Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri, care se bazeaza pe interactiunea diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu doua faze cromatografice: faza mobila si faza stationara.

Izolarea substantelor chimice din amestecuri si id 525j99f entificarea componentelor a reprezentat întotdeauna una dintre obiectivele prioritare ale chimiei. La ora actuala nu numai în chimia analitica ci si în tehnologia chimica se manifesta o cerere din ce in ce mai mare de compusi cu puritate foarte avansata. Separarea amestecurilor în componente este o operatie esentiala care permite obtinerea acestora într-o stare cât mai pura. Aceasta separare se poate face la scara analitica, daca ne intereseaza sa cunoastem numai compozitia amestecului sau la scara preparativa, daca vrem sa obtinem fizic componentele separate.

În prezent exista un mare numar de metode de separare care si-au gasit aplicatii în chimie. Fiecare dintre aceste metode poate cuprinde mai multe tehnici de separare. Cele mai importante dintre metode de separare sunt cele bazate pe echilibrul între faze, care valorifica diferenta dintre proprietatile de distributie ale componentelor unui amestec între doua faze nemiscibile aflate în contact. Asemenea metode sunt distilarea, cristalizarea, precipitarea, sublimarea, extractia. Aceste metode, cunoscute si aplicate de multa vreme, s-au dovedit a fi insuficiente atunci când s-a pus problema separarii unor amestecuri foarte complexe si a fost nevoie de dezvoltarea unor noi metode, printre care s-au impus mai ales cele cromatografice.

Principalele avanteje pe care le prezinta cromatografia ca metoda de separare sunt:

-         Permite separarea, identificarea si dozarea cantitativa simultana a componentelor unui amestec.

-         Se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practic orice compus organic putând fi separat printr-o metoda cromatografica

-         Sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicata, ceea ce înseamna ca necesita doar cantitate foarte mica de proba. În acelasi timp însa se pot aplica si la scara preparativa.

-         Durata analizei este redusa, comparativ cu alte metode de analiza ale amestecurilor complexe. 

1.1. Istoric

Cromatografia a fost initiata în 1901 de botanistul rus Tswet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere în limba greaca).

Urmatorul pas important în dezvoltarea cromatografiei a fost facut în 1941, când A. Martin si R. Synge au initiat cromatografia lichida de repartitie pe coloana, pentru care au primit ulterior Premiul Nobel pentru chimie  în 1952. Ei au separat aminoacizi acilati pe o coloana ce continea silicagel saturat cu apa, iar drept faza mobila au utilizat n-butanol saturat cu apa. În 1944, au fost puse bazele cromatografiei pe hârtie, prima forma de cromatografie planara, iar cromatografia de schimb ionic este utilizata începând din 1947. Începuturile cromatografiei de gaze se leaga tot de numele lui Archer J.P. Martin, care împreuna cu A.T. James a separat acizi organici volatili pe o coloana de sticla umpluta cu Celite acoperita cu ulei siliconic, utilizând ca faza mobila azotul.

Cromatografia pe coloane cu gel a fost initiata în 1959 de Porath si Flodin, iar cea de bioafinitate se utilizeaza din 1967. Cromatografia de lichide moderna pe coloana, numita de înalta performanta sau de înalta presiune (HPLC) poate fi datata la începutul anilor 1960 si se bazeaza pe lucrarile lui Csaba Horváth, efectuate la Univesitatea Yale.

1.2. Principiul separarii cromatograficePrincipiul de baza al separarii cromatografice consta în distributia inegala a componentelor unui amestec între faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila. Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de capacitatea diferita de a difuza în acestea. Acest principiu este ilustrat în Figura 1.1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei.

Figura 1.1. Principiul separarii cromatografice

Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc în momentul initial ametecate,  într-un volum restrâns, vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana, deci este in proces dinamic.

1.3. Clasificarea metodelor cromatografice

            Exista o serie de criterii pe baza carora se poate face o clasificare a metodelor cromatografice: mecanismul separarii, natura fazelor cromatografice, configuratia sistemului cromatografic, etc.

1.      Clasificarea în functie de mecanismul separarii

1.1.   Cromatografie de adsorbtie

1.2.   Cromatografie de repartitie

1.3.   Cromatografie cu faze chimic legate

1.4.   Cromatografie de schimb ionic

1.5.   Cromatografie de excluziune

1.6.   Cromatografie de afinitate

În functie de mecanismul separarii, metodele cromatografice se clasifica în:

-         Cromatografie de adsorbtie, în care fenomenul principal care sta la baza separarri este adsorbtia, iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie.

-         Cromatografie de repartitie, în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor se face în functie de diferenta dintre coeficientii lor de repartitie între cele doua faze.

-         Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie, fiind o combinare a acestora.

-         Cromatografia de schimb ionic, care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia, iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor.

-         Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel), în care fenomenul principal este difuzia, iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor.

-         Cromatografia de bioafinitate, în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate.

Trebuie mentionat ca în afara în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie, care sunt însa mai putin uzuale.

2.      Clasificarea în functie de natura fazelor cromatografice

2.1.   Cromatografie de gaze

2.1.     Gaz-lichid (GLC)

2.2.     Gaz-solid (GSC)

2.2.   Cromatografie de lichide

2.1.     Lichid-lichid (LLC)

2.2.     Lichid-solid (LSC)

2.3.   Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

În functie de starea de agregare a fazei mobile, avem trei tipuri de cromatografie: gazoasa, lichida si cu fluide supercritice. Fiecare dintre acestea se subîmparte în functie de natura fazei stationare, care poate fi solida sau lichida. În cazul cromatografiei cu fluide supercritice în denumire nu se face referire la natura fazei stationare. Mai trebuie precizat ca în cazul în care faza stationara este lichida, ea trebuie fixata pe un suport solid corespunzator, în general un material poros.

3.      Clasificarea în functie de configuratia sistemului cromatografic

3.1.   Cromatografie pe coloana

3.1.     Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)

3.2.     Cromatografie pe coloane capilare

3.2.   Cromatografie planara

3.1.     Cromatografie în strat subtire

3.2.     Cromatografie pe hîrtie

În functie de configuratia sistemului cromatografic, avem cromatografie pe coloana si cromatografie planara. Cromatografia pe coloana cuprinde cromatografia pe coloane clasice (cu umplutura) si cromatografia pe coloane capilare (numite si coloane tubulare deschise). Cromatografia planara cuprinde la rândul ei cromatografia pe hârtie si cromatografia în strat subtire.

1.4. Schema de principiu a cromatografului

Este prezentata în Figura 1.2. Faza mobila care se gaseste într-un rezervor de faza mobila 1 trece printr-un dispozitiv de masurare si reglare a debitului 2, apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de catre faza mobila, peoba fiind în continuare transportata prin coloana cromatografica 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se gaseste în mod uzual într-o incinta termostatata (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza sa se desfasoare la o temperatura stabilita. Componentele separate ajung în detectorul 5, unde fiecare componenta este pusa în evidenta sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezinta semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.

               

             

               

                     Probǎ 

1 - rezervor faza mobila

2 - dispozitiv de reglare si

      masurare a debitului

3 - dispozitiv de introducere a

      probei

4 - coloana cromatografica

5 - detector

6 - înregistrator sau integrator

Figura 1.2. Schema de principiu a cromatografului

Diagrama care reprezinta rezultatul analizei cromatografice se numeste cromatograma. Ea este înregistrata în general ca o functie a intensitatii semnalului detectorului în raport cu timpul. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic, iar aria picului este proportionala cu concentratia componentei respective. În cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza, iar componentele sunt evidentiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatograma este data în Figura 1.3.

Figura 1.3. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi.  Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata.