1

Populaţiile Limfocitare

Markerii de Suprafaţă

CURSUL VIII

2

• Limfocitele reprezintă 25-35%, aprox 1500-3000 de elemente pe mm³, din totalul elementelor figurate sanguine. Din pdv morfologic ele pot fi împărţite în:

• Limf mici, care sunt populaţia limfocitară majoritară, 80-85%, cu diametre de 6-9 m, raportul nucleu / citoplasmă > ca 1. În această categorie se includ limf B şi T

• Limf mari, 15-20% din total, au diametrul de 10-15 m,raportul nucleu /citoplasmă > ca 1 , dar citoplasma este mai bine reprezentată, conţine granulaţii azurofile evidente în microscopie: se numesc LGL (Large Granular Lymphocytes). În această categorie includem cel NK (natural killer)

3

• Distincţia dintre Ly T şi Ly B nu se face pe

criterii morfologice, ci cu ajutorul unui test

funcţional: testul rozetării.

• Principiu: punând în contact Ly, separate

într-o etapă anterioară prin gradient ,cu

eritrocite de berbec sau oaie, singurele care

formează conglomerări celulare şi reacţionează

sunt Ly T, formând „rozete”.

• Ly T rozetează pt că ele prezintă pe

suprafaţă receptori de adeziune celulară, cel

mai important fiind CD2.

4

• Ly T nu sunt omogene ca clasă celulară, ci este

vorba de o populaţie heterogenă,cu 4 subtipuri :

• limfocitele T helper (Ly Th)

• limfocitele T supresoare (Ly Ts)

• limfocitele T contrasupresoare (Ly Tcs)

• limfocitele T citotoxice (Ly Tc).

• Nu sunt diferite morfologic, distincţia se face

prin metoda de flaucitometrie, sau citometrie

în flux: evidenţierea cu ajutorul Ac monoclonali

a unor receptori ce sunt markerii definitorii la

suprafaţa Ly T.

5

Ly T şi Markerii de suprafaţă

Caractere generale

• Ly T reprezintă populaţia limfocitară majoritară,

60-80% din Ly aflate în sângele periferic, au

durata de viaţă lungă sau f lungă, de rândul

anilor sau zecilor de ani.

• Sunt celule intens recirculante, parcurg anumite

circuite în căutarea Ag pt care sunt genetic

construite. Testul rozetării permite

identificarea Ly T, numărătoarea globală a Ly

T, separarea de alte Ly prin centrifugare.

6

Markerii de suprafaţă ai

receptorilor definitorii

• CD este nomenclatura de catalog a receptorilor

de suprafaţă şi înseamnă „clasă de

diferenţiere”. Alte titulaturi descriptive sunt:

• LFA = antigen asociat funcţiei leucocitare

• ICAM = molecule de adeziune intercelulară

• VLA = antigen cu apariţie foarte târzie

7

Receptorii de recunoaştere antigenică

• Caracterele recunoaşterii antigenice efectuate de Ly T:

• Ly T recunosc Ag numai după structura lor primară

• Ly T recunosc Ag după secvenţa aminoacidică a epitopilor, nu recunosc Ag după conformaţia în spaţiu

• Ly T recunosc doar Ag prezentate în complex cu moleculele MHC pe suprafaţa APC

• Ly T nu recunosc niciodată Ag în stare solubilizată

• Recunoaşterea este asociativă

8

Complexul TCR-CD3

• Pe membrana unui Ly T aflat în repaus se află între 60 şi 100 de mii de asemenea complexe.

TCR

• Este un heterodimer, are 2 lanţuri diferite ce se

asociază între ele: un lanţ cu greut de 45 kd, genele

ce codifică acest lanţ se află pe cro 7 şi un lanţ , cu greut de 40 kd, genele ce codifică acest lanţ se află pe cro 14

• Lanţurile şi sunt transmembranare, capetele C

(carboxi-terminale) se află în interiorul celulei, astfele se

separă 3 segmente cu funcţii distincte: extracelular,

transmembranar, intracitoplasmatic.

• Segmentul extracelular: are dispoziţie Ig-like, cu 2

bulcle şi 2 domenii, cu aproximativ 110 aminoacizi.

9

• Cele 2 bulcle sunt constituite din secvenţe

aminoacidice hipervariabile şi se numesc V

(variabil ) şi respectiv V, iar celelalte 2 bucle (situate spre

membrană) au secvenţe constante, numindu-se C şi

C. V şi V sunt alcătuite dintr-o cavitate ce

se mai numeşte şi situsul combinativ pt Ag.

• Domeniile V, V nu angajează legături prin

întreaga lor secvenţă,ci doar prin mici segmente

de 8-15 AA ce provin în urma plicaturării V,

V şi protruzionând către interiorul cavităţii,

această secvenţă se combină cu Ag prin potrivire: regiuni determinante ale complementarităţii = CDR

10

.

11

12

• Cele 6 CDR angajează legături diferenţiate cu

moleculele de Ag, cooperează cu APC ce

prezintă un epitop pe moleculele MHC.

• CDR 1 şi CDR 2 angajează legături cu molec

MHC, recunoscând doar domeniile polimorfe (din MHC 1 domeniile 1, 2, din MHC 2 domeniile 1, 1).

CDR 3 angajează legături cu epitopul.

• Prin TCR se recunosc şi MHC şi epitopul,

deci se face o recunoaştere antigenică

asociativă intrareceptorială.

13

14

• Lanţurile şi se asociază cu legături disulfurice,

de aceea se formează heterodimerul, şi rezultă o

porţiune dotată cu maximum de mobilitate (baleiere), ce

favorizează recunoaşterea antigenică,numită zona

balama (hinge engl)

• Segmentul transmembranar are 22-25 de

aminoacizi, cu dispoziţie helicoidală.

• Segm intracitoplasmatic este f scurt, are 5-12 AA

• TCR are rol în recunoaşterea antigenică, este

responsabil pt generarea unor semnale

activatoare, centripete, către centrul celulei, către

sist enzimatice. Transducţia semnalului se face

prin complexul CD 3

15

16

• Este un complex pentameric, cu 5 lanţuri

transmembranare, dintre care 3 lanţuri scurte

cu 20-25 kd greutate, genele codificatoare pe

cro 11, denumite (khi), , şi 2 lanţuri identice, f

subţiri, efilate, lungi, ce pătrund mult în Ly T, cu

greutatea de 16 kd, genele codificatoare pe cro

1, numite (zeta).

• În realitate , prin asocierea TCR-CD3 se

formează un complex heptameric, cu CD 3

responsabil de transducţia semnalelor către

sistemul enzimatic de profunzime.

17

CD 4

• Este distribuit caracteristic pe Ly Th , care se numeşte

şi Ly T CD 4+. Este o glicoproteină transmembranară,

exprimată pe cro 12,cu capul N(amino-terminal) extracelular.

Segmentul extracelular are 4 bucle de AA, are

segment transmembranar şi intracelular f. lung.

Funcţiile:

• Prin segmentul extracel se produce cooperarea dintre

Ly Th şi APC, CD4 angajând legături cu molec MHC

II şi recunoscând domeniul monomorf MHC II (2).

• Prin segmentul intracitoplasmatic are rol în activarea

Ly Th, are contact fizic cu o enzimă importantă:

protein kinaza p56 (PK56), numită şi kinaza

specifică leucocitelor (lck).

18

CD 8

• Este prezent pe suprafaţa Ly Tc, Ly Ts,

numite şi Ly T CD8+.

• Este o glicoproteină transmembranară,

heterodimerică, cu greutate de 72 kd, genele

codificatoare sunt pe cro 2, lanţurile se numesc

, , cu segmente intracelulare f. lungi.

Funcţiile:

• Segmentul său extracelular, cu 2 bucle , ,

face cooperarea dintre Ly Tc sau Ly Ts, şi APC,

realizându-se legături cu moleculele MHC I

prerzente la suprefaţa APC, se recunoaşte

domeniul monomorf 3.

19

20

Recunoaşterea asociativă

21

• Recunoaşterea asociativă este dublă,

intrareceptorială şi interreceptorială: prima este

între TCR şi CD3, iar a doua este între TCR şi

CD4 sau CD8.

• Complexul angajează un nr de 2 legături cu Ag:

prin TCR cu CDR3 V, CDR 3 V; 4 legături

prin TCR cu CDR 1 V, V, cu CDR 2 V, V şi

încă o legătură cu CD4 sau CD8 deci 5 legături.

• În concluzie Ly T este mai interesat de

structurile prezentatoare de Ag decât de Ag.

• În realitate Ly T recunosc doar Ag membranare,

iar din totalitatea lor doar anumite categorii.

22

23

Concluzii:

• Ag ataşate sunt recunoscute de Ac

• Ag constitutive sunt recunoscute de Ac, celule NK

• Ag prezentate de MHC sunt recunoscute doar

de Ly T

• Ly T recunosc numai Ag prezentat de MHC

• În funcţie de MHC se dau răspunsuri imune

diferite: MHC I RIU; MHC II şi MHC II RIC

24

Receptorii cu rol accesor în activarea Ly T CD28

25

• CD28 se află pe suprafaţa Ly Th şi Ly Tc, este

o glicoproteină transmembranară, cu greutatea

de 50 kd, homodimer.

• Poatre fi activat în momentul în care angajează

legături cu un contraligand prezent pe suprafaţa

APC: CD80, rezultând semnale activatoare. Cd

28 este responsabil de stimularea

interleukinelor, citokinelor, Ly Th, Ly Tc .

• Rezultatul stimulării CD28 este stabilităţii

ARN mesager pt interleukine şi citokine.

26

CD45

• Este o glicoproteină transmembranară, cu

greutate de 180-240 kd, prezent pe membrana

tuturor celulelor de origine hematogenă, cu

excepţia eritrocitelor şi a plachetelor.

• Pe membrane Ly Teste foarte bine reprezentat,

ca suprafaţă atinge cam 10% din membrană.

• Se află în complex cu lanţurile (csi) din CD3,

deci se activează în urma activării CD3 şi

devine o protein fosfatază ce împreună cu

protein kinaza formează un cuplu f activ (protein tirozin

fosfatază).

27

Receptori de adeziune intercelulară

Au ca funcţie majoră stabilirea de contacte

între APC şi Ly T , fapt important pt cooperările

dintre aceste celule.

28

CD2

• Este prezent pe toate Ly T, este prezent şi pe celulele NK.

• Este o glicoproteină transmembranară, cu greut de 50 kd, în segm extracelular are 2 bucle, un segment intracelular f lung.

• Funcţiile segmentului extracelular sunt acelea de contact cu un contraligand reprezentat de LFA3 (CD58) o legătură prin complementaritate.

• Are contribuţie în pregătirea activării Ly T, prin segmentul intracelular ce se află în contact cu fosfolipaza C.

• Activarea se face astfel: modificarea conformaţională de segment intracelular CD2 ce produce alunecarea PLC spre suprafaţa membranei unde activează cascada inozitol hexafosfat(IP6) şi aşa mai departe.

• CD2 este prezent pe suprafaţa Ly T numite naive, adică cele care nu au întâlnit încă antigenul.

• Cuplul CD2-LFA3 este considerat un cuplu de adeziune celulară de linia I, adică sunt primele legături celulare între APC şi Ly T, având o f mare afinitate între receptori.

29

LFA1

• Este un heterodimer, cu un lanţ (CD11a), cu greutate de 95 kd şi un lanţ (CD18) cu greut de 180 kd; cele 2 lanţuri prezintă câte 2 bucle aşezate simetric

Funcţia:

• LFA1 are legături cu moleculele din clasa ICAM , este un receptor de adeziune larg întâlnit: pe Ly T, mai ales pe cele cu memorie, Ly B, celule Nk, membrana PMN.

• Cuplul de adeziune LFA1 – ICAM este un cuplu de linia a doua, sunt legături instabile, LFA1 are afinitate scăzută pt ICAM dacă Ly T este neactivat.

30

Funcţiile receptorilor de adeziune:

• Receptorii de adeziune permit contacte intime

între membranele celulare permiţând

cooperarea intercelulară, sunt învinse forţele

de respingere electrostatică.

• Aceste cupluri realizează un efect de fermoar,

apoziţie intimă pe suprafeţe f mari, permite o

cooperare intimă,favorizează net recunoaşterea Ag

• Datorită apoziţiei receptorii MHC şi TCR

difuzează prin membrană până ajung faţă în

faţă.

31

Clasificarea fenotipică a Ly T

Ly T CD3 CD4 CD8 CD28

Ly Th + + - +

Ly Tc + - + +

Ly Ts + - + -