ADER 5.1.5.Ameliorarea şi consolidarea unui nucleu de vaci de rasă Bălţată

Românească de tip Fleckvieh prin selecţie şi utilizarea la reproducţie a celor mai performante structuri genetice în vederea

creşterii eficienţei economice a activităţilor fermei

Cod proiect: ADER 5.1.5.

Tip proiect: PLAN SECTORIAL –ADER

Faza: IV – Genotiparea taurilor potențial reproducători în vederea obținerii generației descendente

Coordonator proiect:Stațiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Arad

Director proiect: Dr. Ing. Neamţ Radu

• Proiectul are ca scop îmbunătăţirea şi consolidareastructurii genetice a unui efectiv de rasă BălţatăRomânească de tip Fleckvieh, prin utilizarea la reproducţie acelor mai performante structuri genetice şi selecţia asistatăde markeri moleculari, în vederea obţinerii unor parametriproductivi vizând cantitatea şi calitatea laptelui (grăsime șiproteină), competitivi în contextul actual al pieţeloreuropene.

Obiectivul proiectului

Obiectivul fazei

• Genotiparea taurilor potențial reproducători în vedereaselectării acestora și obținerii generației descendente.

Activități desfășurate în vederea realizării obiectivului fazei

• Activitatea 4.1 – Genotiparea taurilor potențial reproducători în vedereaselectării acestora și obținerii generației descendente.

• Se vor stabili valorile de ameliorare individuale a taurilor incluși în evaluare,sub aspectul indicilor de interes economic;

• Se vor stabili taurii potențial reproducători în vederea obținerii generațieidescendente;

• Izolarea ADN total genomic total din probele biologice (MSC) și analizamarkerilor moleculari;

• Amplificarea prin reacţie PCR a genelor de interes;• Determinarea genotipurile individuale prin tehnica RFLP (care presupune

restricţia enzimatică a ampliconilor rezultaţi în urma amplificării);• Migrarea în gel de agaroză a produşilor PCR-RFLP pentru evidenţierea

genotipurilor.

• Activitatea 4.2.- Raport tehnic de fază.

• Centralizarea și raportarea rezultatelor obținute.

Alegerea taurilor potențiali reproducători

Nr Crt. Taur Cod

1 Winston 533852 Varistor 540143 Manton 528734 Wildboy 533415 Wimm 533846 Polaroid 537567 Mogul 535658 Shaqiri 537919 Hubertus 5400810 Mantikor 5401111 Huterande 5413812 Delius 5375113 Macbeth 5378414 Manigo 5435315 Huldig 5366616 Obolus 5287117 Rehkitz 5314118 Mach Mal 53785

Indicii de ameliorare a caracterelor de interes zoo-economic

Taur VAG VAL Lapte Gr kg

Pr kg

Lărgime crupă

Viabilitate viței

Ușurință fătare

Uger AscendențăLapte Gr.% Pr.%

Winston 124 122 1090 26 34 111 120 112 100 12202 44,3 3,6Varistor 129 121 698 32 28 98 121 124 105 10865 4,11 3,25Manton 123 118 997 22 28 98 112 118 94 9858 4,22 3,44Wildboy 130 126 806 38 35 121 93 117 113 9895 4,12 3,29Wimm 131 119 617 30 21 112 108 118 118 11226 4,44 3,44Polaroid 131 123 753 44 21 102 106 110 110 12073 3,95 3,22Mogul 128 115 524 19 24 102 117 114 118 10260 4,36 3,51Shaquiri 129 118 553 26 21 106 106 108 131 9159 4,64 3,61Hubertus 126 125 678 44 28 100 101 102 92 9742 5,3 3,85Mantikor 125 120 950 29 27 102 104 121 94 10810 4,31 3,46Huterandre 134 125 876 40 231 107 98 111 107 7004 3,77 3,78

Delius 126 112 544 16 17 104 99 112 115 12214 3,93 3,47Macbeth 125 111 359 21 11 82 113 114 119 10296 4,02 3,64Manigo 133 115 675 14 28 95 124 120 127 10844 4,27 3,35Huldig 118 105 524 11 14 109 103 114 111 11006 4,94 3,43Obolus 126 101 ‐140 0 3 89 114 97 109 9794 4,31 3,49

Mach Mal 124 122 499 35 35 107 102 106 99 10678 4,46 3,49Rehkitz 125 110 576 13 16 87 116 117 106 12046 4,47 3,62

Semnificația indicilor de ameliorare a caracterelor de interes economic

Taur VAG VAL Lapte Gr%

Pr%

Lărgimecrupă

Viabilitateviței

Ușurințăfătare

Uger Evaluare

+ ‐ *Winston + + + + + + + + * 8 0 1Varistor + + + + + ‐ + + + 8 1 0Manton + + + + + ‐ + + ‐ 7 2 0Wildboy + + + + + + ‐ + + 8 1 0Wimm + + + + + + + + + 9 0 0Polaroid + + + + + + + + + 9 0 0Mogul + + + + + + + + + 9 0 0Shaquiri + + + + + + + + + 9 0 0Hubertus + + + + + * + + ‐ 7 1 1Mantikor + + + + + + + + ‐ 8 1 0Huterandre + + + + + + ‐ + + 8 1 0Delius + + + + + + ‐ + + 8 1 0Macbeth + + + + + ‐ + + + 8 1 0Manigo + + + + + ‐ + + + 8 1 0Huldig + + + + + + + + + 9 0 0Obolus + + ‐ * + ‐ + ‐ + 5 3 1Mach Mal + + + + + + + + ‐ 8 1 0

Rehkitz + + + + + ‐ + + + 8 1 0

Evaluarea indicilor de ameliorare în raport cu grupele de caractereTaur V.A. Condiția de bunăstare Uger Evaluare

+ ‐ *

Winston + + * 2 0 1

Varistor + + + 3 0 0

Manton + + ‐ 2 1 0

Wildboy + ‐ + 2 1 0

Wimm + + + 3 0 0

Polaroid + + + 3 0 0

Mogul + + + 3 0 0

Shaquiri + + + 3 0 0

Hubertus + + ‐ 2 1 0

Mantikor + + ‐ 2 1 0

Huterandre + ‐ + 2 1 0

Delius + ‐ + 2 1 0

Macbeth + + + 3 0 0

Manigo + + + 3 0 0

Obolus + + + 3 0 0

Huldig + + + 3 0 0

Mach Mal + + ‐ 2 1 0

Izolarea ADN genomic total din material seminal congelat (MSC)

- liza celulelor seminale timp de minim 6 ore într-un tampon de liză [450 µl(10 mM Tris pH 8,0; 100 mM NaCl; 10 mM EDTA pH 8,0; 1%SDS), 50 µl DTT 500mM şi 10 µl protează K cu o concentraţie de 20 mg / ml], precipitarea proteinelorcu o soluţie de NaCl 6M şi extracţia ADN genomic total prin precipitare cuizopropanol și etanol 70%, urmată de rehidratarea ADN în soluţie TE (TRIS 10mM pH 7,4 şi EDTA 1 mM)

- analiza spectofotometrică, (NanoDrop ND- 2000), pentru verificarea purităţii şiconcentraţiei, prin măsurarea absorbanţei totale a extractului la o lungime deundă de 260nm si de 280nm. Puritatea probelor de ADN extrase a fost apreciatăpe baza raportului A260/A280 iar concentraţia probelor a fost calculată automatcu softwareul spectofotometrului NanoDrop 2000 (fig. 1). În urma efectuăriispectofotometriei pentru toate probele de ADN s-au obţinut valori ale raportuluiDO A260/A280 cuprinse între 1,82 și 2,06

Graficul spectrelor de absorbanță pentru probele de ADN

Rezultatele obținute în urma determinării purităţii şiconcentraţiei ADN prin tehnica de spectofotometrie

Nr. Crt. Nume taur Cod ConcentrațiaAND (ng/µl)

A260 A280 RaportulA260/A280

RaportulA260/A230

1 Winston 53385 176,4 3,527 1,901 1,86 1,12 Varistor 54014 137,2 2,745 1,46 1,88 1,13 Manton 52873 408,3 8,167 4,316 1,89 1,984 Wildboy 53341 238,4 4,768 2,481 1,92 1,75 Wimm 53384 292,3 5,846 3,04 1,92 1,776 Polaroid 53756 192,4 3,848 2,04 1,89 1,477 Mogul 53565 319,1 6,381 3,386 1,88 1,728 Shaqiri 53791 122,3 2,446 1,223 2 2,199 Hubertus 54008 212,8 4,257 2,211 1,93 1,710 Mantikor 54011 181,9 3,637 1,836 1,98 2,3411 Huterande 54138 835,9 16,719 8,84 1,89 2,0912 Delius 53751 95,5 1,911 0,953 2,01 1,8113 Macbeth 53784 113,6 2,271 1,102 2,06 2,6114 Huldig 53666 989 19,78 10,846 1,82 2,0415 Manigo 54353 121,1 2,421 1,209 2 2,7516 Obolus 52871 96,4 1,929 0,964 2 2,1617 Rehkitz 53141 112 2,24 1,122 2 2,5618 Mach Mal 53785 116,6 2,331 1,152 2,02 2,32

ADN genomic total migrat în gel de agaroză de 0,8%

Genotiparea taurilor potențiali genitori pentru markerii moleculari de interes

1. amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specifice genelor de

interes, prin intermediul tehnicii PCR;

2. vizualizarea ampliconilor (produşilor PCR) în gel de agaroză;

3. restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu

ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de

lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză;

Etapele reacției PCR κ‐CN β‐LG α‐LASecvența primerilor 5’‐ATCATTTATGGC

CATTCCACCAAAG‐3’3’‐GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA‐5’

5’‐TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG‐3’5’‐GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT‐3’

5’‐CTCTTCCTGGATGTAAGGCTT‐3’5’‐AGCCTGGGTGGCATGGAATA‐3’

Denaturarea iniţială 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 minDenaturarea 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 secAlipire primeri 60oC ‐ 30 sec 63oC ‐ 30 sec 55oC ‐ 30 secExtensie 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec.Extensie finală 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min

Parametrii reacţiei de amplificare

Determinarea genotipurilor existent la nivelul genelor de interes

Produși PCR-RFLP pentru gena din locusul κ-CN obținuți prin digestia ampliconilor de 350 pb cu enzima HindIII

Produși PCR-RFLP pentru gena din locusul β-LG obținuți prin digestia ampliconilor de 247 pb cu enzima HaeIII

Produși PCR-RFLP pentru gena din locusul α-LA obținuți prin digestia ampliconilor de 166 pb cu enzima MnlI

NrCrt

Taur Cod Genotip pentruκ‐CN

Genotipulpentruβ‐LG

Genotipulpentruα‐LA

1 Winston 53385 BB BB BB2 Varistor 54014 AA AB BB3 Manton 52873 AA AA BB4 Wildboy 53341 AA AB BB5 Wimm 53384 AA AB BB6 Polaroid 53756 AA AB BB7 Mogul 53565 AA AA BB8 Shaqiri 53791 AA AB BB9 Hubertus 54008 AB AB BB10 Mantikor 54011 AA AA BB11 Huterande 54138 AB AB BB12 Delius 53751 AB AB BB13 Macbeth 53784 AA AB BB14 Huldig 53666 AB AA BB15 Manigo 54353 AB AA BB16 Obolus 52871 AA AA BB17 Rehkitz 53141 BB AB BB18 Mach Mal 53785 AB AA BB

Rezultatele genotipării taurilor pentru genele de interes

Locus Genotip Frecvenţa genotipuluiObservată/(asteptată)

Alele Frecvenţaalelelor

κ‐CN AA 0,5556 / (0,5216) AB

pA‐0,722qB‐0,278ᵪ=0,4728AB 0,3333 / (0,4012)

BB 0,1111 / (0,7720)

β‐LG AA 0,3889 / (0,4444) AB

pA‐0,667qB‐0,333ᵪ=0,2888AB 0,5556 / (0,4444)

BB 0,0556 / (0,1111)

α‐LA AA 0 AB

pA‐0qB‐1ᵪ=1AB 0

BB 1

Polimorfismul din locusul genelor de interes în cadrul taurilor analizati

Structura efectivului de tauri pentru genele de interes analizate

0 0,2 0,4 0,6

AA

AB

BB

κ‐cazeină

0,5556

0,3333

0,1111

κ‐cazeinăAA

κ‐cazeinăAB

κ‐cazeinăBB

0 0,2 0,4 0,6

AA

AB

BB

β‐lactoglobulină

0,3889

0,5556

0,0556 β‐lactoglobulinăAA

β‐lactoglobulinăAB

β‐lactoglobulinăBB

0 0,5 1

AA

AB

BB

α‐lactalbumină

0

0

1 α‐lactalbuminăAA

α‐lactalbuminăAB

α‐lactalbuminăBB

Structura efectivului de tauri pentru gena din locusul κ-CN

Structura efectivului de tauri pentru gena din locusul β-LG

Structura efectivului de tauri pentru gena din locusul α-LA

ConcluziiS-a achiziționat MSC de la taurii disponibi în centrele SEMTEST;

S-au stabilit valorile de ameliorare individuale a taurilor incluși

în evaluare, sub aspectul indicilor asociați caracterelor de interes

economic;

S-a izolat ADN total genomic total din probele biologice (MSC) și

s-au analizat markerii moleculari;

S-au amplificat genele de interes prin reacţie PCR;

S-au determinarea genotipurile individuale prin tehnica RFLP

(care presupune restricţia enzimatică a ampliconilor rezultaţi în

urma amplificării);

S-au migrat în gel de agaroză produșii PCR-RFLP pentru

evidenţierea genotipurilor;

S-au stabilit frecvențele alelelor în grupa taurilor incluși în

studiu;

S-au stabilit taurii ce vor fi utilizați la reproducție în vederea

obținerii generației descendente.