilor productorului. Aceste teste au fost efectuate folosindu-se supernatanul rezultat prin centrifugarea mediilor de cultur

colectate la sfritul timpului de tratare a celulelor.

Western Blotting pentru Expresia proteica COX-2

Celulele au fost tripsinizate, cltite de dou ori cu PBS i apoi lizate prin sonicare. Totalul de celule lizate ce conine 25 g de

proteine, dupa cum s-a determinat prin metoda Bradford (12), au fost separate prin electroforez n gel de poliacrilamida in prezenta de sodiumdodecil sulfat (SDS-PAGE; poliacrilamid 10%), i apoi transferat pe membranele de nitroceluloz. Pentru detectarea proteinei COX-2 s-a

folosit un kit de Imunodetectie cromogenic WesternBreeze Western Blot (Invitrogen).

Metode statistice

Cel puin trei experimente au fost efectuate n trei exemplare pentru fiecare condi ie experimental. Datele sunt exprimate ca medie

SEM. Diferenele statistice au fost analizate cu ajutorul lui Students t-test sau analiza de varian atunci cnd a fost cazul.


17/44

Pentru evaluarea statistic a datelor obinute, s-au efectuat testele de compara ie multiple Bonferroni ANOVA ntr-o singura direc ie. Toate

valorile sunt exprimate ca mijloace SEM. Analiza statistic a fost realizat cu ajutorul software-ului Prism (GraphPad, San Diego, CA).

2.2. Studiile clinice

2.2.1. Evaluarea efectului fructoboratului de calciu asupra inflamatiei sistemice si amarkerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita

primara

Design de studiu i selecia pacienilor

Studiul a fost placebo controlat , randomizat, dublu-orb, cu patru grupuri de subieci. Recrutarea pacientilor a avut loc din 10 martie

2009 pana la data de 30 august 2009 la Clinica Medicala II a Spitalului de Urgen Craiova, Romnia, cu pacienti alesi din comunitatea locala.

Caracteristicile pacieniilorNumrul total de pacieni nscrii a fost de 116 . Nu toi subiecii nregistrati au fost inclusi n populatia cu intenie de tratament (ITT).

Aceast populaie ITT a fost definita drept orice subiect care a primit produsul i care a avut parte de evaluari ulterioare. Patruzeci i patru de

persoane care nu au ndeplinit criteriile de includere sau au refuzat s participe nu au fost luate n considerare pentru analiza ITT. Astfel, num rul

total de subieci care au fost inclusi in analiza ITT a fost de 72. Acesti 72 de pacienti au fost impartiti in 4 grupe (19 n grupa 1, 18 in grupa 2, 17

n Grupa 3 i 18 n grupul placebo), dar 12 dintre ei nu au respectat protocolul complet.

Tabel 1.

Caracteristicile demografice de baza ale pacientilor care au terminat cu success studiul

Grupuri de pacienti

Caracteristici Placeboa

Grup 1 Grup 2 Grup 3

Numer de pacienti pe grup 15 15 15 15

Gen(M:F) 3:12 3:12 7:8 4:11

Varsta medie (SD), ani. 67.6 (5.5) 68.2 (6.6) 59.8 (8.8) 64.8 (10)

Mediul de provenienta (rural: urban) 15:0 15:0 9:6 12:3Aportul dietetic de bor zilnic (mg/zi) 2.2 (0.7) 2.1 (0.8) 1.9 (0.5) 2.0 (0.4)

Borul suplimentat cu CF (mg bor/zi) 0 1.5 3.0 6.0

Pacienti cu dislipidemieb

(%), no. 11 (73.3) 14 (93.3) 10 (66.6) 12 (80)

Pacienti cu inflamatiec

(%), no. 14 (93.3) 12 (80) 8 (53.3) 11 (73.3)


18/44

aPlacebo i s-a administrat 113 mg fructoza

b Pacienti cu LDL>130 si Colesterol>200c Pacienti cu CRP>0.5

Criteriile de includere a participantiilor

Au fost inclusi barbati si femei care nu sunt insarcinate ,cu varsta cuprinsa ntre 40 i 85 de ani, cu OA primar la cel puin un genunchi.

Acest fapt a fost demonstrat la un examen radiologic, care a fost efectuat n ultimele 3 luni.

Criteriile de excludere a participantiilor

Subiecii cu probleme de digestie, cu febr i/sau sub tratament cu antibiotice, cu intoleran la fructoz i cei care iau orice analgezice i/sau

vitamina B6 si aspirina au fost exclui din studiu.

Vizite de studiu i administrare

Studiul a folosit un supliment alimentar comercial marc FruiteX-B , nregistrat de ctre Compania FutureCeuticals din Statele Unite

ale Americii. FruiteX-B a fost dovedit stiintific ca fiind identic cu cele care apar in mod natural pe baza de plante bor-carbohidrati, FC .

Cele patru grupuri de subiecti sunt descrise dup cum urmeaz:

Grupa 1: 28,5 mg FC (1,5 bor mg / zi) de dou ori pe zi;

Grupa 2: 56.5 mg FC (3,0 bor mg / zi) de dou ori pe zi;

Grupa 3: 113 mg FC (6,0 bor mg / zi) de dou ori pe zi;

Grupa Placebo: 120 mg Placebo de dou ori pe zi. Materialul Placebo s-a bazat doar pe fructoz.

Durata tratamentului a fost de dou sptmni. Doua capsule pe zi au fost administrate pe cale oral n timpul meselor.

Parametrii biochimici

Parametrii biochimici de baz, cum ar fi profilul lipidic (total, HDL-i colesterolul LDL) i markerii inflamatori (PCR) au fostanalizati n ser utiliznd procedurile standard biochimice.

Evaluarea siguranei pacientilor

Trei numere de telefon de urgen au fost date subiectilor pentru a menine contactul n timpul studiului, n cazul n care au avut orice

reacii adverse sau alte probleme legate de studiu.

Analizele statistice

FC sau efectul placebo a fost evaluat printr-o analiza bloc randomizata a varianei, cu dou sensuri. Software-ul Microsoft Excel a fost utilizat

pentru analiza statistic. Semnificaia statistic a fost definit la nivelul de 95% (p < 0.05). Rezultatele sunt exprimate ca medie devia ii

standard (DS).


19/44

2.2.2 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu

Angina Pectorala Stabila

Designul de studiu si selectia pacientilor

Studiul a fost randomizat, dublu orb realizat pe 3 grupe de subiecti.Recrutarea pacientilor a avut loc din octombrie 2009 pana in

decembrie 2010 la Centrul de Cardiologie Craiova, Romania.

Caracteristicile pacientilor

Numrul total de pacieni inregistrati a fost de 166. Nu toi subiecii inregistrati au fost inclusi n intenia de tratament (ITT). Aceast

populaie ITT a fost definita ca fiind toti subiec ii care au primit produsul i care au avut parte de o evaluare ulterioara. Cincizeci de persoane nu

au ndeplinit criteriile de includere sau au refuzat s participe i ca atare nu au fost luate n considerare pentru analiza ITT. Astfel, num rul total

de subieci care au fost inclusi in analiza ITT a fost de 116. Acesti 116 pacien i au fost impartiti in 4 grupe (29 subieci n fiecare grup) i toti au

ndeplinit protocol complet. Din numrul total de pacieni inclui n studiu (n = 166), numai 116 au definitivat perioada de 60 zile de tratament.

Tabelul 1 Caracteristicile demografice de baza ale pacientilor care au terminat cu success studiul

Caracteristici Grupul 1 Grupul 2 Grupul 3 Control

Varsta- medie, (SD) 64.9 (5.8) 66.3 (5.5) 63.7 (6.2) 64.2 (7.1)

Barbat/Femeie 17/12 18/11 18/11 18/11

Istoric de MI (%) 41.37 41.37 48.27 44.82

Istoric de PCI ori de CABG

(%) 13.79 17.24 13.79

13.79

Istoric de hipertensiune (%) 100 96.55 93.1 96.55

Istoric de DM (%) 44.82 41.37 44.82 41.37

Istoric de PAD (%) 20.68 20.68 17.24 17.24

Legend: SD deviatie standard, MI infarctul miocardic, PCI interventie percutana coronara, CABG by-pass coronarian, DM diabetul

mellitus,

PAD boala arterial periferica.

Criteriile de includere ale participantilor

Criteriile de includere au fost: pacientii de sex masculin sau feminin cu varsta peste 18 ani, diagnosticati cu angina pectorala(Clasa II-IV,

Societatea Canadiana de Cardiologie), conditie clinica stabila pentru cel putin o luna, aflati pe tratament stabil standard pentru angina pectorala(

in luna anterioara studiului.


20/44

Criteriile de excludere ale participantilor

Criteriile de excludere au fost: pacienti necooperanti cu incapacitate legala ori incapacitate legala limitata, femei gravide sau care

alapteaza, participant aflati in alt studiu in acelasi timp ori in ultimile 30 de zile de la inceperea studiului, cu spitalizare recenta( mai putin de 3

luni) pentru angina instabila, infarct miocardic ori reascularizare coronariana, cunoscuti cu abuz de alcool sau de droguri, cunoscuti cu

insuficienta moderata sau severa a ficatului(scorul Child-Pugh >7), ori cunoscuti cu insuficienta renala severa( creatinina serica>220

micromoli/L) ori cunoscuti cu anemie(Hb


21/44

Examinarea pacientilor a fost facuta in cadrul a 3 vizite: la includere, la o luna si la 2 luni.

Evaluarea pacientilor a inclus:

-Examen clinic

-EKG cu 12 derivatii

-Testele de laborator:HLG complete, sodium, potassium seric, GOT, GPT, glucoza plasmatica, lipidiograma completa, proteina C reactiva cusensibilitate inalta(hs-CRP), NT-proBNP.

-Chestionarul pentru angina Seattle ( numai vizita 1 si 3).

Parametrii biochimici

Parametrii biochimici de baza cum ar fi profilul lipidic( colesterol total, HDL-colesterol si LDL-colesterol, trigliceride) si markeri

inflamatori(protein C reactiva inalt sensibila), au fost analizate in serum prin proceduri standard biochimice, utilizand analizatorul automatic

Cobas Integra 400 Plus automatic analyzer si kituri(Roche , Switzerland).NT-proBNP a fost determinat utilizand analizatorul Cobas h232 si

testele(Roche).

Calitatea vietii

Rezultatele secundare au fost clasa angina CCS asa cum este evaluat de care medic in timpul interviului pacientului, numarul mediu

de atacuri anginoase pe saptamana, si scorurile chestionarului Seattle Angina Questionnaire obtinute la includerea in studiu si la finalul celor 60

de zile de vizita. Chestionarele au fost completate de catre pacienti ori cu ajutorul unei rude sau cuiva apropiat.

Evaluarea de siguranta

2 numere de telefon de urgenta au fost date pacientilor pentru a tine legatura pe toata durata studiului, in cazul in care ei ar prezenta vreo un

efect advers ori ar avea vreo intrebare in legatura cu studiul.

Analizele statistice

Analizele statistice au fost realizate cu ajutorul SPSS 15.0 pentru Windows. Testul student a fost utilizat pentru a analiza diferentele dintre

valorile medii.

5. REZULTATE

3.1 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra granulocitelor neutrofilice

umane

Tratamentul neutrofilelor polimorfonucleare umane cu doze diferite de FC a fost monitorizat cu microscopie cu contrast de faz (fig. 1).


22/44

control 450 mM

3,150 mM 22,500 mM

Fig.1. Aspectul morfologic al celulelor de PMN tratate timp de 24 de ore, cu diferite concentraii de fructoborat de calciu, evaluat prin

microscopia optic cu contrast de faz (100)

Expunerea de celule PMN la FC are ca rezultat modific ri morfologice dependente de doz ale celulelor. Efectele citotoxice cele mai

evidente au fost observate la concentraia maxim utilizata in studiu, 22500 mM. Nu s-au observat diferene atunci cnd au fost examinate

neutrofilele CC i SB tratate.

Am constatat c FC a exercitat cele mai intense efecte citotoxice, ntr-o manier dependent de doz, mai evident la doze ntre 450 mM

i 22,500 mM FC.

Tabelul 1: Citotoxicitatea de expunere a celulelor PMN (24 h, 37 C), la diferite concentraii de fructoborat de calciu, borat de sodiu i clorur de

calciu

Tratament Absorbanta la 550 nm

mM Fructoborat de

calciu

Borat de sodiu Clorura de calciu


23/44

0 0.375 0.003 0.416 0.004 0.385 0.004

450 0.364 0 0.411 0 0.377 0.003

1,350 0.341 0.001 0.413 0.008 0.392 0.007

2,250 0.304 0.001 0.404 0.004 0.389 0.007

3,150 0.230 0 0.409 0.004 0.371 0.002

22,500 0.146 0 0.399 0.005 0.335 0.004

Am observat prezenta unor celule apoptotice n experimentul de control, dup 24 de ore de cultur. Tratamentul celulelor PMN cu

3150 mM FC a indus vacuolizarea citoplasmei, contracia n dimensiune i pierderea integritii membranei celulare, o caracteristic clasica a

celulelor necrotice sau tardiv apoptotice. Celulele desprinse si-au pierdut ataamentul fa de substrat i n cele din urm au plutit n mediul de

cultur.

Rezultatele obinute n studiul nostru sugereaza ca tratamentul cu FC inhib n mod semnificativ generaia speciilor reactive de oxigen

(ROS), ntr-o manier dependent de doz. n raport cu experimentul de control, nivelul ROS a sczut cu 50%, 78,5%, 87,2% i 92,9% ca urmare

a tratamentului celulelor PMN cu 450 mM, 1350 mM, 2 250 mM, 3 150 i respectiv 22 500 mM FC.

Tratamentul celulelor cu aceleai doze de SB are efecte mai mici inhibitorii asupra ciclului respirator. Astfel, n ceea ce privete

controlul, intensitatea ciclurilor respiratorii a celulelor PMN stimulate fMLP a sczut cu 27,7% i 66,9%, ca urmare a tratamentului celulelor cu

borat 450 mM i respectiv 22,500 mM. n concentraii variind de la 450 la 3.150 mM, Ca2+ ionii au artat o influen uoar sau chiar deloc asupra

acestei funcii a celulelor PMN. Cu toate acestea, creterea concentraiei de CC pn la 22,500 mM a determinat o scdere a ciclurilor respiratorii

cu 53,3%.

3.2 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra productiei de mediatori ai

inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stimulate LPS

ntr-o prim etap, viabilitatea celular dup diferite tratamente a fost studiata folosindu-se att testele MTT cat i LDH.Aa cum se arat la Fig. 1, tratamentul timp de 24 ore cu FC a dus la modificri minore n viabilitatea celular a macrofagelor nestimulate.


24/44

Fig. 1. Efectele tratamentului cu FC n intervalul de dozare de 0.2-1 mM asupra viabilitatii celulare a macrofagelor RAW 264.7

nestimulate cat si stimulate (1g/ml LPS). Datele reprezint media SEM din cele patru experimente (fiecare concentra ie de FC a fost testata n

trei exemplare). *: p


25/44

Fig. 3. Efectele tratamentelor cu dozele de FC in cre tere asupra eliberarii de IL-1b matur prin intermediul macrofagelor RAW 264.7

stimulate LPS. Datele reprezint media SEM a celor patru experimente (fiecare concentraie de FC a fost testata n trei exemplare). **: p


26/44

Modificare, (95% CI)

% modificare de la nivelul de baseline

0.77

(0.07)

0.04

5.47

(0.02)

-0.47

-60.25

(0.24)

-0.2

-26.66

0.47

(0.17)

-0.1

-17.54

aSemnificatia statistica a baseline

Markeri dislipidemici

n timpul perioadei scurte de studiu, nici trigliceridele si nici colesterolul HDL nu s-au schimbat n mod semnificativ fa de valoarea

iniial n toate grupurile (p > 0.05). Constatrile in privinta lipidelor (a se vedea tabelul 3) au fost neconvingatoare in privinta faptului ca borul a

avut vreun efect real fiziologic semnificativ asupra dislipidemiei. Chiar si in grupurile 3 i 4 combinate, B nu are vreun efect semnificativ

asupra colesterolului sau colesterolui LDL. Numai n Grupul 1, s-a ob inut un motiv important i acela a fost din fericire o mica deviaie standard

in acest grup. Pe baza a doar dou msurtori (la nceput i la sfrit), variabilitatea a indicat faptul ca grupurile 3 i 4 au o constatare mai

previzibila.

Tabel 3.

Masuratorile markerilor dislipidemici sanguine pentru grupul ITT dupa 2 saptamani de suplimentare cu CF

Grupuri de pacienti

Variabila, masuratoare Placebo Grup 1 Gup 2 Grup 3

Trigliceride , pa

Nivel de baza, medie (SD)

Final, medie(SD)


% modificare de la nivelul de baza

0.36767

121 (11)

130 (15)

9

7.5

0.42201

137 (15)

128 (16)

-9

-6.5

0.09214

188 (15)

145 (22)

-43

-22.87

0.30010

141 (13)

138 (12)

-3

-2.1

Colesterol, pa


Final, medie (SD)



0.16336222 (13)

234 (10)

12

5.4

0.01378244 (10)

222 (9)

-22

-9.01

0.14875230 (69)

224 (45)

-6

-2.6

0.27139260 (78)

255 (70)

-5

-1.92


27/44

HDL-colesterol, pa


Final, medie (SD)



0.19320

47 (8)

51 (4)

4

8.51

0.15895

53 (3)

54 (4)

1

-3.77

0.38799

49 (7)

50 (6)

1

2.04

0.11081

55 (11)

58 (13)

3

5.45

LDL-colesterol, pa


Final, medie (SD)



0.10529

150 (9)

160 (8)

10

6.66

0.00555

164 (6)

144 (6)

-20

-12.19

0.42315

143 (7)

144 (10)

1

0.69

0.15522

175 (20)

170 (16)

-5

-2.85

a Semnificatia statistica de la nivelul de baza

3.4. Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu

Angina Pectorala Stabila

Proteina C reactiva de nalt sensibilitate

A existat o scdere semnificativ a hs-PCR n toate grupurile, n ambele vizite la zile 30 i 60 de zile (vezi tabelul 3). Aceast scdere

a fost mai mare pentru Grupa 3 (doar fructoborat de calciu sub forma de Fruitex-B), urmat de grupul 2 care a primit resveratrol n asociere cu

fructoborat de calciu. S-a observat c, dup 30 de zile Grupul 3 a avut cea mai mare scdere (22%), urmat de grupul 1 i grupul 2 (aproape

nesemnificativa). Dupa 2 luni (60 zile), grupul 2 a depit grupul 1 (30,3% fa de 24,6%), insa grupul 3 a avut n continuare cea mai mare

scadere (39,7%). Diferenele fa de valoarea iniial, la fiecare grup, precum i diferenele dintre fiecare grup comparativ cu controlul, au fost

semnificative statistic.

Tabelul 3. Evolutia hs-CRP(mg/L) in cele 3 grupuri

La includere Luna 1 Luna 2 pa

trend

Grupul 1 6.9 2.5 5.7 1.9

(-17.3%)

5.2 1.7

(-24.6%)

0.040


28/44

Grupul 2 6.6 2.6 6.2 2.5

(-6%)

4.6 1.8

(-30.3%)

0.030

Grupul 3 6.8 1.9 5.3 2.5

(-22%)

4.1 1.5

(-39.7%)

0.007

Control 6.6 2.4 6.2 2.1

(-6%)

5.9 2.6

(-10.6%)

-

a Comparativ cu grupul de control

NT-proBNP

Tabelul 4 prezint evoluia NT-proBNP n cele trei grupuri. NT-proBNP a fost redus n mod semnificativ de resveratrol (Grupul 1) (cu

59,7% la 60 de zile) i de fructoboratul de calciu (Grupul 3) (cu 52,6% la 60 de zile). Asocierea lor a fost cea mai eficienta (Grupul 2), inducnd o

scdere de 65,5% (p = 0,04, comparativ cu controlul). Trendul descendent pentru grupul 2 este cel mai mare, dup prima lun i la sfritul

studiului (dup 60 de zile).

Tabel 4 Evolutia NT-proBNP (pg/mL)

Includere Luna 1 Luna 2 pa

trend

Grupul 1 674 192 552 232

(-18.1%)

271 137

(-59.7%)

0.03

Grupul 2 662 238 498 147

(-24.7%)

228 84

(-65.5%)

0.04

Grupul 3 684 151 531 165(-22.3%)

324 102(-52.6%)

0.01

Control 671 218 582 197

(-13.2%)

514 207

(-23.3%)

-

aComparativ cu grupul de control

Markeri lipidici

Profilul lipidic (vezi tabelul 5) a avut o evoluie favorabil, n toate grupurile. Colesterolul total, colesterol LDL i trigliceridele au sczut,

n timp ce colesterolul HDL a crescut. Acest efect a fost semnificativ statistic mai ales pentru Grupul 3 (numai fructoboratul de calciu). Cu toate

acestea, rezultatele obinute nu au fost n ntregime concludente. Modificaril markerilor lipidici sunt sub 10%. Merit s menionm c n timpul

studiului toi pacienii au continuat tratamentul cu statine urmat de ei, medicamentul utilizat pentru scderea nivelului de colesterol. Acest

medicament ar fi putut avea o influen asupra rezultatelor obinute. Dei Grupul 3 pare a fi avut cele mai bune valori, con ine cel mai mare

numr de subiecti care au primit statina. Nu au existat reac ii adverse raportate.


29/44

Tabelul 5. Evolutia profilului lipidic(mg/dl)

Includere Luna 1 Luna 2 pa trend

Colesterolul total

Grup 1 176.5 89 171.1 97 164.3 79

(-6.9%)

0.04

Grup 2 167.5 95 165.2 89 163.7 71

(-2.2%)

ns

Grup 3 172.5 75 166.8 77 162.2 69

(-5.9%)

0.03

Control 169.4 85 166.3 91 164.8 82

(-2.7%)

-

LDL colesterolul

Grup 1 123.2 63 118.4 59 115.3 57

(-6.4%)

0.03

Grup 2 118.5 57 115.2 54 113.2 56

(-4.4%)

ns

Grup 3 122.6 46 115.1 49 111.2 55

(-9.2%)

0.02

Control 121.2 61 118.7 57 116.6 52

(-3.7)

-

HDL colesterolul

Grup 1 53.2 25 52.8 27 54.1 33

(1.6%)

ns

Grup 2 52.3 45 51.9 27 52.8 35

(0.9%)

ns

Grup 3 50.1 20 51.3 23 52.7 26

(5.1%)

0.04

Control 51.8 23 51.2 32 51.6 29 -


30/44

(-0.3%)

Trigliceride

Grup 1 134.1 64 131.2 72 128.8 58

(-3.9%)

0.04

Grup 2 127.1 72 127.8 67 125.7 68

(-1.1%)

ns

Grup 3 137.6 54 135.8 62 132.7 64

(-3.5%)

0.04

Control 132.4 69 130.4 81 129.8 72

(-1.9%)

-


Calitatea vietii

A existat o imbunatatire a calitatii vietii pacientilor pentru toate grupurile. Tabelele 6, 7 i 8 reflect scderea n mod semnificativ

a numrului de episoade de angina pe sptmn i ale consumului de nitroglicerin, creterea scorurilor SAQ i mbuntirea n clasa anginei la

toate grupurile.

Tabelul 6. Numarul de episoade de angina si consumul de nitroglicerina pe saptamana

Includere Luna 1 Luna 2 pa

trend

Episoade anginoase/saptamana

Grup 1 4.2 3.3 2.1

(-50%)

0.030

Grup 2 4.4 3.2 1.8

(-59%)

0.003

Grup 3 4.5 3.5 2.3

(-48.8%)

0.040

Control 4.2 3.8 3.2

(-23.8%)

-

Consumul de nitroglicerina (tablete ori pufuri/saptamana)

Grup 1 3.2 2.3 1.4 0.009


31/44

(-56.2%)

Grup 2 3.4 2.1 1.1

(-67.6%)

0.004

Grup 3 3.1 2.4 1.4

(-54.8%)

0.010

Control 3.4 2.8 2.4

(-29.4%)

-


Tabelul 7. Rezultatele Seattle Angina Questionnaire

Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control

BaselineLuna

2Baseline

Luna

2Baseline

Luna

2

Baseline Luna

2

Limitarea

miscarilor

52.2 64.3 50.5 66.4 53.4 64.4 55.3 59.1

Stabilitatea

anginei

46.7 81.2 44.2 86.5 47.3 82.6 49.3 61.2

Frecventa

anginei48.6 69.4 46.5 73.1 46.8 70.2 47.2 59.4

Satisfactia la

tratament

67.5 78.1 68.4 81.3 66.2 78.3 69.1 73.2

Perceptia bolii 33.4 52.1 32.1 54.4 34.7 55.6 34.1 41.2

Scorul pe scala

vizuala

63.2 74.5 64.5 77.1 61.8 75.6 62.4 68.1

p < 0.001, Wilcoxon Signed Ranks

Table 8 Clasa de angina CCS


32/44

Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control

Baseline Luna 2 Baseline Luna 2 Baseline Luna 2 Baseline Luna

2

Clasa I 0 4 0 5 0 7 0 2

Clasa II 8 13 9 11 10 13 9 10

Clasa III 19 10 19 12 17 8 18 16

Clasa IV 2 1 3 1 2 1 2 1

p < 0.001, Wilcoxon Signed Ranks

4. CONCLUZII GENERALE

1. Borul este un nutrient esenial pentru anumite organisme, n special plantele vasculare i diatomee. Rolul borului n ciclul de

via al plantelor este bine documentat, dar se stiu putine lucruri despre homeostazia si functia borului din celulele animale.

2. Aciunile borului pot fi corelate cu faptul c acidul boric formeaza diesteri ciclici cu diolii sau polioli corespunztori de la mai

multe dintre substanele chimice gsite n organism, cum ar fi carbohidrati (zaharuri i polizaharide), nucleotide (cum ar fi

adenozin monofosfatul i dinucleotid adenin niacinamida) i vitamine (cum ar fi acidul ascorbic, piridoxina si riboflavina).

Esterii cei mai stabili sunt cei n care acidul boric formeaza puntea de leg tur ntre dou molecule de carbohidrai, de exemplu,

fructoz-bor-fructoz. Astfel de complexe de bor solubile se gsesc n mod natural n seva floemului i in nectarurile din plante.

Polizaharidele care conin bor n legturi similare se gsesc n pereii celulelor plantelor, sub form de pectine.

3. n prezent, dou ipoteze au fost avansate care incearca sa explice funcia biochimica a borului la animale, inclusiv la om. Prima

este faptul c borul joac un rol n functiile membranei celulare care influen eaz rspunsul la aciunea hormonilor, semnalizarea

transmembranei i miscarii transmembranare a ionilor. S-a demonstrat pe modele animale ca borul influen eaza transportul de

calciu extracelulari eliberarea de calciu intracelular n trombocitele activate de trombin. Acesta influeneaz, de asemenea,

reactii redox implicate n transportul membranei celulare la plante. O a doua ipotez este c borul actioneaza ca si reglator

metabolic n mai multe sisteme enzimatice. Borul poate juca un rol important in reglarea ciclurilor respiratorii, prin mecanismul

ce implica formarea speciilor reactive de oxigen, prin care celulele albe din sange distrug microorganismele. Dac borul regleaza

intr-adevar ciclurile respiratorii, acesta i asum rolul de antioxidant de noua generatie, prevenind unele dintre daunele

colaterale care pot aparea atunci cand speciile reactive de oxigen reacioneaz cu esuturile nconjurtoare.

4. Studi ile noastre in vitro arat c fructoboratul de calciu are efecte marcante asupra celulelor PMN umane in func ie de

concentraia lui. Astfel, tratamentul cu FC al PMN cu stimulare fMLP, timp de 24 de ore, a condus la scderea ciclurilor

respiratorii, ntr-o manier dependent de doz. Faptul c scderea nivelului ROS are loc chiar n cazul dozelor netoxice de FC

(de exemplu, cu 50% n cazul dozei de 450 mM FC) intrete concluzia c FC scade intensitatea puseului respirator deci are un

efect anti-inflamator. Aceste date trebuie interpretate innd seama de observaiile anterioare c stimularea neutrofilelor cu fMLP

are ca rezultat o eliberare crescut de anion superoxid i o cretere a nivelului apoptozei (32). Este posibil ca FC s inhibe

activarea complexului enzimatic NADPH-oxidaza, care reduce n mod direct oxigenul molecular pentru a genera anionul


33/44

superoxid, care este ulterior transformat n alti intermediari reactivi. De men ionat c aceast actiune este datorat FC si nu

ionilor de Ca2+ sau restului borat din compoziia lui. De fapt, Granfeldt et al. (33) au artat c o cretere a [Ca2+] mediata prin

legare a fMLF de receptorul sau face parte dintr-o cascada de semnalizare care activeaza oxidaza localizata in membrana

plasmatica. La acest moment este dificil de propus u n mecanism prin care FC inhib funcia NADPH a oxidazei deoarece acest

complex enzimatic legat prin membrana este continut att de membrana integrala cat i de proteinele citosolice si este supus unui

control deosebit de complicat. O mai bun nelegere a mecanismelor folosite de fructoboratul de calciu pentru a inhiba oxidaza

Investigarea aciunii FC asupra nivelului intracelular al anionilor superoxid n cazul celulelor PMN nestimulate ntrete ideea

activitii antioxidante a FC(19) conform creia FC este un saprofit pentru anionii superoxid.

5. Dismutaza superoxid (SOD) protejeaza coninutul PMN mpotriva activitatii oxidante prin distrugerea anionilor superoxid (O2

), SOD reduce att stresul oxidativ cat i activarea mediatorilor de rspuns inflamator (35). n studiul nostru am pus n eviden

faptul c in cazul dozei citotoxice de FC nivelul anionilor superoxid este sczut datorit creterii activitii SOD. Activitatea

scazuta a dismutazei superoxid din celulele PMN poate explica micile discordane intre datele privind nivelul anionilor O2 si

activitatea SOD. Aceste date sugereaz c apoptoza celular a celulelor PMN si citotoxicitatea indus de FC nu sunt mediate de

eliberare de superoxid. Sunt necesare studii mai ample pentru a determina mecanismul exact de actiune antioxidanta a

fructoboratului de calciu, care poate permite o mai bun nelegere a mecanismului acestui supliment nutritiv.

6. Acest studiu a demonstrat ca tratamentul cu FC al macrofagelor RAW 264.7 stimulate LPS a indus o reglare in sens ascendent a

nivelului de proteine TNF- n mediul de cultur, nu a produs nicio modificare semnificativ a nivelului expresiei proteice COX-

2 induse LPS i o scdere a produciei de NO precum i la eliberarea de IL-1 i IL-6. Dei putem trage concluzia c FC ar putea

afecta productia de macrofage a mediatorilor inflamatori, aceste studii trebuie s fie completate cu cercetari suplimentare cu

scopul de a stabili dac tratamentul cu FC poate fi benefic pentru suprimarea produc iei de citokine pro-inflamatorii i pe fondul

progresiei maladiilor cauzate de endotoxina. De asemenea, intentionam sa elucidam mecanismul efectelor FC si eficacitatea

acestuia ca agent anti-inflamatoriu, comparativ cu medicamentele cu aciune anti-inflamatoare bine stabilita.

7. Trecera la studii clinice privind fructoboratul de calciu a aratat sugereaza ca pe termen scurt suplimentarea FC (numai 15 zile)

poate creste calitatea vietii pentru pacientii cu OA, cu un prognostic favorabil pentru stadiile inflamatorii. Importana acestui

studiu este legat de aciunile benefice ale FC asupra inflamaiei sistemic i perturbarii metabolismului lipidic pentru persoanele

n vrst care altfel ar putea avea un prognostic nefavorabil n bolile cardiovasculare. Acest studiu prezint rezultatele

preliminare care necesit o experimentare ulterioara. O perioad mai lung de suplimentare este necesar pentru a stabili dac FC

este un agent anti-inflamator eficient.

8. n ceea ce privete studiu clinic privitor la efectele cuplate ale fructoboratului si resveratrolului, rezultatele au fost semnificative

statistic pentru fructoboratul de calciu (Grupul 3) i numai pariale n cazul resveratrolului. n amestec, cei doi compui nu au

promovat rezultate bune. Cu toate acestea, tendinele duc la efecte benefice. Tendina observat a fost spre o scdere a

colesterolului total, a colesterolui LDL i a trigliceridelori o cretere a colesterolului HDL. Schimbrile observate au un procent

scazut, sub 10, dar acestea ar putea fi foarte importante pentru c orice scdere, orict de mica ar putea parea, de exemplu, 1 mg

de colesterol, va diminua riscul. Pentru date cat mai precise i mai exacte, este necesar o perioad mai lung pentru investigaii.

9. n ceea ce privete inflamaia sistemic msurat prin PCR hs, rezultatele obinute sunt expuse dup cum urmeaz. Ambele

substane, resveratrol i fructoboratul de calciu (marca inregistrata Fruitex-B), au un efect benefic, mai ales acesta din urm, cu

reducerea semnificativ a nivelului de PCR hs. Problema este c n asociere (resveratrol i Fruitex-B), efectul este mai mic dect

strict n cazul fructoboratului de calciu. O explicaie ar putea fi particularitatea grupului 2 de pacieni. Aa cum se observ, la

grupul 2 scaderea PCR hs iniiala (dup 30 de zile) este foarte mica, doar 6%, n comparaie cu alte grupuri. Apoi, dup alte 30

de zile, nivelul PCR hs a scazut brusc de la aproximativ 24% (total 30,3% dupa 2 luni). Deci, teoretic, dac am fi continuat

studiul pentru nc o lun sau dou, am fi avut curbe separate.

10. Nivelurile crescute de NT-proBNP previzioneaza o mortalitate ridicata in randul pacientilor cu insuficienta cardiaca si sindroame

coronariene acute [27]. NT-BNP la pacienii cu insuficien cardiac ischemic este un indicator pentru evolutia bolii pe termen

lung, independent de vrst, fracia de ejecie a ventriculului stng i de factorii de risc convenionali. Dup cum s-a menionat,

NT-proBNP este un indicator al func iei ventriculare. [28]


34/44

11. Conform rezultatelor obinute, scderea observat este destul de mare (65,5% n grupul 2), dar, n lipsa unui grup placebo, este

dificil de prezentat i de asemenea este greu sa avem certitudinea c un tratament de dou luni cu resveratrol i fructoborat de

calciu are efecte atat de importante asupra func iei ventriculului stng. Aici efectul este consistent, ceea ce pare a fi un efect

sinergic.

12. n ceea ce privete acest studiu, rezultatele au fost semnificative statistic pentru fructoboratul de calciu (Grupul 3) i numai

pariale n cazul resveratrolului. n amestec, cei doi compui nu au promovat rezultate bune. Cu toate acestea, tendin ele duc la

efecte benefice. Tendina observat a fost spre o scdere a colesterolului total, a colesterolui LDL i a trigliceridelori o cretere

a colesterolului HDL. Schimbrile observate au un procent scazut, sub 10, dar acestea ar putea fi foarte importante pentru c

orice scdere, orict de mica ar putea parea, de exemplu, 1 mg de colesterol, va diminua riscul. Pentru date cat mai precise i mai

exacte, este necesar o perioad mai lung pentru investigaii.

BIBLIOGRAFIE-

1. Amstrong TA, Spears JVV, Crenshaw TD, Nielsen FH. Boron supplementation of a semipurified diet for weanling pigs improves feed

efficiency and bone strength characteristics and alters plasma lipid metabolites.J Nutr. 2000;130(10):2575

2581.

2. Armstrong, B. & Doll, R. (1975). Environmental factors and cancer incidence

and mortality in different countries with special reference to dietary practices.

International Journal of Cancer, Vol. 15, pp. 617625.

3. BarrancoWT, Eckhert CD. Boric acid inhibits human prostate cancer cell proliferation. Cancer Lett. 2004;216(1):2129.

4. Barranco, W.T. & Eckhert, C.D. (2006). Cellular changes in boric acid treated

DU145 prostate cancer cells.British Journal of Cancer, Vol. 94, pp. 884- 890.

5. Barranco, W.T.; Hudak, P. & Eckhert, C.D. (2007). Evaluation of ecological and

In vitro effects of boron on prostate cancer risk (United States). Cancer Cause

Control, Vol. 18, pp. 71-77.

5. Barranco, W.T.; Kim, H.T; Stella Jr., S.L. & Eckhert, C.D. (2009). Boric acid

inhibits stored Ca2+ release in DU-145prostate cancer cells. Cell Biology and

Toxicology, Vol. 25, pp. 309-320.

6. Bemd, G.J. & Chang, G.T. (2002). Vitamin D and vitamin D analogs in cancer treatment. Current Drug Targets, Vol. 3, 8594.

7. Bolanos, L, Lukaszewski K, Bonilla I, Blevins D.Why boron? Plant Physiol Biochem. 2004;42:907912.

8 Braunwald E, Mark DB, Jones RH, et al:Unstable Angina: Diagnosis and Management .Clinical Practice Guideline No.10(amended).AHCPR

Publication No.94-0602. Rockville, MD, Agency for Health Care Policy and Research and the National Health, Lung and Blood Institute, Public

Health Service, U.S. Department of Health and Human Services, 1994).

9. Buras, R.; Schumaker, L.M. & Davoodi, F. (1994). Vitamin D receptors in breast cancer cells.Breast Cancer Research and Treatment, Vol.

31, pp. 191202.

9. Castellsague, X.; Bosch, X.F. & Munoz, N. (2002). Environmental cofactors in


35/44

HPV carcinogenesis. Virus Research, Vol. 89, pp. 191-199.

10. Caygill, C.P. & Hill, M.J. (1995). Fish, n-3 fatty acids and human colorectal and breast cancer mortality. European Journal of Cancer

Prevention, Vol. 4, No. 4, pp. 329-332.

11. Caygill, C.P.; Charlett, A. & Hill, M.J. (1996). Fat, fish, fish oil and cancer.

British Journal of Cancer, Vol. 74, No.1, 159-164.

12. Colston, K.W.; Berger, U. & Coombes, R.C. (1989). Possible role for vitamin D in controlling breast cancer cell proliferation. Lancet, Vol. 1,

pp. 185191.

13. Colston, K.W. & Hansen, C.M. (2002). Mechanisms implicated in the growth

regulatory effects of vitamin D in breast cancer,Endocrine Related Cancer, Vol. 9,

pp. 4559.

14. Coughlin JR, Nielsen FH. Advances in boron essentiality research: symposium summary. In: M Abdulla, M Bost, S Gamon, P Arnaud, and G

Chazot (Eds.),New aspects of trace elements research, pp. 3341. London: Smith-Gordon, 1999.

15. Criste RD, Grossu DV, Ciurascu C, Scorei R, Mitrut M. Investigations on the effect of the supplemental Vetabor, boron-enriched protein

concentrate, added to broiler diets on breast meat fatty acids profile. In: 17th European symposium on the quality of poultry meat and 11th

European symposium on the quality of eggs and egg product, May 2326, 2005, pp. 165169. The Netherlands: Doorwerth, 2005a.

16. Criste RD, Grossu DV, Scorei R, Duca RC, Mitrut M, Ciurascu C. New investigations on the effect of the dietary boron on broilers and

layers: boron and food quality. In: 4th international symposium, biology and nutrition of farms animals-towardsintegration in the European

research area, Bucharest, Romania, September 30, 2005b.

17. Deckere, E.A. (1999). Possible beneficial effect of fish and fish n-3 polyunsaturated fatty acids in breast and colorectal cancer. European

determinarea efectului anti-inflammator al fructoboratului de calciu, prin evaluarea unor markeri...

Documents