2. purificarea enzimei 2.4. separarea cromatografica · sulfonat de metil -o-ch 2-choh-ch 2-o-ch 2...

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Coloana

cromatografica

Amestec

supus

separarii

GelA B

http://www.waters.com/

2.4. Separarea cromatografica

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Tipul gelulului Intervalul de

separare

(M, KDa)

Sephadex G-10 < 0.7

Sephadex G-25 1-5

Bio-Gel P-60 3-60

Sephadex G-75 3-70

Sephadex G-100 4-100

Bio-Gel P-100 5-100

Sephadex G-200 30-200

Sephacryl S-300 10-1.500

Sepharose 2B 70-40.000

10

100

1000

0 20 40 60 80 100 120

Volume/ml

MW

/kD

a

2.4. Separarea cromatografica

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

http://slideplayer.com/slide/6171151/

2.4. Separarea cromatografica

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

2.4. Separarea cromatografica

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

http://www.ap-lab.com/images/LS_setup.gif

Siatem de purificare cromatografică

http://wolfson.huji.ac.il/purification/

Superdex 200 Increase 10/300 GL

http://www.gelifesciences.com/

2.4. Separarea cromatografica

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Avantajele tehnicii

Timpi de separare medii

Separare binedefinită

Benzi înguste / sensibiliate bună

Consum redus de fază mobilă

Poate fi folosită la desalinizare

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

– –– –––

–

Enzima

Schimbator

anionicIoni din

tampon

–

–––

––

–

A B

Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Dietil-amino-etil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+( CH2CH3)2 slaba

Cuaternara aminoetil

(QAE)

-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3 puternica

Cuaternara amoniu (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 puternica

Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO- slaba

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3- puternica

Sulfonat de metil -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3- puternica

Grupări functionale ale schimbatorilor de ioni

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

Ion exchange chromatography. Principles and methods. Pharmacia Biotech, S-75182, Upsala, Sweden

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

Separarea deacetoxycefalosporin C sintazei

prin cromatografie de schimb ionic

Ion exchange chromatography. Principles and methods.

Pharmacia Biotech, S-75182, Upsala, Sweden

M: 14,3 KDa

129 de AA

pH optim

9,2

(261,5 nm, 1%) = 26,4

pI = 11.0

Stabilitatea

pH 4-5

Inhibitori

imidazol

SDS

alcooli

acizi

grasi

Caractersticile

lizozimei

(albusul de ou)

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe

Principiul cromatografiei prin interacțiuni hidrofobe

Hydrophobic interaction and Reverse Phase Chromatography. Principles and methods.

Pharmacia Biotech, 11-0012-69, Upsala, Sweden

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe –etapele separării

Echilibrarea Concentrație de sare mare în soluția tampon

Aplicarea probei Îndepărtare enzime cu hidrofobicitate f. mică

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe –etapele separării

Elutia component 1Îndepărtare enzimei cu hidrofobicitate redusă

descreșterea conc. sării

Elutia component 2 Descreșterea suplimentară a conc. sării

Îndepărtare enzimelor mai hidrofobe

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe –etapele separării

Elutia component 3 Îndepărtare enzimei cu hidrofobicitate ridicată

conc. sare minimă

Etapă spălare Îndepărtare ultimeleor macromolecule hidrofobe

fără sare

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe

Coloana – Fenil-Sepharose

Tampon start – 1,7 M (NH4)2SO4, 20 mM Tris, pH 7,5

Tampon eluție – 20 mM Tris, pH 7,5

Gradient 0-100%; 10 vol. coloane

Hydrophobic interaction and Reverse Phase Chromatography.

Principles and methods. Pharmacia Biotech, 11-0012-69, Upsala, Sweden

www.pall.com

http://www.jncamericany.com/

Cromatografie mixtă – hidrofobă + ionică

http://www.genengnews.com/

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe

Bugg, T., Introduction to enzyme and coenzyme chemistry

2nd ed., Blackwell Publishing, 2004

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe

Cre

ste

rea

hid

rofo

bic

itatii

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.4. Cromatografia de afinitate

www.herbalanalysis.co.uk

ADN cu secventa suplimentara

Insertie in

bacterii (E coli)

Distrugerea membranelor

proteina cu

secventa

adiacenta

alte

proteine

legare

Ma

trice de a

finita

te

Spalare

Elutie

Indepatare

secventa

suplimentara

= ligand

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.4. Cromatografia de afinitate

Denumirea

secventei

adiacente

Lungimea

secventei

adiacente

Caracteristici

His-tag scurta Leaga cationii imobilizati (Co2+, Ni2+, Cu2+)

Elutia se face cu imidazol 250 mM

Flag-tag scurta Secventa adiacenta DYKDDD-DK complexeaza

Ca2+ permitand imobilizarea anticorpilor M1, M2 si

M5; ultimii 5 aminoacizi pot fi clivati de

enterokinaza

S-tag medie Secventa KETAAKFERQHMDS se leaga de

fragmentul S din ARNaza A

Elutia se face cu citrat 0,2 M

GST-tag mare GST= glutation S-transferaza (26 KDa) se leaga

specific de o matrice pe care este imobilizat

glutationul; proteinele fuzionate cu GST sunt in

general stabile si solubile

Secvente adiacente - cromatografia de afinitate

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.4. Cromatografia de afinitate

2.4. Separarea cromatografică

2. Purificarea enzimei

2.4.4. Cromatografia de afinitate

"Column Chromatography„ Ed. D. F. Martin, B.B. Martin,

Cap 3.,Affinity Chromatography and Importance in Drug

Discovery, O. B. Acikara et al., 2013, In Tech

Suport solid N

O-

O

O-

O

Ni2+

HISN

N

HIS

N

N

ENZIMÃ

(HIS)4

http://www.interchim.com/blog/protein-purification-cep-strategy/

2.4. Separarea cromatografică – Tipuri de cromatografii

2. Purificarea enzimei

2.4. Separarea cromatografică – HPLC

2. Purificarea enzimei

elte.prompt.hu

dionex.com

10

100

1000

0 10 20 30

distance/mm

MW

/kD

a

97 kDa

45 kDa

30 kDa

20 kDa

66 kDa

14 kDa

2.5. Verificarea puritatii – ultracentrifugarea

gel filtrarea

electroforeza

2. Purificarea enzimei

Electroforeza

Avantajele SDS electroforezei

SDS (detergent) solubilizeaza aproape

toate proteinele;

Izoenzimele nu apar sub forma unor benzi

diferite;

Micelele de SDS-enzima, fiind puternic incarcate

negativ, poseda o mobilitate electroforetica;

Lanturile polipeptidice sunt despachetate

separarea = f(dimensiune a porilor, M);

www.pnas.org

Dezavantaje

Enzimele separate prin SDS-electroforeza -

leaga bine colorantul.

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza

2. Purificarea enzimei

Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)

• 16.5% 2-25 kDa

Sisteme de electroforeza folosite

Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)

• 7.5% 40-400 kDa

• 12.5% 20-100 kDa

• 20% 3-25 kDa

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza

2. Purificarea enzimei

Sisteme de electroforeza folosite

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza

2. Purificarea enzimei

Mecanism de polimerizare

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza - prepararea gelului

2. Purificarea enzimei

Acril-

amida

(%)

Intervalul

de separare

(KDa)

15 15-45

12,5 15-60

10 18-75

7,5 30-120

5 60-210

Mecanism de polimerizare

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza - prepararea gelului

2. Purificarea enzimei

Reducerea puntilor disulfidice

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza - prepararea gelului

2. Purificarea enzimei

forma

densitatea moleculei

Separarea enzimelor

Enzime fibroase < Enzime globulare

Viteza de sedimentare

Autoamsamblarea unei sintetaze din

Mycobacterium tuberculosishttp://openi.nlm.nih.gov/

2.5. Verificarea puritatii – ultracentrifugarea

2. Purificarea enzimei

2.5. Verificarea puritatii / Mr – spectrometria de masa (MALDI-TOF)

2. Purificarea enzimei

www.atdbio.com

http://www.kcl.ac.uk/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim

https://biochemianzunited.wordpress.com/

https://www2.estrellamountain.edu/faculty/

farabee/biobk/BioBookEnzym.html

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2.5.1. Factori care guvernează

activitatea catalitică

pH-ul optim

http://cbc.chem.arizona.edu/classes/bioc462/462

a/NOTES/ENZYMES/enzyme_kinetics3.html

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim vs stabilitate

Prazeres, J. N.dos, Cruz, J. A. B., & Pastore, G. M. (2006).

Characterization of alkaline lipase from Fusarium oxysporum

and the effect of different surfactants and detergents on the enzyme

activity. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4), 505-509

pH optim – albastru

Interval pH stabilitate – roșu

Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology

Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim vs stabilitate

Activitatea enzimatică a pepsinei vs

stabilitatea pepsinei

D W Piper and B H Fenton,

Gut, 6, 506-508, 1956

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența solventului

Ibrahim, A.S.S. et al., Enhancement of Alkaline Protease Activity and

Stability via Covalent Immobilization onto Hollow Core-Mesoporous

Shell Silica Nanospheres, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(2), 184

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența tăriei ionice

Influența tăriei ionice asupra activității tioesterazei

Wei, J. , Kang, H. W., Cohen, D.E.

Biochemical Journal, Jul 15, 2009,

421 (2) 311-322;

Influența tăriei ionice asupra activității

ribonucleazei (wt, K41R si K7A/R10A/ K66A)

Park, C. și Raines. R.T.,

J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11472-11479

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

Anionul fosfatul inhibă

Carboxipeptidazele

Fumarazele

Carboxilaze

Fosfoglucomutaza

Tris (Tris(hidroxi-metil)aminometan), ACES, BES, TES

Leagă ionii de Cu

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

Mohan, C., A guide for the preparation and use of buffers in biological

systems, EMD, San Diego, California

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența temperaturii

slideplayer.com/slide/8444574/

Fox, P. F. et al., Heat-Induced Changes in Milk,

Dairy Chemistry and Biochemistry, pp 345-375

Lipaza, fosfataza alcalină termolabile

Fosfatza acidă - relativ stabilă

Lapte praspăt ↔ Lapte pasteurizat

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența temperaturii

fructoz-1,6-bifosfat

-aldolaza

E coli

Edwardsiella ictaluri

Somn (entero-septicemie)

Rearanjarea ADN-ului

Williams, G. Et al., Direct evolution of aldolase

https://drjockers.com/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

www.sharinginhealth.ca

personalpages.manchester.ac.uk

Situs activ al TBP aldolazei

Gavin J. Williams et al.

PNAS 2003;100:6:3143-3148

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Legarea Mg2+ se face la substrat

Human epidermal growth

factor receptor 2 (HER2)

-tirozin kinaza-

Receptor activat în

20-30% cancerele de sân

Aranda, Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(12), 2543

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Situs activ al endonucleazei

FEMS Microbiology Review

2001; 25:5, 583-613

Funcții

endonucleaze

replicare

recombinare

reparare ADN

Benedik, M.and Strych, U. (1998),

Serratia marcescens and its extracellular nuclease

FEMS microbiology letters, 165, 1-13

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Carter, E. L. et al. (2009),

Interplay of metal ions and urease

Metallomics, 1, 207-221

Hille, R. (2002),

Molybdenum and tungsten in biology

TiBS, 27(7), 360-367

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Pauff, J.M. et al., JBC, 284(13):8760-7, 2019

Cofactor piranopterinic

Romão, M.J., Dalton Transaction, 21, 2009

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

FAD DAAO Lipoamid

dehidrogenaza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Din punct de vedere structural coenzimele - 4 clase:

• coenzime de natură alifatică;

• coenzime de natură aromatică;

• coenzime cu structura nucleozidică;

• coenzime cu structura nucleotidică.

Coenzime de natură alifatică: GSH, acidul lipoic, acidul ascorbic

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Coenzime de natură alifatică: GSH

glutation-homocistin-transdehidrogenaza

Acidul lipoic - reacții transacilare

amit1b.wordpress.com

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Coenzime de natură alifatică: acidul ascorbic

Biosinteze dependente de vitamina C

Sinteza carnitinei

Hidroxilarea prolinei (colagen)

http://www.chemistryviews.org/details/ezine

Sinteza Tyr din Phe

Sinteza noradrenalinei din dopamina

Sinteza serotoninei din triptofan

Amidarea peptidelor

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Acidul ascorbic

https://edhsredu.wordpress.com/

News-Medical.Net

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

http://chem.libretexts.org

/

Substratul Produsul Enzima

Acetil-CoA Malonil-CoA Acetil-CoA carboxilaza

Piruvat Oxaloacetat Piruvat carboxilaza

Propionil-CoA Metilmalonil-CoA Propionil-CoA carboxilaza

Malonil-CoA Propil-CoA Malonil-CoA-carboxitransferaza

Izovaleril-CoA β-metil-crotonil-CoA β-metil-crotonil-CoA carboxilaza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Piridoxal-fosfatul şi piridoxamino-fosfatul - cofactori ai enzimelor ce

catalizează transferul grupărilor aminice:

2. Transaminazele

Reactia glutamatului cu piruvatul - formarea alaninei

Reactia glutamatului cu oxaloacetatul - formarea aspartatului.

1. Decarboxilazele aminoacizilor

3. Racemazele - catalizează formarea DL-alaninei din D-sau L-alanină.

4. Dezaminazele (pentru serină şi treonină).

Piridoxal-fosfatul este transportat cu ajutorul albuminei serice

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

TGO: forma citozolica forma mitocondriala

Aspartat-aminotransferaza (TGO)

Legarea PLP la situsul activ al transaminazelor

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

https://fet-ev.eu/mediatoren-histamin/

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001559

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

Deng, Nucleic Acids Research 28(17):3379-3385, 2000

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care

guvernează activitatea

catalitică

Cofactorii enzimatici

organici – THF

Metilarea uracilului

http://watcut.uwaterloo.ca/

5-fluoro-uracilul

inhibă activitatea

tiamidilat sintetazei

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – nucleozid-fosfații

Kinaze – reacții de transfosforilare

http://www.wikiwand.com/en/Nucleoside-diphosphate_kinase

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Rol metabolic coenzime

NAD+

NADP+

NAD+ Reactii de scindare

NADP+ Reactii de biosinteza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Localizare

NAD+ - intramitocondrial

NADP+ - citozol

http://www.maac10.com/science/Michan, S. and Sinclair, D.

Biochem. J. 2007;404:1-13

https://bitesizebio.com/6478/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

1U - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / minut

1Kat - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / secundă

c =A

l ·

legea Lambert-Beer

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Activitatea enzimatica =modificari

timp=

c

min=

A

min · l ·

Activitatea pe litru serVolumul total din cuva

Volumul de enzima=

A

min · l · ·

Act. enzimatica din ser - U/L

Act. enzimatica - µmol min-1 L-1

X 1000

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Fluorimetric

Colorimetric