BACTERII

Metode de sterilizare utilizate n microbiologie

Sterilizarea este operaia de distrugere a microorganismelor prezente ntr-un mediu sau pe instrumentarul de laborator. Cunoaterea metodelor de sterilizare este necesar pentru desfurarea corect i reuita oricrei lucrri de microbiologie. Exist numeroase metode. Alegerea metodei potrivite depinde de natura materialului care va fi sterilizat (sticlrie, cauciuc, metal).

Clasificarea metodelor de sterilizare se face n funcie de natura operaiilor efectuate:

Metode care utilizeaz ageni fizici: cldura ( uscat, umed), radiaii UV, filtrarea, ultrasunetele. Metode care utilizeaz ageni chimici: substane antiseptice, substane dezinfectante. Metode care utilizeaz cldura uscat: incinerarea, nclzirea la rou, flambarea, sterilizarea cu

ajutorul aerului cald. Metode care utilizeaz cldura umed: fierberea, pasteurizarea, tindalizarea, autoclavarea

Principul metodelor care se bazeaz pe cldur- n cursul operaiei are loc degradarea proteinelor

microbiene pn la calcinarea materialului biologic. Cldura realizeaz distrugerea formelor vegetative la temperatura de 50- 60o C cam n 30 de minute. Dac se crete temperatura la 70o C formele vegetative sunt distruse n 10 minute. La 20o C cu cldur umed i la 100o C cu cldur uscat sunt distrui sporii.

Incinerarea const n arderea materialului biologic n cuptoare speciale sau crematorii. Prin aceast metod sunt distruse cadavrele animalelor scoase din exploatare ca i vata i tifoanele infectate.

nclzirea la rou este folosit pentru ansele bacteriologice care sunt meninute n flacra becului de gaz pn la rou, mai nti la baza flcrii, apoi la vrf. Ansa se sterilizeaz obligatoriu nainte i dup utilizare.

Flambarea const n trecerea prin flacra becului de gaz de cteva ori a obiectului care se sterilizeaz- lame de sticl, pipete gradate, pipete Pasteur, nainte de sterilizare, idem mnerul ansei i gtul eprubetelor i baloanelor nainte i dup utilizare.

Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficient msur de sterilizare cu cldur uscat. Carbonizarea materiei vii se face n etuve la 180o C timp de o or. Este o metod de sterilizare complet: se sterilizeaz sticlria de laborator, instrumentarul chirurgical. Nu se pot steriliza seringile cu armtur metalic i obiectele de cauciuc. Obiectele se pregtesc pentru sterilizare astfel: sticlria s fie bine splat i perfect uscat. Se mpacheteaz n hrtie de ambalaj fiecare obiect n parte. Toate eprubetele i baloanele se astup cu dopuri de vat nvelite n tifon, se leag cu sfoar i li se aplic un capion de hrtie. Pipetele se ambaleaz individual, sau n cilindrii metalici. Vata, compresele, pansamentele se sterilizeaz n casonete speciale (cutii de tabl cu perei dubli) peretele intern prezint orificii i peste el se afl o centur metalic ce astup orificiile dup ncetarea sterilizrii. Controlul sterilizrii la etuv se face amplasnd pe lng materialele de sterilizat, tubuoare de sticl care conin zaharoz al crei punct de topire este de 170o C Dac zaharoza este caramelizat nseamn c s-a atins temperatura necesar. Temperatura nu trebuie depit pentru c vata i hrtia ard producnd substane inhibitoare pentru microorganisme.

Cldura umed are o putere de penetrare mai mare- distruge microorganismele hidratate n timp mai scurt i la o temperatur mai sczut dect cldura uscat.

Fierberea const n fierberea instrumentelor chirurgicale, seringilor la 100o C timp de 20- 30 minute. Fierberea nu este o metod complet, sporii nu sunt distrui. Se face n fierbtoare electrice sau cu gaze i se recomand s se foloseasc ap distilat pentru a evita depunerea srurilor. Se recomand adugarea a 4- 5% carbonat de sodiu sau borax care ridic cu cteva grade punctul de fierbere i mpiedec ruginirea. Teoretic obiectele sterilizate pot fi utilizate 24 de ore. Se recomand folosirea lor imediat. Pasteurizarea este sterilizare incomplet, sunt distruse numai formele vegetative, nu i sporii. Este folosit la stilizarea laptelui i a berii. Se face prin nclzirea produsului la 56- 90o C timp de 30 minute. nclzirea se face pe baie de ap. Produsele astfel sterilizate se pstreaz ambalate ermetic la 4o C pn la momentul folosirii pentru a mpiedeca germinarea sporilor.

Tindalizarea este o pasteurizare repetat de 3 ori la intervale de 24 de ore. Se face la sterilizarea mediilor de cultur care conin diferite substane organice: glucide, gelatin, ser sanguin care se degradeaz la temperaturi mai mari.. n intervalul dintre sterilizri se pstreaz la temperatura camerei pentru ca sporii rmai nedistrui s evolueze la forme vegetative care vor fi distruse la viitoarea nclzire. Tindalizarea este o sterilizare complet.

Autoclavarea este sterilizarea cu vapori de ap sub presiune. Este cea mai folosit n practica microbiologic,. este o sterilizare complet i sigur. Cu vapori de ap sub presiune se obin temperaturi peste 100o C. La 0,5 atmosfere temperatura este de 115o C La 1 atmosfer temperatura este de 121o C La 2 atmosfere temperatura este de 134o C

nclzirea se face timp de 20 de minute. Materialele sterilizate sunt materialele infectate, culturile microbiene vechi, casonete cu instrumentarul medical, medii de cultur, obiecte din cauciuc. Sterilizarea se face n autoclav care este un cazan de tabl cu pereii dubli cei interni prezentnd orificii prin care trec vaporii.

Antisepticele substane care mpiedec multiplicarea microorganismelor. Aceste substane au n general, aciune microbiostatic, acioneaz n concentraii mici i pentru timp scurt pot fi aplicate pe esuturi vii. Exemplu. Alcoolul etilic de 70o ,KMnO4 0,1%, tinctura de iod, acidul boric , H2O2 ,detergenii cationici de tip bromocet 0,1%.

Dezinfectanii sunt substane care au n general, aciune microbicid, care distrug microbii de pe diferite obiecte neanimate. Exemple: formol, fenol, cloramina. Alcoolul absolut de 96o este un dezinfectant foarte slab, el acioneaz prin coagularea proteinelor.

Tipuri morfologice de baz la bacterii

Forma bacteriilor este controlat genetic, ele ncadrndu-se ntr-un anumit tip morfologic i anumite dimensiuni. Forma poate fi influenat i de condiiile de mediu, totui polimorfismul este limitat- domin forma tipic pentru specia dat. Convenional forma bacteriilor se apreciaz pe bacterii din culturi tinere, aflate n cretere activ, cultivate pe medii corespunztoare i n condiii optime de temperatur, PH i presiune de oxigen adecvat. Dup form deosebim 5 tipuri:

Bacterii sferice- coci, aproape izodiametrice, uor ovalare, poliedrice, reniforme. Dup modul de grupare la sfritul diviziunii

-coci izolai -grupate cte dou

-tetrada

- sarcina

-streptococ

- stafilococi

Bacterii cilindrice ( bacili )- celule alungite- bastona, dar sunt i forme de tranziie, ntre coci i bastonae- cocobacili. Capetele bacililor pot fi:

- rotunjite

- tiate drept

- ascuite

- picot

Pot fi: -izolai

- grupai cte-doi

- n palisad -streptobacili

- n rozet

Diplococcus pneumonie

Micrococcus tetragenes (4 celule)

Sarcina lutea (8 celule)

Streptococcus pyogene (celule n lan)

Staphylococcus aureus (ciorchine)

diplococi

Corynebacterium diphteriae

Lactobacillus sp.

Agrobacterium stellatum

-grupri neregulate 3.Bacterii spiralate (elicoidale) Dup numrul spirelor i dup aspect sunt mai multe subtipuri:

-vibrion

- spirili cu ture de spir rigide

-spirochetele cu ture de spir flexibile:

-strnse - relaxate 5. Bacterii ptrate.

Descoperite n 1980 n Sinai de Walsby. Aparin genului Qadra, grupul Arhebacteriilor. n afara tipurilor de baz sunt i forme rare de bacterii: bacterii pedunculate, bacterii care nmuguresc, bacterii cu apendici acelulari rezultai din produi de excreie, bacterii care formeaz trichoame (lanuri de bacterii reunite de o teac polizaharidic comun, dar pot tri i izolat).

Minicelulele- sunt corpusculi mici, sferici care nu cresc, ei se formeaz printr-o septare neobinuit a celulelor bacteriene. Se formeaz la extremitatea unor bacterii- Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella i Vibrio. Aceste minicelule nu au material nuclear, nu cresc i nu se divid, au totui metabolism propriu (cu enzime) sunt rezistente la radiaii ionizante. Sunt importante pentru cercetare, vor fi folosite ca vaccinuri vii.

Vibrio cholerae

Spirillum volutans

Treponema pallidum

Leptospira sp.

Studiul mediilor de cultur utilizate n bacteriologie

Mediul de cultur este un produs nutritiv preparat artificial n laborator n vederea cultivrii microorganismelor. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

Compoziia chimic s fie corespunztoare pentru dezvoltarea microorganismelor S asigure sursa de C, N ,srurile minerale i vitaminele PH-ul ntre 7- 7,5 pentru bacterii i 5,5- 6 pentru drojdii Mediul s fie steril Umiditatea mediului s fie corespunztoare S se asigure protecia fa de lumin S se asigure cerinele pentru oxigen n funcie de tipurile de microorganisme: aerobe, microaerofile,

anaerobe Asigurarea temperaturii de dezvoltare de 25- 28oC pentru germenii saprofii i 37oC pentru germenii

patogeni. Cele mai utilizate medii de cultur sunt mediile uzuale sau simple. Mediile uzuale pot fi lichide- exemplu bulionul simplu de carne, sau solide- exemplu geloza nutritiv. Etapele preparrii unui mediu de cultur:

Stabilirea compoziiei chimice a mediului n funcie de tipul de microorganisme Cntrirea substanelor n ordine din reet i dizolvarea lor n ordine n din cantitatea de ap, se

adaug restul de ap, se corecteaz PH-ul fie cu HCl 10% fie cu NaOH . Dac este cazul se filtreaz Sterilizarea mediului printr-o metod adecvat- filtrare, tindalizare, autoclavare Reete pentru