UNIVERSITATEA ACADEMIEI DE STIINTE A

REPUBLICII MOLDOVA

CATEDRA DE BIOLOGIE

Referat

TEMA: Mecanismele moleculare ale apoptozei

Autor:Biriţa Cristina

Chisinau 2015

1

Cuprins:

1Introducere-----------------------------------------------2

2Mecanismele moleculare ale apoptozei.-------------3

3 Fazele procesului apoptotic-------------------------------7

4 Morfologia apoptozei-----------------------------------9

5 Genetica apoptozei-------------------------------------12

6 Biochimia apoptozei-----------------------------------13

7 Embriogeneza------------------------------------------19

8 Reglarea mitocondriala-------------------------------20

9 Apoptoza versus necroza--------------------------------21

10 Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice 24

11 Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia

cancerului -------------------------------------------------27

12 Bibliografie --------------------------------------------33

2

Introducere

Apoptoza (din limba greacă: αποπτωσις, apo = departe şi ptosis = cădere, termen referitor la

"căderea frunzelor" toamna) este o formă a morţii celulare programate, proces prin care

celulele declanşează propria lor auto-distrugere ca răspuns la un anumit semnal. Apoptoza este o

moarte celulară fiziologică, programată genetic, necesară pentru supravieţuirea organismelor

pluricelulare, în echlibru constant cu proliferarea celulară. Termenul a fost propus în 1972 într-

un articol publicat în British Journal of Cancer de către John F. Kerr de la Universitatea

din Queensland (Australia) împreună cu Andrew H. Wyllie şi Alastair R. Currie de la

Universitatea din Aberdeen (Scoţia), ca rezultat al observaţiilor lor făcute în cursul studiilor

efectuate asupra ţesuturilor cu microscopul electronic. Fenomenul fusese deja remarcat

în 1842 de cercetătorul german Carl Vogt; o descriere mai amănunţită aparţine anatomistului

englez Walther Flemming (1885).Hippocrate din Cos (460 - 377 î.Chr.) folosise deja termenul

de apoptosis pentru a descrie "căderea oaselor" în procesul de descompunere a ţesuturilor după

moarte.

Apoptoza se deosebeşte de alte forme de moarte celulară programată, prin faptul că este

caracterizată de prezenţa unui grup de enzime cu activitate proteolitică, aşa numitele caspaze,

care joacă un rol primordial în procesul de auto-distrugere. Acest proces poate fi provocat din

exteriorul celulei (de ex. prin factori imunitari), sau din interior, în urma unei modificări a

informaţiei genetice.

Cercetările asupra apoptozei au căpătat o amploare spectaculară în ultimii douăzeci de ani. În

afara importanţei sale ca fenomen biologic, o desfăşurare defectuoasă a apoptozei are o

semnificaţie deosebită în patogeneza multor maladii. O activitate apoptozică excesivă poate

cauza pierderi celulare, ca în unele boli neurodegenerative (de ex. boala Parkinson), în timp ce o

apoptoză insuficientă poate implica o proliferare celulară necontrolată, mecanism ce stă la

baza neoplasmelor(cancere)

Modelul mortii celulelor - pe calea apoptozica sau a necrotica - e dependenta si de

concentratiile intracelulare de NAD+ si ATP. Micsorarea nivelului de NAD+ si ATP induce

necroza celulara (F.Oliver si al., 1999, P.Nicotera si al., 1997).

   Intr-un organism sanatos moartea programata celulara (MPC) este un mecanism de

mentinerea homeostaziei. Atat hipofunctia, at si hiperfunctia apoptozei are in consecinta

dereglari de homeostazie. Se considera actualmente, ca MPC este o etapa naturala de

activitate a celulelor animale

3

Mecanismele moleculare ale apoptozei.  Apoptoza este un proces multifazic. Prima faza consta in primirea semnalului, aparitia unei

informatii, transmisa in celula din exteriorul ei sau generata in compartimentele ei. Semnalul

este fixat de receptor si supus analizei. Apoi semnalul este consecutiv transmis de mesagerii, de

diferit rang, pana la nucleu, unde si are loc includerea programei sinuciderii celulare prin

activarea genelor letale sau represia celor antiletale. Realizarea MPC in sistemele nucleare,

confirma ca prezenta nucleului nu este un component obligatoriu pentru efectuarea acestui

proces.

   Referitor la celulele animale si ale omului, apoptoza in majoritatea cazurilor este

dependenta de activatia proteolitica a cascadei de caspaze - o familie de proteaze cisteinice,

evolutiv conservative, care specific scindeaza proteinele dupa resturile de acid aspartic. In

corespundere cu omologia structurala caspazele se deriva in subfamilii:

a) caspazele 1 (1,4,5),

b) caspazele 2 (2 si c) caspazele 3 (3, 6-10) (V.Kidd, 1999). E stabilit, ca apoptoza poate

parcurge si fara aceste enzime: superproducerea proteinelor- promotori ai apoptozei Bax si Bak

induc MPC in prezenta inhibitorilor caspazelor.

   In rezultatul actiunii caspazelor are loc:

☻activarea procaspazelor, cu formarea caspazelor;

☻scindarea proteinelor antiapoptozice din familia Bcl-2.

☻hidroliza proteinelor laminelor, ce stabilizeaza membrana nucleara, cu condensarea

cromatinei;

☻distrugerea proteinelor, participante la reglarea functiei citoscheletului;

☻inactivarea si dereglarea reglarii proteinelor ce iau parte in reperarea DNA, splaisigului

mRNA, replicarii DNA. Tinta caspazelor este poli (ADP-ribozo) polimeraza (PARP).

Aceasta enzima participa la repararea DNA, catalizand poli (ADP-ribozilare) proteinele,

legate de DNA. (Новомилова A. si al., 1996, Oliver F. si al., 1999).

   Exista cateva cai de realizare a MPC (Новомилова A si al. 1996, Raff M. 1998, Kumar S si

al. 1999, Aravind L. si altii 1999):

   1. Calea determinata de inductorii fiziologici, actiunea carora se realizeaza prin recep- torii

celulari, ce au functia de a include mecanismele programei apoptozei. Schematic ar putea fi

in felul urmator: inductor > receptor > adaptori > caspazele initiale > reglatori > caspazele

finale. Receptorul (Fas) interactioneaza cu ligandul (FasL) (proteina transmem- branara a T-

Kiler), se activeaza si include PMC infectata de virus (desen 1). 4

. Apoptoza celulei tinta dependenta de Fas-receptor sub actiunea T-limfocitelor (T-kiler)

Astfel, la interactiunea cu FasL pe suprafata limfocitelor -T sau a anticorpului la Fas-

receptor mor beta-limfocitele, producatoare de anticorpi ce duc Fas-receptor, care nu sunt

necesare organismului insanatosit.

   FasL – ligandul e componentul familiei factorilor necrotici ai tumorilor (TNF) - o

familie numeroasa de liganzi homotrimeri. Fas - prezinta proteine transmembranare, care cu

locusurile extracelulare interactioneaza cu trimerii liganzilor. Interactiunea receptor-ligand

duce la formarea clasterelor receptorici cu fixarea locusurilor intracelulare de adap- tori. Ultimii,

fixandu-se pe receptori, intra in actiune cu efectorii - cu caspazele initiale, deocamdata neactive.

Interactiunea descrisa se realizeaza prin proteine omofile –interac- tiune proteica a domeniilor

mici: DD (death domain - domeniul mortii), DED (death efec- tor domain - domeniul efectorului

mortii), CARD (caspase activation and recruitment do- main - domeniul activarii si recrutarii

(inhibitiei) caspazei). Toate au structura asemanatoa- re, contin sase alfa-catene. Mai bine e

studiata procaspaza 8. Agregatul FasL - Fas - FADD (Fas - associated DD-protein) - procaspaza

8 se activeaza, purtand denumirea de apoptoso- ma (Green D.S., 1998) sau semnal-complex, ce

induce moartea (disc- death-inducing sig- naling complex) (Peter H.si al, 1997)), sau ciaperonine

apoptozice (Hengartner M., 1998).

   Procaspazele poseda o activitate proteolitica joasa (1-2%) fiind in forma monomerica,

concentratia lor in celula e mica. Se considera ca apropierea spatiala la agregarea lor duce la

formarea caspazelor active prin auto- sau transscindare. In rezultat, de la procaspaza (masa

moleculara = 30-50 kDa) se detasaza domeniul N-reglator, iar restul moleculei diso- ciaza in 2

subunitati: mare (20 kDa) si mica (aproximativ 10 kDa)

5

   In continuare are loc asocierea lor in tetramer cu 2 centre catalitice independente, ce apare

in citozolul celulei. Sunt descrise si alte cai de activare a caspazei 8.

   La faza activarii caspazelor initiale viata celulei poate fi pastrata. Sunt descrisi regla- torii,

care blocheaza sau accelereaza efectul destructiv al caspazelor initiale.

                

. Activarea procaspazelor prin scindare proteolitica in subunitati cu asocierea lor ulterioara.

Caspaza 8 activeaza caspaza finala (caspaza efector): prin proteoliza se genereaza caspaza 3,

dupa ce procesul MPC devine ireversibil

                    

. Interactiunea functionala intre caspazele initiale si efectoare (finale) subfamiliei caspazei 3.

6

Caspaza 2 are doua forme, una (ICH-IL) initiaza si alta (ICH-IS) inhiba apoptoza.

Substratele intra- celulare nu sunt redate. Caspaza 3 se poate autoactiva, activand alte caspaze si

DFF, ce duc la liza ireversibila a DNA in fragmente nucleozomale.

   2. In celulele, supuse actiunii inductorului apoptozei, brusc se micsoreaza potentialul

membranar, ce duce la majorarea permeabilitatii membranei interne mitocondriale, ca

consecinta la formarea porilor. (Bernardi P si al. 1998). Deschiderea porilor e determinata de

micsorarea cantitatii de glutation redus, NAD(P)H, ATP, ADP.

   Recent se confirma ca un rol-cheie in apoptoza il poseda mitocondriile. Unul din

simptomele cele mai timpurii ale apoptozei e depolarizarea membranei interne mitocon-

condriale. Atit apoptoza, cit si depolarizarea membranei mitocondriale se protejeaza prin

utilizarea inhibitorilor, ce blocheaza formarea de pori in membrana interna.

   O analiza minutioasa confirma prezenta unei legi fundamentale, ce are o arie de ras-

raspindire majora in lumea animala. Si, in final, se presupune, ca diferite cauze pot provoca

apoptoza, insa numai un singur mecanism permite celulei sa-si realizeze ultimatumul mor- tal.

Care-i cauza ca celula a ales anume acest mecanism foarte compus de realizare a apop- tozei?

   In 1994 s-a expus ipoteza ca celula aeroba poseda un sistem esalonat de aparare la

formarea superoxidului - O.-2. Acest sistem functioneaza in ansamblu cu mecanismele anti-

oxidante, ce neutralizeaza superoxidul format sau produsele transformarilor ulterioare.

   In celulele fara DNA mitocondrial (p°) apoptoza poate fi provocata de factorul necro- tic

cancerigen (TNF), dar nu de antimicina A. In celulele martor (p+), ce poseda mitocon- drii cu

DNA, ambele substante induc apoptoza. Se confirma ca natura semnalelor primare ce provoaca

apoptoza e diferita. TNF e un semnal exterior de autodistrugere, caruia celula se supune.

Antimicina A este un inhibitor specific absolut, care blocheaza transportul e- intre hemul bh si

citocroma b .

   Dintre proteinele mitocondriale, ca factori apoptogeni sunt si: citocrom c, procaspazele 2, 3,

9; proteina AIF (apoptosis inducing factor), ce prezinta o flavoproteina cu masa mole- culara de

57 kDa.

   Citocrom c impreuna cu factorul citoplasmatic APAF-1 (apoptosis protease activating factor

-1) ia parte la activarea caspazei 9. APAF -1 joaca rolul de schelet, unde are loc procesingul

autocatalitic al caspazei 9. Modificarile conformationale, dependente de ATP duc la fixarea

cit.C (desen 4), cu aparitia a noi conformatii. Oligomerizarea duce la deschiderea CAKD

pentru procaspaza 9 cu domeniul identic. In final se formeaza o apoptosoma cu masa

moleculara aproximativ 1,3 mln daltoni, ce contine minimum 8 subunitati APAF-1.

Apropierea conformationala a moleculelor de procaspaze 9 pe fundamentul multimeric

APAF-1-cit.C duce la activarea caspazei 9. Caspaza 9 scindeaza si activeaza procaspaza 3.

7

Flavoproteina AIF provoaca in celulele HeLa condensatia cromatinei si fragmentarea

DNA, iar adaosul la mitocondriile ficatului de sobolan - eliberarea cit.C si a caspazei 9.

Efectele descrise nu sunt inhibate de inhibitorul caspazelor - L-VADfmk, care

preintampina apoptoza, indusa de cit.C. AIF - este un efector mitocondrial al MPC ce activeaza

indiferent de caspaze.

             

. Model de formare a apoptosomei si activarea procaspazei 9.

Fazele procesului apoptotic

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular

este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3

optiuni posibile

Celula poate fi:

1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza

(celula aflata in faza G0);

2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0→G1→S→G2→mitoza)

3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata

(G0→D1→F→D2→fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata

(necroza) (figura 2).

8

Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1

defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este

ceruta pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se

fragmenteaza in corpi apoptotici.

Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza a ciclului

celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de crestere ce

regleaza progresia in interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt independent

determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei in cauza. Astfel, acelasi factor de

crestere (ex: factorul transformant de crestere – β1) poate avea efecte agoniste sau antagoniste in

cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al proliferarii celulare in celulele

mezemhimale sau inductor al arestului in G0 sau progresia prin fazele apoptozei pentru celulele

epiteliale).

Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:

- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil

angajata pe calea mortii;

- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;

- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.

9

Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru prima

data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punct de vedere

al mecanismului.

Morfologia apoptozei

Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate in

interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarile morfologice

care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatina condenseaza si

formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un model conformational semilunar.

Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o degradare ordonata a ADN-ului de catre

o nucleaza endogena dependenta de cation (9), intai in fragmente mari de 30-50 kilobaze (10)

pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechi de baze (11). Totusi, clivarea cromatinei la

fragmente nucleozomale nu are loc in toate tipurile celulare si poate fi inhibata fara a bloca

celelalte modificari ale apoptozei (12,13). Odata cu condensarea cromatinei este alterata

ultrastructura nucleara. Lamina nucleara si reteaua de filamente intermediare care mentine

integritatea anvelopei nucleare si distributia porilor nucleari sunt clivate proteolitic (14-16).

Astfel, distrugerea structurii retelei nucleare ar putea permite alaturarea porilor nucleari (17) si

faramitarea nucleului in fragmente ce contin cromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale

membranei nucleare. Celelalte organite citoplasmatice raman intacte din punct de vedere

structural cu toate ca difunctiile mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (18)

Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului transmembranar

mitocondrial, necuplarea transportului de electroni de la sinteza ATP-ului si cresterea generarii

de specii reactive de oxigen. In citoplasma apare cross-linkarea de proteine prin actiunea

transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agrega in formatiuni paralele si reticulul

endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu membrana plasmatica creand cratere in forma de sac la

nivelul fuziunii. Se poate specula faptul ca celula sufera o alterare profunda a citoscheletului. Cu

toate ca, pana in momentul de fata, aceasta problema nu a fost studiata in detaliu, exista exemple

in care distrugerea citoscheletului duce la angajarea celulei pe calea apoptotica, in timp ce,

stabilizarea citoscheletului inhiba apoptoza. In apoptoza, membrana celulara se umfla si se

cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in necroza, fenomenul a fost numit zeioza.

Integritatea structurala a membranei este ulterior compromisa prin pierderea asimetriei

fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare. Celula se sfericizeaza, se indeparteaza

10

de vecinii sai si se contracta dramatic si expulzeaza protuberante care se separa in “corpi

apoptotici” inveliti in membrana. In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice si corpii apoptotici

sunt recunoscuti si fagocitati rapid de catre celulele vecine sau macrofage.

Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi

izolate atata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma

dispersata si cromatina nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b)

Celula a pierdut o parte din volum si organitele citoplasmatice sunt strans impachetate, se

observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt prezente modificarile membranare

care duc la fagocitoza. (c) Celula etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei in

forma de semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e)

Nucleul are acum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar

membrana se cuteaza vormand vezicule. (g) Fragmentele celulare continute in corpii

apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.

Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica interactii ale lectinelor

macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-acetil specifice exprimate pe suprafata celulelor

apoptotice, interactiile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din stratul exterior al

membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de suprafata celulara, ce contin

11

resturi incomplet caracterizate, de pe suprafata celulelor apoptotice (20). Exista evidente ce

sugereaza ca mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie de populatia de fagocite.

Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte celulara este clerance-ul rapid si

eficient al resturilor apoptotice de catre fagocitele vecine, amatoare sau profesioniste, deoarece

previne raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea distrugerii celulare si deversarea

proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiul extracelular.

Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul proces demareaza rapid si

este complet terminat in cateva ore (21). Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cu

tipul celular si stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o cale

comuna. Totusi, stadiul de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pana la initierea

fazei ireversibile de executie este extrem de variabil si depinde de tipul celular, de stimulul

apoptotic, de situarea in cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factori modulatori ai

mortii. Multi factori care influenteaza angajarea sau susceptibilitatea celulara la apoptoza sunt

implicati direct in receptia si transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factori reglatori sunt

frecvent selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazice sau dezvoltarii

rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii virale.

Perioada de fragmentare a ADN poate fi utilizata pentru dividerea in serii temporale a

evenimentelor implicate in apoptoza mai mult decat perioada sintezei de ADN ce este utilizata

pentru impartirea ciclului celular proliferativ (22). Pe parcursul fazei D1 apoptotice, celula sufera

o reprogramare genetica, proces pe parcursul caruia gene care erau normal exprimate acum sunt

supresate si invers (23-26). Aceste modificari epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu

catenara a ADN pe parcursul fazei F. Pe parcursul acestei faze F morfologia nucleara se schimba

(marginalizarea nucleara a cromatinei urmata de condensarea nucleara si eventual de

fragmentarea nucleului insusi), cu toate ca membranele plasmatica si lizozomala sunt inca intacte

si mitocondria inca functionala. Pe parcursul urmatoarei faze, portiunea D2, apare inmugurirea

membranei si eventual fragmentarea celulara in clustere de corpi apoptotici inveliti in membrana.

12

Genetica apoptozei

In pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea stiintifica este foarte

dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice si

moleculare in sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis elegans reprezinta

un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de util (76). Pe parcursul

dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului sunt eliminate 131 din 1090 celule in cadrul unui

program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spatio-temporal. Astfel, s-a

identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice ale procesului apoptotic si

genele corespunzatoare care au fost ordonate intr-o schema genetica .Aceste gene sunt implicate

in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acestei cai, in inglobarea celulelor muribunde si

in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii. Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4

sunt necesare pentru toate formele de apoptoza din cadrul dezvoltarii si se considera a codifica

efectorii finali ai cai apoptotice. O alta gena reglatoare cheie, ced-9, este necesara pentru supresia

apoptozei in celulele programate sa supravietuiasca (77). Aceasta gene codifica o proteina

omologa cu familia Bcl-2 din sistemul uman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2 poate inhiba

apoptoza in nematode si poate chiar substitui partial pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica

faptul ca cel putin cateva componente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile

survenite in 6 gene afecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine non-

profesionale. Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera

comparabila cu omologii lor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si

extensia citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1 activeaza atat in celula

muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este

analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil,

inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 .

13

Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce

afecteaza apoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii

afecteaza doar un numar mic de gene. Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune

tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea mortii. Activitatea lui ced-3 si

ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.

Biochimia apoptozei

Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile

evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai

plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare

imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice

ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intr-un mod adecvat. A fost observata

umflarea cisternelor reticului endoplasmic.

Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de degradarea

lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nu este inca bine

caracterizata. Totusi, initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractarea apoptotica se 14

realizeaza atat de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara, citometria in flux poate

ajuta la caracterizarea modificarii si in combinatie cu sortarea celulara poate inlesni o patrundere

mai profunda in ordinea evenimentelor.

Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moarte

celulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ce

produce necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula

initial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la stimuli

vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabila de evenimente

metabolice ce au loc in cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe tipuri celulare

apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul, poate activa latent

enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul apoptozei. Aceste enzime includ o

endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza invariabil ADN si o transglutaminaza

care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente (calpaina) degradeaza

citoscheletul.

In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, reclama sinteza

activa a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitele mature,

agentii care inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei; din contra,

in neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi amplifica apoptoza.

Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelor contin proteine reglatoare

care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-un tip particular celular,

comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate determina daca sistarea

sintezei de ARN si proteice previne sau induce apoptoza.

15

Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru β-tubulina inainte de aparitia

modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma

cantitati crescute de β -tubulina. Probabil ca, genele pentru β-tubulina sunt degradate impreuna

cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30). Agentii care interfera cu

polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previn inmugurirea celulara ce duce

la formarea corpilor apoptotici fara a bloca fragmentarea nucleului sau clivajul DNA (31)

Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.

Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie dar au

fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenti cum sunt acridin

oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de la un tip celular la altul dar, in

general, nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteaza si, in final se

leaga strans de anvelopa nucleara.

Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitati regulate

ce formeaza o “scara” ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la nivelul

regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un milion de astfel

16

de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are loc sistarea transcriptiei

(32).

In ultimii ani a existat o controversa cu privire la dimensiunile fragmentelor de

ADN, produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe calea mortii

celulare.

Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioara reprezinta

o celula normala. Imaginea inferioara reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza;

sagetile indica fragmente de cromatina condensata.

Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra in apoptoza ADN-ul

genomic este degradat in fragmente mici nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi au

existat rapoarte ce sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice fara

producerea “scarii” de ADN nucleozomal (33-36, 37).

O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala a ADN

in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu (Ca2+) (11,

38). De asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub diferite

forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular (Ca i) (39-

43) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD (44,

17

45). Celulele raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului in interiorul unei organite

intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica. Astfel de transport de Ca2+ este

catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-

aze Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+ in afara celulei un astfel de transport ar

putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau transportat in afara celulei (46).

In modelul propus de Filipski in 1990 este privit ca fiind ordonat in bucle de cromatina

bine stabilizate de cate 50 Kb, aceste bucle sunt infasurate in structuri hexamerice numite rozete

si continand aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeaza subunitatea de baza a cromatidei

rasucite.

Au fost studiate activitatile endonucleolitice asociate cu fragmentarea ADN cu masa

moleculara mare cu ajutorul tehnicii PFGE (pulsed field gradient gel electrophoresis). S-a

observat, in toate tipurile de celule studiate, o activitate dependenta de Mg2+ capabila de

producerea fragmentelor de la 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost necesari pentru

fragmentarea ulterioara la oligonucleozomi (47-49). Aceaste experimente au sugerat ca ar putea

fi necesare doua enzime separate pentru fragmentarea completa a ADN pe parcursul apoptozei.

Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular (50) s-a observat ca pentru degradarea ADN de

masa moleculara mare sunt de asemenea necesare cantitati nanomolare de calciu, complicand

astfel explicatia fenomenului de clivare. De asemenea s-a observat ca fragmentarea

internucleozomala de ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor al endonucleazelor

Ca2+ si Mg2+ dependente (51, 52).

In continuare s-a demonstrat faptul ca fragmentarea internucleozomala a ADN in

apoptoza nu este randomica (53). Fragmentarea apare preferential in elementele repetate ale

ADN care au un rol in organizarea structurala a cromatinei.

18

Modelul Filipski et al. (1990) ce prezinta structura cromatinei. Sagetile corespund

situsurilor de clivare ale cromatinei.

De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta din regiunea domeniilor

“rozeta” si/sau “bucla” ce contin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazei secundare de

degradare. S-a aratat ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu este alterata pe

parcursul apoptozei (54). Aceasta indica faptul ca in conditiile unui nivel ridicat de Ca2+

fragmentarea de ADN are loc in interiorul “buclelor” de ADN la un numar strict de loci si nu e

dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitatea generala a

regiunilor linker (55). Luand in considerare toate aceste date se poate spune ca fragmentarea

endogena a ADN pe parcursul apoptozei se produce in 3 etape (fig. 6). Prima etapa incepe cu

activarea unei endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de atasare a matricei si

citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari ale cromozomului la matricea

nucleara. Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficienta pentru activitatea ei. Nu este

nici o cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-au evidentiat astfel o serie de

fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de apoptoza. A doua etapa implica

propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceasta propagare are o dependenta de Ca2+

sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G si toata cromatina este redusa la

fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se cliveaza ADN internucleozomal la regiunile linker din

interiorul “buclelor” si genereaza “scara” ADN. Aceasta clivare este relativ independenta de

secventa (in termeni legati de situsurile ce leaga nucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica. De

asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza (56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar

putea realiza extensia finala a fragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul. Toate

aceste etape de degradare sunt catalizate de o enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati

DNaza-I like.

19

Embriogeneza

Moartea programata a celulei joaca un rol important in dezvoltarea embrionara a plantelor si

animalelor. Genele implicate in dezvoltarea ontogenetica sunt implicate in apoptoza diferentiata

a organelor in dezvoltare si a diferentierii celulare. Spre deosebire de necroza, apoptoza este

determinata de contractarea si fragmentarea celulei fara varsarea continutului celular inafara

celulei, aceasta faciliteaza fagocitarea de catre macrofagi (wikipedia), iar arhitectura tisulara si

celulara adiacenta  este pastrata intacta si ea umple spatiile lasate goale de catre celula apoptotica

Afectarea genelor implicate in declansarea specifica a apoptozei poate da nastere la diferite

malformatii ale dezvoltarii diferitelor organe. De exemplu: perturbarea apoptozei specifice in

dezvoltarea degetelor la om poate provoca sindactilie:

Dezvoltarea celulelor limfocitare B si T sunt controlate de sortarea celulara in maduva osoasa

respectiv timus pentru maturare si indeplinirea functiei pe care trebuie sa o indeplineasca.

Maturarea incompleta a acestor celule declanseaza intracelular cai de semnalizare care duc la

apotoza celulelor incompetente de indeplinirea functiei date ( de exemplu sinteza de anticorpi).

Celulele citotoxice-T sunt capabile sa interactioneze direct cu membrana celulara a celulelor tinta

eliberand substante care induc apoptoza in celula infectata cu un virus sau care nu este capabila

de functionarea normala. Formarea porilor de interactiune cu celulele tinta este data de cercetarea

perforinelor si de granule care contin granzima B, proteaze serinice care impreuna activeaza o

varietate mare de cai de semnalizare cu implicarea caspazelor cu o actiune de taiere a proteinelor

la nivelul asparaginei.

20

Reglarea mitocondriala

Mitocondria indeplineste un rol esential in organismele multicelulare. Fara mitocondrii celula

inceteaza sa respire aerob si moare repede. Proteinele implicate in declansarea apoptozei se leaga

specific de mitocondrie si o distruge partial eliberand diferite molecule care declanseaza moartea

programata a celulei. Aceste molecule pot declansa o umflare a membranei si eliberarea

anumitor componente intramitocondriale. Oxidul de azot este capabil de a disipa potentialul

membranar al mitocondriei astfel membrana este mai permeabila pentru anumite componente.

Proteinele membranare SMAC (second mitochondia-derived activator of caspases) sunt eliberate

in citosol in urma permeabilitatii membranei. Aceste proteine se leaga specific de IAPs

(Inhibotor of Apoptosis Proteins) le dezactiveaza astfel inhibarea apoptozei este distrusa si celula

nu mai poate supravietui si este declansata apoptoza. IAPs de asemenea activeaza protezele

cisteinice cunoscute sub numele generic de Caspaze care declanseaza degradarea celulei.

Prin afectarea membranei mitocondriale de asemenea se elibereaza Citocromul C prin

intermediul canalelor MAC (mitochondrial apoptosis-induced chanel). Citocromul C eliberat din

mitocondrie leaga specific proteina Apaf1 si ATP care impreuna cu pro-caspaza 9 formeaza un

complex proteic care este apoptosoma. Apoptosoma taie pro-caspaza 9 rezultand caspaza 9, care

la randul ei activeaza caspaza 3.

.Activarea apoptosomei de catre citocrom C si pro-caspaza 9

21

Apoptoza versus necroza

Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular. Dovezile

sprijina ipoteza existentei unui “program de sinucidere” inerent in celulele vertebratelor care

este activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restului comunitatii celulare.

In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie

distincta: apoptoza si necroza (3, 4), insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca

complet intelese.

NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si

mai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si

gradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se dilata.

Initial se observa inmuguriri reversibile ale membranei, modificari timpurii in conformatia si

functia mitocondriilor si celula devine rapid incapabila de a mentine homeostazia. Depasind un

prag, procesul devinde ireversibil. Membrana celulara poate deveni situsul major al alterarilor

pierzandu-si astfel capacitatea de reglare a presiunii osmotice, celula se umfla si crapa.

Deteriorarile membranelor interne permit eliberarea enzimelor lizozomale, continutul celulei este

imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca un raspuns inflamator nespecific.

Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, ce

determina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta sau

traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic (5),

22

. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si

necroza (7 si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin

compactarea si marginalizarea cromatinei, condensarea citoplasmei si plierea

membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si

protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici,

care (4), sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este

asociata cu gruparea neregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a

membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi mentine

intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele mononucleare.

APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil. Este

adesea echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele doua concepte

distincte - cel morfologic si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie de modificari

morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari diferite de cele observate in

necroza, fiind asociata cu procesul normal de reglare a tesuturilor (fig. 1). La vertebrate, moartea

celulara este acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat previzibil, dar “programarea” ei

nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a celulelor individuale, care in anumite

cazuri poate fi apreciata, cu mare acuratete, ca fiind programata (6, 7). In ultima vreme suntem

fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moartea celulara este atat programata cat si

stohastica. De exemplu, pe parcursul dezvoltarii populatiilor de celule B, aproximativ 95 % din

celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate de motive (rearanjament genic imperfect sau absenta

stimularii) dar este imposibil de prevazut dinainte care dintre ele se va produce.

Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de celule invecinate, asa

cum se intampla in necroza.

Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci cand moartea celulara

este determinata fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu

perioada de injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involutia

celulelor lipsite de factorii de crestere necesari; moartea morfologica a celulelor pe parcursul

evolutiei embrionare si postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drept tinte

celulelor T, celulelor natural ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celular dependente

de anticorpi.

23

Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un tip celular la altul la fel

si mecanismul de declansare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediul inconjurator, ca

in expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de crestere. Acest aspect

este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se traduce prin faptul ca soarta unei

celule este dependenta de activitatea alteia; chiar daca moartea este programata, locusul

programului este in afara celulei care trebuie sa moara. In alte cazuri, de exemplu turnoverul

neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern autonom care ar controla programul de moarte a

celulei (adevaratul program de moarte celulara autonom a fost identificat la nematode si genele

ce controleaza acest proces au fost elucidate (8). Caile de activare a apoptozei vor fi diferite in

diferite celule, dar mecanismul de moarte in sine va fi mereu acelasi, ceea ce inseamna ca exista

o cale finala comuna. Este foarte important ca in studiul apoptozei sa incercam sa facem

distinctia dintre procesele care sunt specifice celulei de cele care sunt specifice mortii. Se pare ca

exista multe mecanisme declansatoare ale cailor de sinucidere, chiar si intr-un singur tip de

celula. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediat ca fiind “programate”. De exemplu, pentru a

activa calea apoptotica, timocitele pot fi semnalizate de catre glucocorticoizi sau de o cross-

linkare a receptorului pentru antigen, in acest caz, ambii stimuli fiind considerati fiziologici. Dar,

timocitele vor suferi un proces apoptotic identic dupa expunerea la o doza mica de radiatii

ionizante sau la o otrava. Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este fiziologic, in acest caz

moartea celulelor nu poate fi strict definita ca fiind programata. Totusi definitia poate fi largita in

sensul ca in anumite celule, cand sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o “moarte

programata”. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte severa pentru ca programul sa

poata fi exprimat: daca timocitele sunt mentinute la 43ºC vor muri prin necroza, dar daca se

revine, suficient de rapid, la o temperatura de 37ºC, vor muri prin apoptoza. S-a sugerat ca, ar fi

prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de tipuri de leziuni, atata vreme

cat o reparare imperfecta ar putea duce la instalarea autoimunitatii sau a leucemiei in astfel de

cazuri celulele activandu-si mecanismul apoptotic.

24

Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice

Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de

recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartate inaintea

lizei lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata ce

semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste

(macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si celule musculare netede din peretii

vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi receptori pe macrofage si alte celule ce

leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati de receptori lectin-

like (65), receptorul pentru vitronectine αvβ3 (66), CD36, receptorul de recunoastere al

fosfatidilserinei (67), inca necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger (69). De curand, s-a

demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobarea celulelor mamaliene

apoptotice, mediaza transportul anionic fiind omolog genei ced-7 asociata cu fagocitoza corpilor

apoptotici in C. elegans. Mecanismul prin care acesti receptori mediaza fagocitoza celulelor

apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu sunt inca bine caracterizati. Cu toate

acestea comun multor celule ramane expunerea fosfatidilserinei pe fata externa a membranei

plasmatice, acest fosfolipid parand a fi recunoscut intr-o maniera stereospecifica de catre

subseturi de macrofage, de catre celule melanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor

de sange si de celule Sertoli. In mod normal, fosfolipidele de membrana sunt distribuite

asimetric.

Macrofagele sunt “fagocite profesioniste” ce indeparteaza celulele si corpii apoptotici,

dar la acest proces pot participa si alte tipuri celulare, ca de exemplu celule epiteliale si tumorale

ce pot ingloba celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice, macrofagele nu

elibereaza agenti de tipul eicosanoizilor si citokinelor (70). Lipsa acestui raspuns pare a fi

determinata de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt ingerate, dat fiind ca celulele

apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai macrofagelor, induc, de

exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele apoptotice nu sunt preluate de catre

macrofage, ele se umfla si se dezintegreaza eliberandu-si continutul. Daca ar avea loc un astfel

de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile inflamate, eliberarea

continutului granulelor citoplasmatice ar avea consecinte nefaste. Mai mult decat atat, evadarea

nedorita a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi de asemenea periculoasa,

nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula sinteza de ADN si

imunoglobuline in limfocitele viabile (71). Prin urmare, este posibil ca dezintegrarea limfocitelor

25

apoptotice (presupus neingerate) sa constituie o sursa de ADN nucleozomal circulant, observat

de altfel la anumiti pacientii cu lupus sistemic eritematos, contribuind la stimularea policlonala a

celulelor B tipica pentru aceasta afectiune autoimuna si tintind autoanticorpi catre paturile

vasculare, cum ar fi glomerulii renali, in care componentele nucleozomale circulante s-ar putea

lega (72).

Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catre

fagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice.

Lectinele fagocitelor

Un mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta legarea carbohidratilor de la

suprafata celulara a unei celule de lectinele altei celule, mecanism ce poate fi inhibat specific de

catre zaharuri simple recunoscute de lectine.

Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de modificarile specifice ale

carbohidratilor de pe suprafata membranei celulare. Se presupune ca pierderea, printr-un

mecanism inca necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile laterale

glicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina si galactoza,

mascate in conditii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cu presupusele

lectine macrofagice

26

Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea recunoaste celulele ce intra in

apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelor

Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoaste neutrofile si

limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) αvβ3 si

receptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ce

serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Se pare ca aceasta recunoastere este

independenta de expunerea fosfatidilserinei le suprafata membranei celulei apoptotice si pare a fi

legata de fenotipul macrofagului si nu de tipul celulei apoptotice.

Receptorii pentru fosfatidilserina

Este clar ca macrofagele pot recunoaste fosfatidilserina intr-o maniera dependenta de

doza si de stereospecificitate, fapt ce sugereaza existenta receptorului pentru FS. Au fost descrisi

o serie de receptori cu rol in medierea recunoasterii FS si anume CD68, CD14, anexinele,

receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I si gas-6. Exista si date care sugereaza recunosterea FS

de pe celulele apoptotice de catre fagocite “amatoare”. Nu se stie totusi daca acesti receptori sunt

specifici pentru FS. Cel mai probabil este ca mai multi receptori pot lega FS, dar ramane inca sub

semnul intrebarii daca ei pot recunoaste FS pe suprafata celulara.

Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte “nedorite” a fost subestimata.

Pana nu demult, inglobarea celulelor apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva a

celulelor nedorite (75). Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o noua

semnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de catre fagocite poate

supresa inflamatia, poate modula deletia directionata a celulelor gazda sau a parazitilor invadanti

de catre macrofage si poate regla raspunsul imun

27

Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia

cancerului

Implicatiile apoptozei in patologie

Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte celulara excesiva,

insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii umane.

Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia si

severitatea mai multor dereglari neurodegenerative ce includ maladia Alzheimer, scleroza

laterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii si

chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este corelata cu

sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta a acestui

proces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative.

Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in genele activatoare ale

mortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele supresoare de moarte este incriminata in

transformarea neoplazica. Virusurile si-au dezvoltat mecanisme care manipuleaza calea

apoptotica pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri, inhiband apoptoza celulelor

infectate pentru a permite replicarea virala si activand apoptoza mecanismelor celulare de

28

aparare ale gazdei. Tinand cont de aceste realitati, manipularea cailor apoptotice prin interventie

farmacologica sau genetica promite noi oportunitati terapeutice pentru o serie de maladii.

Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in doua mari categori. Apoptoza apare in

tesuturile normale, unde raspunde de deletia celulelor si este de asemenea observata in contexte

patologice specifice. Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fi sustinut

teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice. Supravietuirea celulelor in curs de

distrugere ar putea fi nociva gazdei. In contrast, necroza este totdeauna patologica fiind

consecinta lezarii majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica (9).

Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un medicament induce

apoptoza intr-un limfocit, de obicei ne furnizeaza mai multe date despre celula decat despre

medicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestui

proces in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi folosit in prevenirea

pierderii celulei acordand timp altor forme de terapie sa inlature infectia. In cancer, dimpotriva,

va avea valoare terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne. Modul de

obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o provocare la fel ca in cazul

agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele mai stralucite

inventii ale naturii, stiu cum sa ucida specific.

O alta potentiala terapie e reprezentata de anticorpii declansatori ai apoptozei, dar foarte

importante sunt si imunotoxinele ce ascund liganzi ce induc apoptoza.

Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei este necesara

descoperirea mecanismelor si moleculelor implicate.

Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desavarsit, capabil sa

elimine celulele nedorite; noua ne revine dificila sarcina de a descoperi cum sa inducem

organismului comutarea procesului pe “on” sau “off”, la comanda.

Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata nu ar fi posibile fara

un mecanism de indepartare individuala a celulelor care nu mai sunt necesare sau care nu mai

functioneaza normal. Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol in

etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale sistemului nervos

central. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera noi posibilitati de profilaxie si tratament

acestor maladii.

29

Transformarea maligna

Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge

fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau

tratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate sau

initiate promoveaza carcinogeneza.

In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de

vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund

pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale (hiper- sau

hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti, singulari sau

multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule “bizare”, cu

nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezinta semnele citologice

ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite varietati de cancer, celulele tumorale au un aspect

morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul de malignitate este dificil

de hotarat si in astfel de situati se apeleaza la alte criterii, in particular arhitecturale.

Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune.

Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prin

numarul de mitoze pe unitatea de camp microscopic, are o valoare data contribuind la evaluarea

prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat, ca cel care se

poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer, diagnosticul de

malignitate se bazeaza pe indicele mitotic (79).

Apoptoza si cancerul

Oncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate

acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul

apoptoze

Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani in

urma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare ce apar in

tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si activarea

in tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea, chemoterapia

citotoxica, ablatie hormonala (81,82). Totusi, in ultimii ani, extinderea cunostintelor despre

controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei ei potential oncologice

depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia celulelor tumorale. In

30

particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsii unor anumite proto-

oncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetari.

Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea anormala de celule se

produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii celulare,

determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult mai incet

decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda datorita prelungirii timpului de viata

al celulei.

Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentru

replicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri: poate

intarzia diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza sau poate progresa

fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.

Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne deoarece ea

indeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promova

dezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea

indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se cunosc factorii care

determina celula sa urmeze una din cele trei cai: intrarea in apoptoza dupa leziune, repararea

deteriorarii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care stimuleaza diviziunea

celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat . Concentratiile de ARN si proteina

pentru c-myc cresc timpuriu in apoptoza si supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza

in fibroblaste .

Oncogena bcl-2 ar putea fi “supresorul general al mortii celulare” pentru genele care

regleaza direct apoptoza . Toate celulele hematopoetice si limfoide, multe celule epiteliale si

neuronii contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul

endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie crescuta de proteina Bcl-

2, datorita translocatiei [t(14:18)] care plaseaza gena bcl-2 sub controlul unui promotor puternic,

cel al genei ce codifica pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului Epstein-Barr

cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt .

Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2 supravietuiesc mai mult

in cultura dupa privarea de factori de crestere si sunt rezistente atat la radiatii ionizante cat si la

glucocorticoizi. De asemenea, concentratiile crescute de Bcl-2 protejeaza celulele de apoptoza

indusa de catre c-myc (85). Soarecii transgenici, care au fost inginerizati pentru a supraproduce

proteina Bcl-2, in limfocitele B, deseori dezvolta limfoame imunoblastice cu celule mari si

31

difuze. La jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarca translocatia genei

c-myc .

Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului celular

inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la

nivelul genei p53 . Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega si inactiva

proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului prin permiterea

duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este

doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o “apoptogena” directa (o

gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica

mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza .

Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli externi, uneori numiti

semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseaza evenimentele

metabolice comune atat replicarii cat si apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre

replicare, altminteri survine apoptoza.

Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge celulele incapabile sa

strabata “punctul de vama” inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competente

activate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o

leziune intr-o perioada critica.

32

Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agenti

alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibile (89). In

urma acestor observatii este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de

interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducand la

apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca, in

diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care degradeaza ADN

pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferi apoptoza

poate fi importanta in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de crestere, care

sunt de obicei rezistente la agenti citostatici.

Aparitia spontana a apoptozei in tumori

Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine

studii cantitative precise (90), evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei in

anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida

evidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila.

Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil,

diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza, unde se

presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauza cunoscuta a

activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice (91, 92).

S-a aratat ca, TNFα (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza in liniile de celule

tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fi

atribuite eliberarii acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptoza poate

fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice. Totusi, un nivel ridicat al

apoptozei este observat si in locusurile preneoplazice si in nodulii ce se dezvolta in ficat dupa

administrarea de carcinogeni chimici (93), este improbabil ca factorii mentionati ar putea fi

operativi in aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare ale

populatiilor celulare, descrise mai sus, actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului de

carcinogeneza, cu o apoptoza crescuta ce echilibreaza temporar cresterea proliferarii celulare. In

sfarsit, nivelurile crescute de apoptoza in tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec al acestor

celule. Ratele de apoptoza gasite in tumori similare difera fiind rezultatul expresiei diferitelor

oncogene.

33

Bibliografia :

1https://ro.wikipedia.org/wiki/Apoptoz%C4%83

2https://www.academia.edu/11550272/Fenomenul_apoptozei_celulare

3http://aosr-neamt.ro/wp-content/uploads/2014/03/Apoptoza-I.pdf

4 R.J. Smeyne, M. Vendrell, M.Hayward, S.J. Baker, G.G. Miao, K. Schilling, L.M. Robertson, T. Curran, and J.I. Morgan, Nature, 363, 166-169 (1993)

5 K. Murao, V. Terpstra, S.R. Green, N. Kondratenko, D. Steinberg and O. Quehenberger, J. Biol. Chem., 272, 17551-17557 (1997)

34