Donor ovocit Donor nucleu somatic

Şoarece agouti

Zona

pellucida

Nucleu

ovocitar

Ovocit

enucleat

Izolare nucleu somatic

Introducere nucleu somatic

Condensarea cromozomilor în

ovocitul activat

Nu se formează globul polar

1 – 6 ore

Cultivare in vitro

Transfer embrioni 2-8

blastomere/blastocisti în

oviduct/uter femele

pseudogestante

Şoarece negru

Şoareci clonaţi

cu blana gri

CLONAREA LA ŞOARECI

Epidermă Derivate mezodermale

(mușchi, notocord)

Calota animală

Emisfera vegetativă Blastulă

amfibian

Blastocel

Emisfera

animală

SPECIFICARE

Experiment prin care se demonstrează specificarea celulelor în

embriogeneza amfibienilor

A P A P

TRANSPLANT

A P A P A P

DESTIN NORMAL GAZDĂ GAZDĂ

EMBRIONI

A P A P A P ADULȚI

DONOR DONOR

NEDETERMINAT DETERMINAT

Tehnica prin care se stabilește momentul determinării constă în

transplantarea celulelor dintr-o regiune embrionară în altă regiune

embrionară

CITOPLASMĂ

Promotor Promotor Promotor

Gena a Gena b Gena c

Membrana nucleară

Proteina A Proteina C

Autoreglare

transcriptională

feedback pozitiv

NUCLEU

Proteina C Poteina A

După diviziune celulele fiice

conțin în citoplasmă proteinele

A și C

Translocarea proteinei A în

nucleu restabilește modelul

inițial de exprimare a genelor

Memoria citoplasmatică este asigurată printr-un mecanism de feedback pozitiv.

Monostrat

celule

pigmentare

Microvili Granule pigment

Hialuronidază

Ser fetal

Feniltiouree

Acid

ascorbic

Celule

cristaliniene

Pierderea

microvililor și

a pigmentului

TRANSDIFERENȚIEREA IN VITRO

Celulă cromafină Neuron simpatic

Factor de creștere

nervos (NGF)

Adrenalină Noradrenalină

Transdiferențierea celulelor

retiniene în cultură

Transdiferențierea celulelor cromafine în

cultură

BOX A Element

intermediar BOX C

ADN

Motive zinc finger TFIIIA

Fig. 2. Interacția TFIIIA cu gena ARNr 5S

Regiune cu activitate Regiune zinc-finger Regiune C-terminală

transcriptională (5 motive )

N C

Fig.3B. Structura proteinelor ZIC

Fig. 3A. Structura primară

a proteinelor zinc-finger

cu domeniu KRAB

Căi de livrare a liganzilor receptorilor nucleari

RECEPTORII NUCLEARI (C4)

Hormon tiroidian

Retinol sangvin Ligand

Acid retinoic NUCLEU

9 cis

Receptori

nucleari

Prostaglandine

ADN

Spațiu

extracelular CITOPLASMĂ Secvențe repetitive

Regiune

legare Regiune

Regiune variabilă ADN Regiune Regiune legare variabilă

(A/B) (C) D ligand (E) (F)

N- -C

AF-1 Helix 3 Domeniu AF-2

dimerizare

B.

Regiune legare ADN (C)

P-BOX

Zn Zn

H2N COOH

D-BOX

C C C C

C C C C

Fig. 5. Structura receptorilor nucleari

AGGTCA AGGTCA n

AGGTCA AGGTCA nn

AGGTCA AGGTCA nnnnn

n

nnn

AGGTCA ACTGGA

ACTGGA ACTGGA

RD1

RD2

RD5

RI1

RO3

Fig. 6. Secvențe repetitive aflate în regiunea promotor a genelor

Secvențe

repetitive

directe

Secvențe

repetitive

indirecte

Secvențe

repetitive

opuse

Ligand Receptor

?

RXR RAR RXR RXR

ADN

Receptori pentru Heterodimeri Receptori Receptori

hormoni steroizi RXR-RAR homodimeri RXR orphan monomerici

LIGANZI

Glucocorticoizi Hormoni tiroidieni Acid retinoic 9 cis SF-1

Mineralocorticoizi Acizi retinoici trans COUP

Progesteron Ecdizon HNF-4

Androgeni Vitamina D3

Estrogeni Acizii biliari

Fig. 7. Clasificarea receptorilor nucleari și liganzii corespunzători

Co-represor

RXR RAR

RARE

ADN

Co-represor

RXR RAR

RARE

ADN

Ligand

Eliberare Co-represor

RXR RAR

Co-activator

RARE

Complex transcriptional bazal

RXR RAR

Co-ctivatori RARE

Complex transcriptional bazal

Fig. 8. Modelul activării

transcripționale de către

receptorii nucleari

ENDODERM

GATA-4 Situsuri de legare

ADN

ENHANCER-UL GENEI ALBUMINEI

MUGURELE HEPATIC

GATA-4 Alți factori transcripționali

Fig.9. Activarea genei albuminei de către factorii transcripționali GATA

Zn Zn

H2N COOH

MOTIV LIM

C H C D

C C X2 C C

Fig.10. Structura motivului LIM

Homeodomeniu

LHX N LIM LIM C

GRUP I LMO N LIM LIM C Domeniu kinazic

LIMK N LIM LIM C

CRIP N LIM C Motiv conservat

GRUP II

CRP N LIM LIM -C

RIB N LIM C

ZYXIN N LIM LIM LIM C

GRUP

III PAXILLIN N LIM LIM LIM C

PINCH N LIM LIM LIM LIM LIM C

Fig. 11. Clasificarea proteinelor LIM

I. Clasa Leucin - zipper

DIMER

Domeniu de dimerizare

C-terminal (monomer)

A. DETERMINARE

FGF

RECEPTORI FGF

MP

PKC

Rb AP-1 Id

MyoD Myf-5

PKC

P P P

DIVIZIUNE DIFERENȚIERE

B. DIFERENȚIERE

FGF

MP

MyoD Myf-5 MyoD MyoD Myf-5

Rb Rb AP-1 E12 E47

DIVIZIUNE DIFERENȚIERE

Fig.16. Mecanismul determinării și diferențierii celulelor musculare

1 2 3 Helix recunoaștere

Braț flexibil N-terminal

Buclă

Turn

N-- ---C

Homeodomeniu

Fig. 18. Structura homeodomeniului

III. 1. Clasa proteinelor cu

homeodomeniu

Domeniu activare Deformed

transcripțională

Proteină Homeodomeniu

inhibitoare

BLOCARE

ADN

ACTIVARE

Extradenticle

Fig.20. Modelul controlului transcripțional realizat de proteina Deformed

FT POU

Homeodomeniu

Domeniu POU

specific

Fig. 21. Structura FT POU

Domeniu pereche (paired) Homeodomeniu Domeniu de activare

PAI RED transcriptională

N C PAX4 PAX6

HTH HTH HTH

Octapeptidă

N C PAX 3 PAX5 PAX7

N C PAX1 PAX9

Homeodomeniu incomplet

N C PAX2 PAX8

N C Proteine PAX C. elegans

Fig. 22. Structura proteinelor PAX

Fig. 24. Structura factorilor transcripționali ETS

Domeniu reglator Domeniu ETS

N C ETS I

N C PEA

II N C ERF

Domeniu inhibitor Domeniu de activare

transcripțională

III

N C TCF

Domeniu de interactie cu

alți factori transcripționali

TCF

C B

SRF COMPLEX TERNAR

A

B

C

SRF

A

Fig.25. Mecanismul de activare transcripțională al factorilor ETS

Regiune comună REL Repetitii ankyrin

N C

Domeniu Domeniu Domeniu Clivaj proteolitic

legare ADN dimerizare legare inhibitor

PROTEINA MATURĂ (p52)

PRECURSOR PROTEIC NEPROCESAT (p100)

Regiune comună REL

N C p65 (Rel A); Dorsal

Domeniu de activare

transcripțională

Fig. 26. Structura factorilor transcripționali REL

Domeniu reglator Secventă PEST Repetitii ankyrin

N C

Fig. 27. Structura proteinei IB/cactus

Fig.28. Modelele activării proteinelor REL

Domeniu de localizare nucleară

N C

Domeniu legare ADN Domeniu activare/represie

transcripțională

Fig. 29. Structura factorilor transcripționali T-BOX (TBX5)

Domeniu MADS-Box Domenii activare transcriptională

N C

Domeniu MEF2 Domeniu specific Secventă de localizare nucleară

muscular

Fig. 30. Structura factorilor transcripționali MADS-BOX

Fig.31. Modelele interacției factorilor transcripționali MADS-BOX cu ADN

MODEL 1 MODEL 2

MEF2 E12 MyoD

E12

MyoD MEF2

ADN ADN

E-BOX Situs legare MEF-2

MODEL 3 MODEL 4

E-BOX

MyoD

E12

MEF2

ADN ADN

MODEL 1 MODEL 2

Fig. 32. Interacția proteinelor HMG cu ADN

Proteină reglatoare Proteine reglatoare

Proteină HMG Proteină HMG

Proteine Polycomb

Element de răspuns Polycomb ADN

Modelul interacției proteinelor Polycomb cu ADN

Structura proteinei MeCP2

Domeniu legare Domeniu represie Secvențe

ADN metilat transcripțională repetitive

N C

Semnal localizare nucleară

Sin3

MeCP2

Deacetilaze histonice

MODEL 1

Octamer histonic

ADN

CH3

MeCP2

MODEL 2

Complex pre-inițiere incomplet

TFIIB

MeCP2

MODEL 3

Modele ale represiei transcripționale mediată de MeCP2

Promotor metilat

Promotor nemetilat

Gena globinei Gena globinei

Embrion

6 săptamâni Cromozom

11

Globina

Promotor metilat

Promotor nemetilat

Embrion

12 săptamâni

Globina

Metilarea regiunii promotor a genelor globinei în eritrocitele embrionului uman

Extragerea unui pronucleu Introducerea unui pronucleu de același sex

Pronuclei Solu\ie cu virus Sendai inactivat

Zona pellucida Ou fecundat

ACCEPTOR ACCEPTOR

Îndepărtarea

pronucleului ♀ Îndepărtarea

pronucleului ♂

DONOR ♀ ♂

ANDROGENETICI GINOGENETICI

Metoda de obținere a animalelor andro- și ginogenetice

MATERN PATERN MATERN PATERN

Igf-2 Igf-2

H19 H19 Igf-2r Igf-2r

Perechea de cromozomi 7 Perechea de cromozomi 17

Gene întipărite

Modele ale mecanismului de întipărire genomică

MODEL 1 MODEL 2

Metilare Metilare

Alelă întipărită Imprintor Alelă exprimată

represată represat

Alelă exprimată Alelă represată

Proteină represoare

codificată de imprintor

ARNm ftz

Membrană

laterală

Nuclei

Transportul nucleo-citoplasmatic al ARNm ftz la Drosophila

Nucleu colorat cu DAPI

ARNm ftz

ARNm oskar

Granule polare

A P

FECUNDARE

Celule polare

A P

ARNm oskar tradus

ARNm oskar degradat

Controlul spațial al stabilității ARNm.

Celule nutritive

Microtubuli 3’ + +

Nucleu

Canale

+ + inelare

Proteină purtătoare

+ + +

+ +

ARNm

Proteină

motoare

(dineină)

MTOC

Nucleu

5’

Ovocit

Transportul ARNm din celulele nutritive în ovocit, la Drosophila

ARNm bcd 5’

3’ Proteina Exuperantia

Proteina Swallow

+

Microtubul

Fig.14. Transportul ARNm bicoid

3’UTR

Proteina Nanos

ARNm hbm

5’ 3’An 5’ 3’ An

Secventă

recunoaștere

Nanos

Degradarea ARNm hbm/Blocarea traducerii

Proteină Hbm

Jumătatea anterioară a embrionului Jumătatea posterioară a embrionului

Fig.15. Reglarea traducerii ARNm hunchback la Drosophila

hb Kr kni

Micropil

Genele domeniilor

nerepetitive A P

tll

Genele perechi A P

Ftz eve

Genele polarității A P

segmentelor

wg

en Parasegment

wg en Embrion

Larvă

Segment

Fig. 19. Ierarhia controlului

genic embrionar la

Drosophila.

Kruppel knirps

hunchback Kruppel knirps

bcd _ Embrion mutant

bicoid

osk-- hunchback Kruppel

Embrion normal

Embrion mutant oskar

Fig. 20. Metoda prin care se stabilește dacă o genă influențează exprimarea altei gene, la

Drosophila.

Bcd Hbm ARNm hbm

Proteina Proteina Hbm Proteina Nanos

Bcd

Proteina Oskar

A P

hbz Kr kni Gene hbz Kr kni hbz Kr kni

Proteina Hbz Proteina Kr Proteina Kni

Regiune anterioară Regiune mijlocie Regiune posterioară

Fig. 21. Reglajul genic al genelor domeniilor nerepetitive la Drosophila.

Gena eve

ADN 1 2 3 4 5 6 7 TATA

Module reglatorii

Proteine

Giant

Bicoid Hbz Kr

ADN

MODUL 2 (Banda 2) MODUL 6 (Banda 6, alte benzi)

Situsuri de recunoaştere pentru proteine

Fig. 22. Reglajul genic al genelor perechi la Drosophila

Parasegment

Celule care exprimă wg Celule care exprimă en

Receptor Wg

Wg

wg hh en

Receptor Hedgehog Proteină Hedgehog

Limita dintre parasegmente

Fig. 23. Reglajul genic

al genelor polarităţii

segmentelor la

Drosophila

Fig. 8. Organizarea genelor Hox la mamifere şi corespondenţa lor cu genele

complexului HOM de la Drosophila.

lab pb Dfd Scr Antp Ubx abdA AbdB

HOM Cromozom 3 Drosophila

3' 5'

a1 b2 A3 A4 A5 A6 A7 A9 A10 A11 A13 Evx1

HoxA 3' 5’ Cromozom 6

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9

HoxB 3' 5' Cromozom 11

Şoarece

C4 C5 C6 C8 C9 C10 C11 C12 C13

HoxC 3' 5' Cromozom 15

D1 D3 D4 D8 D9 D10 D11 D12 D13 Evx2

HoxD 3' 5' Cromozom 2

Grup paralog 4

Anterior Posterior

Sensul transcrierii

Hoxb1 Hoxb2 Hoxb3 Hoxb4

3' 5'

AXA ANTERO-POSTERIOARĂ

Anterior

Celule ale crestelor neurale

Rombomere

R1

B1

R2

Ectoderm

R3

Hoxb1

R4

B2

R5

B3 R6

R7

B4 R8

Măduva

spinării

Hoxb2 Hoxb3 Hoxb4

Posterior

Fig.9. Exprimarera genelor din

extremitatea 3' a grupului Hoxb în

rombomerele (R) creierului

posterior. Arcuri branhiale (B1,

B2, B3, B4).

CERVICALE (7) TORACICE (13) LOMBARE (6) SACRALE (4) CAUDALE

Domeniu de exprimare Hox a7

Domeniu de exprimare Hox d13

Domeniu de exprimare Hox c6

D

O

M

I

N

A

N

T

A

P

O

S

T

E

R

I

O

A

R

A

Proteina Deformed (Drosophila)

N Homeodomeniu C

N Homeodomeniu C Proteina Hox b.4

(Mamifere)

Regiuni 20-30 AA Motiv YPWM

Fig. 10. Asemănările dintre proteinele Deformed de la Drosophila şi Hoxb4 de la mamifere.