cap3-2 enzime de restrictie

8/14/2019 Cap3-2 Enzime de Restrictie

1/8

Genetica microorganismelori inginerie genetic microbianNote de curs i tehnici de laborator

3.2. Enzime utilizate n tehnologia ADN recombinant

Enzimele de restricieIntroducere

Sistemele de restricie i modificare (metilare) au fost descoperite n urma analizei interaciilorbacteriofag-bacterie. ADN-ul fagic eliberat de o anumit tulpin bacterian poate infecta cu succesbacterii care aparin aceleiai tulpini, deoarece prezint acelai model de modificare ca i ADN-ul

gazdei. n cazul n care fagii meninui pe o anumit tulpin bacterian sunt transferai pe alta, ADN-ulfagic este atacat de enzimele de restricie ale noii gazde: bacteriofagul este restricionat la o tulpinbacterian.

Fenomenul de restricie nu este absolut; unii fagi nu sunt restrictai, fie pentru c prezintmutaii n situsurile recunoscute de sistemele de restricie ale gazdei, fie pentru c dobndesc unmodel de modificare similar celui al ADN-ului gazdei.

Principala caracteristic a unui sistem de restricie i modificare const n faptul c o tulpinbacterian prezint metilaze i endonucleaze care au aceeai specificitate de secvena. Metilaza vaadaug o grupare metil (la un rest de citozin sau adenin) la aceei secvena care este recunoscutde enzima de restricie. n urma metilrii un situs int devine rezistent la restricie.

La bacterii exist 3 sisteme de metilare, care induc formarea de 6-metiladenin sau 5-metilcitozin:

1. sistemul hsd, care determin un model specific metilare pe resturi de adenin care identific

bacteria gazd; exist la multe specii de bacterii, n unele cazuri determinnd i metilri peresturi de citozin;

2. sistemul dam este implicat n evidenierea catenelor de ADN nou replicate de catenele vechi;este implicat n controlul replicrii ADN i n marcarea catenelor ADN care sunt subiect pentrureparare;

3. sistemul dcm este implicat n metilarea citozinei; funciile sale in vivo sunt necunoscute.Specificitatea de gazd pentru o tulpin bacterian este dat de aciunea specific a acestor

metilaze, care dau un model de modificare al ADN-ului. Modificarea permite unei tulpini bacteriene sfac distincia ntre ADN-ul propriu i orice ADN strin, nelegnd prin ADN strin orice molecul deADN care nu prezint acelai model de metilare. Aceast difereniere face ca orice molecul de ADNstrin (fagic, plasmidial, cromosomal) s fie atacat i clivat de enzimele de restricie. Prin urmare, rolulsistemelor de restricie i modificare este acela de a proteja ADN-ul propriu de contaminare cusecvene de alt origine.

NomenclaturaDescoperirea unui numr foarte mare de enzime de restricie a impus adoptarea unei

nomenclaturi universale. Astfel, se folosete un cod de 3 litere, n format italic, prima litera semnificndgenul, iar celelalte 2 specia bacterian de la care a fost izolat enzima (spre exemplu, Eco Escherichia coli); n unele cazuri, o a patra liter (n format normal) indic tulpina bacterian (ex:EcoR). Dac o anumit tulpin bacterian are mai mult de 1 sistem de restricie-modificare, acestease identific prin numere romane : spre exemplu BglI si BglII.

Tipuri de siteme de restricie/modificareEndonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice, scurte,

legarea fiind urmat de clivare, fie la situsul de recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, nfuncie de tipul de enzim. Sistemele enzimatice de restricie/modificare (sau restricie/metilare) au

fost mparite n 3 categorii: Tipul I, Tipul IIi Tipul III. Tipurile I i III constau n enzime care au attfuncii de restricie ct i funcii de modificare; ambele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate,de ADN dc; enzimele de tip I cliveaz ADN-ul ntr-o manier randomizat (situs-nespecific), pe cndcele de tip III taie la situsuri specifice, dar nu n cadrul secvenei de recunoatere, ci la o distana de25-27 nucleotide de acesta (ex: EcoP1 codificat de fagul P1). Sistemele de tip II constau n enzimeseparate care ndeplinesc funciile de metilare, respectiv, restricie.

Existi un al 4-lea sistem de restricie/modificare care opereaz n sens invers: conine oenzim de restricie care recunoate i cliveaz o secvena de ADN metilat. Anumite tulpini deSteptococcus pneumoniae prezint enzimDpnI care cliveaz secven GATC numai dac aceasteste metilat; aceste tulpini nu prezint o metilaza care s metileze secvenele GATC. Alte tulpini aleacestei bacterii prezint enzima DpnII, care cliveaz GATC nemetilate, dar aceste tulpini prezintmetilaze specifice, care modific aceast secvent, astfel nct ADN-ul lor este metilat. DpnI poate fifolosit pentru restricia de substraturi metilate, substraturi pe care enzimele care recunosc aceeai

secvena sunt nactive (Mbo I, Sau3A I). Ambele sisteme vor restricta ADN-ul strin care intr ntulpina bacterian i prezint un model diferit de metilare; sistemele de restricie care recunosc icliveaz ADN metilat sunt rare i probabil mai puin eficiente, deoarece vor degrada doar moleculelede ADN care prezint un model specific de metilare.

1


2/8

Cap. 3-2 Endonucleaze de restricie

Tip II TipIII TipIStructura proteica Metilaze i endonucleaze

distincteEnzima bifuncional careconine 2 subuniti

Enzima bifuncional careconine 3 subuniti

Situs de recunoastere Secvene de 4-6 pb,adesea palindromice

Secvene asimetrice de 5-7pb

Secvene bipartite iasimetrice

Situs de clivare Acelai sau apropiat desitusul de recunoastere

La 24-26 pb n aval faa desitusul de recunoastere

Nespecific, la mai mult de1000 pb de situsul derecunoastere

Restricie i metilare Reacii separate Simultane Exclusive

Tab.3.2. Principalele tipuri de sisteme de restricie/modificare

Sisteme de restricie/modificare de tip IISistemele de restricie/modificare de tip II sunt cele mai des ntilnite (se ntlnesc la una din 3

tulpini bacteriene) i constau n endonucleaze i metilaze distincte, activitatea ambelor enzime fiinddependent de ioni de magneziu. Genele pentru endonucleazele i metilazele de tip II sunt adiacente n cromosomii bacterieni, n toate cazurile studiate pn n prezent. Metilazele sistemului II derestricie/metilare pot induce formarea de 5-Me-citozin, 4-Me-citozin (mai puin ntlnit) sau 6-Me-adenina. Enzimele de restricie de tip II au o secvena de recunoatere scurt, de 4-6 nucleotide, ncele mai multe cazuri palindromic. De exemplu, enzima EcoRI recunoate o secvenahexanucleotidic:

5-G-A-A-T-T-C-3

3-C-T-T-A-A-G-5Similar altor endonucleaze de restricie, EcoRI nu taie la nivelul axei de simetrie a secvenei

de recunoatere, ci spre captul 5, ntre G i A, ducnd la formarea de capete 5 coezive:

5-G-3 5-A-A-T-T-C-33-C-T-T-A-A-5 3-G-5

n mod similar, multe alte enzime de restricie genereaz fragmente cu capete 5 coezive;altele (ex: PstI) genereaz fragmente cu capete 3 coezive, n timp ce alte enzime taie la nivelul axeide simetrie a secvenei de recunoatere, ducnd la formarea de fragmente cu capete drepte. Spreexemplu, enzima BalI recunoate secvena

5-T-G-G-C-C-A-33-A-C-C-G-G-T-5

i taie la nivelul axei de simetrie ducnd la obtinerea de capete drepte :

5-T-G-G-3 5-C-C-A-33-A-C-C-5 3-G-G-T-5

Organizarea structural a enzimelor de restricie de tip IIEnzimele de restricie de tip II au fost i sunt folosite ca sistem model pentru a analiza diverse

aspecte ale interaciilor specifice ADN-proteine i mecanismele hidrolizei legaturilor fosfodiesterice.Pn n prezent, dei pentru cel putin 60 de enzime de restricie a fost determinat secvena deaminoacizi, au fost elucidate structurile tridimesionale numai pentru enzimele EcoRV, PvuII, EcoRI,BamHI, iar mai recent pentru Cfr10I i BglII. Analiza structurii primare a artat, surprinztor, o lips desimilaritate n ceea ce privete secvena de aminoacizi. Totui, n urma analizei structurilor secundarei tertiare, enzimele de restricie de tip II pot fi mparite n 2 subfamilii, n funcie de tipul de fragmente

de ADN generate dup clivare. Astfel, BamHI, EcoRI i Cfr10I hidrolizeaz secvenele derecunoatere n zigzag, ducnd la formarea de capete ADN 5 coezive, i sunt structural mai nruditentre ele dect cu EcoRV i PvuII, care cliveaz ADN-ul ducnd la obinerea de capete drepte. BglI, oendonucleaz care produce capete 3 coezive, este structural mult mai apropiat enzimele EcoRV iPvuII, dar actualmente nu este considerat ca reprezentant al unei subfamilii diferite.

n ciuda similaritii reduse la nivelul secvenei de aminoacizi, toate endonucleazele de tip IIprezint un centru catalitic similar care const n 5 catene -pliate flancate de 2 -helixuri. n acestcentru catalitic activ, conservat spaial, se regsesc 3 resturi de aminoacizi eseniali n activitateacatalitic a endonucleazelor. Aceste resturi de aminoacizi sunt reprezentate, n general, de 2 resturiacide (glutamat sau aspartat) i un rest de lizina (tab.3.3.). Singura excepie o reprezintBam HI careconine n situsul activ 3 grupri acide, 2 resturi de glutamat i unul de aspartat.

PvuII Eco RV BglI Eco RI Bam HI Cfr10IAsp58 Asp74 Asp116 Asp91 Asp94 Asp134

Glu68 Asp90 Asp142 Glu111 Glu111 Glu204Lys70 Lys72 Lys144 Lys113 Glu113 Lys190

Tab.3.3. Compoziia n aminoacizi a centrului catalitic activ pentru enzimelePvu II, Eco RV, BglI, Eco RI, Bam HI si Cfr10I.

2


3/8


Mecanismul de clivare al ADN

Enzimele de restricie de tip II necesit prezena de Mg++ pentru a cliva secvenele derecunoatere. Deoarece n urma clivrii ADN rezult molecule cu capete 5 fosfat i 3 hidroxil, sepresupune ca legturile fosfodiesterice sunt clivate prin activarea unei molecule de apa i ataculnucleofilic al acesteia asupra gruprii fosfat. Se consider c ruperea unei legturi fosfodiestericenecesit 3 componente: o grupare bazic care s activeze molecula de apa nucleofilic; un acidLewis, cum ar fi un ion metalic bivalent, necesar pentru a stabiliza sarcinile negative ale fosforului

pentavalent i un acid care va transfera un proton gruprii 3 hidroxil. Toate cele 3 resturi deaminoacizi din centrul catalitic al unei enzime de restricie de tip II sunt eseniali pentru clivare; mutaiin oricare din aceste situsuri duc la anularea sau la reducerea drastic a activitii de restricie.

Deoarece situsurile de recunoatere pentru enzimele sistemului II sunt simetrice, pot fimetilate ambele catene ADN. n aceste condiii, un situs de recunoatere poate fi gsit n starecomplet metilat (cu ambele catene ADN metilate), hemimetilat (doar una dintre catene metilat) saunemetilat. Astfel, in vivo, putem ntlni urmtoarele situaii:- situsurile complet metilate nu sunt supuse aciunilor de restricie sau modificare (metilare);- situsurile hemimetilate nu sunt recunoscute de enzimele de restricie, dar sunt recunoscute de

metilaze, care determin modificarea catenei nemetilate;- situsurile nemetilate pot fi inte att pentru restricie ct i pentru metilare; n general, un astfel de

situs este restrictat, fiind foarte rare cazurile n care ADN-ul nemodificat dobindete pattern-ul de

metilare al noii gazde.Metilazele nu adaug mai multe grupri metil per reacie; dac substratul este reprezentat de ADNnemetilat, enzima introduce o singur grupare metil, disociaz de pe ADN, fiind necesar o a douareacie de asociere la substrat/metilare pentru introducerea celei de-a doua grupri metil. Structural,metilazele prezinta 2 domenii separate de un an n care este legat ADN-ul; s-a dovedit ca secvenainta de ADN este denaturat local, restul de baz azotat care urmeaz a fi metilat fiind extras dindublul helix, este adaugat gruparea metil (n general, donorul de grupari metil este S-adenozil-metionin), dup care restul de baz azotat este dispus n poziia original.

n unele cazuri, secvenele de recunoatere tetranucleotidice apar n cadrul secvenelorhexanucleotidice ale altor enzime de restricie. Este cazul enzimelorMbo I i Sau3A I, care recunosc osecvena G-A-T-C, n timp ce Bam HI recunoate secvena G-G-A-T-C-C. Deoarece aceste 3 enzimegenereaz acelai tip de capete coezive, fragmentele de ADN obinute prin digestie cu Mbo I sau cuSau3A I pot fi clonate ntr-un vector digerat cu Bam HI.

Alte enzime de restricie din cadrul tipului II nu necesit secvene palindromice derecunoatere (Tipul IIs); aceste enzime vor tia ADN-ul la un numr precis de baze n afara secveneide recunoatere. Spre exemplu, Mbo II recunoate secvena 5-G-A-A-G-A-3, i taie la o distan de 8baze fata de captul 3 al acestei catene, i la 7 baze fa de captul 5 al catenei complementare.

Sisteme de restricie-modificare de Tip I si IIIA doua categorie de sisteme de restricie-modificare este reprezentat de tipurile I i III, care

constau n enzime multimerice ce prezint att activitate de restricie ct i activitate de metilare.Mecanismele de aciune ale acestor enzime sunt diferite unele de altele i de cele ale tipului II, fiindtotodat mai puin ntlnite.

Sisteme de restricie-modificare de tip IExista 3 familii de enzime de Tip I, codificate de grupuri de gene nrudite; sistemele Eco B i

Eco K aparin sistemului hsd, sunt primele descoperite, cele mai cunoscute, i reprezint unul dintre

aceste 3 grupuri. O enzim de restricie de tip I const n 3 subuniti diferite (Fig..3.26.). Astfel,enzima EcoK cuprinde subunitatile R2M2S: subunitatea R este responsabil de restricie, subunitateaM de metilare iar subunitatea S de recunoterea secvenei int de ADN. n urma recunoasteriisubstratului de ctre subunitatea S, legarea enzimei la ADN poate fi urmat fie de metilare fie derestricie. Activitaile subunitilor R i M sunt exclusive; subunitile M i S pot forma heterodimeri MS,care exprim funcia de metilare independent de cea de restricie.

Fiecare subunitate este codificat de cte o gena proprie: hsdR, hsdM i hsdS (Fig.3.27.).Mutaii n gena hsdR determin fenotip r

m

+; ADN-ul nu mai este restricionat, dar este metilat.

Mutaii n hsdSdetermin un fenotip r-

m-

, deoarece complexul enzimatic nu se mai leag la ADN.Mutaii n hsdMprevin att modificarea ct i restricia, ceea ce duce la concluzia c subunitatea Meste cumva implicat n funcionarea subunitii R. Acesta ar putea reprezenta un mecanism desigurana, care asigur ca mutantele hsdMs prezinte mai degrab un fenotip r

m

-, dect unul r

+m

-

care ar fi letal (n absena activitaii metilazei, ar fi restrictat i ADN-ul propriu). Situsurile derecunoatere pentru EcoB i EcoK sunt structuri bipartite, formate dintr-o secvena specific de 3 pbseparat prin cteva perechi de baze de o secvena specific de 4 pb. Faptul c cele 2 secvene

3


4/8


specifice sunt separate printr-o secven nespecific, sugereaza c ele sunt situate pe aceeai fa aADN-ului; secvena nespecific nu este implicat n recunoatere.

hsdR hsdM hsdS

ADN

ARNm

ARNm transcris de laal 2-lea start

Proteine

135kD 62kD 55kD

R M S

Enzima cu functiede restrictie-modificare

Complexul cu functiede modificare

(intilnit numai la )EcoB

Fiecare secven a situsului int esterecunoscut de cte un domeniu distinct al subunitii S.Recombinri ntre genele hsdS pot genera noi tipuri desubuniti de recunoatere care conin o combinaie dedomenii de recunoa

tere.

Structura situsului de recunoatere este:

T G A N N N N N N N N T G C TA C T N N N N N N N N A C G A

O anumit secvena de ADN este clivat saumodificat n funcie de starea n care se gasete situsulint: dac situsul int este complet metilat, enzima seleag la ADN, dar este eliberat fr reacii ulterioare;dac secvena int este hemimetilat, enzima metileazcatena nemetilat, perpetund modelul de metilare algazdei; dac situsul int este nemetilat, legarea enzimei

duce la clivare. Mutaii care permit enzimei s modifice unsitus nemetilat se gasesc n hsdM, ceea ce sugereaz cmetilaza este raspunztoare de detectarea strii n carese gsete inta.

Gruprile metil sunt furnizate de S-adenozil-metionin (SAM), care este convertit n S-adenozil-homocistein n timpul reaciei. n stadiul iniial al reaciei,SAM acioneaz ca efector allosteric, modificndconformaia subunitii S, ceea ce permite legareaacesteia la ADN. n urma legrii la ADN, enzimainteracioneaza cu ATP, hidroliza acestuia fiind necesarpentru clivare; SAM este eliberat de enzima anteriorreaciei de restricie (Fig.3.27).

Fig.3.26. Structura enzimelor de restrictie de tip I

n cazul enzimelor de tip I, clivarea nuapare la situsul de recunoastere, ci lao distan de circa 1000 pb fa deacesta. Cu toate acestea, alegereasecvenei ce va fi restrictat nu estentru totul ntmpltoare, unele situsurifiind clivate preferenial. Reacia declivare are loc n 2 etape: mai ntieste clivat una dintre catene ADN,apoi cealalt caten este clivat napropierea primei incizii; clivarea esteurmat de o activitate exonucleazic,nsoit de hidroliza extins a ATP. Ocaracteristic interesant a acestorenzime este aceea c proteinaramne permanent legat la ADN,chiar dac clivarea are loc al odistan de circa 1000 pb de situsul derecunoatere i legare.

SAM

SAM

SAM

SAMSAM

Enzima de restrictiemodificare

S-adenozil-metionina (SAM)

Forma activata a enzimei

ADN METILAT ADN HEMIMETILAT ADN NEMETILAT

ATP+SAH ATP +SAM

Enzima se desprindede pe ADN

ADN-ul este completmetilat

ADN-ul este clivat ladistanta de situsul de recunoastere

Fig.3.27. Modul de acine al enzimelor de tip I

4


5/8


Situsde legare Situs de clivare

Enzima se deplaseaza pe ADN

ADN-ul este curbat, situsul de clivarefiind adus in apropierea celui de legare a enzimei

[1]

[2]

Au fost emise 2 ipoteze privindrelaia dintre situsul de recunoatere icel de clivare:

a. enzima se leag la ADN la nivelulsitusului de recunoa

tere, apoi se

deplaseaz de-a lungul moleculeiADN pna la nivelul situsului derectricie (Fig.3.28.)

b. enzima ramne ataat la nivelulsecvenei de recunoatere idetermin plierea ADN-ului, prininteracia cu un alt domeniu delegare la ADN (Fig.3.28).

Cel de-al doilea model este maiplauzibil, fiind susinut de date demicroscopie electronic.

Fig.3.28. Relaia dintre situsul de recunoastere i cel de clizare pentruenzimele de tip I

Sisteme de restricie-modificare de tip III

Enzimele de restricie i modificarede tip III sunt mult mai rare, pn nprezent fiind caracterizate doar 3 astfel desisteme: EcoP1 i EcoP15 codificate deplasmidele P1 i P15 de la E.colii Hinf, dela H. influenzae serotip Rf. Fiecare enzimeste format din 2 tipuri de subuniti:

subunitatea R, responsabil de restricie isubunitatea SM responsabil pentrurecunoaterea ADN int i modificare(Fig.3.29.).

Situs de recunoastere

Situs de clivare

SubunitateaR (108kD)Subunitatea

MS (75kD)

Fig.3.29. Structura enzimelor de restrictie-modificare de tip III

Activitaile de restricie i modificare sunt exprimate simultan. ntr-o prima etapa, enzima seleag la ADN, aciune care necesit ATP; n urma legrii, funciile de metilare, respectiv restriciecompetiioneaz pentru a reaciona cu ADN-ul. Metilarea va apare la nivelul situsului de recunoatere;restricia apare la 24-26 pb fa de situsul de recunoatere, probabil pentru c enzima este suficientde mare pentru a contacta ADN-ul la acest nivel. Restricia const n 2 incizii n trepte, la distana de2-4pb.

Enzimele sistemului de tip III metileaz resturi de adenin, dar situsurile int pentru P1 i P15au o caracteristic interesant: pot fi metilate doar pe una din catene. Secvena acestor situsuri este:

A G A C CT C T G G (P1)

C A G C A GG T C G T C (P15)

n urma replicrii rezult 2 tipuri de situsuri de recunoatere: un situs care prezint restul deadenin metilat, similar modelului original i un situs nemetilat. Acest din urma situs reprezint o intatt pentru restricie ct i pentru metilare. Ce factori determin ca situsul nemetilat s fie metilat i nurestrictat? S-a dovedit c exist o diferena n cerinele pentru activitile de metilare respectivrestricie: metilaza poate recunoate i modifica un singur situs de recunoastere, pe cnd restrictaza

are nevoie de 2 situsuri inversate, ambele nemetilate (Fig..3.30.). Deoarece replicarea a 2 situsuriinversate duce ntotdeauna la secvene care au unul dintre situsuri metilat, aceste situsuri sunt intepentru modificare i nu pentru restricie.

5


6/8


AGACC

AGACC AGACC

AGACC AGACC

AGACC AGACC

GGTCT

GGTCT GGTCT

GGTCT GGTCT

GGTCT GGTCT

TCTGG

TCTGG TCTGG

TCTGG TCTGG

TCTGG TCTGG

CCAGA

CCAGA CCAGA

CCAGA CCAGA

CCAGA CCAGA

*

* *

*

*

*

*

*

Replicare Metilare

Restrictie

Numrul i dimensiuneafragmentelor generate de oenzim de restricie depind defrecvena cu care aparsitusurile de recunoatere aleenzimei respective. ntr-omolecul

de ADN care con

ine

50% GC, o secven derecunoatere de 4 perechi debaze va apare cu o frecvenade 44 (256) bp, o secvena de6 bp cu o frecvena de 64(1096) bp, iar o secvena derecunoatere de 8 bp cu ofrecvena de 84 (65536) bp.

Fig.3.30. Enzimele tipului III au nevoie de 2 situsuri inversate nemetilate pentrua exprim activitatea de restricie

Fragmente mici de ADN sunt obinute prin digestie cu enzime care recunosc secvene de 4bp, cum ar fi Hae III, utile n aplicaii cum ar fi ADN fingerprinting. Pentru cartare sau clonare

genomica, unde sunt necesare fragmente mari de ADN, se folosesc enzime care recunosc secven ede 8 sau mai multe bp; enzimele care recunosc secvene de 6 bp sunt cel mai des folosite pentruinserarea de ADN heterolog n vectori de clonare, vectori n care au fost introduse, prin ingineriegenetica, o serie de situsuri unice pentru endonucleaze, cunoscute ca polilinkeri sau situsuri depoliclonare.

Enzimele izoschizomere i neoschizomere n general, enzimele de restricie recunosc secvene de ADN diferite. Cu toate acestea, din gazdediferite au fost izolate enzime care au acelai situs de recunoatere. Enzimele care au aceeaisecvena de recunoatere i taie n aceleai poziii se numesc izoschizomere; spre exemplu, secvena

^G-A-T-C

este recunoscut de enzimele Mbo I i Sau3A I, care taie n aceeai poziie; prin urmare acesteenzime sunt izoschizomere.O enzim este neoschizomer fa de alt enzim dac ambele enzime recunosc aceeai secvena,dar au situsuri de clivare diferite:

C^-C-C-G-G-G XmaIC-C-C^-G-G-G SmaI

Endonucleaze de tip HomingAceste endonucleaze se pot autopropaga n cadrul unui genom ca urmare a func iei lor

catalitice. Aceste enzime se gsesc n toate regnurile biologice, i prezint mecanisme care asigurviabilitatea genomului gazda. O astfel de clasa de enzime (notata cu prefixul I, cum ar fi, spreexemplu, I-CreI) sunt codificate de ORF-uri coninute n grupul I de introni de la eucariote i bacterii,

ca i n intronii grupului archaea. O alt clas de astfel de enzime (notat cu prefixul PI PI-SceI)rezult din splicingul unor proteine precusor; n urma procesrii acestei proteine precursor, rezult oendonucleazi proteina homing funcional. Aceste endonucleaze invadeaz alele care nu coninsecvene de ADN codificatoare de endonucleaze, realiznd rupturi dublu-catenare la nivelul unorsecvene specifice de ADN; procesele de reparare i recombinare care urmeaza duc la conversiaalelei respective ntr-o form care codific pentru endonucleaze. Exist mai multe caracteristici caredeosebesc endonucleazele tip homing de endonucleazele de tip II tipice. Endonucleazele tip homingrecunosc secvene de ADN lungi, degenerate, de 15-40 pb. n al doilea rnd, endonucleazele degazd prezint similaritate de secvena, la nivelul secvenei de aminoacizi, secvena consens cel maides ntlnit fiind LAGLIDADG, care, n unele cazuri se ntlnete de 2 ori n cadrul aceleiai secveneproteice.

6


7/8


Recomandri generale pentru realizarea reaciilor de digestie a unor molecule de ADN cuendonucleaze de restricie

Principalele componente ale unei reacii de restricie ADNComponentele obligatorii ale oricrei reacii de restricie ADN sunt :

1. Enzima de restricie2. ADN3. Tamponul de reac

ie

4. a.d.s. (ap distilat steril)Aceste componente se adaug n urmtoarea ordine: a.d.s., tampon, ADN, enzim , toate n fundulunui tub Eppi mic (0.5 ml) steril, si nu pe peretii acestuia.Se lucreaza steril, cu mnui i se schimb vrful pipetei la fiecare component al reaciei i la fiecaretub de reacie (cu excepia primului component a.d.s.)Opional: n afar de componentele obligatorii, n anumite reacii de restricie este recomandabil s seadauge:

BSA (Bovine SericAlbumine) n concentraie final de 100 ug/ml (n mod special n reaciile derestricie a unor molecule mari de ADN, de ex. ADN cromosomal, sau n cazulanumitor enzime de restricie pentru care se consult cataloagele productorilor).

RNazaA n concentraie final de 100-200 ug/ml (n cazul n care n etapele de purificare a ADNnu a fost fcut si tratament cu RNazaA sau n cazul RFLP pe ADN cromosomal).

Enzima1 unitate [U] de activitate a unei enzime de restric ie este definit ca fiind cantitatea de enzimnecesar pentru digestia complet a 1 ug ADN substrat, n 60 min, la temperatura adecvat, folosindun tampon adecvat, ntr-un volum total de reacie de 50 ul. Aceast definiie este valabil n cazulfolosirii ADN din diverse virusuri (fag , fag T4, adenovirusul Ad-2, virusul SV40) i pentru vectorii declonare/exprimare.Cantiti recomandate :

Pentru digestia unor vectori de clonare 1 5 U / ug ADNPentru digestia unor molecule de ADN plasmidial extras din tulpini naturale de MO 4 8 U / ug ADNPentru digestia unor molecule de ADN cromosomal 5 15 U / ug ADN

Enzimele de restricie se stocheaz la 200C. La utilizare se menin pe gheata.n cazul majoritii enzimelor de restricie, concentraia produsului comercializat este de 10-20 U/l.Din acest motiv, n multe situaii este necesar efectuarea uneiprediluiia soluiei stoc de enzim ntampon de reacie.

Alegerea enzimeiEste preferabil s se fac n funcie de ADN-ul prob, fiind necesar s se tie pentru ce enzime derestricie prezint acesta situsuri de recunoatere.Alegerea enzimelor de restricie depinde i de scopul aplicaiei- pentru restricie de ADN plasmidial sefolosesc enzime obinuite (Eco RI, Hind III etc.), n timp ce pentru RFLP genomic, spre exemplu, sepoate opta fie pentru enzimele uzuale (cele de mai sus), fie pentru enzime de restric ie cu situsurirare.Se recomand, de asemenea, ca volumul de enzim utilizat s reprezinte ntre 1/10 i 1/5 din volumultotal de reacie.

ADN (cantitatea de prob, puritatea si concentraia acestuia)n reaciile de restricie, probele de ADN trebuie s fie:- suficient de pure, mai ales n ceea ce privete contaminanii proteici;- suficient de concentrate, dat fiind c se recomand ca volumul probei de ADN s nu depaeasc

1/3-1/2 din volumul total de reacie;ntr-o reacie de digestie trebuie introdus o cantitate de ADN suficient de mare pentru ca n gel s seobina fragmentele de dimensiunea dorit sau (n funcie de aplicaie) benzi vizibile.

Tamponul de reactieSe livreaz n preul enzimei. Este comercializat n form 10X (de zece ori concentrat), motiv pentrucare se adaug n amestecul de reacie n proporie de 1/10 din volumul total al acestuia.

Temperatura de reacieEste de 370C, pentru majoritatea enzimelor de reacie. Trebuie verificat, ns, ntotdeauna ntr-uncatalog de produse, deoarece exist

i enzime de restric

ie care au optimum-ul de activitate la diferite

alte temperaturi.

7


8/8


Timpul de reacieIndiferent de volumul de reacie, enzima de restricie utilizat, sau varianta tehnicii de lucru aplicatetimpul minim de reacie este de o or.

Tipul probei ADN digerate Timpul de reacieADN fag , vectori 1.5 - 2.5 hPlasmide naturale 3 - 5 hADN cromosomal 6 - 24 h

Variante de stopare a reaciei de restricie- scderea temperaturii amestecului de reacie pn la 200C;- adugarea la amestecul de reacie a 0,2 volume (fa de volumul total al amestecului) de

EDTANa2 0.5 M;- adugare de BFE sau BFER (n vederea ncrcrii gelului de electroforez).Electroforeza n gel de agarozConcentraia agarozei se apreciaz n funcie de dimensiunile presupse ale fragmentelor de digestie-spre exemplu, n cazul fragmentelor obinute la digestia ADN sau a vectorilor se utilizeaz agaroza0,8- 0,9 %. Tamponul de electroforez folosit: TBE 0.5X

8

cap3-2 enzime de restrictie

Documents