CLONAREA SI MANIPULAREA GENEI- Utilizarea altor organisme -

GURALIUC LENUȚA (căs. BRÎNZĂ) PÎNZARIU SANDALĂ-CRISTINA (căs. FECIORU)Biotehnologii microbiene și celulare

1. INTRODUCERE 1. Introducere: În capitolele anterioare au fost descrise tehnicile de manipulare agenomului E. coli. Cu toate acestea, este foarte probabil că va fi nevoie sălucrăm și cu alte organisme, fie pentru a produce versiuni modificategenetic ale unor specii comerciale importante (ex.: culturi de plante),fie pentru a le imbunătăți caracteristicile. Se aplică aceleași principii ca și la E. coli, având nevoie de vectori corespunzători, un mijloc de a obține AND-ul în organism și modalitățide a selecta transformanții. Un organism care contine o genă derivată din altă parte esteconsiderat a fi transgenic. Vom analiza vectorii și transformareasistemelor disponibile pentru o serie de organisme, vom lua înconsiderare primele bacterii de la ciuperci, apoi plante (inclusiv alge) șianimale.

2. BACTERIILE

2. Bacteriile: E. coli, analizată în detaliu în capitolele anterioare, face partedin grupul de bacterii Gram-negative, unul dintre multele grupuride bacterii care conțin membri și care sunt importante pentruclinică din motive economice, ecologice sau de natură biologică. 2.1. Vectorii: ADU-ul folosit la manipularea speciilor de interes ar putea fiîncadrat într-una din următoarele categorii: a. AND-UL non replicant - poate fi material liniar saucircular și care, deși are posibilitatea de a se reproduce in E. coli, nuse poate reproduce în alte gazde.

2.1. Vectorii

De aceea ar putea, prin urmare, să fie stabil menținută în speciațintă numai prin integrarea într-un alt replicon, cum ar fi un altcromozom bacterian sau o plasmidă. În cazul în care specia gazdă are un sistem de recombinare activomolog și ADN-ul de intrare conține secvența de omologare într-unloc în genomul gazdă, introducerea lui ar putea fi posibilă înlocul respectiv. În caz contrar, introducerea poate avea loc în locurialeatoare, ceea ce constituie un dezavantaj. b. Plasmidă unică la speciile luate în studiu – desigur E. coli nueste singura specie de bacterie care conține plasmide. Și speciileținte pe care le-am putea folosi pot avea plasmide proprii ce se potutiliza în procesul de manipulare genetică.

Cu toate acestea, este mai convenabil dacă plasmida utilizată sepoate reproduce în E. coli, precum și în speciile vizate. c. O gamă largă de plasmide gazdă : sunt multe plasmide gazdăcapabile să se reproducă într-un număr diferit de specii de bacterii. Se pot clasifica în grupuri de incompatibilitate pe baza faptuluică prezența într-o celulă a unei plasmide dintr-un grup inhibăreplicarea de plasmide diferite ale aceluiași grup, ca urmare ainterferenței dintre procesele de replicare. Plasmidele diferă și prin cât de ușor pot fi transmise la altebacterii. Unele sunt de la sine transmisibile, altele sunt înimposibilitatea de a-și conduce transferul propriu, putând fitransferate în cazul în care funcțiile sunt furnizate de o altăPlasmidă, spunându-se despre ele că se mobilizează.

Restul nu pot fi mobilizate de către alte plasmide si se spunedespre acestea ca sunt ne – mobilizate. Din acest motiv este foarte probabil ca plasmida să serăspândeasca în populații sălbatice în caz de eliberare, lucru doritmai puțin din motive de siguranță. d. Transport de vectori : aceștia sunt construiți în mod artificialpe baza hibrizilor între E. coli, plasmide și plasmide de la alte specii.Prin urmare, ei au posibilitatea de a reproduce și de a fi selectați înambele specii. Sunt numiți vectori de transfer deoarece aceștia potfi naveta de la o gazdă la alta și, de eceea, sunt utilizați pe scarălargă. În fapt, ei sunt plasmide a căror gamă de gazdă a fost extinsăartificial prin introducerea unei origini de replicare suplimentare.Unii vectori de transfer se pot reproduce în mai multe specii.

De exemplu, vectorii bazați pe plasmida pC194 de Staphylococcusaureus se pot reproduce în specii de Bacillus. De regulă, inițierea construcției și verificarea de către o plasmidărecombinantă utilizând un serviciu al unui vector de transfer, arputea fi realizată prin utilizarea E. coli ca și gazdă, urmată detransferul în speciile de interes. Vectorii de expresie urmează aceleași principii folosite laexprimarea în E. coli. Multe E. coli promontorii vor lucra în altebacterii Gram-negative, deși pot fi utilizați promontorii puternici dinspeciile aflate în discuție. Unii promomtorii care acționează în E. coli, voracționa în mai multe bacterii conexe la distanță. De exemplu, PN25promotor de E. coli bacteriofag T5, va acționa în Bacillus subtilis chiar dacăacesta este o specie Gram-pozitivă și E. coli este Gram-negativă.

Bacteriile Gram-pozitive sunt deosebit de atractive ca și gazdepentru secreția de proteine exprimate în mediul de creștere, așacum sunt capabile să facă acest lucru la rate ridicate. Un dezavantaj în utilizarea de specii de Bacillus ca și gazdepentru secreție îl constituie producerea la niveluri ridicate deproteaze endogene. Deși gazdele cu niveluri reduse de protează suntdisponibile, ele nu sunt întotdeauna satisfăcătoare, deoareceproteazele endogene pot pune mai puține probleme decât unelespecii de Streptomyces.

2.2. INTRODUCEREA ADN-ULUI

2.2. Introducerea ADN-ului: Există trei modalități principale prin care ADN-ul poate fiintrodus în celule bacteriene beneficiare. Acestea sunt: introducerea directă a ADN-ului gol în celule intacte; transformarea protoplaștilor; metoda combinativă. a. Introducerea de ADN gol: Multe specii de bacterii pot fi induse în a primi ADN-ul gol printratamente adecvate, cum ar fi soluții reci de calciu sauelectroporație, utilizate cu E. coli.

Pentru o specie care nu a mai fost studiată anterior, se impuneefectuarea unui studiu de eroare, în vederea optimizării metodelor. Un număr de genuri importante, care includ speciile Grampozitive Bacillus, Streptococcus și Streptomyces,prezintă competențănaturală. Competența este, de obicei, reglementată și de cele mai multe orideterminată de excreția de creștere în mediul extracelular, proteinecu masă mică extracelulară, denumite proteine de competență. Competența se dezvoltă ca densitate celulară (și concentrația deproteină competentă), apoi mediul se extinde. Cerințele detransformare a ADN-ului în mai multe dintre aceste specii suntcomplexe.

De exemplu, cu Bacillus, plasmide care sunt capabile de transformare directă într-o gazdă, în general, necesită secvențe care sunt prezente pe gazda cromozom sau secvențe care sunt de asemenea prezente deja pe o o plasmidă în cadrul celulei, sau cel putin parțial în cadrul secvenței duplicării interne a plasmidei. Există posibilitatea ca intrarea moleculei în celulă să fie asociată cu tăierea și degradarea unui singur fir. Regenerarea moleculei poate depinde de un dublu-catenar care poate fi replicat, apoi de un eveniment de recombinare intramolecular. Dacă recombinarea are loc între ADN-ul de intrare și o secvență în cromozomul gazdă sau plasmida endogen, rezultatul este integrarea ADN-ului în cromozom sau plasmidă.

Dacă ADN-ul de intrare se recombină cu el însuși într-o reacție intramoleculară, atunci rezultatul este recirculator. În plus, pentru unele specii, prezența uneo nucleoide specifice scurtsecvențială permite plasmidei absorbția acesteia. b. Transformarea protoplaștilor: Pentru mai multe grupuri de bacterii, în special Bacillus Gram-pozitive și Streptomyces, există constrângeri privind tipurile de plasmide care pot fi utilizate la trasformarea naturală a protoplastilor (celule la care pereții au fost eliminați prin tratarea cu lizozimă) poate fi exonerat de utilizarea în prezența unui tampon osmotic adecvat, pentru a opri liza celulelor și a polietilenglicolului. Unele protocoale utilizează alți reactivi, în plus față de polietilenglicol, ca de exemplu celulele normale, apoi regenerate din protoplaști prin transferul unui mediu adecvat.

c. Metoda combinată: În metoda combinată, două celule devin din punct de vedere fizic legate printr-un tub proteic și ADN-ul este trecut direct de la o celulă la alta. Acesta este modul în care plasmida F (pentru fertilitate), care constituie baza, este transferată de la o celulă la alta. Factorul F codifică toate funcțiile necesare pentru transferul său. Plasmida care urmeazăsă fie transferată (uneori numită plasmidă marfă) este de multe ori în imposibilitatea de a conduce transferul propriu. În schimb se bazează pe o plasmidă conjugală, care este capabilă să facă acest lucru și uneori unul sau mai multe plasmide helper ca Methylases, care codifică aceste funcții și care va proteja gazda marfă de la degradarea ei în viitor.

Plasmida de ajutor poate efectua, de asemenea, funcții necesare pentru transferul marfei. De obicei, transferul este realizat într-o împerechere triparentală, formată din următoarele trei componenteȘ E. coli care transportă plasmida conjugală E. coli; transportul de marfă și orice plasmidă ajutor; destinatarul speciei de bacterie care urmează să fie manipulată. Combinarea între două tulpini de E. coli plasează toate cele necesare într-o plasmidă de celule E. coli și conjugarea cu bacteria beneficiară transferă marfa în speciile beneficiare. Într-o împerechere biparentală, este suficient să se introducă plasmida de interes în tulpina destinatar.

Deși E. coli poate fi combinată cu o gamă largă de bacterii, inclusiv unele bacterii Gram-pozitive, și alte specii pot fi utilizate ca donator. În cazul în care aceleași specii pot fi folosite ca donator și primitor, transferul plasmidei poate fi mai eficient. Metoda combinată este adesea utilă în cazurile în care transformarea directă și transformarea protoplaștilor au eșuat.

3. SACCHAROMYCES CEREVISIAE

2.3. : GAZDELE Se aplică aceleași considerente de proiectare a gazdelor în E. coli și la alte bacterii. Bacillus subtilis oferă, probabil, cea mai bună gamă de tulpini gazdă. Există, de asemenea, mutații de reducere endogenă privind activitatea enzimei de activitate și restricția proteazei (care poate fi utilă atunci când exprimă gene clonate). 3. SACCHAROMYCES CEREVISIAE: Ciupercile sunt un grup de organisme extrem de divers. Poate una dintre cele mai bine studiate este ciuperca Saccharomyces cereviae ascomycete (de asemenea cunoscută sub numele de drojdia de panificație sau pur și simplu drojdie), astfel încât ne vom concentra pe aceasta.

Cu toate acestea, vectorii și sistemele de transformare au fost dezvoltați și pentru o serie de alte ciuperci, inclusiv ciupercile care sunt de interes special ca agenți patogeni pentru plante și animale. 3.1. Markerii: Unul dintre cei mai utilizați markeri este gena URA3. Aceasta codifică decarboxilaza fosfat 5 orotina, o enzimă de biosinteză uracilă. Achiziționarea de celule de către o genă URA3 anterior mutată anterior în acest loc, le permite să crească în absența exogenului uracil. În tabelul 1 sunt prezentați markeri selectabili frecvent utilizați, inclusiv markeri nutriționali care pot fi selectați în mod similar.

3.1. MARKERII

Unii dintre ei, cum ar fi CAN1 sau URA 3, pot fi selectați, de exemplu putem selecta

absența lor. Gena CAN1 codifică o permisiune care determină adoptarea argininei canavanine toxice analogică și, în consecință, moartea celulelor. Celulele mutante gazdă CAN1 sunt cele tezistente la canavanină, deoarece acestea nu au posibilitatea de a importa. Tabelul 1-Markeri selectabili frecvent utilizați

tet R

ARSI

E.c. ori URA3

amp R

CEN4

Cu toate acestea, întreruperea lanțului SUP4, supresoare, determină producția de CAN1 funcționale în fundal (deoarece suprimă mutația CAN1) și, prin urmare, provoacă moartea celulelor CAN1 în prezența cavaninelor. Celulele care conțin SUP4 pot fi identificate, fără a le ucide, prin utilizarea de gazde, cu o mutație ocru în întreruperea lanțului genei ADE2 pentru fosforibozil amino-imidazol carboxilază, o componentă a biosintezei purinelor. Mutația face celulele să acumuleze un pigment roșu, în timp ce coloniile sunt de obicei de culoare ocru dacă mutația este suprimată de SUP4.

3.2. VECTORII PLASMIDĂ

Integrarea prin non-replicarea ADN-ului de intrare circular sau liniar în genomul de drojdie prin recombinare poate fi folosit pentru modificarea genetică stabilă. Nevoia de integrare va face în mod clar recuperarea ADN-ului de intrare mult mai dificilă decât în cazul în care un vector replicator este utilizat. Vectorii plasmidă de replicare utilizați în mod obișnuit în drojdia de bere pot fi împărțiți în două categorii principaleȘ vectori plasmidă ai drojdiei de bere centrometrică (PCI) și vectori plasmidă ai drojdiei episomali. Caracteristica distinctă a plasmidei PCI este prezența unei secvențe centrometrice cromozomiale, în acest caz, CEN4.

Mulți dintre vectorii de drojdie se bazează pe pBR322 în acest fel, dar alte plasmide au fost utilizate asemenea, inclusiv speciile și PUC Bluescript. Există, de asemenea, un marcator de selecție și o origine de replicare pentru drojdie, ARS1. Prezența unei secvențe centromerice permite plasmidei care urmează să fie împărțită de către axul aparatului de celule în același mod în care cromozomii endogene sunt mpartiți. Deși acest lucru duce la o reducere semnificativă a numărului de copii pe celulă, aceasta conferă o stabilitate mult mai mare în timpul diviziunii celulare, permițând plasmidei să fie menținut în absența selecției. Vectori plasmide care au ARS, dar nu și o secvență CEN sunt uneori numite YRp (drojdia de bere reproduce plasmide). Deși au copii mai mari decât vectori PCI, instabilitatea lor este un dezavantaj major.

Un exemplu de un vector Da este prezentat în figura 9.5. Cele mai multe dintre caracteristici sunt similare cu cele ale plasmidelor PCI, cu excepția absenței secvenței centromerice și înlocuirea acestuia cu o alta de origine replicatoare. 3.3 YACs YACs sunt vectori de clonare sofisticați care pot fi utilizați pentru înmulțire de mare intindere ale ADN-ului. Acest lucru este foarte util, deoarece reduce numărul de recombinante necesare pentru a acoperi întregul genom al unui organism. Scopul este de a construi un cromozom artificial, care poate fi menținut în drojdia de bere, dar care este cea mai mare parte compus din ADN străin.

Un exemplu de un vector Da este prezentat în figura 9.5. Cele mai multe dintre caracteristici sunt similare cu cele ale plasmidelor PCI, cu excepția absenței secvenței centromerice și înlocuirea acestuia cu o alta de origine replicatoare. 3.3 YACs YACs sunt vectori de clonare sofisticați care pot fi utilizați pentru înmulțire de mare intindere ale ADN-ului. Acest lucru este foarte util, deoarece reduce numărul de recombinante necesare pentru a acoperi întregul genom al unui organism. Scopul este de a construi un cromozom artificial, care poate fi menținut în drojdia de bere, dar care este cea mai mare parte compus din ADN străin.

3.4. Sisteme de expresie Un număr de promotori constitutivi sunt disponibili, de exemplu, de la gena GPD pentru glyceraldehyde-3-fosfat dehidrogenaza, TEF pentru traducerea factorului de alungire 1a, și CYC1 pentru o componentă a citocromului c oxidazei. Unii dintre cei mai utilizați promotori controlabili proveniți de la gene pentru metabolismul galactozei, respectiv GAL1 și GAL10, codificați galactokinase și UDP-galactoza-4-epimerase. Când un tip proteine de tip sălbatic de control sunt prezente, transcrierea GAL1 și GAL10 este crescută foarte mult în prezența galactozei. În prezența glucozei, transcrierea este bine reprimată. Există două variante de ștergere a promotorului GAL1 Gall, desemnat și feminin care sunt mai puțin puternice și, prin urmare, este mai puțin probabil să ducă la problemele cauzate de toxicitatea proteinelor străine.

Toți acești promotori, împreună cu secvențe din amontele lor de control, pot fi folosiți fie în vectori de expresie sau casete pentru introducerea în alte constructe. Toți acești promotorii pot fi utilizați pentru a orienta sinteza, fie a proteinelo nemodificate sau a proteinelor de fuziune. Acesta din urmă poate încorpora oricare dintre produsele corespunzătoare ale GAL1, GAL10 și așa mai departe, sau secvențe, cum ar fi LacZ sau TrpE de la E. coli. Un avantaj în utilizarea de drojdie, mai degrabă decât celulele procariote de exprimare a eucariote proteine ar fi că modificările post-translationale de proteine, este puțin probabil să aibă loc în sistemele de procariote, dar ele pot face acest lucru în drojdie. Chiar și în drojdia de bere aceste modificări nu poate avea loc fiabil, și poate fi necesar să se folosească expresia în celule de insecte sau de mamifere.

9.3.5 Secretia de sisteme Secreția de proteine overexpressed de fuziune la un semnal de secreție poate fi utilă, deoarece ajută purificarea și permite proteinei produse a fi doar minim expusă la proteaza intracelulara de drojdie.

În plus, ar putea ajuta pentru a aduce glicozilare corecte și pot spori, de asemenea, plierea proteinei. O serie de semnale de secretie, atât din drojdie și din alte organisme pot fi folosite. Feromonii de împerechere alfa-peptide și invertaza (produs al genei SUC2) sunt adesea folosiți. Împerecherea feromonilor este o peptida 13 reziduuri, secretată de celulele de împerechere tip alfa, care acționează pe un receptor de pe celulele de împerechere. Invertaza este secretată în scopul de a aduce defalcarea de zaharoză, glucoză și fructoză.

9.3.6 Sisteme de transformare Sunt frecvent utilizate trei moduri pentru introducerea de ADN exogen în Saccharomyces cerevisiae. a. Unul dintre cele mai simple și mai utilizate pe scară largă este tratamentul de celule cu acetat de litiu și polietilen glicol și o căldură șoc, împreună cu ADN-ul de transformare și suplimentare nespecifice denaturate "transportator" al ADN-ului (de exemplu, din timus de vițel). Această metodă este relativ rapidă și simplă și poate oferi un randament de transfer de până la 105 la 106 de colonii per micrograme de plasmidă cu tulpini adecvate. b. O a doua abordare a introduce ADN exogen în Saccharomyces cerevisiae este transformarea protoplaștilor (de asemenea, numit spheroplasts), care sunt obținuți prin digestia peretelui celular cu enzime corespunzătoare, în prezența unui tampon adecvat osmotic, cum ar fi soluție de sorbitol, pentru a preveni liza. Protoplaștii sunt expuși ADN-ului de transformare, în prezența de polietilenglicol și clorură de calciu.

Următorul pas este de a regenera celulele intacte de la protoplaști. Acest lucru este realizat prin imobilizarea protoplaștilor într-un agar-agar adecvat, care este tamponat osmotic. Înconjurarea protoplaștilor cu un mediu solid permite păstrarea materialului peretelui celular în jurul valorii celulei în etapele timpurii și cele mai sensibile ale peretelui celulei de regenerare. Transformarea protoplaștilor este consumatoare de timp mai mult decât transformarea cu acetat de litiu, dar cu unele tulpini se poate da un randament mai mare de transformare. Prin urmare este util cu tulpini care au o eficiență de transformare altfel scăzută, sau atunci când cantitatea de ADN este scăzut.

c. O a treia metodă de introducere a ADN-ului în Saccharomyces cerevisiae este electroporarea. Este raportat că această metodă poate da chiar mai mare eficiență decât transformarea protoplaștilor, deși cifra reală pare să varieze destul de mult și, probabil, depinde de tulpină utilizată. Un dezavantaj este faptul că numărul de transformanții obținuți atinge un platou, cu sume relativ mici ale ADN-ului. Ca și în alte sisteme electroporatice, celulele sunt supuse pur și simplu la un puls de câmp electric. Nu este nevoie de a face protoplaști pentru acest tratament, deși un tampon osmotic, cum ar fi sorbitol, este de multe ori inclus.

Alte metode mai puțin utilizate pe scară largă de transformare a Saccharomyces cerevisiae includ bombardament de particule și de deteriorarea celulelor de agitație, cu mărgele de sticlă. Celulele E. coli trebuie să conțină o plasmidă care poate se poate reproduce în E. coli și în drojdia de bere (de exemplu, un vector de transfer) și o altă plasmidă pentru a oferi funcții de mobilizare.