curs biochim analitica prof.dr. anton ciucu
Post on 04-Apr-2018
242 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
1/82
ASPECTE TRATATE IN CURS
Aspecte generale legate de biosenzori;Discutie sumara asupra grupelor majore de enzime redoxutilizate in constructia biosenzorilor:
OxidazeDehidrogenazePeroxidaze
Avantajele si dezavantajele utilizarii enzimelor redox inproiectarea si constructia biosenzorilor;Aspecte legate de TME si TDE;Avanatajele analitice ale TDE;
Aplicatiile biosenzorilor in detectia:Metalelor grele
PesticidelorFenolilor
Peroxizilor anorganici si organici
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
2/82
Una dintre provocarile actuale din domeniul chimiei
analitice o reprezinta simplificarea metodologieide lucru pina la nivelul de la care determinarea practica,
de rutina a analitului de interes sa se desfasoare
rapid
fara o pretratare a probei
cu un minimum de cerinte asupra deprinderile practice ale operatorilor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
3/82
OBIECTIVELE CHIMIEI ANALITICE
In acest sens unul dintre
REACTIVI SELECTIVI
UNOR METODE ANALITICE SELECTIVE
este dezvoltarea
bazate pe folosirea unor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
4/82
ENZIMELE
REACTIVI FOARTE SELECTIVI SI VERSATILIexistente in natura care pot fi integrate cu
UN TRADUCTOR FIZICO-CHIMIC
Obtinindu-se astfel un instrument analitic denumit in sens generic
BIOSENZOR
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
5/82
Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalulbiochimic intr-un semnal masurabil (cuantificabil)
Ce este un biosensor?
Analiti Bioreceptor(cataliticafinitate)
Traductorfizico-chimic
Componentaelectronica
Reprezentarea schematica a unui biosenzor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
6/82
DEFINITIA BIOSENZORILOR
Instrumentul are drept scop detectia (reversibila si selectiva) a concentratiei
speciilor chimice in orice tip de proba..
D. R. Thevenot, K. Toth, R. A. Durst, G.S. Wilson, Biosens. Bioelectron., 16 (2001) 121-131
El este capabil sa genereze o informatie analitica specifica cantitativa sausemicantitativa (IUPAC,1996)
Biosensorul este un instrument analitic care consta dintr-un componentbiologic responsabil pentru recunoasterea selectiva a anlitului, aflat incontact intim (spatial direct) cu un traductor adecvt.
Interactia specifica de tip cheie-lacat dintre analit si biocomponentconduce la o modificare a unui parametru fizico-chimic care este detectat
de traductor, masurat si procesat
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
7/82
Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor
BIOCOMPONENT
TRADUCTOR
Analati
ELECTROCHIMIC,OPTICCALORIMETRICPIEZOELECTRIC
ENZIME, ANTICORPIORGANITE, CELULE
METABOLITI, IONI, GAZEVAPORI ORANICI
Interactiecheie-lacat
Etapa generariisemnalului
Transmitereasemnalului
Amplificare siprocesare
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
8/82
Trebuie facuta o distinctie clara intre un biosenzor si:
Sistemul bioanalitic
necesita etape aditionale de procesare (prelucrare) a probeicum ar fi adaugarea de reactivi
Bioproba
care fie este de unica folosinta si se arunca dupa o singura masurare,
fie nu este capabila de a monitoriza in mod continuu concentratiaanalitului de interes
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
9/82
CLASIFICAREA BIOSENSORILORFunctie de:
Elementul de recunoastere
molecularaTipul traductorului Reactiile
monitorizate
ex. redox
hidroliza
Speciile monitorizate
Monitorizare directa a Monitorizare indirecta a
-concentratiei de analit
-reactiilor in care se consuma sau
se produc substrate noi
Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de
recunoastere biologica
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
10/82
TRADUCTORUL
BIOMOLECULAR
(asigura selectivitatea
biosenzorului)
Avantaje Dezavantaje
Enzime Selectivitate si activitate mare Stabilitate limitata
SinzimeSisteme mutienzimatice Cresterea posibilitatilor de
imobilizare, marirea
gamei de compusi
detectabili
Cresterea interferentelor,
probleme legate de
optimizarea conditiilor de
lucru
Organite celulare
Tesut animal sau vegetal Simplitatea constructieibiosenzorului, marirea gamei
de compusi detectabili
Cresterea interferentelor si a
timpului de raspuns al
biosenzorului
Microorganisme Varietate mare, simplitateaconstructiei, posibilitati de
regenerare
Selectivitate redusa, timp mare
de raspuns
Anticorpi
monoclonalipoliclonali
Selectivitate mareRelative ieftini
Cost ridicatSelectivitate limitata
Acizi nucleici
Aptameri
Receptori celulari selectivi instabili
Receptori sintetici
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
11/82
TRADUCTORUL
FIZICO-CHIMIC
(asigura sensibilitatea
biosenzorului)
Modul de masurare
(marimea masurata)
Avantaje Dezavantaje
Electrochimic Potentiometric (potentialul)
Amperometric (curentul)
Impedimetric (impedanta)
Domeniu mare de
raspuns;
instrumentatie
simpla
Variatie liniara a
raspunsului
Variatie logaritmica a
raspunsului;
selectivitate
limitata
Posibile interferente
Coductometric Conductivitatea
(conductanta)
Pret de cost scazut neselectivi
Optic/optoelectronici
(absorbanta,
fluorescenta,
luminiscenta,
unda
evanescenta)
Optic
fibre opticeDimensiuni mici,
raspuns rapid,
maresc domeniul
compusilor
detectabili
Instrumentatie
speciala, probleme
in cazul solutiilor
tulburi
Piezoelectric Modificari de masa(frecventa)
Dimensiuni reduse Raspuns lent
Termistori Calorimetric/thermometric
(caldura/temperatura)Simpli, raspuns liniar Neselectivi, dificultati
de lucru in faza
gazoasa
Magnetic
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
12/82
TRADUCTORII FIZICO-CHIMICIUTILIZATI IN CONSTRUCTIA
BIOSENZORILOR
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
13/82
Stabilitate mica a biomoleculelor
Pret de cost ridicat pentru enzime si receptori
Necesitatea adaugarii unor compusi suplimentari (ex. Oxigenul, cofactori)
Probleme legate de imobilizarea biocomponentilor
Performante scazute in medii neapoase
Compatibilitate scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in
dificultati legate de proiectarea multisenzorilor
Dimensiunile moleculare
PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
14/82
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
15/82
SCOPUL UNUI BIOSENZOR
Este acela de genera o informatie certa (de incredere) in timp util asupracompozitiei chimice a unei probe.
continuureversibil
sa nu conduca la perturbarea saucontaminarea probei
Biosenzorul trebuie in mod ideal sa raspunda
Masuratorile realizate trebuind a firapide
de increderela un pret de cost scazut
Astfel de instrumente vor permite realizarea masuratorilor multor compusi deimportanta chimica si biochimica in afara laboratorului direct pe teren
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
16/82
Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinatin cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei
Poate fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil)
Dispozabil (de unica folosinta)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
17/82
BIOSENSORIIau fost clasificati functie de modul de transfer deelectroni dintre enzima si electrod in 3 generatii
La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometricbiosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cuconcentratia compusului de analizat
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
18/82
SENZORII ELECTROCHIMICI
Reprezinta o clasa de sensori chimici care s-a dezvoltat cel mai rapid
datorita simplitatii generarii semnalului electrochimicsi de aceea au fost des utilizati ca traductori in constructia biosenzorilor.
Sensorii amperometrici beneficiaza de o serie de avantaje legate de:Sensibilitatea lor marePretul de cost scazut
Usurinta fabricarii lor in masa, in diferite formate si de orice dimensiune
Un biosensor electrochimic este considerat a fi un electrodchimic modificat deoarece in constructia lui materialul deelectrod electronic, semi-electronic conductor sau ionic conductoreste acoperit cu un film biochimic
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
19/82
Enzox
Enzred
e-
electrod
S
P
Transfer de electroni
Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal deutilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere
ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transferdirect de electroni cu suprafata electrodului
A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587
Oxido-reductazele enzimele redox reprezinta o clasa binecunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si
folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
20/82
Problema care se pune este legata de posibilitatile de a serealiza un transfer eficient de electroni de la cofactorul
unuei enzime redox spre suprafata electrodului si invers laun potential aplicat mic!
A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587.
Centrul actival enzimei
electrod
=
Transferul direct de electroni blocat
datorita impiedicarilor de ordin
steeric sau al restrictiilor cinetice
e-
Transferul direct de electroni (DET) intre centrul activ al uneienzime redox si suprafata de electrod este de cele mai multe ori blocat.
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
21/82
Centrul activ
al enzimei
electrod
Transferul de electroni are loc in 2etape
1: intre enzima si mediator
2: intre mediator si electrod
e-
e-mediator
Transferul mediat de electroni (MET) intre centrulactiv al unei enzime redox si suprafata de electrod.
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
22/82
Posibile moduri de cuplare a reactiei enzimatice cu reactia electrochimica:(a) transferul mediat de electroni (MTE) si (b) transferul direct de electroni (DTE)
Reprezentarea schematica a bioelectrocatalizei in cazul unei enzimecare contine 2 grupari redox (cofactori) in structura moleculara
servind drept centre de schimb de electroni electrocatalitic
si centru de transformare biocatalitica a substratului.
Enzime redox pentru care s a dovedit existenta unor reactii cu DET cu suprafata electrozilor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
23/82
Enzime redox pentru care s-a dovedit existenta unor reactii cu DET cu suprafata electrozilor.
EnzimaCofactor Substrat Reactii
Redox
Lacaza 4 Cu O2 Reducere
Ascorbat oxidaza 4 Cu O2 ReducereSuperoxid dismutaza Cu-Zn O2
Peroxidaza
Citocromc peroxidaza
Citocromc peroxidaza
-Paracoccus denitrificans
Lactoperoxidaza din bovina
Microperoxidaza
Hem
Hem
Hem
Hem
Hem
2 Hem
H2O2
H2O2
H2O
2
H2O2
H2O2
H2O2
Reducere
Reducere
Reducere
Reducere
Reducere
Reducere
Hidrogenaza cluster Fe-S H2
H+Oxidare
Reducere
Diaforaza FMN NADH Oxidare
Enzime bi-functionale
Citocrom b2
- Lactat dehidrogenaza
- Flavocitocrom c552- Celobioz dehidrogenaza
- Phanerochaete
chrysosporium
- Sclerotium rolfsii
Alcool dehidrogenaza
Flavo-hem
FMN-hem
FAD-hem
FAD-hemFAD-hem
PQQ-hem
PQQ-4 hem
PQQ-4 hem
FAD- cluster Fe-S
Lactat
p-cresol
sulfide
etanoletanol
etanol
succinat
fumaratalcool
Oxidare
Oxidare
Oxidare
OxidareOxidare
Oxidare
Oxidare
Oxidare
Reducere
Enzime tri-functionale
D-Gluconat dehidrogenazaFAD-hem- cluster Fe-S D-gluconat Oxidare
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
24/82
SCOPUL FINAL !
Il reprezinta realizarea unui transfer de electroni dintresubstrat si electrod prin intermediul unei enzime
redox a carui centru activ sa poata schimba direct
electronii cu suprafata electrodului
(ex. o reactie de oxidare a unui substrat)
Domeniul optim de potential
Thermodynamic driving force enough to drive the reaction
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
25/82
ENZIME REDOX
OXIDAZEDEHIDROGENAZE PEROXIDAZE
Enzime continandFAD/FMN
EnzimecontinandCu
Enzime continindcofactor legat
Enzime utilizindNAD/NADP dreptcofactor solubil
-FMN oxidazeex. L-amino acid oxidaza-FAD oxidazeex. D-amino acid oxidaza-Metalo FAD oxidazeex. glucoz oxidaza
xantin oxidaza
-Tirozinaza-Lacaza-Ascorbat oxidaza-Citocrom c oxidaza-Galactoz oxidaza
Enzimecontinind
PQQ
EnzimecontinindFAD/FMN
-Metanoldehidrogenaza-Glucozdehidrogenaza-Fructozdehidrogenaza
-FAD dehidrogenaze
ex. lipoil dehidrogenaza-Metalo-FAD dehidrogenazeex. colin dehidrogenaza-Metalo-FMN dehidrogenazeex. L-lactat dehidrogenaza(citrocrom b2)
-Alcool dehidrogenaza- Glucoz dehidrogenaza- Glutamat dehidrogenaza- Aminoacid dehidrogenaza-Testosteron 17dehidrogenaza- Lacat dehidrogenaza
-Peroxidaza din hrean
-Citocrom coxidaza-Ascorbat peroxidaza-Lactoperoxidaza
Clasificarea oxido-reductazelor utilizate in constructia biosensorilor [4]
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
26/82
Schema de detectie a substratelor bazata pebiosensori amperometrici implicind enzimele redox [4]
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
27/82
GRUPELE MAJORE DE ENZIME REDOX
OXIDAZELE FAD dependentecare au ca produs de reactie H2O2 80 enzime
care au ca produs de reactie H2O 20 enzime
DEHIDROGENAZELE
NAD(P) + NAD(P)H dependente 450 enzimePQQ dependente 20 enzime
Flavin dependente 50 enzime
PEROXIDAZELE
Hem dependente 40 enzime
Exista aprox. 600-700 diferite enzime redox cunoscute
Care pot fi combinate in constructia biosenzorilorcu un numar de alte enzime (ne-redox)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
28/82
Structura chimica a flavin adenin dinucleotidei, FAD
N N
N
H
NO
O
CH2
C C
OH
H
C
OH
H
CH2
O
OH
H
P
O
O
OH
P O
OH
O
CH2
O
OH OH
N
N
NH2
N
(grupare legata covalent de molecula de enzima)
NO
O
HOO
HOOC
N
COOHH
Structura chimica a pirolo-chinolin chinonei, PQQ(grupare legata covalent de molecula de enzima)
2,7,9-tricarboxi-1H-pirolo-(2,3-f-chinolin-4,5-diona)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
29/82
Structura chimica a nicotinamid adenin dinucleotidei,NAD+ (cosubstrat solubil)
O
P OHO
O
PHO
O
O
CH2
CH2
O
H
N
CNH
2
O
OH OH
O
OH OH
N
N
N
N
NH2
Daca este fosforilata, NAD(P)+
Structura hemului
Fe
COOH-
COOH-
Hemul
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
30/82
OXIDAZELE
S Oxidazaox H2O2(sau H2O)
P Oxidazared O2
Cofactorul este legat puternic (covalent) de enzima
ex. FAD, FMN, Cu
Produs de reactie H2O2 - ( 60 - 70 enzime)glucoz oxidaza (FAD, Fe)xantin oxidaza (FAD, Fe, Mo)L-amino acid oxidaza (FAD-veninul de sarpe)
(FMN-ficat)alcool oxidaza (FAD) Produs de reactie H2O
tirozinaza (polifenol oxidaza) (Cu)ascorbat oxidaza (Cu)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
31/82
DEHIDROGENAZELE
(nu sunt afectate de oxigenul molecular)
substrat cofactorox aceptor de electroniredenzima redox
produs cofactorred aceptor de electroniox
cofactori legatienzime continind flavinaex.:L-lactat dehidrogenaza (FMN, hem)
(citochromul b2)diaforaza (FAD, hem)
(enzima care oxideaza NADH-ul)enzime continind PQQ(descoperite relative recent10-20 enzime)ex. glucoz, alcool-, lactat-, fructoz- dehidrogenaza
cofactor solubil
enzime nicotinamid dependenteNAD+/ NADH dependente (250 enzime)
NADP+/ NADPH dependente ( 150 enzime)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
32/82
PEROXIDAZELE
N
N
Fe
COOH-
N
N
COOH-
Heme
De facut!!!!
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
33/82
BIOSNZORII ELECTROCHIMICI
Sau dintr-un biosensor care poate functiona in mod reversibil si care poate fi inserat(implementat intr-un sistem de anliza in flux (sau automatizat) pentru monitorizareacontinua a anlitului de interes
ei constau din:
Parte sensibila de unica folosinta, care consta dintrun electrod miniaturizat pesuprafata caruia s-a imobilizat un biocomponent, parte care este introdusa intr-un instrument portabil
cei mai studiati biosenzori
Reprezentarea schematica a biosensorului pentru glucoza produs deExac Tech.
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
34/82
Compania
Compounsul
Yellow Springs Instruments-YSA (USA) Glucoza, etanolul, lactoza, fructoza, lactatul etc.
Baxter Travenol, (USA) Glucoza
Universal Sensor, (USA) Glucoza, aspartamul, ureea, acidul uric, Listeria, etc.
Molecular Devices, (USA) ADN, poluanti, toxine, etc.
AndCare Inc, ESA (USA) E.Coli, Salmonella, Polivirus, hibridizarea AND, etc.
Bioanalytical Systems, BAS (USA) Apa oxigenata
VEB-MLV Prufagerate-Medigen (D) Glucoza, lactatul, BOD,
Institute of Molecular Biology-Berlin (D) Glucoza, lactatul, acidul uric.
Setric SGI (F) Lactatul, glucoza
Ceres (F) Glucoza, colina, lyzina.
Radiometer (F) Glucoza
Metertech Inc. (Taiwan) Glucoza
Nissan Electric (JPN) BOD
Daiichi-Kyoto (JPN) Glucoza
Pegasus Biotechnology Ontario (Canada) Prospetimea pestelui
Exemple de companii care comercializeaza biosenzori electrochimici
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
35/82
medical/clinic (prevenirea si diagnosticarea unor boli)
controlul poluarii mediului
industriile alimentara si a bauturilor (calitatea alimentelor)
apararii si securitatii militare
testelor sportive de dopare
O data cu intrarea in cel de al III-lea mileniu domenii ale societatii precum
necesita utilizarea unor instrumente analitice simple precum
SENSORII BIOCHIMICI
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
36/82
METODELE CLASICE DE ANALIZA FOLOSITE IN DETERMINAREA
COMPUSILOR DE IMPORTANTA CHIMICA SI BIOCHIMICA
sunt metodesensibileselective
care permit identificarea si determinarea diferitilor compusii apartinind uneisingure clase
spectrometria in UV si IR, HPLC, GC, MS
combinatii ale acestora (GC/MS, HPLC/MS
in ciuda selectivitatii si sensibilitatii lor aceste metode necesita:
Laboratoare foarte bine dotateUn personal inalt calificatSunt metode laborioaseNecesita un timp relativ mare de analizaNu pot fi utilizate pe teren pentru omonitorizare continua
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
37/82
si testarea ei in laborator
Aparitia biosensorilor
A facut posibila realizarea unor determinari analitice pe teren
Conducind la o scadere a timpului de realizare a unei masurari
nemaifiind necesar transportul probei,
scurtind timpul intre obtinerea si transferul de date si actiunile de remediere ce se impun
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
38/82
BIOSENZORI CLASICI (prima generatie)Primul biosensor construit a avut la baza un electrod de tip Clark, cu ajutorulcaruia s-a urmarit scaderea concentraiei de O2.
Reactiile bioelectrochimice ce stau la baza constructiei electrodului de tip Clark
Electrodul enzimatic de tip Clark
O2 difuzeaza atit in afara membranei spre solutie cit sispre suprafata senzorului pentru oxigen unde este redus electrochimic
O2 + 2 H+ + 4 e- 2 OH-E > - o,6 V
glucoza + O2+H2OGox
acidul gluconic + H2O2
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
39/82
suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic
H2O2 formata difuzeaza atit
G.G. Guilbault, G.J. Lubrano, Anal.Chim.Acta, 60 (1972) 254S.J. Updike, G.P. Hicks, "The Enzyme Electrode", Nature, 214, 1967
E > + 0,6 V
S
E
E
H O2 2
Reactia enzimatica
Glucoza+ Glucozoxidaza
Glucolactona+
O2H2O2
Reactia electrochimica
O2H2
+2 H + + 2 e-O2
Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt
in afara membranei spre solutiecit si spre
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
40/82
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
41/82
Eappl -600mV
O2 + 2H+ + 4e- 2OH-
Eappl +600mV
H2O2 O2 + 2H+ + 2e-
dezavantaje: supra-potentialraspunsul electrodului nu este stabil
OXIDAZE acceptorul natural de e-O2
Dezavataje: solubilitate limitata a O2
H2O2 denatureaza enzima
H2O2 poate reationa cu alte
substante din solutie species
Electrodul Clarkdezavanaje: masoara scaderea semnalului
(semnal de baza mare)
Supra-potential
Electrochimia O2 si a H2O2
Sufera de aplicarea unor potentiale mari(suprapotentiale
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
42/82
ENZIMA
Substrat + O2 Produs + H2O2
hidrolaza
METABOLIT
SENZOR
PRODUS ELECTROACTIV
PRODUS VARIATIE
ELECTROACTIV SEMNAL ELECTRIC
Enzima
(oxidaza)
E1
E2
Glucoza + O2 acidul gluconic + H2O2
Lactatul + O2 Piruvat + H2O2
Urea HCO3-
+ NH4+
ureaza
electrochimic
Bi i i ti i t d t i i b ti
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
43/82
Biosenzori enzimatici pentru determinarea ureei bazati pesenzorii de gaz
Asamblarea biosenzorului
Se folosesc senzorii de gaz pentru: CO2NH3
Enzimele sunt imobilizate pe suprafata membranelor gaz permeabile
Acestia se obtin prin fixarea uneimembrane gaz permeabile pe suprafata unui ISE
ISE este senzorul de pH (sticla)
intre membrana gaz permeabila si suprafata ISE se introduce un electrolit adecvat
uree
ureaza
CO2 + NH3
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
44/82
Principiul de functionare:
NH3 sau CO2 rezultat in urma reactieienzimatice difuzeaza din solutia probei prinmembrana gaz permeabila si hidrolizeaza in solutia interna rezultind astfel o
variatie in concentratia ionilor de H+ care este detectata de ISE (senzorul de pH).
Ptr. Senzorul deCO2:solutia interna: NaHCO3 0.1 M
Echilibrul stabilit[NH4+] NH3 + H+
Ptr. Senzorul de NH3:Soltia interna NH4Cl 0.1 M
Echilibrul stabilitCO2 + H2O HCO3- + H+
Deoarece [HCO3-] este constanta
fiind prezenta in concentratie mare,
[NH4+] este constanta fiind prezenta in
concentratie mare, si atunci:
Ecel= K + 59 log [CO2]Ecel = K - 59 log [NH3]
BIOSENZORI CLASICI ( i ti )
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
45/82
BIOSENZORI CLASICI (prima generatie)
DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FIDETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI
METODA SENZOR Dom. Conc.mol/l
Potentiometrie H+
, Na+
, CN-
, NH4+
,I- 10
-5
10-2
Amperometrie Pt/H2O2 10-710-3
Sensor de gaz
potentiometricNH3, CO2 10
-410-2
Sensor de gaz
amperometricOxygen 10-510-4
C i
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
46/82
Compui
Gaze anestezice
Gaze respiratorii
Gaze inflamabile
Gaze toxice
Metabolii
Metabolii n urme
Ioni
Ioni ai metalelor grele
Vapori organici toxici
Proteine,acizi nucleici
Microorganisme
N O2
CO , O2 2
CH4
CO, H S,Cl , NH2 2 3
Glucoz, uree
Hormoni,steroizi,
H+, Li+, Na+, K+, Ca2+, PO3-4
Pb2+, Hg2+, Cu+, Cd2+
Benzen, toluen
AND, ARN, cazeina
Virui, bacterii
Bi C l l I t Ch t
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
47/82
Biosensor
-----------------------
TraductorEnzima
Celule,
Micro-
Organisme
Imuno-
Agentesut
Animal/
Vegetal
Chemo-receptor
Celula Electro
chimicAmpero-
metricx x x x x x x x
Ponteio-
metricx x x x x x x x X
Semiconductor
( ISFET)x x x
Termistor x x
Fotometric
(fibre optice)x x
Piezoelectric(cuar) x x
Chemomecanic x
D i l A li ii
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
48/82
Domeniul Aplicaii
Clinic/medical Analiza medicamentelor, analiza sngelui, monitorizarea medicamentelor terapeutice,diagnostice clinice
Industrial Procese biotehnologice i fermentative, procese industriale i alimentare, controlul calitii,deteciacontaminanilor, analiza apei i apelor uzate, detecia unorprodui/subprodui
toxici, testarea produselor cosmetice
Agricultur/veterinar Diagnosticarea bolilor la plante i animale, detecia compuilor toxici, testarea calitiisolului i apei, msurarea necesarului biochimic de oxigen, controlul calitii
produselor vegetale i animale, monitorizareapstrrii lor n timp.
Securitate/aprare Deteciasubstanelorchimice duntoareiagenilorbiologici, incluzind explozivi, gaze delupt, micotoxine, virui, bacterii patogene i toxine biologice.
Mediu Detecia unor compui chimici toxici n ap, aer, sol, detecia contaminarii personale.
Robotic Instrumente senzoriale pentru construcia unor sisteme automate care funcioneaz n medii
ostile, n mediu casnic isntate.
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
49/82
-Timpul de raspuns (t90) 2-3 minute-Timpul de revenire- Domeniul de linearitate-Stabilitatea raspunsului:
Pe parcursul masuratorilor: drift
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
50/82
Compusi biochimici detectabili
1. Glucoza2. Alcoolul3. Colesterolul4. Ureea
5. Metalele grele6. Pesticidele7. Fenolii
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
51/82
suprafata unui electrod de platina sau oxigenunde este oxidata respectiv redus electrochimic
H2O2/O2 difuzeaza atit
E > + 0,6 V
S
E
E
H O2 2
Reactia enzimatica
Glucoza
+ Glucozoxidaza
Glucolactona
+O
2H2O2
Reactia electrochimica
O2H2
+2 H + + 2 e-O2
DETECTIA GLUCOZEI
in afara membranei spre solutie
cit si spre
O2 + 2 H+ + 4 e- 2 OH-E > - o,6 V
Biosensor pentru determinarea alcoolului
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
52/82
Determinarea etanolului este probabil cel mai frecvent test necesar in cazurile destabilire legala a gradului de intoxicare cu alcool, care reprezinta una din cauzele majore ale
accidentelor rutiere; ea prezinta importanta si scopuri forensice. Dificultati in conducerea
autoturismelor incepe de cantitati de 50 mg de etanol/100 mL singe.Masuratorile de etanol se efectueaza in probe de singe, urina si saliva.In USA peste 14 millioane de oameni sunt alcoolici, iar in 1996 mai mult de doua
millioane de oameni au fost arestati pentru conducere sub influenta alcoolului.Concentratia de alcool din singe este in present masurata cu ajutorul unor analizoare ale
respiratiei, gaz cromatografie si enzimatic. Imprecizia rimei metode a facut ca in in scopurimedicale sa se foloseasca in mod exclusiv ultimile doua metode.
Alcool + O2 H2O2 + AcetaldehideaAox = alcool oxidazaH2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o
presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.
Biosensor pentru determinarea alcoolului
METHODA ENZIMATICA DE DETERMINARE A ALCOOLULUI DIN SALIVA
Ea are la baza un sensor amperometric pentru H2O2 acoperit cu o membranacontinind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gazpermeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile.
Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila sireactioneaza cu enzima conform ecuatiei:
AOx
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
53/82
Etanol Acetaldehid
ADH
NAD+ NADH + H+
Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului
Detecie la 340nm
Concentraia de NADH crete proprorional cu cea a etanolului.
ADH=alcool dehidrogenaza
NADH-ul este determinat pe baza absorbanei lui la 340nm
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
54/82
S-a realizat un biosensor electrochimic pentru determinarea acidului lactic din saliva.Interferentele electrochimice si biologice din cadrul determinarii au fost eliminate prin
folosirea a doi electrozi de Pt si a unei membrane.
Lactat + O2 +H2O2 Piruvat + H2O2
LOx
METODA ENZIMATICA DE DETERMINARE A LACTATULUI
REACTIE
H2O2 produsa este masurata la + 650 mV fata de Ag/AgCl cu ajutorul electrodului dePt. Modificarea curentului datorata oxidarii H2O2 este proportionala cu concentratiade lactate din proba.
(LOx)= lactat oxidaza
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
55/82
Colesterol
exemplu reprezentativ de steroid
component esential in membranele celulare ani
precursor in biosinteza tuturor steroizilor,
hormonilor, a vitaminei D etc.
stocat in celule sub forma unui ester a acizilor g
Plasma sanguina umana contine 130-260 mg colesterol / 100mL
2/3 din colesterol : esterificat cu acizi grasi
1/3 din colesterol : este sub forma de sterol (cholesterolul liber)
Concentratii mari de colesterol:
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
56/82
Reactia catalizata de enzima
Colesterol O2COx
Colesterol-4-en-3-ona H2O2
Reactia bioelectrochimica de detectie acolesterolului
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
57/82
Dependenta raspunsului senzorului de diferite concentratii de colesterol, acid colic si deoxicolic
Colesterol
Acidul deoxicolic
Acidul colic
Specificitatea senzorului pentru colesterol
HO
H
CH3
H
H
CH3
OH
COOH
OH
H
H3C
H
HO
H
CH3
H
H
CH3
OH
COOH
H
H3C
H
R i li d i
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
58/82
Reactia catalizata de enzima
O O
H
H
H
Grupa ester
Colesteril oleatul H2OCE
Colesterol acidul oleic
OHO
Determinarea colesterolui esterificat
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
59/82
Detectia esterului colesterolului
Reprezentarea schematica a seventelor de reactii reactii enzimatice pentru determinarea
Introduction 5
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
60/82
Detectia esterului colesterolului
Curba de calibrare pentru colesteril oleat obtinuta la suprafata electrodului modificat
Cai de reducere a potentialului pentru transformarea electrochimica a H2O2 si a O2
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
61/82
Cai de reducere a potentialului pentru transformarea electrochimica a H2O2 si a O2
i depunerea unor metale nobile pe suprafata electrozilor de carbunei depunerea unor mediatori redox (ex. albastrul de prusia) pe suprafata electrozilor
conventionalii folosirea altor catalizatori ex. feroftalocianinai folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza
Inlocuirea O2 cu un alti aceptori de e- (mediatori)
Biosensorii vor functiona la valoarea potentialului formal redox al mediatorlui
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
62/82
Electron transfer in biosensors
Second Generation
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
63/82
For an oxidation reaction
Mediated electron transfer path between a redox enzymeand an electrode
reduced mediator
oxidised mediator
electrode
2 e-electron transfer
substrate
product
oxidised enzyme
reduced enzyme
electron transfer electron transfer
Transferul de electroni mediat dintre o enzima redox si un electrod
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
64/82
Depunerea albastrului de Prusia Fe4III[FeII(CN)6]3 si a altorcatalizatori pe suprafata electrozilor conventionali
+ conduce la crestere selectivitatii electroreducerii H2O2 care are loc
pe domeniul cuprins intre +150- -150 mV vs. Ag|AgCl
substrate
oxidase
product
O2
H2O2
2 H2O
electrode
2 e-
2 H+
re duction at +150 - -150 mV vs. Ag|AgCl
Depunerea de metale nobile (Pt, Pd, Ru, Rh) pe suprafata electrozilor de carbon are
dezavantajul lipsei de selectivitate
MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
65/82
N
N
CH3
CH3
S
N
(H3C)2N+ N(CH3)2
N+
N
CH3
O
O
Fe(CN)64-/3-
Fe0/1+
hexacyanoferrate
ferrocene
methylviologen
methylene blue
/+
+
N-methylphenazinium
anthraquinone
1 e- aceptori/donori vs. 2 e--H+ aceptori/donori
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
66/82
ELECTROZI CHIMIC MODIFICAI (CME)
Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentnd o modificareraionala intentionat a structurii moleculare a suprafeei electrozilor convenionalin scopul utilizrii lor n cadrul unor aplicaii specifice
Electrozii chimic modificai (CMEs) se bazeaz pe fixarea unui centru redox (mediator) pesuprafaa electrodului.Acesta funcioneaz ca un mediator pentru transferul rapid de electroniSpre molecula de substrat, care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent(sau deloc n unele cazuri) la suprafaa unui electrod convenional.
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
67/82
e-
SOLUIE
SUPRAFAA
ELECTRODULUI
SUBSTRATred
SUBSTRATox
Medox
Medred
Sox+Mred
- ne-
SredMox +
Mred Mox
Reprezentarea schematic a unui CME si a reaciei de electrod
Determinarea electro-enzimatica a glucozei din singe
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
68/82
Determinarea electro enzimatica a glucozei din singe
Eapl = 0,4V vs. SCE
Glucoza + chinona (Q) + H2O acidul gluconic+ hidrochinona (HQ)
Electrod de Pt
Gox
HQ Q + 2H+ + 2e-
D.L. Williams, A.R. Doig, Jr., A.Korosi, Anal. Chem., 42 (1970)
Electrozii chimic modificati bazati pe metalo-ftalocianine catalizeaza reactiile:
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
69/82
c c c d c b p c c c
tiolilor, carbohidratilor, apei oxigenate si a peroxizilor organici
A. Ciucu, R. P. Baldwin, Electroanlysis, 4, 515-519 (1992)
Structura tetraamino-cobaltftalocianinei
Structura fero ftalocianinei
Proprietatile importante ale metalo-ftalocianinelor:
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
70/82
p p
Solubilitate mica in majoritatea solventilor aposi si organici
B Domeniu larg de potentiale care se schimba odata cu metalulcentral
Metaloftalocianinele prezinta urmatoarele potentiale de oxidare fata de SCE
Fe (II) PhC +0.16 V
Co (II)PhC + 0.77 V
Co (II)PhC are un potential de oxidare pozitiv mare, iar starea ei oxidata
Co(III)PhC generata electrochimic reprezinta un agent oxidant.
Fe(II)PhC poate fi utilizata ca agent reducator
Inhibitia reactiilor enzimatice are aplicatii analitice pentru determinarea unor poluanti ai
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
71/82
mediului
Grupele principale de inhibitori i enzimele asupra crora acioneaz
Inhibitor
Enzima
Pesticide:
Insecticide:
(organofosforice
i carbamate)
Erbicide
(sulfoniluree,
triazaine)Fungicide
(ditiocarbamate)
colinesteraza, alcalin fosfataza, tirozinaza,
peroxidaza
aldehid dehidrogenaza, tirozinaza
Metale grele:
Beriliu
Cadmiu
Crom
CobaltCupru
Plumb
Mercur
Argint
Zinc
Alcalin fosfataza, Colinesteraza, ureaza
Monitorizarea mediului necesita analiza unui numar mare de probe
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
72/82
p
pret de
cost scazut
rapide
Si de aceea sunt necesare metode
de analiza
automate
Monitorizarea continua a modificarilor de mediu necesita realizare unor sisteme analitice de
supraveghere si alerta
POLUAREA CU METALE GRELE
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
73/82
POLUAREA CU METALE GRELE
Devezvoltarea si validarea unor metode de determinare in timp utila metalelor grele toxice
prezente in soluri si ape de suprafata contaminate
! identificarii tendintei de poluare
! a gradului de poluare! controlului eficientei activitatilor deremediere
In scopul
In acest domeniu se are in vedere
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
74/82
Cerinte tehnice pentru metodele de monitorizare a zonelor contaminate
Nu trebuie sa prezinte o precizie ridicata (metode de scanare)
Domeniu de concentrtii (in jurul valorilor de ppm)
Simplitatea analizei (sa nu necesite personal inalt calificat)
Timp de analiza mic (aprox. 1 ora)
Metale grele = Cu, Pb, Hg,etc
Pret de cost scazut
BIOSENSOR PENTRU DETECTIA METALELOR GRELE
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
75/82
Based on this scheme of reaction involving an oxidase:
invertase
Sucrose + H2O D-glucose + D-fructose (I)
Gox
D-Glucose + O2 gluconic acid + H2O2 (II)
and a glucose probe
we developed a FIA system for Hg(II) detection in the range 10-80 ppb.
Curba de calibrare pentru Hg(II), obtinuta cu biosensorul bazat pe invertaza
Inhibata de Hg(II)
A. Lupu, D. Compagnone, A.Ciucu, V.Magearu, G. Palleschi, Anal. Lett., 34 (2001) 17-25
Tab. 3.4Determinarea metalelor bazata pe inhibiie enzimatic
M t l l
Enzima inhibat Metoda de detecie Limita de detecie moli/l
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
76/82
Metalul
determinat
Hg
Ureaza
Invertaza
BuChE
Xantin-oxidaza
Peroxidaza
Glucoz-oxidaza
Poteniometric
Spectrometric
Fluorimetric
Spectrometric
Polarimetric
Amperometric
Spectrometric
Spectrometric
Amperometric
5x10-92x10-7
2,5x10-101x10-8
2,5x10-91x10-8
1x10-11
2x10-8
3x10-5
1x10-8
5x10-6
1x10-5
Cu
Ureaza
BuChE
Alcalin fosfataza
Xantin oxidaza
Glucoz oxidaza
Spectrometric
Poteniometric
Termometric
Amperometric
Spectrometric
Spectrometric
Amperometric
1,5x10-71x10-8
2x10-63x10-6
1x10-6
1x10-9
1,5x10-5
1x10-7
5x10-5
Pb
BuChE
Peroxidaza
Alcalin fosfataza
Ureaza
Amperometric
Spectrometric
Spectrometric
Poteniometric
5x10-71x10-5
5x10-8
3x10-9
2x10-6
CdBuChE
Alcalin fosfataza
Peroxidaza
Amperometric
Spectrometric
Spectrometric
5x10-56x10-5
9x10-61x10-4
5x10-6
BiAlcalin fosfataza
BuChESpectrometric
Fluorimetric
Amperometric
1x10-6
1,4x10-5
1x10-5
NiUreaza
Alcalin fosfatazaPoteniometric
Spectrometric2x10-6
2x10-6
CoUreaza
Alcalin fosfatazaPoteniometric
Spectrometric2x10-6
1,5x10-5
Cr
Ureaza
Xantin oxidaza
Spectrometric
Spectrometric
1,8x10-4
3x10-7
WHY PESTICIDES?
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
77/82
WHY PESTICIDES?
Insecticidele organofosforice si carbamate sunt folosite in agricultura
Ele sunt contaminanti ai alimentelor avind un impact deosebit asupra sanatatii umane
Ele inhiba ireversibil sau cvasi-ireversibil AchE si BuChE care hidrolizeaza neurotransmitatorul
acetilcolina implicat in transmisia neuronalaneuronala
Efect toxict
Directiva comunitatii europenee relativa la calitatea apei potabile:
Concentratia maxim admisibila este de 0.1 ppb pentru pesticidele individuale
si de 0.5 ppb pentru pesticidele totale.
Detectia pesticidelor
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
78/82
Pesticidele sunt prezente in:
Multe probe de solApele de adincime si reziduale
Masurile preventive presupun existenta unor metode rapide de detectie
Sursei de poluare Gradului de poluare
Direct pe teren
Principiile biochimice care stau la baza metodelor de detectie a pesticidelor sunt:
Inhibitia enzimaticaimunodeterminariBlocarea activitatii fotosintetice
Pentru identificarea
Metoda Ellman
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
79/82
bazat pe detecia tiocolinei format n urma reaciei de hidroliz a acetiltiocolinei
ATChO + H2O TChO + CH3COOH
tiocolina
AChE
(CH3)3+N (CH 2)2 SH +
-OOC
SNO2
S NO2
COO-
(CH3)3+N (CH 2)2 S S NO2
COO-
+ HS NO2
COO-
Derivat al acidului di-nitrobenzoic Acid 5-mercapto 2-nitrobenzoic
Tiocolina Acidul dinitro ditiobenzoic
Compus galben (= 412 nm)
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
80/82
AChE
Acetilcolin + H2O Colin + CH3 COOH
Colina + 2O2 + H2O Betain + 2H2O2
ChOx
n general, metodele descrise n literatura de specialitate pentru determinareaactivitii acetilcolinesterazei (AChE) au la baz un sistem de reacii enzimatice
cuplate incluznd pe lng AChE i colin-oxidaza (ChOx), care mpreuncatalizeaz secvena de reacii:
Sistem monoenzimatic
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
81/82
AChEATCh + H2O TIOCOLINA + CH3OOH
oxidare anodicaTIOCOLINE
+410mV
Ditio-bis-colina
S - (CH2)2N+(CH3)3
S - (CH2)2N+(CH3)3
+ 2H+ + 2e-
Sistem monoenzimatic
R iil bi l hi i l i l l i l d d d b difi F PhC
-
7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu
82/82
Reactiile bioelectrochimice la nivelul unui electrode de pasta de carbune modificat cu FePhC
Fe (II) PC + H2O2 Fe (III) PC+produs de reactie redus
Fe (III) PC + e- Fe (II) PC
top related