curs 4 colegiu

BIOFIZICĂ ŞI FIZICĂ BIOFIZICĂ ŞI FIZICĂ MEDICALĂMEDICALĂ

44

BIOFIZICĂ ŞI FIZICĂ BIOFIZICĂ ŞI FIZICĂ MEDICALĂMEDICALĂ

44

Şef lucrări dr. Irena RĂILEANU

METODE FIZICE ŞI BIOFIZICE CU APLICAŢII ÎN MEDICINĂ

1.Metode electroforetice

2.Metode cromatografice

3.Metode de difracţie cu raze X

4.Metode de microscopie electronică (de balaiaj, prin transmisie)

I-A. Electroforeza

EezFe EezFe EezFe

-

+++++

-----

Fe Fη

I-B. Electrofocusarea

I-C. Imunelectroforeza

- +

II. Cromatografia

1. Fază staţionară

- solid

- lichid

- amestec solid / lichid

2. Fază mobilă

- lichid

- gaz

SCOP = separarea componentelor unui amestec

4 tipuri de tehnici cromatografice:

1. de adsorbţie

2. prin schimb ionic

3. prin permeaţie (în funcţie de forma şi marime)

4. de afinitate

Imunoabsorbant – matrice solidă care conţine legat covalent (de obicei) un Ag.

Mixtura de Ac care urmează a fi separată este aplicată la capătul superior şi va trece prin coloana staţionară. Doar Ac specifici Ag din coloana staţionară for forma complexe Ag-Ac şi vor fi reţinuţi.

Se adaugă o soluţie tampon care conţine o cantitate crescută de săruri şi / sau pH scăzut pentru a rupe legăturile necovalente dintre Ag şi Ac său specific.

Se adaugă o soluţie de eluţie care conţine Ag în exces. Această competiţie cu imunoabsorbantul pt. Ac determină elib. Ac în fază fluidă.

Ac eliberaţi în soluţie se colectează într-un recipient.

III. Difracţia cu raze X

2d sinθ = n∙λ

ecuaţia Bragg

BC + BD = nλ

BC = BD = AB sin θ

AB = d

2d sinθ = n∙λ

A

B

C D

d

J. Watson şi F. Crick - premiul Nobel în Medicină şi Fiziologie 1962 împreună cu M. Wilkins: stabilirea structurii ADN-ului

prin difracţie cu raze X

Difracţia cu raze X

Structura primară, secundară, terţiară şi

cuaternară a proteinelor

Structura primară

Structura secundară

Structura terţiară

Structura cuaternară

α - helix

β - pliat

Trioz-fosfat-izomeraza

Funcţii generale ale proteinelor

1. Enzime: catalizează ruptura sau formarea unor legături covalente (mii)

Ex:

- pepsina - ADN-polimeraza

2. Proteine structurale: susţinerea mecanică a celulelor şi a ţesuturilor

Ex: - colagenul şi elastina- tubulina şi actina - α- keratina

Ex: - Hb. - oxigen- Transferina - fier - Albumina - lipide- Proteine de

transport membranar: H2, glucoză, Ca2+

3. Proteine de transport: transportul unor molecule mici sau a unor ioni

4. Proteine motrice: generează mişcare în celule şi ţesuturi

Ex: miozina, kinezina, dineina

5. Proteine de stocare: a unor molecule mici sau ioni

Ex:

- feritina- ovalbumina

6. Proteine semnal: transmit semnale de la celulă la celulă

Ex: - hormoni - factori de creştere: NGF, EGF

7. Proteine receptoare: detectează semnale şi le transmit maşinăriei celulare

Ex: - rodopsina- receptorul pentru acetilcolină al celulei musculare primeşte semnale chimice

8. Proteine reglatoare ale genelor: se leagă de ADN pentru a induce sau a inhiba expresia genelor

9. Proteine cu rol particular

Ex: - proteinele antigel ale peştilor de la polii Nord-Sud- proteine fluorescente- proteine cu funcţie de adeziv

IV. Metode de microscopie electronică

Principiul fizic al microscopiei electronice

Ecuaţia lui de Broglie: = h/p = h/mv

undeh = constanta lui Planckp = impulsul particuleim = masa particuleiv = viteza particulei

ORICE PARTICULĂ ÎN MIŞCARE ARE O LUNGIME DE UNDĂ ASOCIATĂ ()

p = 1/d = n sinu / unde:

p = putere de rezoluţied = distanţa minimă între 2 puncte care poate fi distinsă separatn = indicele de refracţie u = unghiul

ex: la 10 kV, este 130 nm (13 Å), la 100 kV, este 30 nm (3 Å)

Dacă viteza creşte, descreşte, puterea de rezoluţie creşte:

Semnalele emise de un material supus unui bombardament

electronic

MET MEB

MICROSCOPUL MICROSCOPUL ELECTRONIC ELECTRONIC DE BALEIAJDE BALEIAJ

Rezoluţia este mai scăzută decât în MET.

Imagini pseudo-3D.

Un spot de electroni baleiază suprafaţa probei.

Electronii secundari de energie mică (0-50 eV), emişi în urma împrăştierii neelastice, sunt captaţi şi, după o procesare electronică, formează imaginea pe un ecran fluorescent, sau pe o peliculă fotografică.

Luminozitatea fiecărui punct al imaginii depinde de numărul de electroni secundari înregistraţi din poziţia corespunzătoare a probei.

Se obţin imagini ale suprafeţei unei celule, a unui microorganism sau a unui ţesut, de unde impresia de imagine tridimensională.

Mărire maximum 200 000 x, cu o rezoluţie de 3,5 nm.

Un spot de electroni baleiază suprafaţa probei.

Electronii secundari de energie mică (0-50 eV), emişi în urma împrăştierii neelastice, sunt captaţi şi, după o procesare electronică, formează imaginea pe un ecran fluorescent, sau pe o peliculă fotografică.

Luminozitatea fiecărui punct al imaginii depinde de numărul de electroni secundari înregistraţi din poziţia corespunzătoare a probei.

Se obţin imagini ale suprafeţei unei celule, a unui microorganism sau a unui ţesut, de unde impresia de imagine tridimensională.

Mărire maximum 200 000 x, cu o rezoluţie de 3,5 nm.

Tun electronic - fascicol de electroni cu diametrul de circa 50 nm.

2-3 lentile condensoare diametrul până la 2 nm (spot mic, deoarece secţiunea sa determină pe imagine un singur punct).

O lentilă condensoare care re-glează dimensiunea finală a spotului şi focalizează imaginea pe ecran.

Electronii secundari sunt captaţi de un detector de Al care acoperă un cristal de scintilaţie al unei sonde de scintilaţie, semnalul obţinut este amplificat electronic şi formează imaginea pe ecranul unui tub catodic sau al unui monitor.

Tun electronic - fascicol de electroni cu diametrul de circa 50 nm.

2-3 lentile condensoare diametrul până la 2 nm (spot mic, deoarece secţiunea sa determină pe imagine un singur punct).

O lentilă condensoare care re-glează dimensiunea finală a spotului şi focalizează imaginea pe ecran.

Electronii secundari sunt captaţi de un detector de Al care acoperă un cristal de scintilaţie al unei sonde de scintilaţie, semnalul obţinut este amplificat electronic şi formează imaginea pe ecranul unui tub catodic sau al unui monitor.

Eritrocite umane îmbătrâniteEtapele de transformare in echinocit

limfocit

E. coli

ochi de muscă

Contact entre un lymphocyte ( en jaune ) et une cellule dendritique présentatrice d'antigène (en bleu ). Microscopie électronique à balayage.

Contact entre un lymphocyte (immunofluorescence verte) et une cellule dendritique présentatrice d'antigène. Microscopie à contraste de phase

Pereche de cromosomi umani, X şi Y, după Nature (2003) 423: 810-812.

Fibre de sticla

Cristale componente ale ceramicii (x 4000); cu verde - particule îmbogăţite în calciu, în albastru - particule care conţin fosfor. © Didier COT/IEM/CNRS

- granule de polen

MICROSCOPUL ELECTRONIC MICROSCOPUL ELECTRONIC PRIN TRANSMISIEPRIN TRANSMISIE

Se folosesc electronii împrăştiaţi neelastic transmişi prin probă (preparatul de examinat).

Înainte de a ajunge la preparat (probă) electronii proveniţi de la sursa de electroni (tunul de electroni) sunt focalizaţi de două lentile condensor (electromagnetice). Ei sunt mai mult sau mai puţin absorbiţi (spunem despre preparat că este mai mult sau mai puţin dens pt. electroni).

Utilizează marcheri electrono-opaci.

Imaginea se formează în spatele preparatului pe un ecran fluorescent.

Mărirea, raportul dintre mărimea imaginii/mărimea obiectului,rezoluţia, cu atât mai bună cu cât este mai mică şi apertura mare (care, însă, măreşte aberaţiile de sfericitate); la diafragme de 20-70 m rezoluţia este 0,1-0,2 nm.

Luminozitatea imaginii depinde de numărul de electroni transmişi, intensitatea fascicolului incident, caracteristicile probei.

relatia lui de Broglie:

Λ = h/p = h/mv

MET - mitocondrie

MET - PMN

MET - limfocit

aparat Golgi

mitocondrie

nucleu

membrana

reticul endoplasmic rugos

Limfocit - MEBMO

MET

MO AFM

MEB MET

MICROSCOPUL OPTIC1

P1

Punsin2

22,1 1

P.

1

Cellules turgescentes  ------->   Cellules plasmolysées

MICROSCOPUL OPTICcu imersie

2

Microscopul polarizant

Pune in evidenta fenomenul de birefringenta a unor structuri, expresie a anizotropiei acestora.

3

Ultramicroscopul (microscopul cu fond intunecat)

Iluminarea este din lateral.Condensorul este de tip cardioid sau paraboloid.Se bazeaza pe fenomenul Tyndall (de difuzie a luminii).

4

Microscopul cu contrast de faza

Prezinta o lama sfert de unda care transforma defazajul luminii imperceptibil ochiului uman intr-o variatie de intensitate perceptibila vizual (transforma deci un contrast de faza in contrast de amplitudine).Permite observarea celulelor necolorate.

celula epiteliala

5

Microscopul cu fluorescenta6

O sursa UV.Ecran filtrant care lasa sa treaca doar radiatiile UV excitatoare ale fluorescentei.

celule epiteliale