sorana teodora matei rezumatul tezei de doctorat ... · martor de 15 vaci sănătoase, de vârste...
TRANSCRIPT
______________________________________________________________
Cluj-Napoca
2011
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE
ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
Facultatea de Medicină Veterinară
SORANA TEODORA MATEI
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
DIAGNOSTICUL MAMITELOR
SUBCLINICE LA VACĂ PRIN METODE
DE LABORATOR
Conducător ştiinţific,
Prof. Univ. Dr. IOAN GROZA
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
I
INTRODUCERE
Mamitele subclinice continuă să reprezinte cele mai importante afecţiuni ale
glandei mamare la vacă, cu implicaţii zooeconomice datorită pierderilor mari în producţia
de lapte şi riscul care îl reprezintă laptele infectat pentru sănătatea publică (Tylernw J. şi
Cullor S.J., 2002). Deşi s-au înregistrat progrese importante în controlul şi terapia
mamitelor subclinice, totuşi s-a constatat că rezultatele acestor afecţiuni sunt
suboptimale, frecvenţa acestor afecţiuni fiind în unele efective de animale la nivele
superioare, ceea ce are o influenţă negativă asupra parametrilor de producţie şi implicit
asupra indicilor economici în fermele de vaci cu lapte (dos Santos Nacimento şi col.,
2005).
În acest context, abordarea problemelor ce privesc mamitele subclinice la vaci este
oportună, deoarece cota de participare a României în cadrul pieţei comunitare se va
menţine doar prin creşterea calităţii laptelui care este o necesitate pentru crescătorii de
taurine, producătorii de lapte şi economia românească în general, iar în acest fel se va
putea obţine un lapte conform standardelor Uniunii Europene, care se va putea vinde la
un preţ avantajos. În consecinţă cea mai importantă cale de a produce un lapte de bună
calitate, constă în menţinerea situaţiei mamitelor subclinice sub un control foarte strict
(Krzysztof Urbanek, 2008).
CERCETĂRI PROPRII
SCOPUL CERCETĂRILOR
Dată fiind importanţa acestor afecţiuni, prezenta teză de doctorat îsi propune un
studiu al mamitelor subclinice la vaci privind diagnosticul, epidemiologia şi
repercusiunile stresului oxidative indus de aceste afecţiuni asupra calitaţii laptelui,
obiectivele abordate fiind următoarele:
diagnosticul mamitelor subclinice la vaci, studiul epidemiologic precum şi
implementarea unui program computerizat de supraveghere a sănătăţii glandei mamare;
metode de laborator utilizate în monitorizarea parametrilor stresului oxidativ cu
aplicabilitate în diagnosticul mamitelor subclinice la vaci; studiul modificărilor induse de mamitele subclinice la nivelui compuşilor lipofili ai
laptelui şi impactul asupra calitaţii acestuia.
DIAGNOSTICUL ŞI STUDIUL EPIDEMIOLOGIC AL
MAMITELOR SUBCLINICE LA VACI
SCOPUL CERCETĂRII
Având în vedere incidenţa tot mai crescută a mamitelor subclinice la vaci datorită
tehnologiei de muls, încă precare în fermele din Romania, considerăm ca fiind necesare
cercetări suplimentare în ceea ce priveşte aceste afecţiuni. În consens cu acestea,
obiectivele capitolului se referă la precizarea diagnosticului mamitelor subclinice la vaci
şi studiul epidemiologic care priveşte rolul factorilor extrinseci şi intrinseci ce pot
interveni în producerea mamitelor subclinice ca elemente de risc.
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
II
Cercetările noastre au în vedere actualitatea conform căreia cantitatea şi calitatea
laptelui este de o importanţă deosebită pentru crescătorii, producătorii şi consumatorii de
lapte. Rolul şi importanţa acestui subiect se reflectă asupra implementării unor metode de
control şi dirijare a funcţionării glandei mamare la vaci dar şi asupra unor activităţi legate
de producţie şi reproducţie.
MATERIAL ŞI METODĂ
Cercetările au fost efectuate în perioada 2008–2009 în cadrul a 2 ferme din judeţul
Cluj (Ferma A Şi Ferma B), pe un număr total de 1224 de vaci în lactaţie de rase şi vârste
diferite.
S-au colectat date referitoare la şeptelul de bovine, date privind factorii intrinseci
şi extrinseci care pot interveni ca factori de risc în producerea mamitelor subclinice.
Diagnosticul s-a pus pe baza examenelor efectuat cu indicatorul de mamite Waikato,
metoda R-mastitest, hârtia indicatoare Bovi-vet şi programul AfiFarm.
Dintre factorii extrinseci s-au analizat datele referitoare la condiţiile de întreţinere
din adăposturi şi padocuri, condiţiile de furajare, tehnologia de muls, regimul de
dezinfecţie, acţiuni sanitare veterinare efectuate. În cazul factorilor intrinseci s-a făcut o
analiză detaliată a incidenţei mamitelor în relaţie cu rasele de vaci, sezon, vârsta
animalelor, stadiul lactaţiei, producţia de lapte şi numărul sferturilor afectate în relaţie cu
poziţia anatomică a acestora, respectiv drept anterior, drept posterior, stâng anterior şi
stâng posterior.
REZULTATE ŞI DISCUŢII
În urma diagnosticului de mamite subclinice, efectuat prin metoda Waikato la
Ferma A, au fost depistate în anul 2008 un număr de 56 de vaci, media incidenţei lunară
fiind de 3,45%, iar în anul 2009, media incidenţei luneare a acestor afecţiuni a fost mai
scăzută de 3,27% (51 de vaci), iar la nivelul Fermei B, în urma supravegherii activităţii
glandei mamare prin programul computerizat AfiFarm, au fost diagnosticate în anul 2008
un număr de 25 de vaci din totalul de 485 de vaci aflate în lactaţie, media incidenţei
lunare fiind de 0,42% şi 19 vaci din totalul de 470 de vaci cu o medie lunară de 0,33% în
anul 2009. Cele mai mari valori înregistrate în urma studiului epidemiologic efectuat în
funcţie de factorii intrinseci analizaţi ce pot interveni ca factori de risc în producerea
mamitelor subclinice sunt prezentate în tabelul 1:
Tabel 1
Valorile maxime obţinute în urma studiului epidemiologic
Factori
intrinseci
ANUL 2008 ANUL 2009
Ferma A Ferma B Ferma A Ferma B
Sezon Iunie – August
(4,37% - 5,83%)
Iunie – August
(0,82%-1,23%)
Iunie – August
(4,54% - 6,06%)
Iunie – August
(0,53% - 0,85%)
Rasă M2 (55,35%) - M2 (50,98%) -
Vârstă 4-6 ani (62,50%) 4-6 ani (56,00%) 4-6 ani (56,86%) 4-6 ani(73,68%)
Nr. lactaţii lactaţia 4 (46,42%) lactaţia 4 (48,00%) lactaţia 4 (49,01%) lactaţia 4 (42,10%)
Producţie
lapte >15 l/zi (69,63%) >15 l/zi (72,00%) >15 l/zi (58,82%) >15 l/zi (78,94%)
Sferturi Sferturi posterioare
(69,63%)
Sferturi posterioare
(76,00%)
Sferturi posterioare
(58,82%)
Sferturi posterioare
(84,21%)
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
III
METODE DE LABORATOR FOLOSITE ÎN MONITORIZAREA
PARAMETRILOR STERSULUI OXIDATIV CU APLICABILITATE ÎN
DIAGNOSTICUL MAMITELOR SUBCLINICE LA VACI
SCOPUL CERCETĂRII
Numeroase studii, mai ales pe laptele de vacă, au arătat faptul că modificarea
numărului de celule somatice este în legătură cu modificările care apar în compoziţia
laptelui, această legătură având cel puţin două explicaţii: lezionarea celulelor mamare
care reduce sinteza constituenţilor laptelui în glanda mamară şi modificarea
permeabilităţii membranelor şi spaţiilor interstiţiale care amplifică pasajul unor
componenţi din sânge în lapte.
Scopul acestui capitol îl constituie evidenţierea unor indicatori biochimici ai
stresului oxidativ în lapte provenit de la vaci diagnosticate cu mamite subclinice.
principalele obiective ale acestui capitol fiind:
efectuarea profilului metabolic;
determinarea numarului de celule somatice şi a parametrilor fizico-chimici;
examenul microbiologic;
dozarea proteinelor totale, proteinelor solubile şi cazeinelor din lapte;
determinarea profilului de proteine prin electroforeză monodimensională şi
bidimensională;
determinarea aminoacizilor liberi din lapte;
determinarea statusului antioxidant total din sânge şi lapte;
determinarea nivelului de oxidare al lipidelor şi proteinelor din lapte;
determinarea activităţii antioxidante enzimatice în sânge şi lapte.
MATERIAL ŞI METODĂ
Cercetările au fost efectuate pe parcursul a 3 ani, în perioada 2009 - 2011, în
cadrul Fermei A şi Fermei B. Analizele biochimice au fost efectuate în cadrul Clinicii de
Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară în colaborare cu Disciplina de
Biochimie şi Microbiologie a Facultăţii de Medicină Veterinară din Cluj-Napoca,
Facultatea de Fizică Cluj-Napoca precum şi cu Institutului National de Cercetări
Agronomice INRA Jouy en Josas – Paris, Franţa. În vederea realizării obiectivelor acestui
capitol, vacile luate în studiu au fost împărţite în 3 loturi experimentale. Astfel studiul s-
a efectuat pe un număr de 55 de vaci diagnosticate cu mamite subclinice şi pe un lot
martor de 15 vaci sănătoase, de vârste şi rase diferite. Parametri biochimici efectuaţi şi
metodele de analiză sunt prezentate în tabelul 2:
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
IV
Tabel 2
Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză
Nr.crt. Parametri determinaţi Metode de analiză
1. Profil metabolic Aparat automat Vet Scan
2. Numărul de celule somatice şi parametri fizico-chimici Aparat MT-04, EkoMilk ULTRA
3. Conţinut proteine totale, proteine solubile şi cazeine Metodă fotometrică, reactive Bradford
4. Profil proteic prin electroforeză mono şi bidimenională Dispozitiv BioRad Model-MiniProtean 3 Cell
Dispozitiv Amersham Biosciences Ehan Dalt Six
5. Aminoacizi liberi Tehnica gazcromatografica cu spectrometrie de masă
6. Statusul antioxidant Kituri de analiză de tip Randox TAS
7. Activităţii antioxidante enzimatice
Catalaza - metodă fotometric; kitul CAYMAN
SOD - metodă fotometrică; kit RANSOD
GPx - metodă fotometric; kit de tip RANSEL
LpX - metodă cinetică, spectrofotometrică
8. Nivelul de oxidare al lipidelor şi proteinelor Metodă spectrofotometrică-acid tiobarbituric
Metodă spectrofotometrică-reacţia cu DNPH
REZULTATE ŞI DISCUŢII
În cazul profilului metabolic efectuat, menţionăm faptul că în afară de media
proteinelor totale şi a globulinelor, valorile obtinute s-au încadrat în limitele fizologice
prezentatea în datele de literatură. Datorită acumulării globulinelor din sângele vacilor cu
mamite subclinice, apare o creştere a ptoteinelor totale din sânge, media fiind cuprinsa
între 10,23 g/dl şi 9,14 g/dl in cazul vacilor cu mamite subclinice şi între 7,20 g/dl
respectiv 7,50 g/dl în cazul vacilor sănătoase. Aceste creşteri indică activarea răspunsului
imun datorită infecţiei de la nivelul glandei mamare, proteinele fiind implicate direct în
mecanismul de apărare al acesteia.
Rezultatele determinărilor numărului de celule somatice şi a
parametrilor fizico-chimici
Diagnosticul mamitelor subclinice a fost confirmat şi de numărul mare de celule
somatice din laptele mamitic respectiv modificarea ph-ului şi a punctului de îngheţ faţă
de limitele fiziologice.Rezultatele ne-au indicat o creşterea numărului de celule somatice
la vacile cu mamite subclinice peste norma admisă (<400.000. cel/ml.) media fiind între
740.120 NCS/ml şi 1.077.273 NCS/ml (grafic 1). În ceea ce priveşte pH-ul, acesta a fost
alcalin cu o maximă de 7,55, iar punctul de îngheţ cu o medie între -0,590 şi – 0,630
(grafic 2, 3).
Grafic 1 - Media numărului de celule somatice din lapte
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
V
Grafic 2 - Media punctului de îngheţ din lapte Grafic 3 - Media pH-ului din lapte
Rezultatele examenului microbiologic
În urma prelucrării microbiologice a probelor de lapte s-au putut izola
microorganisme din toate probele obţinându-se 9 specii diferite, din care 7 specii
bacteriene şi 2 tipuri de ciuperci. Speciile bacteriene predominante au fost
Staphylococcus intermedius (45,45%), Streptococcus agalactiae (31,81%) şi Bacillus
cereus (27,27%).
Rezultatele determinării statusului antioxidant din lapte şi
a nivelului de oxidare lipidică
În cazul analizelor bochimice efectuate s-a observat faptul că activitatea
antioxidantă totală a laptelui scade în probele de lapte mamitice comparativ cu cele
normale. Astfel în probele de lapte normal valorile s-au încadrat între 10,30 µmoli/ml şi
11,92 µmoli/ml în timp ce în probele de lapte mamitice media s-a încadrat între 7,75
µmoli/ml şi 8,43 µmoli/ml (grafic 4). Aceste scăderi sunt direct proporţionale degradare
oxidativă a lipidelor. Aşa cum se observă şi din graficul 5, în mamite nivelul de
peroxidare creşte semnificativ. În laptele recoltate de la vaci sănătoase, concentraţia
malonil-dialdehidei (MDA), indice al peroxidării lipidice, a prezentat valori medii
cuprinse între 14,54 nmoli/ml şi 16,84 nmoli/ml, în timp ce în laptele mamitic media
MDA a fost între 38,53 nmoli/ml şi 49,97 nmoli/ml. Mai mult nivelul de peroxidare
lipidică este corelat cu creşterea numărului de celule somatice (grafic 6).
Grafic 4 - Activitatea antioxidanta totală din lapte
Grafic 5 - Variaţia concentraţiei MDA în lapte
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
VI
Grafic 6 - Variaţia concentraţiei MDA şi NCS în lapte
Rezultatele determinării nivelului de oxidare a proteinelor din lapte
În cazul probelor de lapte mamitic, în toate experimentele efectuate, media
concentraţiei proteinelor oxidative a fost mult mai crescută comparativ cu media
înregistrată în cazul vacilor sănătoase, valorile având o medie de aproximativ 12
µmoli/mg la vacile sănătoase şi 19 µmoli/mg în cazul vacilor cu mamite subclinice. Mai
mult există o strânsă legătură între peroxidarea lipidelor şi a proteinelor. Aşa cum se
observă din graficul 7, intensificarea proceselor de peroxidare lipidică duce la o creştere a
proceselor de degradare oxidativă a proteinelor.
Grafic 7 - Intensificarea proceselor de peroxidare lipidică concomitent cu
creşterea concentraţiei proteinelor oxidative
Rezultatele determinării activităţii antioxidante enzimatice din lapte
În ceea ce priveşte determinarea activităţii antioxidante enzimatice, o primă
enzimă determină în lapte a fost lactoperoxidaza (LPx). Această a prezentat creşteri
semnificative în laptele mamitic de la valori medii de 3 U/ml în laptele normal, la cu 5
U/ml în laptele mamitic (grafic 8). Mai mult un număr ridicat de celule somatice în
laptele mamitic este corelat cu o activitate ridicată a lactoperoxidazei (grafic 9).
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
VII
Grafic 8 - Variaţia LPx în lapte
Grafic 9 - Corelaţia dintre LPx şi NCS
Rezultatele determinării activităţii antioxidante enzimatice din lapte şi sânge
Pentru toate perioadele luate în studiu, superoxid-dismutaza (SOD), nu şi-a
modificat semnificativ activitatea nici la nivel sanguin nici în lapte (grafic 10).
Activitatea catalazei spre deosebire de SOD, a prezentat creşteri uşoare în ambele medii
studiate, media activităţii catalazice fiind de aproximativ 1,45 U atât în lapte cât şi în
sângele vacilor sănătoase şi o medie de 2 U în probele prelevate de la vaci cu mamite
subclinice (grafic 11).
Grafic 10 - Media SOD din lapte şi sânge
Grafic 11- Media catalazei din lapte şi sânge
Spre deosebire de enzimele prezentate anterior, glutation-peroxidaza (GPx) creşte
semnificativ în laptele mamitic, atingând valori medii de 60 U, comparativ cu media
obţinută în laptele normal de 23 U (grafic 12).
Grafic 12 - Activitatea GPx din lapte
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
VIII
Am emis astfel 3 ipoteze care ar putea explica această variaţie a activităţii
glutation-peroxidazei:
1-creşterea activităţii acestei enzime în lapte se datorează unei creşterii a
concentraţiei/activităţii la nivel sanguin;
2-în lapte enzima este esociată cu cazeinele, iar procese intensive ale hidrolizării
cazeinelor ar duce la eliberarea acesteia şi deci la creşterea activităţii;
3-enzima poate fi produsă de agenţii patogeni.
Prima ipoteză nu a fost confirmată prin datele de laborator obţinute. Aşa cum se
observă şi din graficul 13, ezima nu îşi modifică activitatea la nivel sanguine valorile
fiind apropiate, având o medie atât în sângele vacilor cu mamite cât şi în sângele vacilor
sănătoase de aproximativ 104 U/g Hb.
Cea de a doua ipoteză, pleacă de la modul în care există această enzimă în lapte,
într-o combinaţie legată de cazeine. Rezulatele obţinute au arătat faptul că în laptele
mamitic nu apar modificări semnificative în conţinutul de protein totale, dar se modifică
raportul dintre cazeine şi proteinele solubile. Din graficul 14 se observă scăderi în
cantitatea de cazeine concomitant cu creşterea conţinutului de proteine din lactoser.
Grafic 13 - Activitatea GPx în lapte şi sânge
Grafic 14 - Variaţia concentraţiei proteinelor
din lactoser şi a cazeinelor
Modificările apărute în profilul proteic al laptelui, au fost evidenţiate şi prin
tehnici de electroforeză. Principalele proteine identificate au fost: lactoferina, BSA-
albumina serică bovină, imunoglobulinele, -cazeina, -cazeina, k-cazeina, -
lactoglobulina şi -lactalbumina. În cazul laptelui normal se observă din figura 1, benzi
intense corespunzătoare cazeinelor, benzi ce scad în intensitate în cazul laptelui mamitic.
Concomitent se observă benzi difuze în regiunea intermediară dintre cazeine şi -
lactoglobulină, zonă ce corespunde produşilor de hidroliză a cazeinelor.
Intensificarea proceselor de hidroliză a cazeinelor, este direct corelată cu numărul
de celule somatice prezente în lapte şi bacteriile patogene. În cazul probelor de lapte
mamitic, intensitatea benzilor din regiunea intermediară este mai mare în cazul celor cu
un număr mai mare de celule somatice („zona b”) comparativ cu cele cu un număr redus
(„zona c”). Intensitatea hidrolizei este dependentă de tipul de agent patogen implicat în
infecţie. Astfel daca se compară zonele b şi d (fig. 2), se observă faptul că numărul de
celule somatice este similar în probe, dar profilul proteic este mult diferit. Astfel proba
corespunzătoare „zonei b” este mai intens hidrolizată la nivelul cazeinelor, în această
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
IX
probă fiind identificată specia Staphylococcus intermedius. Proba corespunzătoare „zonei
d”, în care hidroliza cazeinelor este mai redusă conţine germeni patogeni din specia
Streptococcus agalactiae. Pentru a evidenţia modificările apărute la nivelul proteinelor
din lactoser, am efectuat o analiză electroforetică bidimensională. Prin această analiză am
urmărit profilul proteinelor prezente în lapte de origine sanguină şi anume BSA şi Ig.
Astfel în cazul probelor de lapte mamitic se observă apariţia unor zone intense în cazul
albuminei serice bovine (BSA) şi a imunoglobulinelor în special cele cu catenă lungă
(fig. 3).
Fig. 1 - Proteinele majore identificate
în lapte
Fig. 2 - Corelaţie între profilul de
proteine şi NCS
Figura 3 - Gelurile bidimensionale 2D-PAGE obţinute la separarea proteinelor din lactoser
Rezultatele variaţiei conţinutului de aminoacizi în lapte
În ceea ce priveste conţinutul în aminoacizi totali, acesta creşte semnificativ în laptele
mamitic comparativ cu cel normal. Astfel că pentru toate probele analizate, valorile au
fost de peste 20 de ori mai mari, mediile fiind cuprinse între 12.073 mg/ml şi 10.861
mg/ml în laptele mamitic respectiv 553 mg/ml şi 622 mg/ml în laptele normal.Aceste date
confirmă rezultatele obţinute în analiza profilului de proteine din lapte, creşterea
conţinutului de aminoacizi datorându-se proceselor proteolitice ce apar la nivelul
cazeinelor în mamitele subclinice. Aşa cum reiese din graficul 15, apar variaţii între
diversele tipuri de aminoacizi.
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
X
Grafic 15 - Variaţia conţinutului procentual de aminoacizi în lapte
Cea de a treia ipoteză emisă, se bazează pe mecanismul de acţiune al bacteriilor
patogene care se pot adapta stresului oxidativ prin activarea enzimei glutation-
peroxidază. Studiul statistic ralizat a arătat că există o corelaţie directă între activitatea
glutation-peroxidazei şi creşterea numărului total de germeni (tabel 4).
Tabel 4
Corelarea între activitate enzimei GPx din lapte, numărul de celule somatice, CFU
şi concentraţie cazeinelor din laptele mamitic
Corelare Pearson “r” IC 95% “p” R2
Activitate
GPx
U.mL-1
SCC/mL-1
0,0191 -0,6534 - 0,6748 0,9610 0,00036
CFU/mL-1
0,1785 -0,5511 - 0,7534 0,6459 0,03187
Caseins/mg.mL-1
-0,2606 -0,7884 – 0,4881 0,4983 0,06790
STUDIUL MODIFICĂRILOR INDUSE DE MAMITELE SUBCLINICE LA
NIVELUL COMPUŞILOR LIPOFILI AI LAPTELUI ŞI IMPACTUL ASUPRA
CALITĂŢII ACESTUIA
SCOPUL CERCETĂRII
Plecând de la importanţa nutriţională a compuşilor lipofili prezenţi în lapte, în
cadrul acestui capitol am urmărit evidenţierea modificările induse de mamitele subclinice
în concentraţia vitaminelor liposolubile prezente în lapte, în profilul de acizi graşi şi în
concentraţia colesterolului. Astfel, au fost urmărite etapele generale:
dozarea provitaminelor A din lapte (β-carotină, Carotenoide totale);
dozarea vitaminelor liposolubile din lapte (A - α-retinol şi E - α-tocoferol);
determinarea profilului de acizi graşi din lapte;
dozarea colesterolului total din lapte;
evidenţierea unor corelaţii dintre acestea şi înfluenţa lor în diagnosticul mamitelor
subclinice şi a calităţii laptelui.
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XI
MATERIAL ŞI METODĂ
Cercetările au fost efectuate pe parcursul a trei ani, în perioada 2009 – 2011, pe
probe de lapte mamitic şi sănătos recoltat de la vaci din cadrul Fermei A şi Fermei B.
Analizele biochimice au fost efectuate în cadrul Disciplinei de Reproducţie,
Obstetrică şi Ginecologie Veterinară respectiv Disciplina de Biochimie a Facultăţii de
Medicină Veterinară din Cluj-Napoca. Parametri analizaţi precum şi metodele folosite
sunt prezentate în tabelul 5:
Tabel 5
Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză Nr.
crt. Parametri determinaţi Metode de analiză
1. Determinarea vitaminelor
antioxidante din lapte
Cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă - HPLC
►sistem de pompe Shimadzu LC-20 AT
► detector cu fotodiodă SPD-M20A cu softul de prelucrare a datelor
► injector Rheodyne cu buclă de 20 μl
► coloană Hibar 250-4 Lichrosorb RP18 column (5 μm), 25 cm x 4.6 mm
► faza mobilă - acetonitril: metanol (85:15, izocratic)
2. Determinarea acizilor graşi
şi a colesterolului din lapte
Cromatografia în faza gazoasă
Gaz-Cromatograf Shimadzu GC-2010 cu detector FID;
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Rezultatele dozării provitaminei A din lapte
În studiile efectuate de noi am observat modificări în concentraţia vitaminelor şi
provitaminelor antioxidante din lapte. În cazul provitaminelor β-caroten şi carotenoide
totale, valorile au fost sub limita de detecţie.
Rezultatele dozării vitaminei A şi E din lapte
În ceea ce priveste rezultatele dozării vitaminelor liposolubile din lapte, se observă
din graficul 16, că în toate cele trei experimente efectuate atât în cazul α-retinolului cât şi
a α-tocoferolului, valorile au fost mai scăzute la vacile cu mamite subclinice faţă de
vacile sănătose, cu o medie de 13 µg/ml în ceea ce priveste α-retinolul în laptele mamitic
şi 17 µg/ml în laptele sănătos respectiv 50 µg/ml în cazul α-tocoferolului din laptele
mamitic şi 63 µg/ml în laptele normal. Scăderea concentraţiei acestor vitamine poate fi
explicată tocmai prin exercitarea funcţiei lor antioxidante.
Grafic 16- Variaţia concentraţiei α-retinolului şi α-tocoferolului din lapte
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XII
Rezultatele determinării profilului de acizi graşi şi colesterol din lapte
Analiza comparativă a datelor obţinute în analiza acizilor graşi, relevă faptul că în
probele de lapte mamitic creşte proporţia de acizii graşi în special acid stearic, cu o medie
de aproximativ 65% comparativ cu 57% în laptele normal, concomitent cu o scădere a
acizilor graşi nesaturaţi (grafic 17). Scăderea concentraţiei acizilor graşi nesaturaţi, se
explică prin faptul că principalul substrat al peroxidării lipidice îl constituie dublele
legături prezente în aceşti acizi.
În ceea ce priveşte dozarea colesterolului, în laptele mamitic, conţinutul
acestuia scade uneori chiar şi sub limita de detecţie. Valorile medii din laptele normal au
fost cuprinse între 10,84 mg/100 ml şi 11,20 mg/100 ml lapte, fiind în concordanţă cu
datele prezentate de literatura de specialitate, iar în laptele mamitic între 6,28 mg/100 ml
şi 7,28 mg/100 ml lapte (grafic 18). Scăderea concentraţiei colesterolului în laptele
mamitic nu este un semn pozitiv, deoarece scăderea semnalului corespunzător
colesterolului, uneori sub limita de detecţie, este însoţită de apariţia unui nou semnal, care
corespunde produşilor de oxidare ai colesterolului. Studii recente au demonstrat faptul că
aceşti produşi de oxidare sunt nocivi pentru organismul animal şi uman.
Grafic 17 - Variaţia claselor de acizi
graşi din lapte
Grafic 18 - Media concentraţiei colesterolului
din probele de lapte
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XIII
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI PRACTICE
În urma cercetărilor efectuate în stagiul de pregătire al tezei de doctorat, pot fi
formulate următoarele concluzii generale şi recomandări:
1. supravegherea epidemiologică a mamitelor constituie o componentă majoră a
programelor de control şi combatere a acestor afecţiuni. Studiul epidemiologic aplicat
la nivelul celor două ferme luate în studiu ne-a permis să concluzionăm faptul că
tehnologia de exploatare a vacilor, tehnologia de muls precum şi sistemul de prevenire
a afecţiunilor glandei mamare sunt foarte importante:
● diagnosticul mamitelor subclinice la nivelul celor două ferme luate în studiu, ne-a
permis identificare prin metoda Waikato la ferma A, unui număr de 56 de vaci, media
incidenţei lunare fiind de 3,45% în anul 2008, iar în anul 2009 a unui număr de 51 de
vaci, cu o media a incidenţei lunare de 3,27%, iar prin monitorizarea sănătăţii glandei
mamare cu ajutorul programului Afifarm la ferma B, în perioada 2008-2009, incidenţa
lunară a fost de 0,42% (25 vaci) în anul 2008 respectiv 0,33% (19 vaci) în anul 2009;
● datorită programul AfiFarm, cel mai avansat soft pe plan mondial pentru gestiunea
fermelor de vaci de lapte, putem spune că diagnosticul mamitelor subclinice se pune cu
mult mai mare uşurinţă în condiţiile în care se corelează activitatea dinamică a femelei,
cantitatea de lapte, timpul de muls precum şi conductibilitatea electrică a laptelui;
2. studiul epidemiologic efectuat pe durata a 2 ani, în cadru celor două ferme, a
demonstrat faptul că incidenţa mamitelor subclinice este dependentă de diverşi factori
intrinseci cum ar fi: sezon; rasa şi vârsta animalelor; stadiul lactaţiei şi parametri
productivi ai glandei mamare precum şi poziţia anatomică a sferturilor:
● din punct de vedere a evoluţiei temporale putem spune că există o distribuţie
variabilă de la o lună la alta, incidenţa cea mai mare a fost înregistrată la nivelul ambelor
ferme în lunile de vară (iunie – august) cu valori medii cuprinse între 4,37% şi 6,06% la
Ferma A, respectiv 0,63% şi 1,23% la Ferma B, la polul opus fiind situate lunile din
sezonul rece (octombrie – ianuarie), cu valori cuprinse între 1,45% şi 2,91% la Ferma A,
respectiv 0,00% şi 0,41% la Ferma B;
● procentul cel mai mare a mamitelor subclinice a fost evidenţiat în cazul vacilor din
rasa metis Bălţată românească cu Holstein Friză (55,35 - 2008; 50,98 - 2009), iar cea mai
mică incidenţă au prezentat-o vacile din rasa din rasa Bălţată Românească (14,28% - 2008;
21,56% - 2009);
● analizând frecvenţa mamitelor subclinice la vaci în raport cu vârsta, la nivelul
ambelor ferme incidenţa cea mai mare pe perioada cercetărilor a fost întâlnită la vacile
încadrate în categoria 4-6 ani (62,50%; 56,85% - Ferma A; 56,00%; 73,68% - Ferma B),
iar cea mai mică la vacile sub 3 ani (12,50%; 17,64% - Ferma A; 12,00%; 5,26% - Ferma
B);
● studiul epidemiologic al mamitelor subclinice la vaci efectuat în raport cu stadiul
lactaţiei a arătat că apariţia acestor afecţiuni este direct proporţională cu numărul de
lactaţii, astfel că în ambele perioade studiate la cele două ferme, frecvenţa cea mai mare a
fost înregistrată la vacile aflate în a 4-a lactaţie (46,42%; 49,01% - Ferma A; 48,00%;
42,10% - Ferma B) iar cea mai mică incidenţă a fost înregistrată la vacile aflate la prima
lactaţie (8,92%; 11,76% - Ferma A; 12,00%; 10,52% - Ferma B);
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XIV
● au fost evidenţiate corelaţii directe între producţia de lapte şi incidenţa mamitelor
subclinice. Astfel, atât în anul 2008 cât şi în anul 2009 incidenţa cea mai mare a fost
înregistrată la vacile cu producţii mai mari de 15 l/zi (69,63%; 58,82% -Ferma A;
72,00%; 78,94% - Ferma B);
● analiza globală a rezultatelor obţinute pe perioada de monitorizare, referitoare la
sferturile afectate în funcţie de poziţionarea anatomică a acestora, a arătat că frecvenţa
cea mai mare o prezintă vacile cu sferturile posterioare afectate (69,63%; 58,82% -Ferma
A; 76,00%; 84,21% - Ferma B), în timp ce în cazul sferturilor anterioare frecvenţa este
mult mai mică (30,35%; 41,17% - Ferma A; 24,00%; 15,78% - Ferma B);
3. s-a efectuat un studiu biochimic complex prin care s-a urmărit evidenţierea
unor indicatori biochimici ai stresului oxidativ în lapte provenit de la vaci
diagnosticate cu mamite subclinie, indicatori ce pot fi utilizaţi în laborator pentru
diagnosticarea mamitelor încă în faza subclinică:
● rezultatele parametrilor metabolici efectuaţi au relevat valori fiziologice atat în cazul
vacilor sănătoase cât şi în cazul vacilor cu mamite subclinice, cu excepţia proteinelor
totale şi a globulinelor:
- media proteinelor totale (9,14 g/dl-E1; 10,23 g/dl-E2; 9,20 g/dl-E3) şi a globulinelor
(5,76 g/dl-E1; 5,44 g/dl-E2; 5,80 g/dl g/dl-E3) în cazul vacilor cu mamite subclinice a
fost mult mai crescută comparativ cu media proteinelor totale (7,50 g/dl-E1; 7,20 g/dl-E2;
7,60 g/dl-E3) şi a globulinelor (3,95 g/dl-E1; 4,10 g/dl-E2; 3,78 g/dl-E3) din sangele
vacilor sănătoase;
● determinarea numărului de celule somatice din lapte a scos în evidenţă depăşirea
limitelor acestora în probele mamitice şi valori normale la probele prelevate de la vaci
sănătoase, animalele considerate sănătoase au prezentat valori ale SCC cuprinse între
120 şi 300 SCCx10-3
mL- în timp ce limitele numărului de celule somatice în cazul
vacilor cu mamite subclinice au fost cuprinse între 500 şi 1.500 SCCx10-3
mL-;
● determinarea parametrilor fizico-chimici din laptele mamitic cu ajutorul aparatului
Ekomilk Ultra a evidenţiat, la toate cazurile, modificarea în deosebi a valorilor pH-ului şi
a punctului de îngheţ în cazul probelor mamitice. În toate probele de lapte mamitic
analizate media punctului de îngheţ a fost mai scăzută cuprinsă între -0,6300C, iar pH-ul a
prezentat valori cu mult peste limitele normale admise (6,5-6,7 la 20 0C), fiind situat în
domeniul alcalin cu o medie de 7,55;
● examenul microbiologic al probelor de lapte mamitic a arătat existenţa în laptele
mamitic a unui număr de 7 specii bacteriene şi 2 tipuri de ciuperci. Speciile bacteriene
predominante au fost Staphylococcus intermedius (45,45%), Streptococcus agalactiae
(31,81%) şi Bacillus cereus (27,27);
● concentraţia şi profilul proteinelor specifice laptelui se modifică în cazul mamitelor
subclinice:
- în cazul proteinelor totale pentru laptele recoltat de la vacile sănătoase valorile s-au
încadrat în limitele date de literatura de specialitate (30,52 mg/ml-E1; 30,45 mg/ml-E2;
30,43 mg/ml-E3). În cazul laptelui mamitic, concentraţia în proteine totale (29,61 mg/ml-
E1; 29,88 mg/ml-E2; 30,04 mg/ml-E3), nu s-a modificat semnificativ comparativ cu
laptele normal în schimb apar variaţii importante în cazul proteinelor solubile şi a
cazeinelor;
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XV
- în probele de lapte provenit de la vaci diagnosticate cu mamite sublinice apare o
creştere a concentraţiei proteinelor solubile (proteinele din lactoser) (12,03 mg/ml-E1;
12,43 mg/ml-E2; 12,22 mg/ml-E3) faţă de probele de lapte normal (8,08 mg/ml-E1; 8,02
mg/ml-E2; 8,11 mg/ml-E3) concomitent cu scăderea concentraţiei în cazeine în (lapte
mamitic: 16,57 mg/ml-E1; 16,69 mg/ml-E2; 17,12 mg/ml-E3; lapte normal: 22,42
mg/ml-E1; 22,39 mg/ml-E2; 23,11 mg/ml-E3);
-în cazul laptelui mamitic s-au observat scăderi ale concentraţiei cazeinelor
concomitent cu creşterea concentraţiei proteinelor solubile de origine sanguină, în cazul
albuminei serice bovine şi a imunoglobulinelor. Aceste variaţii apărute în profilul proteic
sunt direct corelate cu numărul de celule somatice prezente în lapte şi numărul total de
germeni respectiv tipul de patogen care a determinat infecţia;
- patogenii implicaţi în infecţie eliberează enzime proteolitice cu specificitate diferită
faţă de cazeine (ceea ce explică hidroliza lor diferită) iar organismal reacţionează la
aceste infecţii printr-un răspuns imun similar (fapt ce explică prezenţa în cantităţi similare
a lactoferinei, BSA şi imunoglobulinelor);
- intensificarea proceselor hidrolitice la nivelul cazeinelor laptelui (fapt demonstrat prin
scăderea concentraţiei cazeinelor, substratul preferat al proteazelor eliberate de agenţii
patogeni implicaţi în infecţiile glandei mamare) determină creşterea accentuată a
conţinutului în aminoacizi liberi în laptele mamitic (12.073,06 µg/ml-E1; 11.150,37
µg/ml-E2; 10.861,74 µg/ml-E3) comparativ cu cel normal (619,82 µg/ml-E1; 553,97
µg/ml-E2; 622,45 µg/ml-E3), pentru toate probele analizate, valorile fiind de peste 20 de
ori mai mari ca urmare a proceselor proteolitice ce apar la nivelul cazeinelor;
● activitatea antioxidantă totală a laptelui a prezentat modificări semnificative, în cazul
probelor mamitice comparativ cu cele normale. Laptele provenit de la vaci cu mamite
subclinice prezintă o activitate antioxidantă scăzută (8,43 µmol/mL-E1; 7,75 µmol/mL-
E2; 8,28 µmol/mL-E3) faţă de laptele normal (10,39 µmol/mL-E1; 11,92 µmol/mL-E2;
11,24 µmol/mL-E3) ceea ce duce la acumularea speciilor reactive de oxigen şi instalarea
stresului oxidativ, fiind observată o corelaţie corelaţie directă între nivelul statusului
antioxidant (8,43 µmol/mL-E1; 7,75 µmol/mL-E2; 8,28 µmol/mL-E3) şi severitatea
infecţiei respectiv numărul de celule somatice prezente în lapte (1077,273 SCCx10-3
mL-
- E1; 900,875 SCCx10-3
mL- - E2; 740,120 SCCx10
-3 mL
- - E3);
● stresul oxidativ apărut la nivelul glandei mamare infectate şi a laptelui provenit de la
vaci cu mamite subclinice a fost demonstrat prin creşterea concentraţiei produşilor de
degradare oxidativă a lipidelor şi proteinelor laptelui:
- concentraţia malonildialdehidei, indice al peroxidării lipidice a fost mult crescută în
probele de lapte mamitic (48,97 nmoli/ml-E1; 43,89 nmoli/ml-E2; 38,53 nmoli/ml-E3)
comparativ cu cel normal (16,84 nmoli/ml-E1; 15,60 nmoli/ml-E2; 14,54 nmoli/ml-E3);
- s-a demonstrat faptul că pentru toate probele de lapte prelevat de la vaci cu mamite
subclinice, intensificarea proceselor de peroxidare lipidică duce la o creştere a
concentraţiei proteinelor carbonilate (lapte mamitic-19,16 µmoli/mg-E1;19,06 µmoli/mg-
E2; 18,93 µmoli/mg-E3; lapte normal: 12,17 µmoli/mg-E1; 12,32 µmoli/mg-E2; 12,14
µmoli/mg-E3), deci la o creştere a gradului de degradare oxidativă a proteinelor;
● la vacile cu mamite subclinice apar variaţii diferite în activitatea enzimelor
antioxidante prezente la nivel sanguin şi în lapte:
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XVI
- în cazul catalazei (lapte mamitic: 2,12 U/ml-E1; 2,09 U/ml-E2; 2,07 U/ml-E3; lapte
normal: 1,55 U/ml-E1; 1,56 U/ml-E2; 1,45 U/ml-E3) şi superoxid-dismutazei (lapte
mamitic: 1,065 U/ml-E1; 1,066 U/ml-E2; 1,050 U/ml-E3; lapte normal: 1,044 U/ml-E1;
1,041 U/ml-E2; 1,036 U/ml-E3), s-au observat creşteri uşoare în laptele provenit de la
vaci cu mamite comparativ cu vacile sănătoase, activitatea acestor enzime nefiind
corelată cu creşterea numărului de celule somatice din lapte;
- în cazul mamitelor subclinice nivelul lactoperoxidazei creşte în laptele de vacă
(5,30 U/ml-E1; 5,28 U/ml-E2; 5,21 U/ml-E3) comparativ cu laptele provenit de la
vacile sănătoase (3,23 U/ml-E1; 3,25 U/ml-E2; 3,16 U/ml-E3) fiind astfel stabilită o
corelaţie directă între creşterea lactoperoxidazei şi creşterea numărului de celule
somatice din probele de lapte;
● s-a evidenţiat o creştere semnificativă a activităţii glutation-peroxidazei din laptele
mamitic (60,37 U/ml-E1; 60,32 U/ml-E2; 60,14 U/ml-E3), valorile înregistrate fiind
semnificativ statistic crescute comparativ cu laptele normal (23,09 U/ml-E1; 23,02 U/ml-
E2; 22,94 U/ml-E3), în schimb ce în sânge nu prezintă modificări în ceea ce priveşte
laptele mamitic sau laptele sănătos:
- creşterea activităţii enzimei în laptele mamitic este statistic corelat cu numărul de
celule şi numărul total de germeni; creşterea activităţii enzimatice a fost explicată, în
primul rând prin hidroliza complexului cazeine-enzimă, care conduce la eliberarea acestei
enzime şi, pe de altă parte, mecanismele de apărare antioxidante specifice agenţilor
patogeni;
4. în urma studiul ce a urmărit modificările induse de mamitele subclinice la
vaci la nivelul compuşilor lipofili ai laptelui şi impactul asupra calităţii acestuia putem
concluziona următoarele:
● concentraţia provitaminelor şi vitaminelor liposolubile antioxidante studiate, prezintă
scăderi semnificative în laptele provenit de la vaci diagnosticate cu mamite în fază
subclinică comparativ cu cele sănătoase. Β-carotinele şi carotinoidele totale, au fost sub
limita de detecţie iar concentraţia vitaminelor liposolubile antioxidante studiate (retinol:
13,87 µg/100ml-E1; 12,97 µg/100ml-E2; 13,45 µg/100ml-E3 şi tocoferol: 50,27
µg/100ml-E1; 50,45 µg/100ml-E2; 49,86 µg/100ml-E3) prezintă scăderi semnificative în
laptele provenit de la vaci diagnosticate cu mamite în fază subclinică comparativ cu cele
sănătoase (retinol: 17,26 µg/100ml-E1; 17,63 µg/100ml-E2; 17,32 µg/100ml-E3 şi
tocoferol: 63,60 µg/100ml-E1; 64,11 µg/100ml-E2; 63,70 µg/100ml-E3). Scăderea
vitaminelor este explicată tocmai prin exercitarea funcţiei lor antioxidante;
● studiul comparativ al profilului de acizi graşi în lapte mamitic şi normal a relevat
faptul că laptele mamitic conţine proporţii mai ridicate din acizii graşi saturaţi cu catenă
scurtă C10 – C14, şi de acid stearic (66,85%-E1; 61,00%-E2; 67,85%-E3 ) comparativ cu
laptele normal (60,60%-E1; 56,60%-E2; 59,64%-E3), în schimb am putut remarca o
proporţie mai mică de acizi nesaturaţi;
● mamitele subclinice determină apariţia unor modificări calitative şi cantitative la
nivelul colesterolului total prezent în lapte. În laptele mamitic apare o scădere a
concentraţiei colesterolului total (6,28 mg/100 ml-E1; 6,87 mg/100 ml-E2; 7,28 mg/100
ml-E3), concomitent cu apariţia produşilor de oxidare ai colesterolului.
„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”
TEZĂ DE DOCTORAT
XVII
RECOMANDĂRI
Având în vedere faptul că laptele de calitate bună (număr mic de celule somatice
şi număr total de germeni) are un preţ de livrare mai bun, decât cel în care aceste
elemente sunt în cantitate mare, diagnosticul precoce al mamitelor subclinice trebuie
să reprezinte o prioritate pentru fiecare fermier, prevenţia apariţiei mamitelor clinice
ducând la evitarea pierderilor economice cauzate de costurile terapeutice ale acestor
afecţiuni primare. Supravegherea activităţii de reproducţie şi implicit a performanţei
glandei mamare presupune folosirea unui program cât mai eficient, lucru care duce la
creşterea duratei de exploatare a vacilor de lapte, a performanţelor acestora cu preţuri
de cost mai scăzute. Aceste aspecte prezentate în corelaţie cu rezultatele obţinute în
urma cercetărilor epidemiologice efectuate de noi, ne permite să recomandăm
implementarea unui nou program performant de supravegere a sănătăţii glandei
mamare, cum ar fi programul Afifarm, în toate fermele din Romania.
Studiul biochimic a demonstrat faptul că, încă în faza subclinică, infecţiile
mamitice determină apariţia stării de stres oxidativ. Aceasta se manifestă atât la nivelul
sângelui cât şi în laptele secretat de glanda mamară infectată. Până la ora actuală
datele din literatura de specialitate propun trei parametri ai stresului oxidativ ce pot fi
aplicaţi în laboratoare pentru diagnosticarea mamitelor subclinice la vaci:
lactoperoxidaza şi catalaza (din categoria enzimelor antioxidante) respectiv nivelul de
peroxidare al lipidelor. Toţi aceşti indici sunt în legătură directă cu creşterea
numărului de celule somatice din lapte. Rezultatele obţinute în studiul de faţă le
considerăm de interes, deoarece am reuşit stabilirea unor noi corelaţii între activitatea
enzimei glutation-peroxidază şi numărul de celule somatice în laptele recoltat de la
vacile cu mamite subclinice (până în la ora actuală nu au fost identificate date de
literatură care să prezinte aceste corelaţii). Mai mult, prin analizele suplimentare
efectuate (analize microbiologice respectiv determinarea profilului de proteine din
lapte) am demonstrat mecanismele care determină creşterea activităţii acestei enzime
în lapte.
Astfel, în urma cercetărilor efectuate considerăm că, din punct de vedere al
stresului oxidativ, au fost identificaţi doi indici noi care pe viitor ar putea fi utilizaţi în
laboratoare pentru un diagnostic precoce al mamitelor subclinice la vaci – activitatea
glutation-peroxidazei şi concentraţia proteinelor carbonilate.
Analizele efectuate au demonstrat faptul că, din punct de vedere al calităţii,
laptele provenit de la vaci cu infecţii subclinice prezintă modificări drastice, cu impact
asupra valorii nutriţionale a acestuia. Astfel, creşterea numărului de celule somatice
din lapte determină scăderi accentuate ale concentraţiei provitaminelor A şi a
vitaminelor liposolubile A şi E precum şi a nivelului de acizi graşi esenţiali, toate
aceste componente fiind factori nutriţionali esenţiali pentru creştere şi metabolism la
om şi animale.
De asemenea, din punct de vedere toxicologic, consumarea unor alimente ce
conţin produşi de oxidare ai acizilor graşi şi colesterolui (deci şi lapte provenit de la
vaci cu mamite subclinice, ce ajunge frecvent în alimentaţie) trebuie evitat. Astfel de
compuşi pot avea efecte negative, ei fiind consideraţi citotoxici şi chiar mutageni.