8/8/2019 Curs IHC 01

1/30

Antigene si anticorpi

Principiulmetodei IHC

Panelul minim de

anticorpiDr. Mihai Ceausu

Nu este Salvador DaliNu este Salvador Dali

8/8/2019 Curs IHC 01

2/30

Istoric

1941 - Coons et al. - tehnica imunofluorescentei 1970 - L. Sternberger - metoda PAP (a complexelor

imune circulante)

1974 - Taylor & Mason - tehnica imunoenzimatica 1981-1983 - Hsu et al. - metoda ABC, modificata

de Bussolati & Gugliotta

1996 - DAKOEn VisionTM

Systems - metodadextranului

2000 - metoda amplificarii cu tiramina (Sigma) -

dupa Kerstens et al. (1995)

8/8/2019 Curs IHC 01

3/30

8/8/2019 Curs IHC 01

4/30

Antigenul

Ag este orice substanta de origine exo- sau endogena, capabila sa declanseze unraspuns imun care, consta din stimularea si proliferarea celulelor antigen specifice si

sinteza unor molecule de recunoastere (anticorpi sau receptori) ce au capacitatea de

a se combina specific cu antigenul inductor.

8/8/2019 Curs IHC 01

5/30

Proprietatile antigenelor

Imunogenitate =capacitatea Ag de a

declansa raspunsul

imun

Specificitate =

capacitatea Ag de a

reactiona strict cu

produsele sistemului

imun (Ac) sau Ac

preformati

Dubla reactie IHC pentru lanturi k si P

intr-un folicul limfatic reactiv (secventiere

HRP / APAP)

8/8/2019 Curs IHC 01

6/30

PanCK (KL1 vs MNF116)

HMFG vs EMA

KL1

HMFG - CDI

EMA - TD

MNF116 MTS

8/8/2019 Curs IHC 01

7/30

Anticorpul in imunohistochimie Este o molecula ce se

combina specific cu un Ag

pe baza unei recunoasteri3-D a epitopului antigenic

(mecanism cheie -

broasca)

Fiecare Ag nativ are mai

multi epitopi recunoscuti

de Ac diferiti

Dubla coloratie Cromo / PgR in CDI

cu diferentiere neuroendocrina

8/8/2019 Curs IHC 01

8/30

Structura generala a anticorpilor

Planul structural unic al oricarei

molecule de Ig este unitatea tetra-

catenara, formata din 4 lanturi : 2

grele (H = heavy chains) si 2

usoare (L = light chains), soli-

darizate prin punti disulfurice

Fc = fragment crystalisable;

rol in specificitatea

antigenica si activarea

complementului

Fab = fragment antigen

binding; rol in recunoasterea

si legarea Ag la nivelul

situsului combinativ

8/8/2019 Curs IHC 01

9/30

Ac monoclonali versus Ac policlonali

Acm este un Ac idiotipic specific pentru un singur

epitop produs de o clona de plasmocite hibride

Acp este un antiser ce contine specii diferite de Ac

cu afinitati variabile, in cursul unei imunizari

Acm HPV

Acp BPV

8/8/2019 Curs IHC 01

10/30

Acm versus Acp

Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali

peci icitate (+) ensibilitate (+)

eactie de ond (-) eactie de ond (+)

u coloreaza celulesuplimentare

oloreaza celulesuplimentare

arkeaza putine structurihistologice asemanatoare

arkeaza mai multestructuri histologice

asemanatoare

8/8/2019 Curs IHC 01

11/30

Proprietatile Ac

Specificitatea

Afinitatea si aviditatea

Echivalenta

8/8/2019 Curs IHC 01

12/30

Specificitatea si reactia incrucisata

Este o reactie de cuplare a Ag cu Ac printr-un

mecanism de tip cheie-broasca, pe bazacomplementaritatii epitop-paratop, ale caror

suprafete se adapteaza reciproc

8/8/2019 Curs IHC 01

13/30

Afinitatea

Afinitatea evalueaza o

reactie de tip epitop-

paratop sau intre Fab

si haptena

Afinitatea mare

implica o adaptare

mare a suprafetelorFab - epitop

Atractie inalta Repulsie inalta

(adaptare mare) (adaptare mica)

Afinitatea =Afinitatea = 77Fa + FrFa + Fr; Fa - forta

de atractie, Fr -forta de respingere

epitop

paratop

8/8/2019 Curs IHC 01

14/30

Aviditatea

Aviditatea evalueaza oreactie de tip Ag - Ac

Aviditatea implica o serie

de forte de interactiune

moleculare non-covalente

Se supune legii actiunii

maselor

Ag Ac npAgAc

Legea actiunii maselor :

][

]][[

AgAc

AcAgK !

K = constanta de echilibruK = constanta de echilibru

8/8/2019 Curs IHC 01

15/30

Echivalenta

Cand intr-un sistem este

introdusa o cantitate

suplimentara fie de Ag,

fie de Ac, echilibrul va

fi deplasat in sensul

cresterii cantitatii de

complexe Ag-Ac

Recunoasterea unei molecule antigenice purtatoare a mai multorDRecunoasterea unei molecule antigenice purtatoare a mai multorD--Ag diferitiAg diferiti

este cu mult mai specifica prin interactiunea cu un serpoliclonal sau uneste cu mult mai specifica prin interactiunea cu un serpoliclonal sau un

amestec proportionat de Acm diferiti, decit interactiunea cu un singurAcm !amestec proportionat de Acm diferiti, decit interactiunea cu un singurAcm !

Retele Ag-Ac

cu precipitare

Curba de reci itare i reactiaCurba de reci itare i reactia

gg -- c (Heidelberger, 1930)c (Heidelberger, 1930)

8/8/2019 Curs IHC 01

16/30

Imunohistochimia (IHC)

Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte :

imunologia si histochimia, avind ca scop

evidentierea proprietatilor antigenice ale

unor substante intr-un tesut utilizind Acm

sau seruri polireactive.

Vizualizarea substantelor antigenice sepoate face atit la nivel tisular, cit si la nivel

celular si subcelular, pe preparate la gheata

sau parafina.

8/8/2019 Curs IHC 01

17/30

Tehnica IHC - principiul metodei Se lucreaza cu Acm, de care sunt legate una sau mai multe

molecule enzimatice, ce catalizeaza transformarea unui

substrat incolor intr-un produs de reactie colorat. Enzima

este cuplata covalent cu portiunea Fc a Ac; pe ea se

plaseaza substratul cromogenic.

Enzimele utilizate sunt : - peroxidaza

- fosfataza alcalina

Substratele folosite sunt : - DABpentru peroxidaza (brun)

- fast red si fast bluepentru fosfataza alcalina

8/8/2019 Curs IHC 01

18/30

Metoda ABC (dupa Hsu et al., 1981,

modificata de G. Bussolatti, 1983)

8/8/2019 Curs IHC 01

19/30

CDI - EGFR (ABC)

8/8/2019 Curs IHC 01

20/30

Panelul minim de Ac necesar

Citokeratina Vimentina

Desmina / actina

Neurofilamente Gliofibrile (GFAP)

CLA - L26 / UCHL1

S-100 F VIII

TB-01

Ki-67 / PCNA

8/8/2019 Curs IHC 01

21/30

Citokeratina - filament intermediar ; CK

1p 20 (catalogul Moll); Pan CK : KL1 /

MNF116

ADK colon

8/8/2019 Curs IHC 01

22/30

Vimentina

Melanom Sarcom

8/8/2019 Curs IHC 01

23/30

Desmina / actina

PAS

8/8/2019 Curs IHC 01

24/30

NFT = neurofilamente totale

GFAP = proteina gliofibrilara acida

NFT - tesut nervos normal GFAP in astrocitom

8/8/2019 Curs IHC 01

25/30

CLA = CD45; L26 p CD20; UCHL1 p

CD45RO

L26 UCHL1

CLA

8/8/2019 Curs IHC 01

26/30

S-100

S-100 in histiocite

S-100 in melanom

8/8/2019 Curs IHC 01

27/30

Markeri vasculari : F VIII, CD31, CD34

FVIII vase peritumorale CD31

CD34 ADK gastric

CD34 tesut granulatie

8/8/2019 Curs IHC 01

28/30

TB-01 / Leu 7 (CD57)

Hiperplazie neuroendocrina

Celule NK

8/8/2019 Curs IHC 01

29/30

PCNA / Ki-67 (MIB 1)PCNA - CDI

p53

Ki-67

8/8/2019 Curs IHC 01

30/30

Nu orice micrograf este un histolog i nu orice

histolog este un histopatolog; histopatologul este

totodat histolog i medic [] Histodiagnosticul

este un act medical. El este o CONSULTATIE

MEDICALA n care responsabilitateahistopatologului este grav angajat, cu att mai

mult, cu ct expertiza sa este cerut n ultim

instan i comand terapeutic

Medicul histopatolog ar trebui pltit n raport cu

serviciile pe care le face.

(Masson, Histopatologie)