1

CompuCompuşşi organici i organici neazotaneazotaţţii: : glucidele glucidele şşi lipidei lipide

•

Dozarea enzimatică a glucozei

•

Determinarea lipidelor totale, a colesterolului liber şi esterificat, a trigliceridelor

•

Corpi cetonici

Curs 5

2

1. 1. CarbohidraCarbohidraţţii

Definiţie, clasificare, analizăGlucozaHemoglobina glicatăCorpi cetonici

3

CarboCarbohidrahidraţţii- polihidroxialdehide

sau cetone sau substanţe ce produc astfel de compuşi prin hidroliză

- sursă importantă de energie pentru organism şi modalitate

de stocare

a energiei;

Clasificare:

Monozaharide – zaharuri simple C4-C8, care conţin o funcţie aldehidică sau cetonică, sau sunt derivaţi ai acestor molecule.

Ex. Glucoza: 4 atomi C asimetrici, structurile liniare D şi L se referă la poziţia grupării –OH care poate fi situată la dreapta (izomer D) sau la stânga (izomer L) faţă de C-5.

Structura ciclică introduce un carbon asimetric suplimentar la C-1, cu izomerii α şi β pentru gruparea –OH la dreapta şi respectiv la stânga.

Monozaharidele au proprietăţi reducătoare conferite de gruparea aldehidică sau cetonică.

Oligozaharide – zaharuri care în urma hidrolizei furnizează 2 – 6 molecule de zaharidă.

maltoza (2 molecule de glucoză)lactoza (glucoză + galactoză)sucroza (glucoză + fructoză)

Polizaharide – Cei mai mulţi carbohidraţi din natură sunt polizaharide. În urma hidrolizei furnizează un număr mare de monozaharide (Ex. glicogen, amidon).

4

Structuri ale glucozei

5

GlucozaGlucoza

•

Cea mai investigată dintre glucidele serice•

Valoare

de referinţă: 70 –

110 mg/100 ml

•

Proba

analizată: ser, plasmă

Enzimele glicolitice din celulele sângelui pot determina scăderea nivelului de glucoză (cu 7 %/h)

Procedee de încetinire a glicolizei:

Adaos de inhibitori (NaF)Răcirea probeiSepararea serului de fracţiunea celulară imediat după recoltarea probei

6

Metode de analiză a glucozeiMetode de analiză a glucozei

•

Metoda nespecifică bazată pe proprietăţile reducătoare ale glucozei

(reacţie de culoare).

Eroarea

metodei:

5 -

15 mg/dl.

•

Metode

enzimatice specifice pentru glucoză

–

Glucozoxidaza–

Hexokinaza

–

Glucozdehidrogenaza

7

xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxx x

Dozarea glucozei prin metoda colorimetrica cu o-toluidină

Principiu: Conjugarea

aldo-

şi cetohexozele

cu amine aromatice conduce la compuşi coloraţi, fotometrabili.

Pentru dozarea glucozei, amina cea mai potrivită este o-toluidina care formează cu aldohexozele

un compus intens colorat în verde, conform

reacţiei:

8

Determinarea Glucozei Determinarea Glucozei Metoda GODMetoda GOD--PODPOD

Principiu:Glucoza este oxidată în prezenţa glucozoxidazei (GOD) la acid gluconic cu formare de H2O2. În reacţia cromogenă auxiliară cu fenol şi 4-amino-antipirina, în prezenţă de peroxidază, se formează chinonimina, un compus roşu, fotometrabil.

Fotometrare: A 505 nm

; 37o C

22GOD

22 OHgluconicacidOHOGlucoza +⎯⎯ →⎯++

OHrosieChinonairinAminoantip-4FenolO2H 2POD

22 +⎯⎯ →⎯++

9

Determinarea Glucozei Metoda cu Hexokinaza

Principiu:Glucoza în prezenţă de ATP şi hexokinază este fosforilată la glucozo-6-fosfat. În reacţia cromogenă auxiliară glucozo-6-fosfatul în prezenţă de NADP+ şi sub acţiunea enzimatică a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei (G-6-PDH) se transformă în 6-fosfogluconat (6-PG)Cantitatea de NADPH rezultată este echivalentă cu cantitatea de glucoză intrată în reacţieAbsorbaţa se măsoară la 340 nm.

ADPPGATPGlucoza Hexokinaza +−−⎯⎯⎯ →⎯+ 6

+−−+ ++−⎯⎯⎯ →⎯+−− HNADPHPGNADPPG PDHG 66 6

10

Nicotinamid

adenin

dinucleotid

fosfat NADP+

AbsorbantaX10-3

Lungime de undă, nm

NADP+

NADPH

11

ATPATP

Adenozin-5'-trifosfat (ATP) este o nucleotidă multifuncţională, importantă în transferul de energie intracelular.

Transportă energia chimică necesară metabolismului în cadrul celulelor

Este generat ca sursă de energie în timpul proceselor de fotosinteză şi respiraţie celulară

Este consumat de către multe enzime şi o multitudine de procese celulare.

12

ADPADP

Adenozin

fosfat

(ADP)

(esterul acidului pirofosforic

cu nucleozida

adenozinei

-

alcătuit din gruparea pirofosfat, pentoza riboză şi adenină

-

ADP este produsul de defosforilare

al ATP sub acţiunea

ATPazei

-

ADP este transformat înapoi la ATP sub acţiunea ATPsintetazei.

13

Determinarea glucozei pe filme multistrat

•

Secţiune transversală prin filmul multistrat Schema unui fotometru de pentru determinarea glucozei reflectanţă

Stratul de dispersie (acetat de celuloză +TiO2 ca reflectant) are trei roluri:reflectă radiaţia de la sursa luminoasă din spatele reactivului şi a suportului spre detectorul unui fotometru;forţează proba să difuzeze într-un strat uniform; reţine celule, cristale şi particule precum molecule mari, cum sunt proteinele.

Proba (10 μl) este aplicată pe film, incubată la 37.00±0.05o

C timp de 7 min.

Reflectanţa este măsurată la 495 nm.

Strat de difuzie şi reflexie

Strat

cu reactiviGODPOD

Tampon pH=5Indicator redox

Gelatină

Suport

transparent

Probă

10 μm

100μm

Film multistrat

Filtru

Sursă Detector

14

HemoglobinaHemoglobina

glicatglicată ă ((GHbGHb))

Glicoproteine

-

proteine care au ataşate covalent oligozaharide, formând glicoproteine

Cea mai importantă - GHb

NH2 H-C=O H-C=N-βA H2C-NH-βA + βA H-C-OH H-C-OH C=O HbA + Glucoză pre Hb A1c Hb A1c

•

Formarea sa este practic ireversibilă •

Conc.în sânge depinde de tviaţă

al hematiilor (~

120 zile) şi de conc. de glucoză •

Vformare

a GHb

este d.p.

cu nivelul glucozei din sânge ⇒ conc.

GHb reprezintă o valoare integrată a glucozei pe o perioadă anterioară de 6-8 săptămâni.

•

Valori

de referinta

-

4.8-6% (din hemoglobina

totală)

Grupare aminică N terminală Bază Schiff Cetonamină

RAPID LENT

15

Avantajele

pe

care le prezintă

determinarea HbA1c faţă

de glicemie:

Nu sunt necesare condiţiile “a jeun”;Stabilitate preanalitică mai mare;Variaţie biologică intraindividuală ↓ în comparaţie cu glicemia;Variaţii ↓ în condiţii de stres şi afecţiuni intercurente

Dezavantaje

ale HbA1c:

Cost mai ridicat;Lipsa de disponibilitate a testului în unele tari/regiuni;Lipsa de corelaţie a HbA1c cu glicemia medie la unele persoane;HbA1c nu este relevantă la pacienţii cu unele boli de sînge

16

2. 2. LipideLipide

Definiţie

Clasificare

Analiza

lipidelor

17

LIPIDE

LipideLipidede constituţiede depozitcirculante

Compuşi cu structură

eterogenă, cu unele

caracteristici comune

greu solubile în apăsolubile în solvenţi nepolarirăspândiţi în lumea vie, principala formă de depozitare a resurselor de natură

energetică

Principalele

lipide

circulante

:TriglicerideColesterolFosfolipide

(intră în alcătuirea membranei celulare)

18

Lipidele circulă în organism sub formă de:

LIPOPROTEINE

particule sferice

miez hidrofob ce conţine trigliceride (T) şi colesterol liber (C) sau esterificat (CE)

înveliş format din molecule amfotere, situate cu capătulhidrofob către interiorul lipoproteinei şi cu cel hidrofil cătreexterior, în contact cu mediul apos (plasma); conţine fosfolipide(PL) şi unele proteine numite apolipoproteine (P).

19

Clasificarea lipoproteinelor

în funcţie

de densitate:

chilomicroni – transportă trigliceride

lipoproteine cu densitate foarte joasă (very low density lipoproteins –VLDL) - transportă trigliceride nou sintetizate

lipoproteine cu densitate joasă (low density lipoproteins – LDL) - transportă “colesterol rău”

lipoproteine cu densitate înaltă (high density lipoproteins – HDL) - transportă “colesterol bun”

Fracţiunile se pot separa cromatografic.

20

Lipoproteine Lipoproteine ––predictoripredictori

aiai

afeafeccţţiuniloriunilor coronarienecoronariene

Investigarea metabolismului lipidelor se bazează pe realizarea tabloului lipidic în sânge.

Concentraţiile de colesterol în HDL, LDL şi VLDL sunt predictori

importanţi pentru afecţiuni coronariene.

•HDL funcţional (colesterolul bun) oferă protecţie prin îndepărtarea colesterolului din celule şi ateroame.

•Concentraţii mai mari de LDL şi mai mici de HDL funcţional sunt strâns corelate cu boli cardiovasculare şi risc de ateroscleroză.

Valori optime Valori de risc Colesterol total <200 >240 LDL colesterol <100 160-189 HDL colesterol ~60 <40 Trigliceride <150

Lipide analizate pentru tabloul lipidic şi valorile optime (mg/dL)

21

ClasificareaClasificarea

lipidelorlipidelor

D.p.d.v.

chimic: lipidele conţin legături C-H nepolare produşii de hidroliză:

acizi graşi şi alcooli complecşi

Unele lipide conţin grupări polare

(

–OH, –

NH2

, –SH, fosforil, sialic), ceea ce le conferă afinitate atât pentru apă cât şi faţă de solvenţi organici.

Clasificare după structura chimică (şase categorii):

•

Colesterol•

Acizi graşi•

Trigliceride•

Sfingolipide•

Prostaglandine•

Terpene

22

Colesterol

C27

H46

O(3 β

OH colestan)

Denumirea

provine

din grecescul

chole (bilă) şi

stereos (solid) plus sufixul ol, fiind

identificat

în

calculii

colesterolici

în

anul

1784

• substanţă albă, caracter hidrofob pronunţat

• steroid, compus specific animalelor superioare

• se află în toate ţesuturile, în cantităţi mari în bilă

•

în organism se află atât liber cât şi esterificat cu acizii graşi

ca LDL şi HDL

23

AciziAcizi

gragraşşii•

Formula generală RCOOH; R -

rest alchilic. (acizi graşi saturaţi, acizi graşi mono-

sau polinesaturaţi) •

Acizii graşi circulanţi sunt în formă liberă sau esterificaţi la trigliceride, fosfolipide, colesterolesteri.

•

prin ruperea acizilor graşi liberi rezultă corpii

cetonici

(acetilacetatul, β-OH-

butiratul

şi acetona). Analiza corpilor cetonici se face în legătură cu boala diabetică

Denumire comună Denumrea sistematică

Lauric Dodecanoic

Miristic Tetradecanoic

Palmitic Hexadecanoic

Palmitoleic 9-Hexadecenoic

Stearic Octadecanoic

Oleic 9-Octadecanoic

Linoleic

(esenţial) 9,12-Octadecanoic

Linolenic

(esenţial) 9,12,15-Octadecanoic

Arahidic Eicosanoic

Arahidonic 5,8,11,14-Eicosatetraenoic

Principalii

acizi graşi prezenţi în ţesutul uman

24

Trigliceride

(grăsimi neutre)-esteri ai glicerolului cu 3 acizi graşi (oleic, palmitic, linoleic, stearic, etc.)-simple (cu un singur acid) sau mixte (cu mai mulţi acizi)-rol în stocarea energiei şi în eliberarea acizilor graşi pentru procesele de oxidare din ţesuturi

Fosfolipide–

conţin în structură acid fosforic alături de acizi graşi şi un alcool, tipic

glicerol. Partea hidrofilă şi cea hidrofobă conferă fosfolipidelor posibilitatea de transport.

25

Analiza lipidelor

•

Lipide totale-

se extrag în CH3

OH+CHCl3

; se evaporă solventul şi se cântăreşte reziduul

•

Colesterol totalEtape:

–

hidroliza esterului şi transformarea în colesterol liber şi acid gras

–

oxidarea colesterolului

–

Reacţia cromogenă auxiliară

grasacidColesterolesterColesterol CHE +⎯⎯ →⎯−

222 OHColestenOColesterol CHO +⎯⎯ →⎯+

OHrosieChinonatipirin4AminonoanFenolO2H 2POD

22 +⎯⎯ →⎯++

26

Determinarea colesterolului HDL

Principiu: Lipoproteinele din plasmă, cu excepţia HDL, sunt separate sau mascate

•

Separarea celorlalte lipoproteine: la punctul izoelectric cu polianioni, de ex. heparină, acid fosfowolframic, reacţie catalizată de prezenţa cationilor divalenţi; centrifugare; HDL rămâne în supernatant, unde se determină.

•

Determinarea directă a HDL

(în fază omogenă): mascarea colesterolului din celelalte lipoproteine

Determinarea colesterolului LDL

Metode indirecte

•

Ecuaţia Friedewald

Colesterol LDL = [colesterol total]-[colesterol HDL]-[trigliceride]/5 (mg/dL).

•

LDL sunt precipitate cu heparină la punctul izolectric al acestora (pH 5.12). După centrifugare, HDL şi VLDL rămân în supernatant

şi pot fi determinate prin metode enzimatice. Colesterolul LDL se estimează prin diferenţă:LDL colesterol = Colesterol

total –

Colesterol în supernatant

Metode directe

•

Precipitarea LDL urmată de determinarea colesterolui. •

Ca şi în cazul HDL, a câştigat teren metoda directă cu reactivi omogeni, în care măsurarea colesterolului LDL se face după mascarea colesterolului existent

în celelalte lipoproteine ori prin solubilizarea selectivă a LDL după pecipitare.

27

•

Trigliceride

Etape: –

hidroliza şi transformarea în glicerol şi acizi graşi

–

transformarea în glicerol fosfat

–

Oxidarea

la dihidroxiacetona

–

Reactia

cromogena

cu fenol

si

4-aminoantipirin

grasiaciziGliceroldeTrigliceri Lipaza +⎯⎯ →⎯

ADPfosfatGlicerolATPGlicerol nazaGlicerolki +−⎯⎯⎯⎯ →⎯+ 3

2223 OHcetonaDihidroxiaOfosfatGlicerol asfatoxidazGlicerolfo +⎯⎯⎯⎯ →⎯+−fosfat

28

3. Corpi cetonici3. Corpi cetonici

Se formează în ficat prin oxidarea acizilor graşi liberi din depozitele adipoase

•

Acid acetil acetic•

Acid β

OH butiric

•

Acetona

Creşterea concentraţiei de corpi cetonici:•

Cetonemie (în sânge)

•

Cetourie

(în urină)

29

Determinarea corpilor cetonici

•

Nu există reactiv care să dea reacţie pozitivă cu toţi cei 3 corpi cetonici

•

R. cu nitroprusiat

de sodiu Na2

[Fe(CN)5

NO] – de 10 ori mai sensibilă pentru acidul acetil acetic (în m. amoniacal, coloraţie violetă)

30

•

Prezentaţi o metodă de determinare enzimatică a glucozei din sânge.

•

Ce

este

hemoglobina

glicată? Ce avantaj prezintă determinarea sa faţă de cea a glucozei din sânge?

•

Indicaţi o variantă pentru încetinirea procesului de glicoliză în sângele colectat pentru determinarea glicemiei.

•

Ce sunt lipoproteinele?

•

Explicaţi acronimele HDL, LDL şi semnificaţia lor ca predictori

ai afecţiunilor coronariene.

•

Ce forme ale colesterolului sunt determinate ca şi colesterol total în sânge?

•

Ce sunt trigliceridele?

•

Ce sunt corpii cetonici şi din ce provin în sânge?