2. purificarea enzimei 2.4. separarea cromatografica · sulfonat de metil -o-ch 2-choh-ch 2-o-ch 2...

2.4. Separarea cromatografica

2. Purificarea enzimei

2.4.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Coloana

cromatografica

Amestec

supus

separarii

GelA B

http://www.waters.com/



Tipul gelulului Intervalul de

separare

(M, KDa)

Sephadex G-10 < 0.7

Sephadex G-25 1-5

Bio-Gel P-60 3-60

Sephadex G-75 3-70

Sephadex G-100 4-100

Bio-Gel P-100 5-100

Sephadex G-200 30-200

Sephacryl S-300 10-1.500

Sepharose 2B 70-40.000

10

100

1000

0 20 40 60 80 100 120

Volume/ml

MW

/kD

a



http://slideplayer.com/slide/6171151/



http://www.ap-lab.com/images/LS_setup.gif

Siatem de purificare cromatografică

http://wolfson.huji.ac.il/purification/

Superdex 200 Increase 10/300 GL

http://www.gelifesciences.com/



Avantajele tehnicii

Timpi de separare medii

Separare binedefinită

Benzi înguste / sensibiliate bună

Consum redus de fază mobilă

Poate fi folosită la desalinizare



2.4.2. Cromatografie de schimb ionic

– –– –––

–

Enzima

Schimbator

anionicIoni din

tampon

–

–––

––

–

A B

Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Dietil-amino-etil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+( CH2CH3)2 slaba

Cuaternara aminoetil

(QAE)

-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3 puternica

Cuaternara amoniu (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 puternica

Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO- slaba

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3- puternica

Sulfonat de metil -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3- puternica

Grupări functionale ale schimbatorilor de ioni







Ion exchange chromatography. Principles and methods. Pharmacia Biotech, S-75182, Upsala, Sweden




Separarea deacetoxycefalosporin C sintazei

prin cromatografie de schimb ionic

Ion exchange chromatography. Principles and methods.

Pharmacia Biotech, S-75182, Upsala, Sweden

M: 14,3 KDa

129 de AA

pH optim

9,2

(261,5 nm, 1%) = 26,4

pI = 11.0

Stabilitatea

pH 4-5

Inhibitori

imidazol

SDS

alcooli

acizi

grasi

Caractersticile

lizozimei

(albusul de ou)




2.4. Separarea cromatografică


2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe

Principiul cromatografiei prin interacțiuni hidrofobe

Hydrophobic interaction and Reverse Phase Chromatography. Principles and methods.

Pharmacia Biotech, 11-0012-69, Upsala, Sweden



2.4.3. Cromatografie prin interacțiuni hidrofobe –etapele separării

Echilibrarea Concentrație de sare mare în soluția tampon

Aplicarea probei Îndepărtare enzime cu hidrofobicitate f. mică




Elutia component 1Îndepărtare enzimei cu hidrofobicitate redusă

descreșterea conc. sării

Elutia component 2 Descreșterea suplimentară a conc. sării

Îndepărtare enzimelor mai hidrofobe




Elutia component 3 Îndepărtare enzimei cu hidrofobicitate ridicată

conc. sare minimă

Etapă spălare Îndepărtare ultimeleor macromolecule hidrofobe

fără sare




Coloana – Fenil-Sepharose

Tampon start – 1,7 M (NH4)2SO4, 20 mM Tris, pH 7,5

Tampon eluție – 20 mM Tris, pH 7,5

Gradient 0-100%; 10 vol. coloane

Hydrophobic interaction and Reverse Phase Chromatography.

Principles and methods. Pharmacia Biotech, 11-0012-69, Upsala, Sweden

www.pall.com

http://www.jncamericany.com/

Cromatografie mixtă – hidrofobă + ionică

http://www.genengnews.com/




Bugg, T., Introduction to enzyme and coenzyme chemistry

2nd ed., Blackwell Publishing, 2004




Cre

ste

rea

hid

rofo

bic

itatii



2.4.4. Cromatografia de afinitate

www.herbalanalysis.co.uk

ADN cu secventa suplimentara

Insertie in

bacterii (E coli)

Distrugerea membranelor

proteina cu

secventa

adiacenta

alte

proteine

legare

Ma

trice de a

finita

te

Spalare

Elutie

Indepatare

secventa

suplimentara

= ligand




Denumirea

secventei

adiacente

Lungimea

secventei

adiacente

Caracteristici

His-tag scurta Leaga cationii imobilizati (Co2+, Ni2+, Cu2+)

Elutia se face cu imidazol 250 mM

Flag-tag scurta Secventa adiacenta DYKDDD-DK complexeaza

Ca2+ permitand imobilizarea anticorpilor M1, M2 si

M5; ultimii 5 aminoacizi pot fi clivati de

enterokinaza

S-tag medie Secventa KETAAKFERQHMDS se leaga de

fragmentul S din ARNaza A

Elutia se face cu citrat 0,2 M

GST-tag mare GST= glutation S-transferaza (26 KDa) se leaga

specific de o matrice pe care este imobilizat

glutationul; proteinele fuzionate cu GST sunt in

general stabile si solubile

Secvente adiacente - cromatografia de afinitate







"Column Chromatography„ Ed. D. F. Martin, B.B. Martin,

Cap 3.,Affinity Chromatography and Importance in Drug

Discovery, O. B. Acikara et al., 2013, In Tech

Suport solid N

O-

O

O-

O

Ni2+

HISN

N

HIS

N

N

ENZIMÃ

(HIS)4

http://www.interchim.com/blog/protein-purification-cep-strategy/

2.4. Separarea cromatografică – Tipuri de cromatografii


2.4. Separarea cromatografică – HPLC


elte.prompt.hu

dionex.com

http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/ch06s05.html

http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/ch06s05.html

10

100

1000

0 10 20 30

distance/mm

MW

/kD

a

97 kDa

45 kDa

30 kDa

20 kDa

66 kDa

14 kDa

2.5. Verificarea puritatii – ultracentrifugarea

gel filtrarea

electroforeza


Electroforeza

Avantajele SDS electroforezei

SDS (detergent) solubilizeaza aproape

toate proteinele;

Izoenzimele nu apar sub forma unor benzi

diferite;

Micelele de SDS-enzima, fiind puternic incarcate

negativ, poseda o mobilitate electroforetica;

Lanturile polipeptidice sunt despachetate

separarea = f(dimensiune a porilor, M);

www.pnas.org

Dezavantaje

Enzimele separate prin SDS-electroforeza -

leaga bine colorantul.

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza


http://www.pnas.org/

Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)

• 16.5% 2-25 kDa

Sisteme de electroforeza folosite

Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)

• 7.5% 40-400 kDa

• 12.5% 20-100 kDa

• 20% 3-25 kDa



Sisteme de electroforeza folosite



Mecanism de polimerizare

2.5. Verificarea puritatii – electroforeza - prepararea gelului


Acril-

amida

(%)

Intervalul

de separare

(KDa)

15 15-45

12,5 15-60

10 18-75

7,5 30-120

5 60-210

Mecanism de polimerizare



Reducerea puntilor disulfidice



forma

densitatea moleculei

Separarea enzimelor

Enzime fibroase < Enzime globulare

Viteza de sedimentare

Autoamsamblarea unei sintetaze din

Mycobacterium tuberculosishttp://openi.nlm.nih.gov/

2.5. Verificarea puritatii – ultracentrifugarea


2.5. Verificarea puritatii / Mr – spectrometria de masa (MALDI-TOF)


www.atdbio.com

http://www.kcl.ac.uk/

http://www.atdbio.com/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice


2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim

https://biochemianzunited.wordpress.com/

https://www2.estrellamountain.edu/faculty/

farabee/biobk/BioBookEnzym.html


2.5.1. Factori care guvernează

activitatea catalitică

pH-ul optim

http://cbc.chem.arizona.edu/classes/bioc462/462

a/NOTES/ENZYMES/enzyme_kinetics3.html




pH-ul optim vs stabilitate

Prazeres, J. N.dos, Cruz, J. A. B., & Pastore, G. M. (2006).

Characterization of alkaline lipase from Fusarium oxysporum

and the effect of different surfactants and detergents on the enzyme

activity. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4), 505-509

pH optim – albastru

Interval pH stabilitate – roșu

Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology

Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany




pH-ul optim vs stabilitate

Activitatea enzimatică a pepsinei vs

stabilitatea pepsinei

D W Piper and B H Fenton,

Gut, 6, 506-508, 1956




Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența solventului

Ibrahim, A.S.S. et al., Enhancement of Alkaline Protease Activity and

Stability via Covalent Immobilization onto Hollow Core-Mesoporous

Shell Silica Nanospheres, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(2), 184





Influența tăriei ionice

Influența tăriei ionice asupra activității tioesterazei

Wei, J. , Kang, H. W., Cohen, D.E.

Biochemical Journal, Jul 15, 2009,

421 (2) 311-322;

Influența tăriei ionice asupra activității

ribonucleazei (wt, K41R si K7A/R10A/ K66A)

Park, C. și Raines. R.T.,

J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11472-11479





Influența soluției tampon






Anionul fosfatul inhibă

Carboxipeptidazele

Fumarazele

Carboxilaze

Fosfoglucomutaza

Tris (Tris(hidroxi-metil)aminometan), ACES, BES, TES

Leagă ionii de Cu






Mohan, C., A guide for the preparation and use of buffers in biological

systems, EMD, San Diego, California




Influența temperaturii

slideplayer.com/slide/8444574/

Fox, P. F. et al., Heat-Induced Changes in Milk,

Dairy Chemistry and Biochemistry, pp 345-375

Lipaza, fosfataza alcalină termolabile

Fosfatza acidă - relativ stabilă

Lapte praspăt ↔ Lapte pasteurizat




Influența temperaturii

fructoz-1,6-bifosfat

-aldolaza

E coli

Edwardsiella ictaluri

Somn (entero-septicemie)

Rearanjarea ADN-ului

Williams, G. Et al., Direct evolution of aldolase

https://drjockers.com/







Cofactorii enzimatici anorganici

www.sharinginhealth.ca

personalpages.manchester.ac.uk

Situs activ al TBP aldolazei

Gavin J. Williams et al.

PNAS 2003;100:6:3143-3148





Legarea Mg2+ se face la substrat

Human epidermal growth

factor receptor 2 (HER2)

-tirozin kinaza-

Receptor activat în

20-30% cancerele de sân

Aranda, Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(12), 2543





Situs activ al endonucleazei

FEMS Microbiology Review

2001; 25:5, 583-613

Funcții

endonucleaze

replicare

recombinare

reparare ADN

Benedik, M.and Strych, U. (1998),

Serratia marcescens and its extracellular nuclease

FEMS microbiology letters, 165, 1-13





Carter, E. L. et al. (2009),

Interplay of metal ions and urease

Metallomics, 1, 207-221

Hille, R. (2002),

Molybdenum and tungsten in biology

TiBS, 27(7), 360-367





Pauff, J.M. et al., JBC, 284(13):8760-7, 2019

Cofactor piranopterinic

Romão, M.J., Dalton Transaction, 21, 2009

https://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwiB7L6cxtbgAhV87OAKHUKFBLcQjRx6BAgBEAU&url=https%3A%2F%2Fpubs.rsc.org%2Fen%2Fcontent%2Farticlehtml%2F2009%2Fdt%2Fb821108f&psig=AOvVaw38d7QM-NLPAFUf4aFJhF5k&ust=1551172550663964




Cofactorii enzimatici organici

FAD DAAO Lipoamid

dehidrogenaza





Din punct de vedere structural coenzimele - 4 clase:

• coenzime de natură alifatică;

• coenzime de natură aromatică;

• coenzime cu structura nucleozidică;

• coenzime cu structura nucleotidică.

Coenzime de natură alifatică: GSH, acidul lipoic, acidul ascorbic





Coenzime de natură alifatică: GSH

glutation-homocistin-transdehidrogenaza

Acidul lipoic - reacții transacilare

amit1b.wordpress.com





Coenzime de natură alifatică: acidul ascorbic

Biosinteze dependente de vitamina C

Sinteza carnitinei

Hidroxilarea prolinei (colagen)

http://www.chemistryviews.org/details/ezine

Sinteza Tyr din Phe

Sinteza noradrenalinei din dopamina

Sinteza serotoninei din triptofan

Amidarea peptidelor




Acidul ascorbic

https://edhsredu.wordpress.com/

News-Medical.Net





http://chem.libretexts.org

/

Substratul Produsul Enzima

Acetil-CoA Malonil-CoA Acetil-CoA carboxilaza

Piruvat Oxaloacetat Piruvat carboxilaza

Propionil-CoA Metilmalonil-CoA Propionil-CoA carboxilaza

Malonil-CoA Propil-CoA Malonil-CoA-carboxitransferaza

Izovaleril-CoA β-metil-crotonil-CoA β-metil-crotonil-CoA carboxilaza





Piridoxal-fosfatul şi piridoxamino-fosfatul - cofactori ai enzimelor ce

catalizează transferul grupărilor aminice:

2. Transaminazele

Reactia glutamatului cu piruvatul - formarea alaninei

Reactia glutamatului cu oxaloacetatul - formarea aspartatului.

1. Decarboxilazele aminoacizilor

3. Racemazele - catalizează formarea DL-alaninei din D-sau L-alanină.

4. Dezaminazele (pentru serină şi treonină).

Piridoxal-fosfatul este transportat cu ajutorul albuminei serice




Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

TGO: forma citozolica forma mitocondriala

Aspartat-aminotransferaza (TGO)

Legarea PLP la situsul activ al transaminazelor





https://fet-ev.eu/mediatoren-histamin/

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001559




Deng, Nucleic Acids Research 28(17):3379-3385, 2000



2.5.1. Factori care

guvernează activitatea

catalitică

Cofactorii enzimatici

organici – THF

Metilarea uracilului

http://watcut.uwaterloo.ca/

5-fluoro-uracilul

inhibă activitatea

tiamidilat sintetazei




Cofactorii enzimatici organici – nucleozid-fosfații

Kinaze – reacții de transfosforilare

http://www.wikiwand.com/en/Nucleoside-diphosphate_kinase




Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Rol metabolic coenzime

NAD+

NADP+

NAD+ Reactii de scindare

NADP+ Reactii de biosinteza




Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Localizare

NAD+ - intramitocondrial

NADP+ - citozol

http://www.maac10.com/science/Michan, S. and Sinclair, D.

Biochem. J. 2007;404:1-13

https://bitesizebio.com/6478/



2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

1U - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / minut

1Kat - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / secundă

c =A

l ·

legea Lambert-Beer




Activitatea enzimatica =modificari

timp=

c

min=

A

min · l ·

Activitatea pe litru serVolumul total din cuva

Volumul de enzima=

A

min · l · ·

Act. enzimatica din ser - U/L

Act. enzimatica - µmol min-1 L-1

X 1000




Fluorimetric

Colorimetric

2. purificarea enzimei 2.4. separarea cromatografica · sulfonat de metil -o-ch 2-choh-ch 2-o-ch 2...

Documents